Summary
Samspillet mellem en ATP-afhængig kromatin remodeler med en DNA ligand er beskrevet ved hjælp af CD spektroskopi. De inducerede kropsbygningsændringer på en genpromotor analyseret af de genererede toppe kan bruges til at forstå mekanismen for transskriptionel regulering.
Abstract
Cirkulær dichroisme (CD) spektroskopi er en enkel og bekvem metode til at undersøge biomolekylernes sekundære struktur og interaktioner. Nylige fremskridt inden for CD-spektroskopi har gjort det muligt at studere DNA-proteininteraktioner og dna-overensstemmelsesdynamik i forskellige mikromiljø i detaljer for en bedre forståelse af transskriptionel regulering in vivo. Området omkring en potentiel transskriptionszone skal rulles ud, for at transskription kan forekomme. Dette er en kompleks proces, der kræver koordinering af histone modifikationer, binding af transskriptionsfaktoren til DNA og andre kromatin remodeling aktiviteter. Ved hjælp af CD-spektroskopi er det muligt at studere kropsbygningsændringer i promotorregionen forårsaget af regulatoriske proteiner, såsom ATP-afhængige kromatin remodelers, for at fremme transskription. De kropslige ændringer, der forekommer i proteinet, kan også overvåges. Derudover kan forespørgsler vedrørende proteinets affinitet mod dets mål-DNA og sekvensspecifikitet behandles ved at indarbejde mutationer i mål-DNA'et. Kort sagt kan den unikke forståelse af denne følsomme og billige metode forudsige ændringer i kromatindynamikken og derved forbedre forståelsen af transskriptionsregulering.
Introduction
Cirkulær dichroisme (CD) er en spektroskopisk teknik, der bygger på den iboende chiralitet af biologiske makromolekyler, der fører til differentialabsorption af højrehåndet og venstrehåndet cirkulært polariseret lys. Denne differentialabsorption er kendt som cirkulær dichroisme. Teknikken kan derfor bruges til at afgrænse kropsbygning af biologiske makromolekyler, såsom proteiner og DNA, som begge indeholder chiral centre1,2.
Elektromagnetiske bølger indeholder både elektriske og magnetiske komponenter. Både de elektriske og de magnetiske felter svinger vinkelret på retningen af bølgeudbredelse. I tilfælde af upolariseret lys svinger disse felter i mange retninger. Når lyset er cirkulært polariseret, opnås to elektromagnetiske felter ved 90 ° faseforskel til hinanden. Chiralmolekyler viser cirkulær optisk rotation (birefringence), således at de vil absorbere det højrehåndede cirkulært polariserede lys og det venstrehåndede cirkulært polariserede lys i forskellige omfang3. Det resulterende elektriske felt vil blive sporet som en ellipse, en funktion af bølgelængden. Cd-spektret registreres således som elliptiskhed (q), og dataene præsenteres som Mean Rest Ellipticity som en funktion af bølgelængde.
For proteiners vedkommende er Cα af aminosyrer (undtagen glycin) chiral, og dette udnyttes ved cd-spektroskopi til at bestemme den sekundære struktur af denne makromolekyle4. Cd-spektret af proteinmolekyler registreres typisk i Langt UV-området. α-spiralformede proteiner har to negative bånd ved 222 nm og 208 nm og en positiv top ved 193 nm4. Proteiner med anti-parallel β-arks sekundær struktur viser en negativ top på 218 nm og en positiv top ved 195 nm4. Proteiner med uordnede strukturer viser lav elliptiskhed nær 210 nm og en negativ top ved 195 nm4. Således gør de veldefinerede spidsbelastninger/bånd til forskellige sekundære strukturer CD til et praktisk værktøj til at belyse de kropslige ændringer, der forekommer i proteinernes sekundære struktur under denaturering samt ligandbinding.
Nukleinsyrer har tre kilder til chiralitet: sukkermolekylet, den sekundære strukturs heliktighed og den langtrækkende tertiære bestilling af DNA i miljøet5,6. Cd-spektret af nukleinsyrer registreres typisk i intervallet 190 til 300 nm5,6. Hver kropsbygning af DNA, ligesom proteiner, giver et karakteristisk spektrum, selv om toppe / bånd kan variere med nogle grader på grund af opløsningsmiddel betingelser og forskelle i DNA-sekvenser7. B-DNA, den mest almindelige form, er karakteriseret ved en positiv top omkring 260-280 nm og en negativ top omkring 245 nm6. Tinder/bånd af B-form DNA er generelt små, fordi baseparret er vinkelret på dobbelthelixen, hvilket giver molekylet svag chiralitet. A-DNA giver et dominerende positivt højdepunkt på 260 nm og en negativ top omkring 210 nm6. Z-DNA, den venstrehåndede helix, giver et negativt bånd på 290 nm og en positiv top omkring 260 nm6. Dette DNA giver også en ekstremt negativ top ved 205 nm6.
Ud over disse konformationer kan DNA også danne triplexer, quadruplexes og hårnåle, som alle kan skelnes af CD-spektroskopi. Den parallelle G-quadruplex giver et dominerende positivt bånd på 260 nm, mens den anti-parallelle G-quadruplex giver et negativt bånd på 260 nm og en positiv top på 290 nm, hvilket gør det nemt at skelne mellem de to former for quadruplex strukturer6. Triplexes giver ikke et karakteristisk spektrum8. For eksempel viser spektret af et 36 nukleotidlangt DNA med potentiale til at danne et intramoleklekkulært tredobbelt helix indeholdende G.G.C og T.A.T-basepar i nærværelse af Na+ et stærkt negativt bånd ved 240 nm og en bred positiv top. Den brede positive top viser bidrag på 266, 273 og 286 nm. Den samme oligonuleotid i nærværelse af Na+ og Zn+ viser fire negative bånd (213, 238, 266 og 282 nm) og en positiv top på 258 nm. Således kan spektret af triplex DNA variere afhængigt af saltforhold8.
Ud over disse konformationer har CD-spektre gjort det muligt at identificere en anden form for DNA kaldet X-DNA. X-DNA dannes, når DNA-sekvensen indeholder alternative adenin- og thyminrester. Cd-spektret af X-DNA indeholder to negative toppe ved 250 og 280 nm. Meget lidt information er tilgængelig om X-DNA, selv om det er blevet spekuleret til at fungere som en vask for positiv supercoiling6,9. Ændringer i CD spektre kan også afsløre detaljer om ligand-protein interaktioner og derfor er blevet tilføjet til arsenal af molekylære metoder til påvisning af lægemiddel-protein interaktioner10,11,12,13,14. CD spektre er også blevet brugt til at overvåge ændringerne i den sekundære struktur af proteiner under foldeprocessen15. Tilsvarende cd-spektre kan også bruges til sondering ligand-DNA interaktioner16,17.
Cd-spektroskopi er således en nem og billig metode til at skelne mellem de forskellige former for DNA-kropsbygning, forudsat at der er adgang til ikke-så-billigt udstyr og software. Metoden er yderst følsom og hurtig. Det kræver kun en lille mængde DNA, hvilket giver det en kant over den alternative teknik med nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Titreringer med ligands og substrater er også nemme at udføre. Den største begrænsning er, at DNA'et skal være meget rent. Det er tilrådeligt at bruge polyacrylamidgelelektroforese (PAGE)-renset DNA.
De oplysninger, der er indhentet af CD-spektre, er hovedsagelig blevet brugt til at udlede protein strukturelle træk og til at identificere forskellige DNA-konforme. I denne undersøgelse er CD-spektre blevet brugt til at integrere resultaterne fra et in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) eksperiment for at afgrænse, om proteinet af interesse / forudsagt transskription faktor kan medføre en kropsbygningsændring i promotorregionen af dets effektor gener. Dette samarbejde hjælper med udviklingen af traditionelle CD-spektroskopiske teknikker ved at forudsige mekanismen for transskription regulering af den forudsagte transskription faktor på og omkring transskription start site (TSS) af en promotor.
Chromatin remodeling er en veldefineret mekanisme kendt for at regulere DNA metaboliske processer ved at gøre tæt pakket kromatin tilgængelig for forskellige lovgivningsmæssige faktorer såsom transskription faktorer, komponenter af DNA-replikation, eller skade reparation proteiner. De ATP-afhængige kromatin remodelers, også kendt som SWI / SNF familie af proteiner, er centrale remodeler proteiner til stede i eukaryote celler18,19. Phylogenetisk klyngedannelse har kategoriseret SWI / SNF-familien af proteiner i 6 undergrupper20: Snf2-lignende, Swr1-lignende, SSO1653-lignende, Rad54-lignende, Rad5/16-lignende og fjern. SMARCAL1, proteinet af interesse i denne undersøgelse, tilhører den fjerne undergruppe20. Dette protein er blevet brugt til at undersøge dets form for transskriptionel regulering ved hjælp af CD-spektroskopi.
De fleste af medlemmerne af atp-afhængige kromatin remodeling proteiner har vist sig at enten flytte eller smide nukleosomer eller mægle histone variant udveksling i en ATP-afhængige måde21,22. Nogle medlemmer af denne familie har imidlertid ikke vist sig at ombygge nukleosomer, f.eks. Selv om undersøgelser har vist, at SMARCAL1 forbinder med polyten kromosomer, eksperimentelle beviser vedrørende dens evne til at ombygge nukleosomer mangler23. Derfor blev det postuleret, at SMARCAL1 kan regulere transskription ved at ændre kropsbygning af DNA24. CD-spektroskopi gav en nem og tilgængelig metode til at validere denne hypotese.
SMARCAL1 er et ATP-afhængig kromatin remodeling protein, der primært fungerer som en udglødende helicase25,26,27. Det er blevet postuleret at modulere transskription ved at ombygge DNA-kropsbygning24. For at teste denne hypotese blev SMARCAL1's rolle i reguleringen af gentransskription under doxorubicin-induceret DNA-skade undersøgt. I disse undersøgelser blev SMARCAL1 anvendt til in vivoanalyse og ADAAD til in vitro-analyser28,29. Tidligere undersøgelser har vist, at ADAAD kan genkende DNA på en strukturafhængig, men sekvensafhængig måde30,31. Proteinet binder sig optimalt til DNA-molekyler, der besidder dobbeltstrengede til enkeltstrengede overgangsregioner, svarende til stem-loop DNA, og hydrolyser ATP 30,31.
In vivo-eksperimenter viste, at SMARCAL1 regulerer myc's, DROSHA's, DGCR8's og DICER's udtryk ved at binde sig til initiativregionerne28,29. Interaktionsområdet blev identificeret ved ChIP-eksperimenter28,29. ChIP-teknikken bruges til at analysere samspillet mellem et protein og dets cognate DNA i cellen. Dens mål er at afgøre, om specifikke proteiner, såsom transskriptionsfaktorer på initiativtagere eller andre DNA-bindingssteder, er bundet til specifikke genomiske områder. Proteinet bundet til DNA er først krydsbundet ved hjælp af formaldehyd. Dette efterfølges af isolering af kromatin. Den isolerede kromatin er forskåret til 500 bp fragmenter enten ved sonikering eller nuklease fordøjelse, og proteinet bundet til DNA er immunprecipiteret ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for proteinet. Krydskædning er vendt, og DNA analyseres ved hjælp af enten polymerase kædereaktion (PCR) eller kvantitativ real-time PCR.
ChIP-resultaterne førte til hypotesen om, at SMARCAL1 muligvis formidler transskriptionel regulering ved at fremkalde en kropsbygningsændring i promotorregionerne af disse gener. QGRS-mapper og Mfold-software blev brugt til at identificere disse promotorregioners potentiale til at danne sekundære strukturer28,29. QGRS mapper bruges til at forudsige G-quadruplexes32, mens Mfold33 analyserer en sekvenss evne til at danne sekundære strukturer som stem-loops.
Efter sekundær strukturanalyse blev der udført yderligere in vitro-eksperimenter med rekombinant 6X His-tagged Active DNA-afhængige ATPase A Domain (ADAAD), kvæg homolog af SMARCAL1, renset fra Escherichia coli34. ATPase-analyser blev udført ved hjælp af ADAAD for at fastslå, at de identificerede DNA-sekvenser kunne fungere som effektorer28,29. Endelig blev cd-spektroskopi udført for at overvåge de kropslige ændringer, der blev induceret i DNA-molekylet af ADAAD28,29.
For at bevise, at proteinets ATPase-aktivitet var afgørende for at fremkalde en kropsbygningsændring i DNA-molekylet, blev der tilsat enten ethylendiamin tetraacesyre (EDTA) for at chelatere Mg+2 eller Active DNA-afhængige ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), en specifik hæmmer af SWI/SNF-proteinet, tilsat35,36 . Denne CD spektroskopiske teknik kan anvendes med ethvert renset protein, der er blevet påvist af ChIP eller enhver anden relevant analyse til at binde sig til en forudsagt genomisk region af en promotor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Arbejdskoncentration af reaktionskomponenterne
- Arbejdskoncentrationerne af buffere til cd'er og andre reaktionskomponenter er frisklavet (se tabel 1), og hold dem på 4 °C, før reaktionerne opsættes.
BEMÆRK: For de cd-reaktioner, der er beskrevet i dette papir, er arbejdskoncentrationerne af komponenter som følger: Natriumphosphatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. ATPase aktivitet
- Før CD-spektroskopi skal proteinets ATPase-aktivitet fastslås i dna-molekylernes tilstedeværelse for at sikre, at det protein, der anvendes i cd-spektroskopien, er aktivt, og for at identificere de DNA-molekyler, der er optimalt effektive til at fremkalde ATP-hydrolyse.
- Mål proteinets ATPase-aktivitet i nærværelse af forskellige DNA-molekyler ved hjælp af en NADH-koblet oxidationsanalyse bestående af følgende to reaktioner.
- Bland 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA og 1x REG buffer i en 96-brønds plade til et endeligt volumen på 250 μL.
BEMÆRK: Pyruvatkinseenzymet bruger ADP og Pi til at omdanne fosfoenolpyruvat til pyruvat og dermed regenerere ATP. Dette sikrer, at ATP altid er i en mættende koncentration i reaktionen. I den anden reaktion omdannes pyruvat dannet ved virkningen af pyruvatkinse ved laktatdehydrogenase til laktat. I denne reaktion oxideres et NADH-molekyle til NAD+. Forbruget af NADH måles ved at måle molekylets absorbans ved 340 nm. - Inkuberes i 30 min ved 37 °C i en inkubator.
- Mål mængden af NAD+ ved 340 nm ved hjælp af en mikropladelæser.
- For at måle mængden af NAD+, skal du bruge den software, der leveres sammen med mikropladelæseren.
- Klik på NADH-analysen for at måle absorbansen ved 340 nm.
- Anbring 96-brøndspladen på pladeholderen i instrumentet. Klik på knappen Læs plade for at registrere absorbansen.
BEMÆRK: Koncentrationen af NAD+ beregnes ved hjælp af nadhs molarudryddelseskoefficient som 6,3 mM−1 ved hjælp af eq (1).
A = εcl (1)
Her A = Absorbans
ε = Molarudryddelseskoefficient
c = Molarkoncentration
l = Optisk stilængde i cm
- Bland 0,1 μM ADAAD, 2 mM ATP, 10 nM DNA og 1x REG buffer i en 96-brønds plade til et endeligt volumen på 250 μL.
3. Valg og forberedelse af cd-cuvettes
- Saml CD spektre i høj gennemsigtighed kvarts cuvettes. Brug rektangulære eller cylindriske cuvettes.
BEMÆRK: Der blev anvendt en cd-kvarts-cuvette (nominelt volumen på 0,4 mL, stilængde på 1 mm) til alle de reaktioner, der er beskrevet i dette papir. - Brug en cuvetterengøringsopløsning til at rengøre cuvette. Der tilsættes 1 % cuvetterengøringsmiddel i vand for at fremstille 400 μL af opløsningen, hæld den i cuvette og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
- Vask cuvette med vand flere gange for at rense cuvette. Tag en scanning af vandet eller bufferen i cuvette for at kontrollere, om det er rent.
BEMÆRK: Vandet eller bufferen skal give en aflæsning i 0 til 1 mdeg-området.
4. Fremstilling af proteiner og DNA-oligonukleotid
- Hold proteinets volumen under 50 μL i reaktionen for at minimere mængden af de bufferkomponenter, der undertiden forårsager dannelsen af tvetydige toppe. Hold proteinet på isen under hele eksperimentet for at undgå nedbrydning.
- Brug PAGE-renset DNA-oligonukleotider i reaktionerne.
BEMÆRK: I de reaktioner, der er beskrevet her, blev DNA brugt både i indfødte såvel som varmekølede former (hurtigt afkølede (FC) og langsomt afkølede (SC)). Hurtig køling fremmer intramolekylær binding i DNA'et og giver flere sekundære strukturer. I modsætning hertil fremmer langsom afkøling intermolekylær binding i DNA'et, hvilket resulterer i færre sekundære strukturer. - For hurtig afkøling opvarmes DNA ved 94 °C i 3 min. på varmeblokken, og afkøles det straks på is. Ved langsom afkøling opvarmes DNA ved 94 °C i 3 min og afkøles til stuetemperatur med en hastighed på 1 °C i minuttet.
5. Opsætning af kontroleksperimenter til registrering af det oprindelige spektre
- Hold reaktionsvolumenet på 300 μL i alle reaktioner. Opsætning af i alt 5 baseline reaktioner i 1,5 mL centrifugerør, en efter en, som følger: i) Buffer + Vand; ii) Buffer + MgCl2 + ATP + Vand; iii) Buffer + MgCl2 + ATP + Protein + Vand; iv) iii + EDTA eller ADAADiN; v) Buffer + Protein +Vand.
6. Opsætning af eksperimenter til optagelse af cd-spektre
- Opsætning af i alt 5 reaktioner, en efter en, i 1,5 mL centrifugerør som følger: i) Buffer + DNA + Vand; ii) Buffer + DNA + MgCl2 + ATP + Vand; iii) Buffer + DNA + MgCl2 + ATP + Protein + Vand; iv) iii + EDTA eller ADAADiN; v) Buffer + DNA + Protein +Vand.
7. Optagelse scanning
- Tænd for gassen, og tænd for cd-spektrometeret.
- Tænd lampen efter 10-15 min. Tænd for vandbadet, og indstil holdertemperaturen til 37 °C.
- Åbn cd-spektrumsoftwaren .
- Indstil temperaturen til 37 °C.
- Indstil bølgelængden til 180 - 300 nm.
- Angiv klokkeslættet pr. punkt til 0,5 s.
- Indstil scanningsnummeret til 5.
- Klik på Pro-Data Viewer, lav en ny fil, og omdøb den med oplysninger om eksperimentet og datoen.
- Hold alle reaktionskomponenterne på is for at undgå forringelse. Lav baselines og reaktioner, en efter en, i centrifuge rør og bland dem ved pipettering. Overfør reaktionsmikset til cuvette omhyggeligt, så der ikke er luftbobler.
- Hvis der udføres et tidsforløbsforsøg, inkuberes reaktionerne ved 37 °C i det krævede tidsrum, og scanningen skal udføres. Tilføj EDTA til bufferen, der indeholder DNA, ATP, Mg +2, og protein for at stoppe ATP hydrolyse.
- Forøg koncentrationen af EDTA og dens inkubationstid for at hæmme ATPase-aktiviteten helt.
- Træk basislinjerne fra de tilsvarende reaktioner i softwaren (f.eks. trækker reaktion 1 fra baseline 1). Udglat dataene enten i cd-spektrumsoftwaren eller i dataplottsoftwaren. Plot dataene i dataplottsoftwaren.
BEMÆRK: Hvis basislinjerne trækkes fra de tilsvarende reaktioner, vil det kun give netto-cd-spektret af DNA.
8. Dataanalyse og -fortolkning
- Den formel, der er angivet ved eq (2), til at konvertere de værdier, der er opnået i millidegrees, til middelrester elliptiskhed.
(2)
Her er S cd-signalet i millidegrees, c er DNA-koncentrationen i mg/mL, mRw er den gennemsnitlige restmasse, og l er stiens længde i cm. - Plot en graf mod bølgelængde og gennemsnitlige rester elliptiskhed ved hjælp af data plotte software og analysere toppe.
- Hvis du vil afbilde grafen, skal du vælge den gennemsnitlige ellipse på Y-aksen og bølgelængden på X-aksen og afbilde en lige linjegraf.
BEMÆRK: Denne graf vil give de særlige toppe af forskellige former for DNA. De dna-former, der svarer til tinderne, kan identificeres ved hjælp af eksisterende litteratur6.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ADAAD stabiliserer en stilk-loop lignende struktur på MYC promotor
Tidligere eksperimentelle beviser viste, at SMARCAL1 er en negativ regulator af MYC29. En analyse af den 159 bp lange promotorregion af MYC-genet af QGRS-mapper viste, at den forreste streng havde potentiale til at danne en G-quadruplex (tabel 2). Mfold viste, at begge dele af MYC DNA kunne danne en stilk-loop-lignende struktur (tabel 2). En 34 bp lang DNA-sekvens, der indeholder G-quadruplex (GECE) blev syntetiseret. De Mfoldske strukturer af den forreste og den modsatte sekvens af GECE-oligonukleotid er vist i figur 1A,B.
ATPase assays ved hjælp af 6X His-ADAAD viste, at hurtigt afkølet GECE var en bedre effektor end den indfødte og den langsomt afkølede former. Derfor blev hurtigt afkølet GECE brugt til at optage cd-spektret i mangel og tilstedeværelse af ATP og ADAAD. Cd-spektret viste, at ADAAD fremkalder to positive toppe-en ved 258 nm med en skulder på 269 nm og en større top ved 210 nm i DNA 'et (Figur 1C). Der blev også observeret et dyk mod minus omkring 240 nm. Dette spektrum svarede til det, der blev opnået, da et syntetisk stem-loop DNA, den optimale effektor af ADAAD, blev inkuberet med proteinet og ATP (figur 2A, B). Triplex DNA kan give et lignende spektrum37, hvilket fører til hypotesen om, at proteinet kunne fremkalde en sådan struktur i dette tilfælde. ATP danner et koordinationskompleks med Mg+2, og denne kation er afgørende for ATP-hydrolyse. Tilsætning af EDTA chelates Mg +2, hvilket fører til hæmning af ATP hydrolyse38. Derfor blev EDTA tilføjet til reaktionsmikset for at forstå, om ATP-hydrolyse fra ADAAD var vigtig for kropsbygningsændringer. Tilføjelsen af EDTA til reaktionen ophæver denne kropsbygning. CD-spektret har nu en negativ 210 nm top og et bredt positivt bånd med toppe på 230 og 250 nm (Figur 1C).
Betydningen af ATPase-aktivitet blev også bekræftet ved hjælp af en ATPase-død mutant af ADAAD. K241A-mutationen forekommer i den bevarede GKT-boks med motiv I, og denne mutant har tidligere vist sig at mangle evnen til at hydrolysere ATP i nærværelse af DNA31. Det mutante protein blev udtrykt med et GST-mærke og renset ved hjælp af glutathion affinitetskromatografi. Den kropsbygningsændring, der blev induceret i MYC-DNA af denne mutant, var forskellig fra den, der blev fremkaldt af ADAAD af vildtypen. CD-spektret af MYC DNA i nærværelse af det mutante protein havde en positiv 210 nm peak og en negativ 260 nm peak (Figur 1D).
ADAAD fremkalder A-form for kropsbygning i DROSHA promotor
Initiativtagerregionerne DROSHA, DGCR8 og DICER blev også analyseret af QGRS-mapper og Mfold-software. Både QGRS og MFold viste, at promotorregionerne har potentiale til at danne G-quadruplex- og stilklignende strukturer (tabel 2). De Mfoldede strukturer i de fremadrettede og omvendte oligonukleotider er vist i figur 3A,B. ATPase-aktiviteten viste, at det indfødte og varmekølede DNA opførte sig på samme måde. Derfor blev den langsomt afkølede form af disse DNA-sekvenser brugt til cd-undersøgelser. Cd-spektret viste, at ADAAD fremkalder et negativt højdepunkt på 210 nm og et positivt højdepunkt på 260 nm i DROSHA-promotoren (Figur 3C). Dette spektrum er karakteristisk for A-DNA6.
ADAAD fremkalder BX-overgang og G-quadruplex-dannelse i DGCR8-initiativtageren
De Mfoldede strukturer af de fremadrettede og de omvendte tråde af de anvendte oligonuleotider er vist i figur 4A,B. Der blev observeret et positivt højdepunkt på 210 nm og et bredt negativt højdepunkt på 260 nm for DGCR8 par 1 (figur 4C). Dette spektrum er karakteristisk for BX overgang6. De Mfoldede strukturer af de fremadrettede og de omvendte tråde af de anvendte oligonuleotider er vist i figur 4D,E. CD-spektret af DGCR8 par 7 viste en stærk positiv top på 210 og 270 nm og en negativ top på 250 nm (Figur 4F). Dette spektrum er karakteristisk for parallelle G-quadruplex DNA-strukturer6.
ADAAD inducerer A-X overgang i DICER promotor
Mfold-strukturerne for de fremadrettede og omvendte oligonukleotider er vist i figur 5A,B. Der blev observeret et positivt højdepunkt på 210 nm og to negative toppe-den ene ved 230 nm og den anden ved 260 nm peak-the dicer-par 1 (figur 5C). Disse toppe er karakteristiske for AX DNA-overgang6,9. Alle CD-spektretoppene og de former for DNA, der har specifikke roller i transskriptionsprocessen, er sammenfattet i tabel 3.
Figur 1: ADAAD ændrer kropsbygning af GECE DNA. Mfold strukturer blev forudsagt for (A) fremad streng og (B) omvendt streng. (C) CD-spektre af GECE alene (sort), GECE inkuberet med ATP og ADAAD før (rød) og efter tilsætning af EDTA (blå). (D) CD-spektre af GECE inkuberet med ATP og GST-mærket ADAAD før (sort) og efter tilsætning af EDTA (rød) samt CD-spektre af GECE inkuberet med ATP og GST-mærket K241A mutant (blå). Dette tal er blevet ændret fra 29. Forkortelser: ADAAD = Active DNA-afhængige ATPase A-domæne; CD = cirkulær dichroisme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: ADAAD ændrer kropsbygning af slDNA. (A) Mfold struktur forudsagt for stilken-loop DNA. (B) CD-spektre af slDNA alene (sort), slDNA inkuberet med ATP og ADAAD (rød). Dette tal er blevet ændret fra 29. Forkortelser: ADAAD = Active DNA-afhængige ATPase A-domæne; slDNA = stem-loop DNA; CD = cirkulær dichroisme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: ADAAD ændrer kropsbygning af DROSHA par 5 DNA. Mfold struktur forudsagt for (A) fremad streng og (B) omvendt streng. (C) CD-spektre af DROSHA par 5 DNA alene (sort), DROSHA par 5 DNA inkuberet med ATP og ADAAD (rød). Dette tal er blevet ændret fra 28. Forkortelser: ADAAD = Active DNA-afhængige ATPase A-domæne; CD = cirkulær dichroisme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: ADAAD ændrer overensstemmelsen af DGCR8 par 1 og 7 DNA. Mfold strukturer forudsagt for (A) fremad streng og (B) omvendt streng DGCR8 par 1 oligonukleotid. C) CD-spektre af DGCR8 par 1 alene (sort), DGCR8 par 1 inkuberet med ATP og ADAAD (rød). Mfold strukturer forudsagt for (D) fremad streng og (E) omvendt streng dgCR8 par 7 oligonukleotid. f) CD-spektre af DGCR8 par 7 alene (sort), DGCR8 par 7 inkuberet med ATP og ADAAD (rød). Dette tal er blevet ændret fra 28. Forkortelser: ADAAD = Active DNA-afhængige ATPase A-domæne; CD = cirkulær dichroisme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ADAAD ændrer overensstemmelsen mellem DICER par 1 DNA. Mfold struktur forudsagt for (A) fremad streng og (B) omvendt streng af DICER par 1 oligonukleotid. (C) CD-spektre af DICER par 1 alene (sort), DICER par 1 inkuberet med ATP og ADAAD (rød). Dette tal er blevet ændret fra 28. Forkortelser: ADAAD = Active DNA-afhængige ATPase A-domæne; CD = cirkulær dichroisme. Klik her for at se en større version af dette tal.
| 5x REG-buffer | |
| Komponent | Koncentration af arbejde |
| Laktatdehydrogenase (LDH) | 50 enheder/mL |
| Magnesiumacetat (Mg(OAc)2) | 30 mM |
| Fosfoenolpyruvat (PEP) | 6,8 mg/mL |
| Pottasiumacetat (KOAc) | 300 mM |
| Pyruvat kinase (PK) | 50 enheder/mL |
| Trisacetat (Tris-OAc) | 125 mM |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | 25 mM |
Tabel 1: Bufferkomponenter.
| Oligonucleotides | Fremadrettet rækkefølge | ΔG (m-Fold) Kcal/mol | G-score (QGRS mapper) | Omvendt rækkefølge | ΔG kcal/mol (Mfold forudsigelse) | G-score (QGRS mapper) | |||
| slDNA | GCGCAATTGCGCTCGA CGATTTTTTAGCGCAA TTGCGC |
-16.36 | - | - | - | - | |||
| MYC GECE | CGCGCGTGGCGTGG CGGTGGGCGCA GTGCGTT |
-8.64 | 19 | AACGCACTGCGCGCC CACCGCCACGCCA CGCGCG |
-5.74 | - | |||
| DROSHA-par 5 | GGCCAGGCACGGTG GCTTATGCCTGTAAT CCCAGCCCTTTGGGA GGCTGAGGCAGG |
-10.18 | 19, 19 | CCTGCCTCAGCCTCC CAAAGGGCTGGGATT ACAGGCATAAGCCAC CGTGCCTGGCC |
-10.95 | - | |||
| DGCR8 Par 1 | GCCACCGTGCCCGG CCGAACCACCGTGC CCGGCCGAACCC |
-7.9 | - | GGGTTCGGCCGGG CACGGTGGTTCGG CCGGGCACGGTGGC |
-9.4 | 21 | |||
| DGCR8 Par 7 | TCATACTGCCGCTG GGTTGGGCGGGAG GCTGCAGCGGGAG |
-7.99 | 33 | TCCCGCTGCAGCCT CCCGCCCAACCCAG CGGCAGTATGAC |
-5.43 | - | |||
| DICER Par 1 | AAGTGCTCAGGAG CCATGTGGGGCTG GTGGCCCCAAACTG |
-8.82 | 19 | CAGTTTGGGGCCAC CAGCCCCACATGGC TCCTGAGCACTT |
-9.16 | - | |||
Tabel 2: Oligonucleotid sekvenser. Alle sekvenser er i 5'-3'-retningen. Forkortelser: slDNA = stem-loop DNA.
| Oligonucleotides | CD Spectra Peaks i nm (Efter inkubation med ATP og ADAAD) | Form af DNA | Rolle i transskription |
| slDNA | +215, +250, +272 | Triplex | Undertrykkelse |
| MYC GECE | +210, +258, +269 | Triplex | Undertrykkelse |
| DROSHA-par 5 | -210, +260 | A-DNA | Indledning/aktivering |
| DGCR8 Par 1 | +210,-260 | BX-overgang | Positiv superkoiling/aktivering |
| DGCR8 Par 7 | +210, -250, +270 | G-quadruplex | Aktivering |
| DICER Par 1 | +210, -230, -257 | AX-overgang | Positiv superkoiling/aktivering |
Tabel 3: CD-spektre peak svarende til forskellige former for DNA med deres rolle i transskription. Forkortelser: ADAAD = Active DNA-afhængige ATPase A-domæne; CD = cirkulær dichroisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne artikel er at introducere CD-spektroskopiteknikken som en metode til at studere de kropslige ændringer, der forekommer i DNA'et i nærværelse af ATP-afhængige kromatin-remodelingproteiner, og at knytte disse kropslige ændringer til genekspression. CD-spektroskopi giver en hurtig og let tilgængelig metode til at studere de kropslige ændringer i DNA.
Et afgørende punkt, der skal overvejes for denne teknik, er renheden af DNA og protein. Det er tilrådeligt at sikre, at både DNA og protein er >95% ren. SIDErensede oligonukleotider skal anvendes i analysen, og proteinet skal helst affinitetsrenseres for at >95% renhed. Den anden kritiske parameter er, at cuvette skal være ren, således at baseline læsning ikke overstiger 1 mdeg. Bufferne skal laves ved hjælp af autoklavet vand, og bufferens baselineaflæsning må ikke overstige 1 mdeg. For at studere promotorens kropsbygning er det vigtigt at identificere de regioner, hvor proteinet binder sig. Derfor er det tilrådeligt at udføre ChIP-eksperimenter ved hjælp af proteinet af interesse, da denne proces hjælper med at identificere DNA-sekvenser, der er til stede i promotorregionen af effektorgen bundet af proteinet. Når regionen er identificeret, kan sekvensens evne til at vedtage specifikke strukturer analyseres ved hjælp af tilgængelige bioinformatikværktøjer. Dette er vigtigt, da ChIP primere er normalt 200 bp lang og kan have flere konformationer. Derfor vil brug af bioinformatikværktøjer til at identificere strukturerne bidrage til at forkorte længden af oligonuleotid til én struktur.
Endelig, hvis proteinet af interesse er en ATP-afhængige kromatin remodeling protein, evne til oligonukleotider til at fungere som en effektor skal kontrolleres ved hjælp af ATPase assays. I både CD-spektroskopi og ATPase-analyser skal det sikres, at der anvendes mættende koncentrationer af ligands i reaktionen. Hvis det er muligt, skal dissociationskonstanten (Kd) for protein-ligand-interaktionen beregnes, før cd-spektroskopi fortsættes. Der findes mange metoder til beregning af bindingsparameteren. Ved hjælp af ATPase-analyser kan Michaelis-Menten-konstanten (KM) beregnes ved at titrere stigende koncentrationer af DNA. KM kan i mange tilfælde tilnærmes bindingskonstanten. Hvis proteinet er fluorescerende, kan bindingskonstanter beregnes ved hjælp af fluorescensspektroskopi. Hvis ingen af disse teknikker er mulige, kan elektroforese mobilitetsskifte assay (EMSA) anvendes.
Hovedproblemet med CD-spektroskopi opstår, når cuvetterne ikke rengøres, eller når reagenserne er urene. Hvis baseline er for høj, er det tilrådeligt at rengøre cuvettes. Der findes mange cuvetterensningsløsninger. Placering af cuvettes i en fortyndet syreopløsning i 16-24 timer hjælper også med at rense cuvette. Det er tilrådeligt at købe reagenser, der er >95% rene og at bruge dobbeltdestilleret og autoklavet vand. Baseline drift er et andet potentielt problem. Hvis du udfører et langsigtet eksperiment, er det tilrådeligt at regelmæssigt kontrollere baseline. Toppene af DNA, når man studerer protein-DNA interaktioner kan ikke ligefrem svarer til toppe / bands opnået med DNA alene. Proteintoppe observeres normalt i Langt UV-området mellem 190 og 230 nm. Derfor kan toppe under 250 nm have interferens fra proteintoppen og giver muligvis ikke pålidelige oplysninger. DNA kan vedtage en række ikke-B-konformationer afhængigt af sekvensen. Jo længere DNA-sekvensen er, jo større er chancen for, at der findes flere konformationer i DNA-oligonuleotid. Dette kan gøre analysen vanskelig. Derfor er det tilrådeligt at bruge kortere oligonukleotider svarende til de potentielle strukturer forudsagt af de bioinformatiske værktøjer.
Den anden store ulempe ved CD-spektroskopi er, at det ikke giver mulighed for atomare strukturanalyse, og det opnåede spektrum er utilstrækkeligt til at identificere den eneste levedygtige struktur. For eksempel giver både røntgenkrystallografi og protein NMR-spektroskopi data om atomopløsning, mens CD-spektroskopi giver mindre detaljerede strukturelle oplysninger. Cd-spektroskopi er imidlertid en hurtig tilgang, der ikke kræver store mængder proteiner eller betydelig databehandling. Som et resultat, CD kan bruges til at undersøge en bred vifte af opløsningsmiddel variabler såsom temperatur, pH, saltholdighed, og tilstedeværelsen af forskellige cofaktorer. Det kan også bruges til at overvåge strukturelle ændringer (på grund af kompleks dannelse, foldning / udfoldelse, denaturering på grund af temperatur, denaturanter, og ændringer i aminosyre sekvens / mutation) i dynamiske systemer. Ved at forbinde det til stop-flow apparatet, det kan også bruges til at studere kinetikken af protein / DNA-ligand interaktioner.
Velkarakteriseret DNA-konforme omfatter A / B / Z DNA, triplex, hårnål, og G-quadruplexes. Alle disse former for DNA er forbundet med en åben DNA-kropsbygning, dvs. afvikle DNA, der tjener som vasken for negativ supercoiling. Transskription er forbundet med negativ supercoiling, da dannelsen af et åbent kompleks er en forudsætning for bevægelse af RNA polymerase. Derfor indebærer transskription af de fleste gener øget negativ supercoiling i promotorregionen. Undersøgelser har vist, at nukleosom udfoldelse fører til A-DNA kropsbygning, som dog er ustabil39. En mulighed er, at det interesseprotein, f.eks. SMARCAL1, binder sig til sådanne strukturer og stabiliserer dem, hvilket letter transskriptionen, som det ses i tilfældet med DROSHA-initiativtagere. Guanine quadruplex er baseret på guanine tetrads bundet af Hoogsteen hydrogenbindinger. I silico analyse har bekræftet, at G4-dannende sekvenser er især beriget proksimale til gen initiativtagere og på transskription start sites. Disse G4-sekvenser kan både aktivere og undertrykke transskription.
I tilfælde af MYC promotor40 fungerer dannelsen af G-quadruplex som et repressor, mens G-quadruplex-strukturen i tilfælde af menneskelig vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) fungerer som dockingsted for transskriptionsfaktorer41 og aktiverer dermed udtrykket af dette gen. For SMARCAL1's vedkommende blev G-quadruplex-strukturen observeret, da ADAAD interagerede med DGCR8-par 7-promotorsekvenser. Da belægningen af SMARCAL1 og RNAPII steg på dette primerpar, er det hypotese, at dannelsen af G-quadruplex i dette tilfælde korrelerer med transskriptionaktivering af dette gen. DNA kan også være positivt supercoiled, og udviklingen af RNA polymerase er kendt for at generere positiv supercoiling foran det. Denne transskription-genereret (+) superkoiling kan forstyrre eller fjerne vej-blok proteiner, destabiliserende nukleosom strukturer for at gøre DNA mere tilgængelig for RNA polymerase. X-DNA er en kropsbygning af DNA, der fungerer som dræn for positiv supercoiling. Det slående træk ved et X-DNA er, at det kan dannes på en sekvensspecifik måde på promotoren af et gen. For SMARCAL1's vedkommende fremkaldte ADAAD AX- og B-X-overgange på en ATP-afhængig måde i henholdsvis DICER- og DGCR8-initiativtagerne. Kombineret med in vivo-data, hvor øget SMARCAL1 og RNAPII belægning blev fundet på disse initiativtagere i nærværelse af doxorubicin-induceret DNA-skade, kan det være en hypotese, at X-DNA dannelse letter transskription ved at fjerne barrierer / blokke. Triple DNA-helices har ikke et karakteristisk spektrum. CD-spektret af DNA-sekvenserne, der findes i MYC-promotoren og det syntetiske stem-loop DNA, viste to positive toppe-en ved 258 nm med en skulder ved 269 nm og en større top ved 210 nm i DNA'et. Denne type spektrum kan opnås i tilfælde af triplexes37. Triplexes er vanskelige at slappe af og er derfor kendt for at blokere transskription42. Derfor er det en hypotese, at dannelsen af denne struktur i c-MYC promotor af SMARCAL1 fører til undertrykkelse af transskription.
Det skal bemærkes, at ATP også binder sig til ATP-afhængige kromatin remodeling proteiner. Den bevarede arginin, der er til stede i motivet VI for disse proteiners helicasedomæne, interagerer via elektrostatiske interaktioner med proteinets γ-fosfat43. I tilfælde af ADAAD er KD af protein-ATP interaktion (1,5 ± 0,1) × 10-6 M38. Bindingen af ATP fremkalder en kropsbygningsændring i proteinet, således at DNA'ets affinitet øges. Bindingen af DNA fremkalder også en kropsbygningsændring i proteinet, hvilket fører til en øget 10-dobling affinitet for ATP31. For eksempel observeres bånd/toppe ved -212 nm og -222 nm for ADAAD. ATP giver også bånd ved 197 nm, +210 nm, -222 nm, -247 nm og -270 nm. Disse skal trækkes fra dna+ADAAD + ATP's spektre for at opnå "netto"-kropsbygning af DNA'et i ligandernes tilstedeværelse.
Således viser dette papir bekvemmeligheden af CD-spektroskopi til studiet af de kropslige ændringer, der forekommer i DNA'et i nærværelse af ATP-afhængige kromatin remodeling proteiner. Korrelere ændringerne i DNA-kropsbygning med ChIP data kan give efterforskerne oplysninger om, hvordan DNA-conformers aktivere / undertrykke transskription.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Advanced Instrumentation Research Facility, JNU, for CD spektrofotometer. V.J. og A.D. blev støttet af et stipendium fra CSIR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher scientific | O3446I-100 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigmaaldrich | A2383 | |
| CD Quartz Cuvette | STARNA | 21-Q-1 | |
| Chirascan V100 CD spectrometer | Applied Photophysics | Not available | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | SRL | 43272 | |
| Glutathione Sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | Glutathione affinity chromatography |
| Hellmanex III cleaning solution | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
| L-Lactic Dehydrogenase | Sigmaaldrich | L2625 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher scientific | BP215-500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher scientific | M33-500 | |
| NADH disodium salt | Sigmaaldrich | 10107735001 | |
| Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt | SRL | 40083 | |
| Potassium Acetate | Fisher scientific | P178-3 | |
| Pyruvate Kinase | Sigmaaldrich | P1506 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher scientific | S374-500 | |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher scientific | S369-500 | |
| Synergy HT microplate reader | BioTek | Not available | |
| Tris Base | Fisher scientific | BP152-500 |
References
- Woody, R. W.
- Kelly, S., Price, N. The Use of Circular Dichroism in the Investigation of Protein Structure and Function. Current Protein & Peptide Science. 1 (4), 349-384 (2000).
- Rodger, A., Marshall, D. Beginners guide to circular dichroism. The Biochemist. 43 (2), 58-64 (2021).
- Greenfield, N. J. Using circular dichroism spectra to estimate protein secondary structure. Nature Protocols. 1 (6), 2876-2890 (2006).
- Kypr, J., Kejnovská, I., Bednářová, K., Vorlíčková, M. Circular Dichroism Spectroscopy of Nucleic Acids. Comprehensive Chiroptical Spectroscopy. , 575-586 (2012).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Miyahara, T., Nakatsuji, H., Sugiyama, H. Helical Structure and Circular Dichroism Spectra of DNA: A Theoretical Study. The Journal of Physical Chemistry A. 117 (1), 42-55 (2013).
- Khomyakova, E. B. Parallel intramolecular DNA triple helix with G and T bases in the third strand stabilized by Zn2+ ions. Nucleic Acids Research. 28 (18), 3511-3516 (2000).
- Kypr, J., et al. The unusual X-form DNA in oligodeoxynucleotides: dependence of stability on the base sequence and length. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 13 (6), 999-1006 (1996).
- Zohoorian-Abootorabi, T., Sanee, H., Iranfar, H., Saberi, M. R., Chamani, J. Separate and simultaneous binding effects through a non-cooperative behavior between cyclophosphamide hydrochloride and fluoxymesterone upon interaction with human serum albumin: multi-spectroscopic and molecular modeling approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 88, 177-191 (2012).
- Sharifi-Rad, A., Mehrzad, J., Darroudi, M., Saberi, M. R., Chamani, J. Oil-in-water nanoemulsions comprising Berberine in olive oil: biological activities, binding mechanisms to human serum albumin or holo-transferrin and QMMD simulations. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (3), 1029-1043 (2021).
- Mokaberi, P., Babayan-Mashhadi, F., Amiri Tehrani Zadeh, Z., Saberi, M. R., Chamani, J. Analysis of the interaction behavior between Nano-Curcumin and two human serum proteins: combining spectroscopy and molecular stimulation to understand protein-protein interaction. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 39 (9), 3358-3377 (2021).
- Danesh, N., et al. Determining the binding site and binding affinity of estradiol to human serum albumin and holo-transferrin: fluorescence spectroscopic, isothermal titration calorimetry and molecular modeling approaches. Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. 36 (7), 1747-1763 (2018).
- Sadeghzadeh, F., et al. Characterizing the binding of angiotensin converting enzyme I inhibitory peptide to human hemoglobin: influence of electromagnetic fields. Protein and Peptide Letters. 27 (10), 1007-1021 (2020).
- Chamani, J., et al. Cooperative alpha-helix formation of beta-lactoglobulin induced by sodium n-alkyl sulfates. Journal of Colloid and Interface Science. 293 (1), 52-60 (2006).
- Dareini, M., et al. A novel view of the separate and simultaneous binding effects of docetaxel and anastrozole with calf thymus DNA: Experimental and in silico approaches. Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 228, 117528 (2020).
- Dehghani Sani, F., et al. Changes in binding affinity between ofloxacin and calf thymus DNA in the presence of histone H1: Spectroscopic and molecular modeling investigations. Journal of Luminescence. 203, 599-608 (2018).
- Hargreaves, D. C., Crabtree, G. R. ATP-dependent chromatin remodeling: genetics, genomics and mechanisms. Cell Research. 21 (3), 396-420 (2011).
- Morettini, S., Podhraski, V., Lusser, A. ATP-dependent chromatin remodeling enzymes and their various roles in cell cycle control. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 5522-5532 (2008).
- Flaus, A., Martin, D. M. A., Barton, G. J., Owen-Hughes, T. Identification of multiple distinct Snf2 subfamilies with conserved structural motifs. Nucleic Acids Research. 34 (10), 2887-2905 (2006).
- Flaus, A., Owen-Hughes, T. Mechanisms for ATP-dependent chromatin remodelling: the means to the end. The FEBS Journal. 278 (19), 3579-3595 (2011).
- Mizuguchi, G., et al. ATP-driven exchange of histone H2AZ variant catalyzed by SWR1 chromatin remodeling complex. Science. 303 (5656), New York, N.Y. 343-348 (2004).
- Elizondo, L. I., et al. Schimke immuno-osseous dysplasia: SMARCAL1 loss-of-function and phenotypic correlation. Journal of Medical Genetics. 46 (1), 49-59 (2009).
- Baradaran-Heravi, A., et al. SMARCAL1 deficiency predisposes to non-Hodgkin lymphoma and hypersensitivity to genotoxic agents in vivo. American Journal of Medical Genetics. Part A. 158 (9), 2204-2213 (2012).
- Bansal, R., et al. SMARCAL1, the annealing helicase and the transcriptional co-regulator. IUBMB life. 72 (10), 2080-2096 (2020).
- Yusufzai, T., Kadonaga, J. T. HARP is an ATP-driven annealing helicase. Science. 322 (5902), New York, N.Y. 748-750 (2008).
- Yusufzai, T., Kong, X., Yokomori, K., Kadonaga, J. T. The annealing helicase HARP is recruited to DNA repair sites via an interaction with RPA. Genes & Development. 23 (20), 2400-2404 (2009).
- Patne, K., et al. BRG1 and SMARCAL1 transcriptionally co-regulate DROSHA, DGCR8 and DICER in response to doxorubicin-induced DNA damage. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (9), 936-951 (2017).
- Sharma, T., Bansal, R., Haokip, D. T., Goel, I., Muthuswami, R. SMARCAL1 negatively regulates c-Myc transcription by altering the conformation of the promoter region. Scientific Reports. 5, 17910 (2015).
- Muthuswami, R., Truman, P. A., Mesner, L. D., Hockensmith, J. W. A eukaryotic SWI2/SNF2 domain, an exquisite detector of double-stranded to single-stranded DNA transition elements. The Journal of Biological Chemistry. 275 (11), 7648-7655 (2000).
- Nongkhlaw, M., Dutta, P., Hockensmith, J. W., Komath, S. S., Muthuswami, R. Elucidating the mechanism of DNA-dependent ATP hydrolysis mediated by DNA-dependent ATPase A, a member of the SWI2/SNF2 protein family. Nucleic Acids Research. 37 (10), 3332-3341 (2009).
- Kikin, O., D'Antonio, L., Bagga, P. S. QGRS Mapper: a web-based server for predicting G-quadruplexes in nucleotide sequences. Nucleic Acids Research. 34, 676-682 (2006).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Gupta, M., et al. Ligand-induced conformation changes drive ATP hydrolysis and function in SMARCAL1. The FEBS Journal. 282 (19), 3841-3859 (2015).
- Dutta, P., et al. Global epigenetic changes induced by SWI2/SNF2 inhibitors characterize neomycin-resistant mammalian cells. PloS One. 7 (11), 49822 (2012).
- Muthuswami, R., et al. Phosphoaminoglycosides inhibit SWI2/SNF2 family DNA-dependent molecular motor domains. Biochemistry. 39 (15), 4358-4365 (2000).
- Gondeau, C. Circular dichroism and UV melting studies on formation of an intramolecular triplex containing parallel T*A:T and G*G:C triplets: netropsin complexation with the triplex. Nucleic Acids Research. 26 (21), 4996-5003 (1998).
- Nongkhlaw, M., Gupta, M., Komath, S. S., Muthuswami, R. Motifs Q and I are required for ATP hydrolysis but not for ATP binding in SWI2/SNF2 proteins. Biochemistry. 51 (18), 3711-3722 (2012).
- Luchnik, A. N. DNA conformational transitions induced by supercoiling control transcription in chromatin. Gene Regulation and Systems Biology. 8, 89-96 (2014).
- Siddiqui-Jain, A., Grand, C. L., Bearss, D. J., Hurley, L. H. Direct evidence for a G-quadruplex in a promoter region and its targeting with a small molecule to repress c-MYC transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11593-11598 (2002).
- Uribe, D. J., Guo, K., Shin, Y. -J., Sun, D. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K and nucleolin as transcriptional activators of the vascular endothelial growth factor promoter through interaction with secondary DNA structures. Biochemistry. 50 (18), 3796-3806 (2011).
- Young, S. L., Krawczyk, S. H., Matteucci, M. D., Toole, J. J. Triple helix formation inhibits transcription elongation in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (22), 10023-10026 (1991).
- Dürr, H., Flaus, A., Owen-Hughes, T., Hopfner, K. -P. Snf2 family ATPases and DExx box helicases: differences and unifying concepts from high-resolution crystal structures. Nucleic Acids Research. 34 (15), 4160-4167 (2006).
