Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية

Published: December 21, 2021 doi: 10.3791/63177
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

يعتمد التطور المبكر على المنتجات الموروثة من الأم ، ودور العديد من هذه المنتجات غير معروف حاليا. في هذا الصدد، وصفنا بروتوكولا يستخدم تقنية كريسبر-كاس9 لتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي في جيل واحد.

Abstract

يعتمد التطور المبكر على مجموعة من العوامل الأمومية المدمجة في البويضة الناضجة أثناء تكوين البويضات والتي تؤدي جميع الوظائف الخلوية اللازمة للتنمية حتى تنشيط الجينوم الوجنتي. وعادة ما يتطلب الاستهداف الجيني لهذه العوامل الأمومية جيلا إضافيا لتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي، مما يعوق القدرة على تحديد دور الجينات المعبر عنها من قبل الأم أثناء النمو. وقد سمح اكتشاف قدرات التحرير ثنائي الأليليك ل CRISPR-Cas9 بفحص الأنماط الظاهرية الجنينية في الأنسجة الجسدية للأجنة المحقونة أو "المقرمشة"، مما زاد من فهم الدور الذي تلعبه الجينات المعبر عنها وzygotic في البرامج التنموية. توضح هذه المقالة بروتوكولا يعد امتدادا للطريقة المقرمشة. في هذه الطريقة ، يسمح التحرير الثنائي للخلايا الجرثومية بعزل النمط الظاهري للأمهات في جيل واحد ، أو "المقرمشات الأمومية ". يعزز الحمض النووي الريبي الموجه متعدد الإرسال إلى هدف واحد الإنتاج الفعال للهشطات النفاسية للأمهات ، في حين يوفر تحليل تسلسل الحوافر المقرمشة للأمهات طريقة بسيطة لتأكيد الآفات الوراثية التي تنتج نمطا ظاهريا للأمهات. ويدعم استخدام المقرمشات النفاسية للأمهات التحديد السريع للجينات الأساسية المعبر عنها من قبل الأم، مما يسهل فهم التطور المبكر.

Introduction

مجموعة من المنتجات المودعة من الأم (على سبيل المثال ، الحمض النووي الريبي والبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى) ضرورية لجميع العمليات الخلوية المبكرة حتى يتم تنشيط الجينوم الوجني للجنين1. عادة ما يكون النضوب المبكر لهذه المنتجات من البويضة قاتلا جنينيا. على الرغم من أهمية هذه الجينات في التطور ، فإن دور العديد من الجينات المعبر عنها من قبل الأم غير معروف حاليا. يتيح التقدم في تكنولوجيا تحرير الجينات في أسماك الزرد ، مثل CRISPR-Cas9 ، استهداف الجينات المعبر عنها من الأم2،3،4. ومع ذلك ، فإن تحديد النمط الظاهري للتأثير الأمومي يتطلب جيلا إضافيا عند مقارنته بالنمط الظاهري الوجني ، مما يتطلب المزيد من الموارد. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام قدرة التحرير ثنائي الأليليك ل CRISPR-Cas9 لفحص الأنماط الظاهرية الجنينية في الأنسجة الجسدية للأجنة المحقونة (F0) ، والمعروفة باسم "المقرمشات"5،6،7،8،9،10. تسمح تقنية الهش بإجراء فحص فعال للموارد للجينات المرشحة في الخلايا الجسدية ، مما يسهل فهم جوانب محددة في التنمية. يسمح البروتوكول الموصوف في هذه الورقة بتحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي ، أو "المقرمشات الأمومية "، في جيل واحد11. يمكن تحقيق هذا المخطط عن طريق توجيه الحمض النووي الريبي المتعدد إلى جين واحد وتعزيز أحداث التحرير ثنائي الأليل في الخط الجرثومي. يمكن تحديد هذه الأجنة المقرمشة للأمهات بواسطة الأنماط الظاهرية المورفولوجية الإجمالية وتخضع للتوصيف الأولي ، مثل وضع العلامات على حدود الخلايا ونمط الحمض النووي11. يسمح التحليل المشترك للنمط الظاهري الذي يمكن ملاحظته والتوصيف الجزيئي الأساسي ل INDELs المستحثة بالتنبؤ بدور الجين المستهدف في التطور المبكر.

في أسماك الزرد ، خلال أول 24 ساعة بعد الإخصاب (hpf) ، تتطور مجموعة صغيرة من الخلايا إلى الخلايا الجرثومية البدائية ، وهي مقدمة للخط الجرثومي12،13،14،15. في البراثن التي وضعتها إناث F0 ، تعتمد نسبة الأجنة المقرمشة للأمهات التي تم استردادها على عدد الخلايا الجرثومية التي تحتوي على حدث تحرير ثنائي الأليليك في الجين المستهدف. بشكل عام ، كلما حدث التحرير في وقت مبكر في الجنين ، زاد احتمال ملاحظة طفرات CRISPR-Cas9 في الخط الجرثومي. في معظم الحالات ، تأتي الأنماط الظاهرية للأجنة المقرمشة للأمهات من فقدان الوظيفة في أليلين أموميين موجودين في البويضة النامية. عندما تنتهي البويضة من الانقسام الاختزالي ، يتم بثق أحد أليلات الأم من الجنين عبر الجسم القطبي ، بينما يتم دمج الأليل الآخر في نواة الأم. سيمثل تسلسل العديد من الفرديات المقرمشة للأمهات خليطا من الطفرات (عمليات الإدراج و / أو الحذف (INDELs)) الموجودة في الخط الجرثومي التي تساهم في النمط الظاهري11.

يصف البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لإنشاء طفرات CRISPR-Cas9 في جينات تأثير الأم وتحديد النمط الظاهري المقابل باستخدام نهج هش للأمهات (الشكل 1). سيشرح القسم الأول كيفية تصميم وإنشاء الحمض النووي الريبي الإرشادي بشكل فعال ، في حين يحتوي القسمان الثاني والثالث على خطوات حاسمة لإنشاء مقرمشات الأمهات عن طريق الحقن المجهري. بعد حقن خليط CRISPR-Cas9 ، يتم فحص الأجنة المحقونة للتعديلات الجسدية عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (القسم الرابع). بمجرد أن تتطور أجنة F0 المحقونة وتصل إلى مرحلة النضج الجنسي ، يتم عبور إناث F0 إلى ذكور من النوع البري ، ويتم فحص ذريتهم بحثا عن الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي (القسم الخامس). يتضمن القسم السادس تعليمات حول صنع المفردات المقرمشة للأمهات التي يمكن دمجها مع تسلسل Sanger لتحديد INDELs التي يسببها CRISPR-Cas9. وبالإضافة إلى ذلك، تتضمن المناقشة تعديلات يمكن إدخالها على البروتوكول لزيادة حساسية هذه الطريقة وقوتها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

في الدراسات التي أدت إلى تطوير هذا البروتوكول ، تمت الموافقة على جميع مساكن أسماك الزرد والتجارب من قبل لجنة جامعة ويسكونسن ماديسون المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC-M005268-R2).

1. توليف الحمض النووي الريبي الإرشادي

ملاحظة: تم إنشاء مقرمشات zygotic باستخدام الحمض النووي الريبي دليل واحد أو تعدد إرسال الحمض النووي الريبي دليل متعدد إلى هدف واحد5،6،7،8،9،10. يزيد تعدد إرسال الحمض النووي الريبي الإرشادي من النسبة المئوية للأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا مقرمشا وموجوتا10. بسبب هذا التردد المتزايد للأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا ، يتم إنشاء المقرمشات الأمومية عن طريق تعدد الإرسال أربعة RNAs موجهة إلى جين واحد. يمكن العثور على بروتوكول أكثر تفصيلا حول استخدام CHOPCHOP لتصميم الحمض النووي الريبي الموجه وطريقة التلدين لتوليف الحمض النووي الريبي الإرشادي لأسماك الزرد في مكان آخر16،17،18،19،20.

  1. لتحديد جين معبر عنه من الأم لاستهدافه ، تأكد من مستويات نسخ mRNA أثناء التطوير عبر قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي التي توفر معلومات النسخ من الزيجوت إلى 5 أيام21. بشكل عام ، يتم التعبير عن الجينات الخاصة بالأم بشكل كبير في الجنين المبكر وتتحلل بعد تنشيط الجينوم الوجني22.
  2. بمجرد تحديد الجين المستهدف الذي تم التعبير عنه من قبل الأم ، حدد أول مجال بروتين متوقع باستخدام قسم "المجالات والميزات" المتاح على متصفح جينوم Ensembl23. استخدم هذا المجال كمنطقة مستهدفة للحمض النووي الريبي الإرشادي الأربعة.
  3. استخدم برنامج اختيار الحمض النووي الريبي CHOPCHOP لتحديد أربعة مواقع مستهدفة للحمض النووي الريبي في أول مجال نشط. تصميم أوليغونوكليوتيدات خاصة بالجينات، كما هو موضح أدناه لكل موقع مستهدف. في oligonucleotide الخاص بالجين ، يتوافق قسم N20 مع التسلسل المستهدف مطروحا منه موقع PAM (NGG) من CHOPCHOP. رتب هذه الأوليغنوكليوتيدات الخاصة بالجينات وقلة النوكليوتيد الثابتة باستخدام تنقية الملح القياسية (انظر جدول المواد).
    قلة النوكليوتيد الخاصة بالجينات:
    5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
  4. لإنشاء قالب RNA إرشادي لكل أوليغونوكليوتيد خاص بالجين ، قم بصلبه إلى oligonucleotide الثابت واملأ المعلقات ببوليميراز T4-DNA كما هو موضح سابقا16. بعد تجميع قوالب الحمض النووي الريبي الإرشادية الأربعة، قم بتنقيتها وتركيزها معا باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي ومجموعة المكثفات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  5. قم بتوليف خليط sgRNA من قالب الحمض النووي الريبي الإرشادي المجمع باستخدام مجموعة نسخ T7 في المختبر (انظر جدول المواد). قم بإجراء النسخ في المختبر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن أن يؤدي استخدام نصف تفاعلات مجموعة T7 Transcription إلى تقليل التكلفة لكل تفاعل.
  6. بعد تخليق الحمض النووي الريبي ، قم بتنقية المجموعة الناتجة من sgRNAs باستخدام بروتوكول خلات الإيثانول / الأمونيوم كما هو موضح سابقا16،20،24. بعد عزل الحمض النووي الريبي، أعد تعليقه في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. إذا تم استخدام نصف تفاعلات مجموعة النسخ T7 لنسخ مجموعة sgRNAs ، فأعد تعليق الحمض النووي الريبي النقي إلى 10-15 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
  7. حدد كمية sgRNAs المجمعة التي تم إنشاؤها باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتخفيف تجمع sgRNAs في المياه الخالية من النوكليز إلى تخفيف 1500 نانوغرام / ميكرولتر ± 500 نانوغرام / ميكرولتر.
  8. بعد تحديد تركيز تجمع sgRNAs ، تحقق من سلامة sgRNAs على هلام الأغاروز بنسبة 1٪.
    1. يلقي 1٪ من الأغاروز / 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم / جل TBE. بمجرد أن يتصلب الجل ، ضعه في مخزن TBE قيد التشغيل.
    2. امزج 1 ميكرولتر من خليط sgRNA و 1 ميكرولتر من مخزن مؤقت لتحميل هلام الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد). قم بتحميل هذه العينة في الجل وقم بتشغيل الجل على 100 فولت لمدة 5 دقائق.
  9. تصور الأشرطة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV). يجب أن تظهر مجموعة sgRNAs كنطاق واحد. إذا لوحظت مسحة ، فمن المحتمل أن يحدث تحلل الحمض النووي الريبي.
  10. قم بتخزين مجموعة sgRNAs في أليكوتس 1 ميكرولتر للاستخدام الواحد في أنابيب شريط PCR خالية من النوكليز في الفريزر -80 درجة مئوية. بالنسبة للكميات الكبيرة من خليط sgRNAs (30 ميكرولتر أو أكثر) ، قم بإدخال نصف الحجم في أنابيب شريط PCR الخالية من النوكليز وتخزين النصف الآخر كحجم أكبر في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النوكلياز. تذوب و aliquot عند الحاجة.
  11. لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، تأكد من أن العينات الموجودة في أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق لا تخضع لأكثر من دورتين للتجميد والذوبان.

2. إعداد الكواشف والمواد اللازمة للحقن المجهري

ملاحظة: في أسماك الزرد ، يمكن أن يؤدي حقن Cas9 mRNA إلى إنشاء مقرمشات وجنتية. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات أن بروتين Cas9 أكثر كفاءة في إنشاء INDELs في الأجنة المحقونة16,25. يستخدم هذا البروتوكول بروتين Cas9 لتوليد المقرمشات النفاسية لأن هذا البروتين لا يعاني من نفس التأخر في النشاط مثل حقن Cas9 mRNA. من الناحية النظرية ، يجب أن يزيد هذا من احتمال حدوث طفرة ثنائية الأليل في وقت مبكر من التطور مما يؤدي إلى زيادة فرصة تأثر جزء أكثر شمولا من الخط الجرثومي. يمكن العثور على بروتوكولات وموارد أخرى توضح بالتفصيل كيفية التحضير للحقن المجهري في مكان آخر24,26.

  1. شراء أو توليد بروتين Cas9 (انظر جدول المواد). أعد تعليق بروتين Cas9 في الماء الخالي من النوكليز لصنع محلول 2 ملغم / مل و aliquot 1 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي الدقيق الخالية من البولي بروبيلين RNase. تخزينها كأنابيب تستخدم لمرة واحدة في -80 درجة مئوية.
  2. في فترة ما بعد الظهر قبل الحقن ، استخدم مجتذب ماصة دقيقة لسحب الشعيرات الدموية الزجاجية وإنشاء إبرة حقن. قم بتخزين الإبرة غير المنقطعة في حامل إبرة مغلق حتى صباح يوم الحقن المجهري.
  3. لإنشاء طبق حقن ، صب 20 مل من 1.5٪ agarose / معقم H2O لملء نصف طبق بتري 100 مم × 15 مم وانتظر حتى يتصلب. بمجرد ضبط محلول الأغاروز ، أضف 20 مل من 1.5٪ agarose / H2O المعقم إلى طبق Petri وضع القالب البلاستيكي (انظر جدول المواد) في الأغاروز السائل واتركه يتصلب.
  4. بعد تصلب الأغاروز ، قم بإزالة القالب البلاستيكي وتخزين لوحة الحقن رأسا على عقب في الثلاجة حتى صباح يوم الحقن. يمكن استخدام صفيحة واحدة للحقن المتعددة طالما أن الآبار تحافظ على سلامتها.

3. الحقن المجهري لكوكتيل CRISPR-Cas9 في جنين الزرد أحادي الخلية لتوليد المقرمشات الأمومية

ملاحظة: يمكن العثور على المزيد من الموارد للحقن المجهري في أجنة أسماك الزرد في أماكن أخرى24،26،27. إن حقن خليط كريسبر-كاس9 في القرص الأرومي النامي للأجنة ذات الخلية الواحدة قد يزيد من احتمال إنتاج المقرمشات الأمومية . يمكن أيضا حقن الخليط في كيس صفار البيض حتى مرحلة 2 خلية. ومع ذلك، تعتمد المخاليط التي يتم حقنها في صفار البيض على تدفق البوبلازم للوصول إلى القرص الأرومي، لذلك يمكن أن يقلل CRISPR-Cas9 الذي يتم حقنه في صفار البيض من كفاءة قطع CRISPR-Cas928.

  1. في فترة ما بعد الظهر قبل الحقن المجهري ، قم بإعداد صلبان من النوع البري في صناديق تزاوج أسماك الزرد. احتفظ بكل من الأسماك الذكرية والأنثوية في نفس الخزان ولكن افصلها بفاصل مربع التزاوج أو ضع الأنثى داخل إدراج وضع البيض.
  2. في صباح يوم التجربة، أخرج 2 ملغم/مل من بروتين كاس9 وأليكوت واحد من مجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الخالي من البولي بروبيلين الخالي من RNase والذي يحتوي على بروتين Cas9 ، قم بتجميع خليط حقن 5 ميكرولتر يتضمن مجموعة من sgRNAs ، و 1 ميكرولتر من محلول أحمر فينول بنسبة 0.5٪ ، ومياه خالية من النوكليز. استهدف تركيزا نهائيا من 400 نانوغرام / ميكرولتر من بروتين Cas9 و 200 نانوغرام / ميكرولتر من sgRNAs المجمعة في الماء الخالي من RNase أو نسبة 2: 1 من بروتين Cas9 إلى sgRNAs في الجنين المحقون. يمكن تخزين خليط الحقن هذا على الجليد لصباح يوم الحقن.
  3. قم بإزالة لوحة الحقن من الثلاجة واتركها تسخن إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  4. بعد تجميع كوكتيل الحقن ، اسمح للذكر والأنثى بالتزاوج ، على سبيل المثال ، عن طريق إزالة مقسم صندوق التزاوج أو عن طريق وضع الذكر في نفس إدراج وضع البيض مثل الأنثى ، حسب الاقتضاء.
  5. بعد وضع الأسماك ولكن قبل جمع الأجنة ، قم بقطع طرف إبرة غير مكسورة باستخدام شفرة حلاقة جديدة أو ملقط ناعم لإنشاء إبرة ذات تجويف صغير بما يكفي لتجنب تلف الجنين ولكنها واسعة بما يكفي بحيث لا تصبح مسدودة بخليط الحقن. بعد قطع الإبرة، قم بتحميل الإبرة بخليط الحقن باستخدام طرف ماصة محمل صغير يتم إدخاله في الطرف الخلفي من الشعيرات الدموية (انظر جداول المواد).
  6. بعد ملء الإبرة ، احتضن الإبرة لمدة 5 دقائق في RT لتجميع مجمعات Cas9-sgRNA.
  7. قم بتشغيل الحاقن الدقيق وأدخل الإبرة في المتلاعب الدقيق. ضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرومتر وقم بمعايرة الإبرة عن طريق ضبط ضغط الحقن حتى تخرج الإبرة بلعة 1 نانولتر في الزيت المعدني.
    ملاحظة: عند الحقن في الزيت المعدني ، سيكون قطر البلعة 1 نانولتر حوالي 0.125 مم (أو نصف قطرها 0.062 مم) كما تم قياسه باستخدام شريحة الميكرومتر.
  8. لمزامنة الأجنة ، اجمعها بعد 10 دقائق باستخدام مصفاة بلاستيكية وشطفها في طبق بتري باستخدام وسائط E3 1x (5 mM NaCl ، 0.17 mM KCl ، 0.33 mM CaCl2 ، 0.33 mM MgSO4 ، وأضف 20 ميكرولتر من 0.03 M Methylene Blue لكل 1 لتر من 1x E3). قم بإزالة 10-15 جنينا ووضعها في طبق بتري منفصل ليتم الاحتفاظ بها كعناصر تحكم غير محقونة.
  9. نقل بقية الأجنة النامية إلى آبار صفيحة الحقن.
  10. حقن 1 نانولتر من المحلول (ما مجموعه 400 جزء من بروتين Cas9 و 200 جزء من الحمض النووي الريبوزي المرسال) في القرص الأرومي النامي لجنين أحادي الخلية. إذا أصبح طرف الإبرة مسدودا ، فاستخدم الملقط لكسر الطرف الخلفي وإعادة معايرة الإبرة لإخراج بلعة 1 nL. تأكد من حقن جميع الأجنة خلال أول 40 دقيقة من التطور بعد الإخصاب.
  11. بعد اكتمال الحقن ، أعد الأجنة المحقونة إلى طبق بتري المسمى الذي يحتوي على وسائط 1x E3 والسماح لها بالتطور طوال اليوم. قم بإزالة أي أجنة غير مخصبة أو لا تتطور بشكل طبيعي وفقا لسلسلة مراحل الزرد29.

4. فحص INDELs الجسدية في الأجنة المحقونة F0

ملاحظة: يمكن استخدام طرق أخرى لتحديد INDELs ، مثل اختبار T7 endonuclease I أو تحليل الذوبان عالي الدقة ، عند تحديد ما إذا كانت الأجنة تحتوي على INDELs 30 الجسدية.

  1. في اليوم التالي بعد الحقن ، قم بإزالة الأجنة المعيبة والمحللة من طبق بتري واستبدل وسائط 1x E3 للحفاظ على صحة الجنين.
  2. بعد تنظيف الطبق ، اجمع ستة أجنة محقونة صحية واثنين من أجنة التحكم من الطبق غير المحقون. ضع كل جنين على حدة في بئر واحد من أنبوب شريط PCR وقم بتسمية الجزء العلوي من الأنابيب.
  3. لاستخراج الحمض النووي الجينومي للأجنة الفردية ، قم بإزالة وسائط E3 الزائدة من آبار أنبوب الشريط وإضافة 100 ميكرولتر من 50 mM NaOH لكل بئر.
  4. احتضن الأجنة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتبريد العينات إلى 4 درجات مئوية ، وأضف 10 ميكرولتر من 1 M Tris HCL (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، ودوامها لمدة 5 إلى 10 ثوان. يمكن تخزين هذا الحمض النووي المستخرج عند -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل دون تدهور كبير في الحمض النووي.
  5. صمم اشعال فحص فريد لكل موقع دليل لتضخيم جزء الحمض النووي بقوة 100-110 نقطة أساس يتضمن الموقع المستهدف CRISPR-Cas9. إذا كان ذلك ممكنا ، ضع الموقع المستهدف في منتصف الجزء المضخم ، مما يسمح بتحديد عمليات الحذف الأكبر.
  6. لكل موقع من المواقع الأربعة المستهدفة الإرشادية، قم بإعداد ثمانية تفاعلات PCR سعة 25 ميكرولتر باستخدام 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي أحادي الجنين المحضر، ومزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل، وأوليات الفحص الخاصة بالدليل لتحديد الطفرات الجسدية في الموقع المستهدف (الجدول 1).
  7. قم بصب 2.5٪ agarose / 0.5 ميكروغرام / مل بروميد الإيثيديوم / هلام TBE باستخدام أمشاط تخلق آبارا بعرض 0.625 سم تقريبا. يسمح هذا المشط العريض بدقة أفضل عند اكتشاف تغيرات الحجم في التسلسل الجينومي. بعد أن يتصلب الجل ، ضعه في غرفة الرحلان الكهربائي التي تحتوي على مخزن مؤقت يعمل ب TBE.
  8. أضف 5 ميكرولتر من صبغة التحميل 6x إلى منتج PCR وقم بتحميل 25 ميكرولتر من هذا الخليط في الجل. تأكد من تشغيل عينات الحقن والتحكم على نفس الصف من الجل. بعد تحميل جميع العينات ، أضف 5 ميكرولتر من بروميد الإيثيديوم لكل 1 لتر من المخزن المؤقت TBE إلى الطرف الإيجابي لصندوق الهلام.
  9. قم بتشغيل الجل على 120 فولت حتى تزول نطاقات الحمض النووي أو يقترب الحمض النووي من نهاية الحارة. إذا أنشأ Cas9 INDELs في الموقع المستهدف ، فعادة ما يتم ملاحظة مسحة في العينات المحقونة ولكن ليس في عناصر التحكم.
  10. إذا لوحظت مسحات في ما لا يقل عن ثلاثة من أصل أربعة مواقع إرشادية في الأجنة المحقونة بأربعة حمض نووي ريبي مرشد ، فتنمو الأجنة المحقونة الشقيقة.
  11. عندما لا تحتوي العينات المحقونة على مسحات في العدد المطلوب من مواقع التوجيه ، قم بتصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي الجديد ليحل محل تلك التي لم تعمل وإنشاء مجموعة جديدة من الحمض النووي الريبي الإرشادي الذي يتضمن تلك التي عملت وتلك المصممة حديثا. حقن واختبار تجمع جديد ل INDELs الجسدية كما هو موضح أعلاه.

5. تحديد الأنماط الظاهرية للتأثير الأمومي في أجنة الأمهات المقرمشة

ملاحظة: بمجرد أن تصل إناث F0 المحقونة إلى مرحلة النضج الجنسي، فإن خلاياها الجرثومية لديها القدرة على توليد خليط من الأجنة المقرمشة والبرية للأمهات. على الرغم من أن هذا الخليط يسمح بضوابط داخلية للإخصاب وتوقيت النمو ، إلا أنه لا يزال من المفيد إعداد incross من النوع البري كعنصر تحكم خارجي في حالة وجود قابض من أنثى F0 يحتوي فقط على أجنة هشة للأمهات.

  1. في فترة ما بعد الظهر قبل التجربة ، قم بإعداد الإناث المحقونة F0 ضد الذكور من النوع البري والتحكم في الصلبان من النوع البري في صناديق تزاوج الزرد القياسية. ضع كلا من الأسماك الذكرية والأنثوية في نفس الخزان ولكن افصلها بمقسم صندوق التزاوج أو ضع الأنثى داخل إدراج وضع البيض.
  2. في صباح يوم التجربة، اسمح للذكر والأنثى بالبدء في التزاوج، على سبيل المثال، عن طريق إزالة مقسم صندوق التزاوج أو وضع الذكر في نفس إدراج وضع البيض مثل الأنثى.
  3. اجمع الأجنة كل 10 دقائق عن طريق تحريك إدراج وضع البيض في قاع خزان تزاوج جديد يحتوي على مياه نظام عذبة وقم بتسمية الخزان بعلامة تحدد أنثى F0 الفردية. خذ خزان التزاوج القديم وصب الماء من خلال مصفاة الشاي لجمع الأجنة من قابض فردي واحد لمدة 10 دقائق.
  4. بمجرد جمع الأجنة من قابض واحد مدته 10 دقائق في المصفاة ، انقلها إلى طبق بتري يحتوي على وسائط 1x E3. ضع علامة على طبق بتري مع وقت الجمع ومعلومات السمك.
  5. تحت مجهر تشريحي مع مصدر ضوء منقول ، راقب الأجنة التي تمر بالتطور كل ساعة لأول 6-8 ساعات ويوميا لمدة 5 أيام القادمة.
  6. تحديد الأجنة المقرمشة المحتملة للأمهات من خلال التغيرات المورفولوجية الإجمالية في نموها مقارنة بعناصر التحكم من النوع البري المتطابقة زمنيا29.
  7. انقل الأجنة المقرمشة المحتملة للأمهات إلى طبق بتري يحتوي على وسائط 1x E3 وفحص النمط الظاهري المورفولوجي عند 24 hpf وقابلية البقاء (على سبيل المثال ، تضخم المثانة السباحة) في 5 أيام بعد الإخصاب.

6. تسلسل الأليلات في الهابلويدات الهشاشة للأمهات

ملاحظة: تحتوي المفردات المقرمشة للأمهات على أليل واحد في الموضع المستهدف ، مما يسمح بتحديد INDELs في الجين المستهدف عبر تسلسل Sanger. يمكن أيضا تحليل أجنة الهابلويدات المقرمشة للأمهات باستخدام اختبارات تسلسل الجيل التالي. من المتوقع أن تحمل الأجنة التي تظهر نمطا ظاهريا هشا للأم آفة في واحد على الأقل من المواقع الأربعة المستهدفة (انظر المناقشة).

  1. في فترة ما بعد الظهر قبل التجربة ، قم بإعداد أزواج تزاوج من إناث F0 المعروفة بإنتاج أجنة هشة للأمهات عبرت إلى ذكور من النوع البري. حافظ على فصل الذكور من النوع البري جسديا عن الإناث باستخدام مقسم مربع التزاوج أو ضع الأنثى في إدراج وضع البيض.
  2. في صباح يوم التجربة ، قم بإزالة القسم المادي أو ضع كل من الذكور والإناث داخل إدراج وضع البيض لبدء التزاوج. في أول علامة على وضع البيض ، قاطع التكاثر عن طريق فصل الذكور والإناث F0. احتفظ بكل أنثى F0 منفصلة في صناديق تزاوج فردية.
  3. قم بإعداد محلول الحيوانات المنوية المعالج بالأشعة فوق البنفسجية باستخدام خصيتين من ذكر واحد من النوع البري لكل 100 ميكرولتر من محلول هانك (الجدول 2) ، وهو ما يكفي لتخصيب البويضات المبثوقة من أنثى واحدة ، كما هو موضح سابقا31.
  4. بثق البويضات الناضجة يدويا من إناث F0 المختارة مسبقا وإجراء الإخصاب في المختبر (IVF) باستخدام الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية31.
  5. بعد الإخصاب في المختبر ، اسمح للأجنة الفردية بالتطور حتى يتم ملاحظة النمط الظاهري الهش للأم ووضع تلك الأجنة في طبق بتري مختلف.
  6. بمجرد تحديد الأجنة الفردية المقرمشة للأمهات ، اسمح لها بالتطور لمدة 6 ساعات على الأقل بعد الإخصاب.
  7. لاستخراج الحمض النووي الجيني من عشرة أجنة فردية هشة على الأقل للأمهات ، ضع جنينا فرديا واحدا في بئر فردي من أنبوب شريط PCR ، وقم بإزالة وسائط E3 الزائدة من البئر وإضافة 50 ميكرولتر من 50 mM NaOH.
  8. احتضن الأجنة عند 95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بتبريد العينات إلى 4 درجات مئوية ، وأضف 5 ميكرولتر من 1 M Tris HCL (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، والدوامة لمدة 5-10 ثوان. يمكن تخزين الحمض النووي المستخرج عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  9. لتحديد مواقع الدليل التي تحتوي على INDELs، قم بتصميم الاشعال للتسلسل لتضخيم جزء من الحمض النووي يتضمن جميع المواقع الأربعة المستهدفة CRISPR-Cas9. تسمح هذه الاشعال التسلسلية بتحديد INDELs التي تمتد عبر مواقع إرشادية متعددة.
  10. قم بإعداد تفاعلين PCR 25 ميكرولتر لكل جنين باستخدام 5 ميكرولتر من الحمض النووي الجينومي المحضر والاشعال التسلسلي.
  11. بعد الانتهاء من تفاعل البوليميراز المتسلسل، قم بتنقية العينتين وتركيزهما باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي والمكثفات (انظر جدول المواد). ثم أرسل جزء الحمض النووي إلى تسلسل Sanger باستخدام كل من الاشعال للتسلسل الأمامي والخلفي.
  12. بعد تسلسل الجزء الهش الأمومي الفرداني ، قم بمحاذاته مع تسلسل النوع البري وحدد INDELs في المواقع المستهدفة باستخدام برنامج محاذاة التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يسمح النهج التجريبي الموصوف في هذا البروتوكول بتحديد الأنماط الظاهرية لتأثير الأم بطريقة سريعة وفعالة في استخدام الموارد (الشكل 1).

توليد المقرمشات الأمومية :
عند تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي الأربعة لاستهداف جين واحد مرشح للتأثير الأمومي، ينبغي إيلاء اعتبار خاص للمكان الذي سيرتبط فيه الحمض النووي الريبي الإرشادي بالحمض النووي. بشكل عام ، يجب تجميعها جميعا مع الحد الأدنى من المناطق المتداخلة أو معدومة بين الحمض النووي الريبي الموجه في بداية مجال البروتين الأول المتوقع (الشكل 2A). إن استهداف الحمض النووي الريبي الإرشادي لهذا المجال يزيد من فرصة أن تؤثر INDELs داخل الإطار وخارجه على وظيفة البروتين. المتغيرات الأخرى التي ينبغي مراعاتها عند تصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي هي خفض الكفاءة وعدد المواقع غير المستهدفة في الجينوم.

بعد حقن محلول CRISPR-Cas9 ، يمكن تحديد النشاط الجسدي ل Cas9 عن طريق تشغيل جزء PCR صغير ، حوالي 100 نقطة أساس ، على هلام الأغاروز. إذا تم إنشاء INDELs في الجنين المحقون ، فيجب ملاحظة مسحة في العينات المحقونة ولكن ليس في التحكم غير المحقون (الشكل 2B). يجب اختبار كل موقع دليل بشكل مستقل لنشاط Cas9 في الخلايا الجسدية. إذا شوهدت اللطاخات في ثلاثة مواقع إرشادية على الأقل ، فيجب أن تنمو الأجنة المحقونة من قبل الأخوة وأن يتم فحصها بحثا عن الأنماط الظاهرية المقرمشة للأمهات.

التعرف على المقرمشات الأمومية :
لتحديد ما إذا كان يتم إنشاء المقرمشات الأمومية في الصلبان الطبيعية ، يمكن مقارنة الأجنة من أنثى الأسماك F0 بعناصر التحكم من النوع البري المتطابقة زمنيا لمراقبة أي تغييرات في النمو المبكر. يجب أيضا تسجيل قوابض F0 عند 24 hpf و 5 أيام بعد الإخصاب لفحص تطور خطة الجسم الأساسية والجدوى ، على التوالي ، لتحديد عوامل الأم التي يمكن أن تنظم المراحل اللاحقة من التطور الجنيني. إن تحديد النمط الظاهري المشترك في القوابض من مختلف إناث F0 يسهل التمييز بين الآثار الناجمة عن فقدان وظيفة الجين المستهدف من التأثيرات غير المستهدفة أو غير المحددة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن القوابض التي تحتوي على مقرمشات الأمهات عادة ما تكون فسيفساء (أي أنها تشمل كلا من الأجنة البرية النموذجية والأم المقرمشة) ، مما يسمح للأجنة من النوع البري بالعمل كعنصر تحكم داخلي للمتغيرات مثل توقيت الإخصاب ومعدل النمو. في المتوسط ، ستحتوي القوابض من إناث F0 على ما يقرب من 69٪ من الأجنة المقرمشة للأمهات ، مع قوابض تحتوي على ما يصل إلى 100٪ من أجنة الأمهات المقرمشة التي لوحظت11.

بعد تحديد الأجنة المقرمشة للأمهات ، يمكن استخدامها للتوصيف الجزيئي الأولي ، أي وضع العلامات المناعية لحدود الخلايا أو تلطيخ الحمض النووي باستخدام DAPI ، والتي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الطبيعة الخلوية لعملية النمو المصابة11. يمكن أيضا استخدام طريقة هش الأم لتصوير الطفرات المعروفة ذات التأثير الأمومي ، مثل موتلي ، و tmi ، والهالة (الشكل 3) 11.

تسلسل الهابلويدات المقرمشة للأمهات:
لتحديد الآفة (الآفات) الجينية التي تساهم في النمط الظاهري المقرمش للأمهات ، يتم الجمع بين الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية والتلقيح الاصطناعي لإنشاء أفرايد هشة للأمهات (الشكل 4). توفر الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية مريكزا ولكنها لا تساهم في الحمض النووي للأب ، مما يسمح بحدوث الانقسام الخلوي مع المواد الجينومية للأمهات فقط. يسمح إنشاء الصبغة الفردية لسانجر بتسلسل أليل الأم وتحديد INDELs المقرمشة للأمهات (الشكل 4). في المتوسط ، لوحظ أليلين لكل قابض من الفرداني المقرمش للأمهات. وتشمل INDELs التي تم تحديدها عن طريق تسلسل Sanger تعديلات في كل من مواقع الدليل الواحد والحذف الذي يغطي مواقع أدلة متعددة (الشكل 4C، الجدول 3). وتظهر دراسة استقصائية ل INDELs الفردية المقرمشة للأمهات من إناث F0 مختلفة أن نفس المواقع الإرشادية يتم تحريرها في أجنة متعددة ، ومعظم الطفرات المستردة هي كودونات توقف سابقة لأوانها (الجدول 3)11.

Figure 1
الشكل 1: سير عمل الأم الهش. لإنشاء هش للأمهات ، ابدأ بتصميم أربعة gRNAs تستهدف أول مجال نشط للجين. 1) ثم توليف الحمض النووي الريبي الأربعة في تفاعل واحد. 2) بعد توليف وتنقية الحمض النووي الريبوزي المرسال ، قم بإنشاء كوكتيل CRISPR-Cas9 وحقنه في القرص الأرومي لجنين أحادي الخلية. 3) بعد ذلك ، قم بفحص الأجنة المحقونة بحثا عن طفرات جسدية باستخدام PCR والرحلان الكهربائي الهلامي. إذا تم إنشاء INDELs في عينات محقونة ، فستظهر مسحة في الأجنة المحقونة ، على عكس النطاق الضيق للتحكم من النوع البري. 4) السماح لأشقاء الأجنة المحقونة بالنمو لمدة 3-6 أشهر للوصول إلى مرحلة النضج الجنسي. بعد الوصول إلى مرحلة النضج الجنسي ، اعبر أنثى حقن F0 ضد ذكر من النوع البري. يمكن أن يكون النسل الناتج مزيجا من الأجنة المقرمشة من النوع البري والأمهات. تحديد أنثى حقن F0 التي تعرض أجنة أجنحتها النمط الظاهري للتأثير الأمومي. 5) لتحديد الآفات التي تساهم في النمط الظاهري ، يتم إجراء التلقيح الاصطناعي باستخدام الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية لإنشاء هابلويدات هشة للأمهات لتسلسل سانجر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: توليد INDELs في الجينات المستهدفة. (أ) مخطط البنية الجينية يوضح مجالات البروتين الافتراضية (الكتل الأرجوانية الفاتحة والداكنة)، وموقع الحمض النووي الريبوزي المرسال (الخطوط الحمراء)، ومواقع PAM (النجوم الحمراء). يتم استهداف gRNAs إلى أول مجال نشط. يتم عرض Exons ككتل ، ويتم عرض introns كخطوط. (ب) تشير اللطاخات في هلام الأغاروز بنسبة 2.5٪ إلى INDELs في الخلايا الجسدية في الأجنة المحقونة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تلخص مقرمشات الأمهات النمط الظاهري للطفرات المعروفة ذات التأثير الأمومي. مقارنة تمثيلية للنوع البري الحي المطابق زمنيا (العمود الأيسر) ، والطفرات الأمومية المعروفة (العمود الأوسط) ، والأجنة المقرمشة للأمهات (العمود الأيمن). (A) متنافرة / birc5b ، (B) tmi / prc1l ، (C) تظهر طفرات الهالة / mid1ipIl / المقرمشات الأمومية عيوبا في الحركة الخلوية في الانقسامات الجنينية المبكرة ، مما يؤدي إلى الأرومية المتزامنة بالكامل (A ، B) ، أو الأجنة اللاخلوية جزئيا (C ، الصندوق الأبيض). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: استخدام الهوايات المقرمشة للأمهات لتسلسل الطفرات التي يسببها كريسبر-كاس9 . (أ) أنثى محقونة F0 عبرت ضد ذكر من النوع البري ينتج عنه جنين ثنائي الصبغيات مع نمط ظاهري لتأثير الأم. (ب) يتم إجراء التلقيح الاصطناعي باستخدام الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية لإنشاء أفرايد هشة للأمهات ، مما يسمح بتسلسل وتحليل INDELs المستحثة في أليل الأم. (ج) التسلسل التمثيلي للفرد الهرولويد المقرمش للأمهات birc5b الذي يظهر حذفا كبيرا بين موقعي الدليل 3 و 4 (معلبأ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل
جمع
معقم H2O 171.12 مل
MgCl2 (1 م) 0.393 مل
Tris-HCl (1 M، الرقم الهيدروجيني 8.4) 2.618 مل
KCl (1 م) 13.092 مل
الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة ، ثم قم بتبريد المحلول على الجليد. الإضافة التالية
BSA (100 ملغم/مل) 3.468 مل
dATP (100 ملليمتر) 0.262 مل
dCTP (100 ملليمتر) 0.262 مل
dGTP (100 ملليمتر) 0.262 مل
dTTP (100 ملليمتر) 0.262 مل
Aliquot في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة
وصفة PCR لكل عينة
مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل 17.9 ميكرولتر
F + R التمهيدي (10 ميكرومتر) 0.2 ميكرولتر
روه2O 1.8 ميكرولتر
طق الحمض النووي بوليميراز 0.1 ميكرولتر
دنا 5 ميكرولتر

الجدول 1: مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل.

حل هانك
هانك بريمكس اجمع ما يلي بالترتيب: (1) 10.0 مل من HS #1 ، (2) 1.0 مل من HS # 2 ، (3) 1.0 مل من HS # 4 ، (4) 86 مل من ddH2O ، (5) 1.0 مل من HS # 5. تخزين جميع حلول النظام المنسق في 4 درجات مئوية
هانك ستوك سوليوشن #1 8.0 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.4 غرام من KCl في 100 مل من DDH2O
هانك ستوك سوليوشن #2 0.358 غرام من Na2HPO4 اللامائي ؛ 0.60 غرام من K 2 H 2 PO4 في 100 مل من ddH2O
هانك ستوك سوليوشن #4 0.72 غرام من CaCl 2 في 50 مل من DDH2O
هانك ستوك سوليوشن #5 1.23 غرام من MgSO4·7H 2 O في 50 مل من DDH20
هانك ستوك سوليوشن #6 0.35 غرام من NaHCO3 في 10.0 مل من DDH20 ؛ اصنعه طازجا في يوم الاستخدام
حل هانك النهائي للعمل الجمع بين 9.9 مل من هانك بريمكس مع 0.1 مل من الأسهم HS # 6

الجدول 2: حل هانك.

birc5b #1 birc5b #2 birc5b #3 prc1l #1 prc1l #2
إجمالي عدد الأجنة المتسلسلة 3 9 12 8 10
إجمالي عدد الأجنة مع INDELs 3 9 12 8 10
طفرة في موقع واحد 0 0 0 0 0
طفرات في مواقع متعددة 3 9 12 8 10
موقع INDELs
دليل الموقع 1 0 0 0 0 0
دليل الموقع 2 0 0 0 8 10
دليل الموقع 3 3 9 12 8 10
دليل الموقع 4 3 9 12 0 10
أنواع INDELs
طفرة داخل الإطار 1 2 2 7 10
طفرة إزاحة الإطار 4 7 10 9 10

الجدول 3: موقع ونوع INDELs الموجودة في مجموعتين مختلفتين من الهابلويدات المقرمشة للأمهات: birc5b و prc1l.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يسمح البروتوكول المقدم في هذه المخطوطة بتحديد وتوصيف جزيئي أولي للنمط الظاهري للتأثير الأمومي في جيل واحد بدلا من الأجيال المتعددة المطلوبة لكل من التقنيات الجينية الأمامية والعكسية. حاليا ، دور العديد من الجينات المعبر عنها من قبل الأم غير معروف. ويرجع هذا النقص في المعرفة جزئيا إلى الجيل الإضافي المطلوب لتصور النمط الظاهري عند تحديد الجينات ذات التأثير الأمومي. في الماضي ، كان من الممكن تحقيق التحديد السريع للجينات ذات التأثير الأمومي في أسماك الزرد عن طريق حقن أوليغونوكليوتيدات مورفولينو مانعة للترجمة في البويضات المستزرعة32. وقد أثبتت هذه الطريقة نجاحها من خلال النسخ الظاهري للعديد من الجينات المعروفة ذات التأثير الأمومي، ولكن التلاعب ببويضة غير ناضجة يمكن أن يكون تجربة حساسة تستغرق وقتا طويلا. يمكن أيضا استهداف الحمض النووي الريبي للأمهات للتحلل باستخدام مجمعات CRISPR-RfxCas13d ، ولكن حقن هذه المجمعات في الجنين أحادي الخلية لا يمكن أن يستهدف البروتين33 المقدم من الأم. في الآونة الأخيرة ، تم اكتشاف أن CRISPR-Cas9 يمكن أن يحفز طفرات ثنائية الأليلية في الخط الجرثومي ، مما يسمح بالتحديد السريع للجينات الجديدة ذات التأثير الأمومي في جيل واحد11.

يتضمن هذا البروتوكول العديد من الخطوات الحاسمة التي تساهم في استعادة الأجنة المقرمشة للأمهات. من الناحية النظرية ، نظرا لأن الخلايا الجرثومية محددة في التطور الجنيني المبكر ، فكلما تم إنشاء آفة الحمض النووي في وقت مبكر في الجين المستهدف ، زاد احتمال أن تصبح الخلية التي تحتوي على طفرات جزءا من الخط الجرثومي. تستخدم هذه الطريقة بروتين Cas9 الذي يتم حقنه في القرص الأرومي النامي لجنين أحادي الخلية لزيادة احتمال حدوث تعديلات في الخط الجرثومي. ومن العوامل الحاسمة الأخرى التي تؤثر على النسبة المئوية للأجنة المقرمشة المستردة للأمهات كفاءة الحمض النووي الريبي الإرشادي في إنشاء تعديلات وراثية في المواقع المستهدفة. يتضمن هذا الإجراء قسما حول تحديد قدرة الحمض النووي الريبي الموجه على إنشاء INDELs جسدية عند 24 hpf بواسطة PCR. إذا فشل الحمض النووي الريبي المرشد في إجراء تعديلات جسدية ، فإن لديه احتمالا منخفضا لإنتاج تعديلات في الخط الجرثومي بمعدل مرتفع بما يكفي لتوليد هش الأم. يوجه هذا البروتوكول المستخدم لاختبار التعديلات الجسدية ، والتي يجب أن تكون مرئية في ثلاثة مواقع إرشادية أو أكثر.

بعد مراقبة النمط الظاهري للأجنة المقرمشة للأمهات ، يمكن تحليل الآفة (الآفات) الجينية التي تساهم في النمط الظاهري على مستوى التسلسل عبر التلقيح الاصطناعي باستخدام الحيوانات المنوية المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية. للحصول على ما يكفي من المواد الأولية ل PCR ، يجب أن تتطور الأجنة الفردية المقرمشة للأمهات لمدة ست إلى ثماني ساعات على الأقل ، مما يسمح بحدوث دورات متعددة من تكرار الحمض النووي. يجب أيضا استخراج الحمض النووي الجيني في 50 ميكرولتر من 50mM NaOH لتركيز الحمض النووي. إذا لم تتمكن الأجنة الفردية المقرمشة للأمهات من البقاء على قيد الحياة لمدة 6-8 ساعات ، فقم بجمع الأجنة في وقت مبكر. لحساب الجنين الذي يمر بدورات أقل من تكرار الحمض النووي ، قم باستخراج الحمض النووي بحجم أصغر من 50 mM NaOH مع الحفاظ على نفس النسبة من NaOH و Tris-HCL. خيار آخر هو تركيز الحمض النووي المستخرج باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي والمكثف. بعد استخراج الحمض النووي ، يجب أن يشمل جزء PCR المستخدم في التسلسل جميع المواقع المستهدفة الأربعة ، إن أمكن. سيسمح هذا الجزء بتحديد عمليات الحذف الكبيرة التي تمتد عبر مواقع إرشادية متعددة في الأجنة المقرمشة للأمهات.

عند جمع الهابلويدات المقرمشة للأمهات لتسلسل سانجر ، اجمع جميع الهابلويدات التي تظهر النمط الظاهري وأرسل ما لا يقل عن 10 عينات جنين فردية فريدة من نوعها إلى تسلسل سانجر. سيسمح تسلسل الأجنة الفردية المتعددة لكل قابض بتحديد INDELs المتعددة الموجودة في الخط الجرثومي. أظهرت بيانات التسلسل السابقة للهابلويدات المقرمشة للأمهات أنه يمكن تحديد أليلات متعددة في مجموعة من الهابلويدات المقرمشة للأمهات11. ومع ذلك ، لا يتم استرداد هذه الأليلات بنسبة 1 إلى 1 المتوقعة11. سيساعد تسلسل الأجنة المتعددة أيضا في دعم فكرة أن النمط الظاهري ناتج عن CRISPR-Cas9 INDEL في الجين المستهدف. أي تسلسل من النوع البري لوحظ في الأجنة الفردية المتسلسلة التي تظهر نمطا ظاهريا معينا سيشير إلى أن النمط الظاهري غير مرتبط بالجين المستهدف. يجب أيضا تأكيد أي أنماط ظاهرية جديدة للتأثير الأمومي يتم تحديدها من خلال استهداف الجينات غير المميزة سابقا من خلال إنشاء خط مستقر باستخدام الذكور الشقيقين F011.

في بعض الحالات ، قد يكون من الصعب تحديد INDELs عن طريق التحليل الفردي حيث يكون للنمط الظاهري الهش للأمهات المحدد خاصية مظهرية معينة. على سبيل المثال، قد يكون من المستحيل اختيار الأجنة الفردية المقرمشة للأمهات التي تبدو غير مخصبة أو محللة خلال مرحلة الانقسام. قد لا يمكن أيضا تمييز الأجنة المقرمشة للأمهات ذات العيوب الممتدة للمحور المشابهة لتلك المقابلة لمتلازمة الصبغة الفردية للتحليل عند توليد الفرديات الأمومية34. في مثل هذه الحالات ، ينصح الباحث بإجراء التحليل مباشرة باستخدام خطوط مستقرة لتأكيد النمط الظاهري الجيني.

أحد قيود بروتوكول الهش الحالي للأمهات هو أنه يحدد فقط الجينات ذات التأثير الأمومي من خلال العيوب المورفولوجية الجسيمة. لزيادة حساسية الطريقة وجعلها أكثر تحديدا لجوانب معينة من التطور المبكر ، يمكن استخدام المراسلين المعدلة وراثيا لتسليط الضوء على هياكل أو أنواع خلايا محددة ، كما حدث مع الشاشات الأخرى9،10،35. على سبيل المثال، يمكن حقن خليط كريسبر-كاس9 في الخط المعدل وراثيا Buc-GFP لتحديد الجينات غير المميتة التي تنظم تكوين وتطوير الخلايا الجرثومية البدائية36. هناك قيد آخر لبروتوكول الهش الأمومي وهو أنه على الرغم من أنه مفيد للجينات التي يتم التعبير عنها فقط أثناء التطور المبكر ، إلا أنه قد لا يكون فعالا للجينات ذات الوظيفة الأمومية والوجنية لأن استهداف CRISPR-Cas9 للجين يمكن أن يكون قاتلا للجنين النامي. لدراسة الوظيفة الأمومية للجينات المعبر عنها طوال فترة النمو ، يمكن استهداف نشاط Cas9 إلى الخط الجرثومي37 ، وبالتالي ترك الوظيفة الجسدية للجين دون تأثر والسماح ببقاء الإناث F0 حتى مرحلة البلوغ.

تعد الهشطات النفاسية للأمهات أداة فعالة لتحديد الجينات الجديدة ذات التأثير الأمومي اللازمة للنمو المبكر. إن الجمع بين الحمض النووي الريبي الموجه متعدد الإرسال إلى هدف واحد والقدرة على التحرير ثنائي الأليلية ل Cas9 يسمح بملاحظة النمط الظاهري للتأثير الأمومي في جيل واحد ، وتجنب مخططات التربية متعددة الأجيال التي تحتاجها عادة عند إجراء تحرير الجينات المستهدفة. إن تجاوز أجيال متعددة يقلل من مقدار المساحة والموارد اللازمة لتحديد الجينات ذات التأثير الأمومي.

بالإضافة إلى تحديد جينات جديدة ذات تأثير أمومي، يسمح هذا البروتوكول لأي مختبر لأسماك الزرد بالنسخ الظاهري ودراسة أي متحور معروف للتأثير الأمومي دون إنشاء خطوط مستقرة والحفاظ عليها، مما يسهل التحليل التفصيلي للمسارات الوراثية. من حيث المبدأ ، يمكن لهذا النهج الهش للأمهات أيضا تحديد وظيفة منتجات الأمهات في أنواع النماذج غير الوراثية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر موظفي تربية الحيوانات في مختبر Pelegri السابقين والحاليين على رعايتهم للمنشأة المائية. ونحن ممتنون أيضا للتعليقات والبصيرة على المخطوطة التي كتبها ريان تريفينا وديان هانسون. تم توفير التمويل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة إلى F.P. (GM065303)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
  3. Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
  4. He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
  5. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
  6. Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  7. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  8. Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
  9. Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
  10. Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
  11. Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
  12. Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
  13. Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
  14. Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
  15. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
  16. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
  17. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  18. Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  19. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  20. Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
  21. White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
  22. Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
  23. Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  24. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
  25. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
  26. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
  27. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
  28. Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
  31. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
  32. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
  33. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  34. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
  35. Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
  36. Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
  37. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

Tags

علم الوراثة ، العدد 178 ، التطور المبكر ، CRISPR-Cas9 ، تأثير الأم ، سمك الزرد ، تحرير الجينوم ، علم الوراثة العكسي
تحديد دور الجينات المعبر عنها من الأم في النمو المبكر باستخدام المقرمشات الأمومية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moravec, C. E., Voit, G. C.,… More

Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter