Summary
Lo sviluppo precoce dipende dai prodotti ereditari materni e il ruolo di molti di questi prodotti è attualmente sconosciuto. Qui, abbiamo descritto un protocollo che utilizza CRISPR-Cas9 per identificare i fenotipi di effetti materni in una singola generazione.
Abstract
Lo sviluppo precoce dipende da un pool di fattori materni incorporati nell'ovocita maturo durante l'oogenesi che svolgono tutte le funzioni cellulari necessarie per lo sviluppo fino all'attivazione del genoma zigotico. Tipicamente, il targeting genetico di questi fattori materni richiede una generazione aggiuntiva per identificare i fenotipi degli effetti materni, ostacolando la capacità di determinare il ruolo dei geni espressi per via materna durante lo sviluppo. La scoperta delle capacità di editing biallelico di CRISPR-Cas9 ha permesso lo screening dei fenotipi embrionali nei tessuti somatici di embrioni iniettati o "crispanti", aumentando la comprensione del ruolo che i geni espressi zigoticamente svolgono nei programmi di sviluppo. In questo articolo viene descritto un protocollo che è un'estensione del metodo crispant. In questo metodo, l'editing biallelico delle cellule germinali consente l'isolamento di un fenotipo di effetto materno in una singola generazione, o "crispanti materni". Il multiplexing degli RNA guida verso un singolo bersaglio promuove la produzione efficiente di crispanti materni, mentre l'analisi della sequenza degli aploidi dei crispanti materni fornisce un metodo semplice per corroborare le lesioni genetiche che producono un fenotipo di effetto materno. L'uso di crispanti materni supporta la rapida identificazione di geni essenziali espressi per la madre, facilitando così la comprensione dello sviluppo precoce.
Introduction
Un pool di prodotti depositati per la madre (ad esempio, RNA, proteine e altre biomolecole) è necessario per tutti i processi cellulari precoci fino all'attivazione del genoma zigotico dell'embrione1. L'esaurimento prematuro di questi prodotti dall'ovocita è tipicamente letale embrionale. Nonostante l'importanza di questi geni nello sviluppo, il ruolo di molti geni espressi per via materna è attualmente sconosciuto. I progressi nella tecnologia di modifica genetica nei pesci zebra, come CRISPR-Cas9, consentono il targeting dei geni espressi per via materna 2,3,4. Tuttavia, l'identificazione di un fenotipo con effetto materno richiede una generazione in più rispetto a un fenotipo zigotico, richiedendo quindi più risorse. Recentemente, la capacità di editing biallelico di CRISPR-Cas9 è stata utilizzata per lo screening di fenotipi embrionali in tessuti somatici di embrioni iniettati (F0), noti come "crispants"5,6,7,8,9,10. La tecnica crispant consente uno screening efficiente in termini di risorse dei geni candidati nelle cellule somatiche, facilitando la comprensione di aspetti specifici nello sviluppo. Il protocollo descritto in questo documento consente l'identificazione di fenotipi di effetti materni, o "crispanti materni", in una singola generazione11. Questo schema è ottenibile moltiplicando gli RNA guida in un singolo gene e promuovendo eventi di editing biallelico nella linea germinale. Questi embrioni materni crispanti possono essere identificati da fenotipi morfologici grossolani e sottoposti a caratterizzazione primaria, come l'etichettatura per i confini cellulari e il pattern del DNA11. L'analisi combinata del fenotipo osservabile e la caratterizzazione molecolare di base degli INDEL indotti consente di prevedere il ruolo del gene bersaglio nello sviluppo precoce.
Nel pesce zebra, durante le prime 24 ore dopo la fecondazione (hpf), un piccolo gruppo di cellule si sviluppa nelle cellule germinali primordiali, un precursore della linea germinale12,13,14,15. Nelle frizioni deposte dalle femmine F0, la proporzione di embrioni materni di crispant recuperati dipende da quante cellule germinali contengono un evento di editing biallelico nel gene bersaglio. In generale, prima si verifica l'evento di editing nell'embrione, maggiore è la probabilità che si osservino mutazioni CRISPR-Cas9 nella linea germinale. Nella maggior parte dei casi, i fenotipi degli embrioni materni crispanti derivano dalla perdita di funzione nei due alleli materni presenti nell'ovocita in via di sviluppo. Quando l'ovocita termina la meiosi, uno degli alleli materni viene estruso dall'embrione attraverso il corpo polare, mentre l'altro allele viene incorporato nel pronucleo materno. Il sequenziamento di aploidi crispanti materni multipli rappresenterà una miscela delle mutazioni (inserzioni e/o delezioni (INDEL)) presenti nella linea germinale che contribuiscono al fenotipo11.
Il seguente protocollo descrive i passi necessari per creare mutazioni CRISPR-Cas9 nei geni con effetto materno e identificare il fenotipo corrispondente utilizzando un approccio crispante materno (Figura 1). La prima sezione spiegherà come progettare e creare efficacemente RNA guida, mentre le sezioni due e tre contengono passaggi critici per la creazione di crispanti materni mediante microiniezione. Dopo aver iniettato la miscela CRISPR-Cas9, gli embrioni iniettati vengono sottoposti a screening per modifiche somatiche tramite PCR (sezione quattro). Una volta che gli embrioni F0 iniettati si sviluppano e raggiungono la maturità sessuale, le femmine F0 vengono incrociate con maschi wild-type e la loro prole viene sottoposta a screening per fenotipi di effetti materni (sezione cinque). La sesta sezione include istruzioni su come produrre aploidi crispanti materni che possono essere combinati con il sequenziamento Sanger per identificare gli INDEL indotti da CRISPR-Cas9. Inoltre, la discussione contiene modifiche che possono essere apportate al protocollo per aumentare la sensibilità e la potenza di questo metodo.
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Protocol
Negli studi che hanno portato allo sviluppo di questo protocollo, tutti gli stabulamenti e gli esperimenti del pesce zebra sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2).
1. Sintesi di RNA guida
NOTA: I crispanti zigotici sono stati creati utilizzando un singolo RNA guida o multiplexando più RNA guida a un singolo bersaglio 5,6,7,8,9,10. Il multiplexing degli RNA guida aumenta la percentuale di embrioni che mostrano un fenotipo10 croccante zigotico. A causa di questa maggiore frequenza di embrioni che mostrano un fenotipo, i crispanti materni vengono creati multiplexando quattro RNA guida a un singolo gene. Un protocollo più dettagliato sull'uso di CHOPCHOP per progettare RNA guida e un metodo di ricottura per sintetizzare RNA guida per zebrafish può essere trovato altrove 16,17,18,19,20.
- Per identificare un gene espresso per la madre da colpire, accertare i livelli di trascrizione dell'mRNA durante lo sviluppo tramite un database di sequenze di RNA che fornisce informazioni sul trascrittoma dallo zigote a 5 giorni21. In generale, i geni materno-specifici sono altamente espressi nell'embrione precoce e vengono degradati dopo l'attivazione del genoma zigotico22.
- Una volta identificato un gene bersaglio espresso per la madre, determinare il primo dominio proteico previsto utilizzando la sezione "domini e caratteristiche" disponibile sul browser del genoma Ensembl23. Usa questo dominio come regione target per i quattro RNA guida.
- Utilizzare il programma di selezione dell'RNA guida CHOPCHOP per identificare quattro siti bersaglio dell'RNA guida nel primo dominio attivo. Progettare oligonucleotidi gene-specifici, come mostrato di seguito per ciascun sito bersaglio. Nell'oligonucleotide gene-specifico, la sezione N20 corrisponde alla sequenza bersaglio meno il sito PAM (NGG) di CHOPCHOP. Ordinare questi oligonucleotidi gene-specifici e l'oligonucleotide costante usando la purificazione desalinosa standard (vedi Tabella dei materiali).
Oligonucleotide gene-specifico:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - Per creare un modello di RNA guida per ogni oligonucleotide gene-specifico, rifornirlo all'oligonucleotide costante e riempire le sporgenze con T4-DNA polimerasi come descritto in precedenza16. Dopo aver assemblato i quattro modelli di RNA guida, purificarli e concentrarli insieme utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
- Sintetizzare la miscela di sgRNA dal modello di RNA guida aggregato utilizzando un kit di trascrizione T7 in vitro (vedi Tabella dei materiali). Eseguire la trascrizione in vitro secondo le istruzioni del produttore. L'utilizzo delle mezze reazioni del kit di trascrizione T7 può ridurre il costo per reazione.
- Dopo la sintesi dell'RNA, purificare il pool risultante di sgRNA utilizzando un protocollo di etanolo / acetato di ammonio come precedentemente descritto 16,20,24. Dopo che l'RNA è stato isolato, risospenderlo in 20 μL di acqua priva di nucleasi. Se le semireazioni del kit di trascrizione T7 sono state utilizzate per trascrivere il pool di sgRNA, risospendere l'RNA purificato in 10-15 μL di acqua priva di nucleasi.
- Quantificare la quantità di sgRNA aggregati che sono stati creati utilizzando uno spettrofotometro. Diluire il pool di sgRNA in acqua priva di nucleasi fino a una diluizione di 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Tipicamente, il volume finale della diluizione di lavoro varia da 30-50 μL.
- Dopo aver determinato la concentrazione del pool di sgRNA, verificare l'integrità degli sgRNA su un gel di agarosio all'1%.
- Gettare un gel di agarosio/0,5 μg/mL di bromuro di etidio/TBE all'1%. Una volta che il gel si è solidificato, posizionarlo nel tampone di esecuzione TBE.
- Mescolare 1 μL della miscela di sgRNA e 1 μL di tampone di carico del gel di RNA (vedere Tabella dei materiali). Caricare questo campione nel gel e far scorrere il gel a 100 V per 5 minuti.
- Visualizza le bande usando la luce ultravioletta (UV). Il pool di sgRNA dovrebbe apparire come una singola banda. Se si osserva uno striscio, è probabile che si sia verificata la degradazione dell'RNA.
- Conservare il pool di sgRNA in aliquote monouso da 1 μL in provette per strisce PCR prive di nucleasi nel congelatore a -80 °C. Per grandi volumi di miscela di sgRNA (30 μL o più), aliquote metà del volume nelle provette per strisce PCR prive di nucleasi e conservare l'altra metà come volume maggiore in una provetta da microcentrifuga priva di nucleasi. Scongelare e aliquote quando necessario.
- Per prevenire la degradazione dell'RNA, assicurarsi che i campioni nella provetta della microcentrifuga non subiscano più di due cicli di congelamento-scongelamento.
2. Preparazione di reagenti e materiali per la microiniezione
NOTA: Nel pesce zebra, l'iniezione di mRNA Cas9 può creare crispanti zigotici. Tuttavia, gli studi hanno dimostrato che la proteina Cas9 è più efficiente nella creazione di INDEL negli embrioni iniettati16,25. Questo protocollo utilizza la proteina Cas9 per generare crispanti materni perché questa proteina non sperimenta lo stesso ritardo nell'attività dell'mRNA Cas9 iniettato. In teoria, questo dovrebbe aumentare la probabilità di una mutazione biallelica all'inizio dello sviluppo, con conseguente aumento della possibilità che una sezione più estesa della linea germinale venga colpita. Altri protocolli e risorse che descrivono in dettaglio come prepararsi per le microiniezioni possono essere trovati altrove24,26.
- Acquistare o generare la proteina Cas9 (vedi Tabella dei materiali). Risospendere la proteina Cas9 in acqua priva di nucleasi per produrre una soluzione da 2 mg/ml e aliquote 1 μL in provette per microcentrifuga in polipropilene privo di RNasi. Conservarli come tubi monouso a -80 °C.
- Il pomeriggio prima dell'iniezione, utilizzare un estrattore di micropipette per tirare un capillare di vetro e creare un ago per iniezione. Conservare l'ago intatto in un portaaghi chiuso fino alla mattina delle microiniezioni.
- Per creare una piastra di iniezione, versare 20 ml di agarosio all'1,5% / H2O sterile per riempire metà di una capsula di Petri da 100 mm X 15 mm e attendere che si solidifichi. Una volta fissata la soluzione di agarosio, aggiungere 20 ml di agarosio all'1,5% / H2O sterile alla piastra di Petri e posizionare lo stampo di plastica (vedi Tabella dei materiali) nell'agarosio liquido e lasciarlo indurire.
- Dopo che l'agarosio si è indurito, rimuovere lo stampo di plastica e conservare la piastra di iniezione capovolta in frigorifero fino alla mattina delle iniezioni. Una singola piastra può essere utilizzata per iniezioni multiple purché i pozzetti mantengano la loro integrità.
3. Microiniezione del cocktail CRISPR-Cas9 in un embrione di zebrafish unicellulare per generare crispanti materni
NOTA: Ulteriori risorse per la microiniezione negli embrioni di zebrafish possono essere trovate altrove24,26,27. L'iniezione della miscela CRISPR-Cas9 nel blastodisco in via di sviluppo di embrioni unicellulari può aumentare la probabilità di creare crispanti materni. La miscela può anche essere iniettata nel sacco vitellino fino allo stadio a 2 cellule. Tuttavia, le miscele iniettate nel tuorlo dipendono dal flusso ooplasmatico per raggiungere il blastodisco, quindi CRISPR-Cas9 iniettato nel tuorlo potrebbe ridurre l'efficienza di taglio di CRISPR-Cas928.
- Il pomeriggio prima delle microiniezioni, impostare incroci di tipo selvatico in scatole di accoppiamento zebrafish. Tenere sia il pesce maschio che la femmina nella stessa vasca ma separarli con un divisorio per la scatola di accoppiamento o posizionare la femmina all'interno di un inserto per la deposizione delle uova.
- La mattina dell'esperimento, estrarre un'aliquota di 2 mg/ml di proteina Cas9 e un'aliquota del pool di sgRNA. Nel tubo di microcentrifuga in polipropilene privo di RNasi che contiene la proteina Cas9, assemblare una miscela di iniezione da 5 μL che include il pool di sgRNA, 1 μL di soluzione rosso fenolo allo 0,5% e acqua priva di nucleasi. Puntare a una concentrazione finale di 400 ng/μL di proteina Cas9 e 200 ng/μL di sgRNA aggregati in acqua priva di RNasi o un rapporto 2:1 tra proteina Cas9 e sgRNA nell'embrione iniettato. Questa miscela per iniezione può essere conservata sul ghiaccio per la mattina dell'iniezione.
- Rimuovere una piastra di iniezione dal frigorifero e lasciarla riscaldare a temperatura ambiente (RT) per almeno 20 minuti.
- Dopo aver assemblato il cocktail di iniezione, consentire al maschio e alla femmina di accoppiarsi, ad esempio rimuovendo il divisorio della scatola di accoppiamento o posizionando il maschio nello stesso inserto di deposizione delle uova della femmina, a seconda dei casi.
- Dopo che il pesce ha deposto, ma prima che gli embrioni siano stati raccolti, tagliare la punta di un ago ininterrotto usando una nuova lama di rasoio o una pinza sottile per creare un ago che abbia un foro abbastanza piccolo da evitare danni agli embrioni ma abbastanza largo da non intasarsi con la miscela per iniezione. Dopo aver tagliato l'ago, caricare l'ago con la miscela per iniezione utilizzando una punta di pipetta microloader inserita nell'estremità posteriore del capillare (vedere Tabelle dei materiali).
- Dopo aver riempito l'ago, incubare l'ago per 5 minuti a RT per assemblare i complessi Cas9-sgRNA.
- Accendere il microiniettore e inserire l'ago nel micromanipolatore. Posizionare una goccia di olio minerale su un vetrino micrometrico e calibrare l'ago regolando la pressione di iniezione fino a quando l'ago espelle un bolo di 1 nL nell'olio minerale.
NOTA: Quando si inietta nell'olio minerale, un bolo di 1 nL avrà un diametro di circa 0,125 mm (o raggio di 0,062 mm) misurato con il vetrino micrometrico. - Per sincronizzare gli embrioni, raccoglierli dopo 10 minuti usando un colino di plastica e sciacquarli in una capsula di Petri usando 1x mezzo E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 e aggiungere 20 μL di 0,03 M Blu di metilene per 1 L di 1x E3). Rimuovere 10-15 embrioni e metterli in una capsula di Petri separata per essere conservati come controlli non iniettati.
- Trasferire il resto degli embrioni in via di sviluppo nei pozzetti della piastra di iniezione.
- Iniettare 1 nL di soluzione (un totale di 400 pg di proteina Cas9 e 200 pg di sgRNA) nel blastodisco in via di sviluppo di un embrione unicellulare. Se la punta dell'ago si ostruisce, usare una pinza per rompere la punta indietro e ricalibrare l'ago per espellere un bolo di 1 nL. Assicurarsi di iniettare tutti gli embrioni durante i primi 40 minuti di sviluppo dopo la fecondazione.
- Al termine dell'iniezione, riportare gli embrioni iniettati in una capsula di Petri marcata che contiene 1x mezzo E3 e consentire loro di svilupparsi durante il giorno. Rimuovere tutti gli embrioni che non sono fecondati o non si sviluppano normalmente secondo la serie di stadiazione del pesce zebra29.
4. Screening per INDELs somatici in embrioni iniettati F0
NOTA: Altri metodi per identificare gli INDEL, come il saggio di endonucleasi I T7 o l'analisi di fusione ad alta risoluzione, possono essere utilizzati per determinare se gli embrioni contengono INDEL somatici 30.
- Il giorno successivo alle iniezioni, rimuovere gli embrioni difettosi e lisati dalla capsula di Petri e sostituire i 1x mezzi E3 per mantenere la salute dell'embrione.
- Dopo aver pulito il piatto, raccogliere sei embrioni sani iniettati e due embrioni di controllo dalla piastra non iniettata. Posizionare ogni embrione individualmente in un singolo pozzetto di un tubo di striscia PCR ed etichettare la parte superiore dei tubi.
- Per estrarre il DNA genomico dei singoli embrioni, rimuovere il mezzo E3 in eccesso dai pozzetti del tubo a strisce e aggiungere 100 μL di 50 mM NaOH per pozzetto.
- Incubare gli embrioni a 95 °C per 20 minuti. Quindi raffreddare i campioni fino a 4 °C, aggiungere 10 μL di 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vorticerli per 5-10 s. Questo DNA estratto può essere conservato a -20 °C per almeno 6 mesi senza una significativa degradazione del DNA.
- Progetta primer di screening unici per ogni sito guida per amplificare un frammento di DNA di 100-110 bp che include il sito target CRISPR-Cas9. Se possibile, posizionare il sito di destinazione al centro del frammento amplificato, consentendo l'identificazione di delezioni più grandi.
- Per ciascuno dei quattro siti bersaglio guida, impostare otto reazioni PCR da 25 μL utilizzando 5 μL del DNA genomico a singolo embrione preparato, del mix PCR e dei primer di screening specifici della guida per identificare le mutazioni somatiche nel sito bersaglio (Tabella 1).
- Gettare un gel di agarosio/0,5 μg/mL di bromuro di etidio/TBE al 2,5% utilizzando pettini che creano pozzetti larghi circa 0,625 cm. Questo ampio pettine consente una migliore risoluzione quando si rilevano cambiamenti di dimensioni nella sequenza genomica. Dopo che il gel si è solidificato, posizionarlo in una camera di elettroforesi contenente tampone di funzionamento TBE.
- Aggiungere 5 μL di colorante di carico 6x al prodotto PCR e caricare 25 μL di questa miscela nel gel. Assicurarsi che i campioni iniettati e di controllo siano eseguiti sulla stessa fila di gel. Dopo aver caricato tutti i campioni, aggiungere 5 μL di bromuro di etidio per 1 L di tampone corrente TBE all'estremità positiva della scatola di gel.
- Eseguire il gel a 120 V fino a quando le bande di DNA si risolvono o il DNA si avvicina alla fine della corsia. Se il Cas9 ha creato INDEL nel sito target, uno striscio è tipicamente osservato nei campioni iniettati ma non nei controlli.
- Se si osservano strisci in almeno tre dei quattro siti guida negli embrioni iniettati con quattro RNA guida, crescere gli embrioni iniettati fratelli.
- Ogni volta che i campioni iniettati non contengono strisci nel numero richiesto di siti guida, progettare nuovi RNA guida per sostituire quelli che non hanno funzionato e creare un nuovo pool di RNA guida che includa quelli che hanno funzionato e quelli di nuova progettazione. Iniettare e testare il nuovo pool per INDEL somatici come descritto sopra.
5. Identificazione dei fenotipi dell'effetto materno in embrioni materni crispanti
NOTA: Una volta che le femmine F0 iniettate hanno raggiunto la maturità sessuale, le loro cellule germinali hanno il potenziale per generare una miscela di embrioni materni crispant e wild-type. Anche se questa miscela consente controlli interni per la fecondazione e la tempistica dello sviluppo, è comunque utile impostare un incrocio di tipo selvatico come controllo esterno nel caso in cui una frizione della femmina F0 contenga solo embrioni croccanti materni.
- Il pomeriggio prima dell'esperimento, impostare le femmine iniettate F0 contro maschi wild-type e controllare gli incroci wild-type in scatole di accoppiamento zebrafish standard. Metti sia il pesce maschio che la femmina nella stessa vasca ma separali con un divisorio per la scatola di accoppiamento o posiziona la femmina all'interno di un inserto per la deposizione delle uova.
- La mattina dell'esperimento, consentire al maschio e alla femmina di iniziare l'accoppiamento, ad esempio, rimuovendo il divisore della scatola di accoppiamento o posizionando il maschio nello stesso inserto di deposizione delle uova della femmina.
- Raccogliere gli embrioni ogni 10 minuti spostando l'inserto per la deposizione delle uova in un nuovo fondo della vasca di accoppiamento che contiene acqua fresca del sistema ed etichettare la vasca con un'etichetta che identifica la singola femmina F0. Prendi la vecchia vasca di accoppiamento e versa l'acqua attraverso un colino da tè per raccogliere gli embrioni da una singola frizione di 10 minuti.
- Una volta che gli embrioni di una singola frizione di 10 minuti sono stati raccolti nel filtro, trasferirli in una capsula di Petri contenente 1x mezzo E3. Etichettare la capsula di Petri con l'ora di raccolta e le informazioni sul pesce.
- Sotto un microscopio da dissezione con una fonte di luce trasmessa, osservare gli embrioni in fase di sviluppo ogni ora per le prime 6-8 ore e ogni giorno per i prossimi 5 giorni.
- Identificare potenziali embrioni materni crispant mediante grossolani cambiamenti morfologici nel loro sviluppo rispetto ai controlli wild-type corrispondenti nel tempo29.
- Spostare i potenziali embrioni materni crispant in una capsula di Petri che contenga 1x E3 media e saggio per fenotipo morfologico a 24 hpf e vitalità (ad esempio, gonfiaggio della vescica natatoria) a 5 giorni dopo la fecondazione.
6. Sequenziamento degli alleli negli aploidi croccanti materni
NOTA: Gli aploidi croccanti materni contengono un singolo allele nel locus bersaglio, consentendo l'identificazione di INDELs nel gene bersaglio tramite sequenziamento Sanger. Gli embrioni aploidi croccanti materni possono anche essere analizzati utilizzando saggi di sequenziamento di nuova generazione. Gli embrioni che mostrano un fenotipo croccante materno dovrebbero portare una lesione in almeno uno dei quattro siti bersaglio (vedi discussione).
- Il pomeriggio prima dell'esperimento, hanno creato coppie di accoppiamento di femmine F0 note per produrre embrioni materni crispant incrociati con maschi selvatici. Tenere i maschi selvatici fisicamente separati dalle femmine usando un divisorio per la scatola di accoppiamento o posizionare la femmina nell'inserto per la deposizione delle uova.
- La mattina dell'esperimento, rimuovere la partizione fisica o posizionare sia i maschi che le femmine all'interno dell'inserto di deposizione delle uova per iniziare l'accoppiamento. Al primo segno di deposizione delle uova, interrompere l'allevamento separando il maschio e le femmine F0. Tenere ogni femmina F0 separata in singole scatole di accoppiamento.
- Preparare la soluzione di spermatozoi trattati con UV usando testicoli di un maschio wild-type per ogni 100 μL di soluzione di Hank (Tabella 2), sufficiente per fecondare le uova estruse da una femmina, come descritto in precedenza31.
- Estrusione manuale di ovuli maturi dalle femmine F0 preselezionate ed eseguire la fecondazione in vitro (IVF) utilizzando lo sperma trattato con UV31.
- Dopo la fecondazione in vitro , lasciare che gli embrioni aploidi si sviluppino fino a quando non si osserva il fenotipo del crispante materno e posizionare tali embrioni in una capsula di Petri diversa.
- Una volta identificati gli embrioni aploidi croccanti materni, lasciarli sviluppare per almeno 6 ore dopo la fecondazione.
- Per estrarre il DNA genomico da almeno dieci embrioni aploidi croccanti materni, posizionare un singolo embrione aploide in un singolo pozzetto di un tubo a striscia PCR, rimuovere i mezzi E3 in eccesso dal pozzetto e aggiungere 50 μL di 50 mM NaOH.
- Incubare gli embrioni a 95 °C per 20 minuti. Quindi raffreddare i campioni fino a 4 °C, aggiungere 5 μL di 1 M Tris HCL (pH 7,5) e vortice per 5-10 s. Il DNA estratto può essere conservato a -20 °C per un massimo di 6 mesi.
- Per identificare quali siti guida contengono INDEL, progettare primer di sequenziamento per amplificare un frammento di DNA che include tutti e quattro i siti bersaglio CRISPR-Cas9. Questi primer di sequenziamento consentono l'identificazione di INDEL che si estendono su più siti guida.
- Impostare due reazioni PCR da 25 μL per embrione utilizzando 5 μL del DNA genomico preparato e dei primer di sequenziamento.
- Al termine della PCR, purificare e concentrare i due campioni utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA (vedere Tabella dei materiali). Quindi sottoporre il frammento di DNA al sequenziamento Sanger utilizzando entrambi i primer di sequenziamento in avanti e indietro.
- Dopo che il frammento di crispant materno aploide è stato sequenziato, allinearlo alla sequenza wild-type e identificare gli INDEL nei siti bersaglio utilizzando un programma di allineamento della sequenza.
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Representative Results
L'approccio sperimentale descritto in questo protocollo consente l'identificazione dei fenotipi degli effetti materni in modo rapido ed efficiente sotto il profilo delle risorse (Figura 1).
Generazione di crispanti materni:
Quando si progettano i quattro RNA guida per colpire un singolo gene candidato ad effetto materno, si dovrebbe prestare particolare attenzione a dove gli RNA guida si legheranno al DNA. In generale, dovrebbero essere tutti raggruppati insieme con regioni minime o nulle sovrapposte tra gli RNA guida all'inizio del primo dominio proteico previsto (Figura 2A). Il targeting degli RNA guida verso questo dominio aumenta la possibilità che sia gli INDEL in-frame che quelli out-of-frame influenzino la funzione della proteina. Altre variabili che dovrebbero essere considerate quando si progettano RNA guida sono l'efficienza di taglio e il numero di siti off-target nel genoma.
Dopo aver iniettato la soluzione CRISPR-Cas9, l'attività somatica di Cas9 può essere determinata eseguendo un piccolo frammento di PCR, circa 100 bp, su un gel di agarosio. Se gli INDEL sono stati creati nell'embrione iniettato, si deve osservare uno striscio nei campioni iniettati ma non nel controllo non iniettato (Figura 2B). Ogni sito guida deve essere testato in modo indipendente per l'attività di Cas9 nelle cellule somatiche. Se si osservano strisci in almeno tre siti guida, gli embrioni iniettati tra fratelli devono essere cresciuti e sottoposti a screening per i fenotipi di crispanti materni.
Identificazione dei crispanti materni:
Per determinare se i crispant materni sono creati in incroci naturali, gli embrioni di un pesce femmina F0 possono essere confrontati con controlli wild-type abbinati al tempo per osservare eventuali cambiamenti nello sviluppo iniziale. Le frizioni F0 dovrebbero anche essere valutate a 24 hpf e 5 giorni dopo la fecondazione per esaminare lo sviluppo del piano corporeo di base e la vitalità, rispettivamente, per identificare i fattori materni che potrebbero regolare le fasi successive dello sviluppo embrionale. L'identificazione di un fenotipo condiviso in frizioni di diverse femmine F0 facilita la distinzione degli effetti causati dalla perdita di funzione di un gene bersaglio da effetti off-target o non specifici.
Inoltre, le frizioni contenenti crispanti materni sono tipicamente a mosaico (cioè, includono sia embrioni fenotipici wild-type che materni), consentendo agli embrioni wild-type di agire come controllo interno per variabili come i tempi di fecondazione e il tasso di sviluppo. In media, le frizioni di femmine F0 conterranno circa il 69% di embrioni materni crispant, con covate contenenti fino al 100% di embrioni materni crispant osservati11.
Dopo aver identificato gli embrioni materni crispanti, possono essere utilizzati per la caratterizzazione molecolare primaria, cioè l'immunomarcatura per i confini cellulari o la colorazione del DNA con DAPI, che può fornire informazioni sulla natura cellulare del processo di sviluppo interessato11. Il metodo del crispant materno può anche essere usato per fenocopiare mutazioni note con effetto materno, come motley, tmi e aura (Figura 3)11.
Sequenziamento degli aploidi materni crispanti:
Per identificare le lesioni genetiche che contribuiscono al fenotipo del crispant materno, gli spermatozoi trattati con UV e la fecondazione in vitro vengono combinati per creare aploidi crispanti materni (Figura 4). Lo sperma trattato con raggi UV fornisce un centriolo ma non contribuisce al DNA paterno, consentendo così la divisione cellulare con il solo materiale genomico materno. La creazione di un aploide consente il sequenziamento Sanger dell'allele materno e l'identificazione di INDEL croccanti materni (Figura 4). In media, sono stati osservati due alleli per frizione di aploide croccante materno. Gli INDEL identificati tramite sequenziamento Sanger includono modifiche sia in singoli siti guida che in cancellazioni che in più siti guida (Figura 4C, Tabella 3). Un'indagine sugli INDEL aploidi croccanti materni di diverse femmine F0 mostra che gli stessi siti guida sono modificati in più embrioni e la maggior parte delle mutazioni recuperate sono codoni di arresto prematuri (Tabella 3) 11.
Figura 1: Flusso di lavoro del croccante materno. Per creare un crispant materno, iniziare progettando quattro gRNA che colpiscono il primo dominio attivo del gene. 1) Quindi sintetizzare i quattro gRNA in una singola reazione. 2) Dopo aver sintetizzato e purificato i gRNA, creare un cocktail CRISPR-Cas9 e iniettarlo nel blastodisco di un embrione unicellulare. 3) Successivamente, eseguire lo screening degli embrioni iniettati per mutazioni somatiche utilizzando PCR ed elettroforesi su gel. Se gli INDEL fossero stati creati in campioni iniettati, apparirebbe uno striscio negli embrioni iniettati, in contrasto con la banda stretta del controllo wild-type. 4) Lasciare che i fratelli degli embrioni iniettati crescano per 3-6 mesi per raggiungere la maturità sessuale. Dopo aver raggiunto la maturità sessuale, incrociare una femmina iniettata F0 contro un maschio wild-type. La progenie risultante può essere una miscela di embrioni croccanti selvatici e materni. Identificare una femmina iniettata F0 i cui embrioni mostrano il fenotipo dell'effetto materno. 5) Per identificare le lesioni che contribuiscono al fenotipo, la fecondazione in vitro viene eseguita utilizzando spermatozoi trattati con UV per creare aploidi croccanti materni per il sequenziamento Sanger. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Generazione di INDELs in geni mirati. (A) Diagramma della struttura genica che mostra ipotetici domini proteici (blocchi viola chiaro e scuro), posizione dei gRNA (linee rosse) e siti PAM (stelle rosse). I gRNA sono mirati al primo dominio attivo. Gli esoni sono mostrati come blocchi e gli introni sono mostrati come linee. (B) Gli strisci in un gel di agarosio al 2,5% sono indicativi di INDELs nelle cellule somatiche negli embrioni iniettati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: I crispant materni ricapitolano il fenotipo delle mutazioni note dell'effetto materno. Confronto rappresentativo di embrioni selvatici vivi, abbinati al tempo (colonna di sinistra), mutanti materni noti (colonna centrale) ed embrioni materni crispanti (colonna di destra). (A) motley/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura/mid1ipIl mutanti/crispanti materni mostrano difetti nella citochinesi nelle prime divisioni embrionali, portando a blastula completamente sinciziale (A, B) o embrioni parzialmente acellulari (C, scatola bianca). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Utilizzo di aploidi crispanti materni per sequenziare le mutazioni indotte da CRISPR-Cas9 . (A) Una femmina iniettata F0 incrociata contro un maschio wild-type si traduce in un embrione diploide con un fenotipo di effetto materno. (B) La fecondazione in vitro viene eseguita utilizzando spermatozoi trattati con UV per creare aploidi croccanti materni, consentendo il sequenziamento e l'analisi degli INDEL indotti nell'allele materno. (C) Sequenziamento rappresentativo dell'aploide croccante materno birc5b che mostra un'ampia delezione tra i siti guida 3 e 4 (riquadro). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Miscela PCR | ||
| Aggiungere | ||
| sterile H2O | 171,12 ml | |
| MgCl2 (1 M) | 0,393 ml | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.4) | 2,618 ml | |
| KCl (1 M) | 13,092 ml | |
| Autoclave per 20 minuti, quindi raffreddare la soluzione su ghiaccio. Aggiunta successiva | ||
| BSA (100 mg/ml) | 3.468 ml | |
| dATP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dCTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dGTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dTTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| Aliquote in provette sterili per microcentrifuga | ||
| Ricetta PCR | per campione | |
| Miscela PCR | 17,9 μL | |
| Primer F + R (10 μM) | 0,2 μL | |
| ROH2O | 1,8 μL | |
| Taq DNA polimerasi | 0,1 μL | |
| DNA | 5 μL | |
Tabella 1: Miscela PCR.
| La soluzione di Hank | |||
| Hank's Premix | Combinare quanto segue nell'ordine: (1) 10,0 mL di HS #1, (2) 1,0 mL di HS#2, (3) 1,0 mL di HS#4, (4) 86 mL di ddH2O, (5) 1,0 mL di HS#5. Conservare tutte le soluzioni HS a 4 °C | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8,0 g di NaCl, 0,4 g di KCl in 100 mL di ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0,358 g di Na2HPO4 anidro; 0,60 g di K 2 H 2 PO4 in 100 mL di ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0,72 g di CaCl 2 in 50 mL di ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1,23 g di MgSO4·7H 2 O in 50 mL di ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0,35 g di NaHCO3 in 10,0 mL di ddH20; fare fresco il giorno dell'uso | ||
| La soluzione finale di lavoro di Hank | Combinare 9,9 mL di Hank's Premix con 0,1 mL di HS Stock #6 | ||
Tabella 2: La soluzione di Hank.
| birc5b #1 | birc5b #2 | birc5b #3 | prc1l #1 | PRC1L #2 | ||
| Numero totale di embrioni sequenziati | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Numero totale di embrioni con INDELs | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Mutazione in un sito | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Mutazioni in più siti | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Posizione di INDELs | ||||||
| Sito guida 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Sito guida 2 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | |
| Sito guida 3 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Sito guida 4 | 3 | 9 | 12 | 0 | 10 | |
| Tipi di INDELs | ||||||
| Mutazione in-frame | 1 | 2 | 2 | 7 | 10 | |
| Mutazione dello spostamento del frame | 4 | 7 | 10 | 9 | 10 | |
Tabella 3: La posizione e il tipo di INDELs trovati in due diversi set di aploidi croccanti materni: birc5b e prc1l.
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Discussion
Il protocollo presentato in questo manoscritto consente l'identificazione e la caratterizzazione molecolare primaria di un fenotipo ad effetto materno in una singola generazione invece delle molteplici generazioni richieste per le tecniche genetiche sia dirette che inverse. Attualmente, il ruolo di molti geni espressi per via materna è sconosciuto. Questa mancanza di conoscenza è in parte dovuta alla generazione extra necessaria per visualizzare un fenotipo quando si identificano i geni dell'effetto materno. In passato, la rapida identificazione dei geni ad effetto materno nel pesce zebra poteva essere ottenuta iniettando oligonucleotidi morfolino che bloccano la traduzione negli ovociti in coltura32. Questo metodo si è dimostrato efficace fenocopiando più geni noti con effetto materno, ma manipolare un ovocita immaturo può essere un esperimento delicato e dispendioso in termini di tempo. Gli RNA materni possono anche essere mirati alla degradazione utilizzando i complessi CRISPR-RfxCas13d, ma l'iniezione di questi complessi nell'embrione unicellulare non può colpire la proteina33 fornita dalla madre. Più recentemente, è stato scoperto che CRISPR-Cas9 può indurre mutazioni bialleliche nella linea germinale, consentendo la rapida identificazione di nuovi geni con effetto materno in una singola generazione11.
Questo protocollo include diversi passaggi critici che contribuiscono al recupero degli embrioni materni crispant. In teoria, poiché le cellule germinali sono specificate nello sviluppo embrionale precoce, prima viene creata una lesione del DNA in un gene bersaglio, maggiore è la probabilità che una cellula contenente mutazioni diventi parte della linea germinale. Questo metodo utilizza la proteina Cas9 iniettata nel blastodisco in via di sviluppo di un embrione unicellulare per aumentare la probabilità di modifiche nella linea germinale. Un altro fattore critico che influenza la percentuale di embrioni croccanti materni recuperati è l'efficienza degli RNA guida nella creazione di modifiche genetiche nei siti bersaglio. Questa procedura include una sezione sulla determinazione della capacità degli RNA guida di creare INDEL somatici a 24 hpf mediante PCR. Se un RNA guida non riesce a fare modifiche somatiche, ha una bassa probabilità di produrre modifiche nella linea germinale ad un tasso abbastanza alto da generare un crispant materno. Questo protocollo indirizza l'utente a testare le modifiche somatiche, che dovrebbero essere visibili in tre o più siti guida.
Dopo aver osservato il fenotipo degli embrioni materni crispant, le lesioni genetiche che contribuiscono al fenotipo possono essere analizzate a livello di sequenza tramite fecondazione in vitro con spermatozoi trattati con UV. Per acquisire abbastanza materiale di partenza per la PCR, gli embrioni aploidi croccanti materni dovrebbero svilupparsi per almeno sei-otto ore, consentendo il verificarsi di più cicli di replicazione del DNA. Il DNA genomico dovrebbe anche essere estratto in 50 μL di 50mM NaOH per concentrare il DNA. Se gli embrioni aploidi croccanti materni non possono sopravvivere per 6-8 ore, raccogliere gli embrioni in un momento precedente. Per tenere conto del fatto che l'embrione subisce meno cicli di replicazione del DNA, estrarre il DNA in un volume più piccolo di 50 mM NaOH mantenendo la stessa proporzione di NaOH e Tris-HCL. Un'altra opzione è quella di concentrare il DNA estratto utilizzando un kit di pulizia e concentrazione del DNA. Dopo che il DNA è stato estratto, il frammento di PCR utilizzato per il sequenziamento dovrebbe includere tutti e quattro i siti bersaglio, se possibile. Questo frammento consentirà l'identificazione di grandi delezioni che si estendono su più siti guida negli embrioni materni croccanti.
Quando si raccolgono aploidi croccanti materni per il sequenziamento Sanger, raccogliere tutti gli aploidi che mostrano il fenotipo e inviare un minimo di 10 campioni di embrioni aploidi unici al sequenziamento Sanger. Il sequenziamento di più embrioni aploidi per frizione consentirà l'identificazione di più INDEL trovati nella linea germinale. I dati di sequenziamento precedenti degli aploidi materni crispanti hanno dimostrato che più alleli possono essere identificati in un set di aploidi materni crispanti11. Tuttavia, questi alleli non vengono recuperatinel rapporto 1 a 1 atteso. Il sequenziamento di più embrioni aiuterà anche a sostenere l'idea che il fenotipo sia causato da un INDEL CRISPR-Cas9 nel gene bersaglio. Qualsiasi sequenza wild-type osservata in embrioni aploidi sequenziati che mostrano un fenotipo specifico suggerirà che il fenotipo non è associato al gene bersaglio. Qualsiasi nuovo fenotipo di effetto materno identificato attraverso il targeting di geni precedentemente non caratterizzati dovrebbe essere confermato anche stabilendo una linea stabile utilizzando il fratello F0 maschi11.
In alcuni casi, può essere difficile identificare gli INDEL tramite analisi aploide in cui il fenotipo crispante materno identificato ha una certa caratteristica fenotipica. Ad esempio, gli embrioni aploidi croccanti materni che sembrano non fecondati o la lisi durante la fase di scissione possono essere impossibili da selezionare. Anche gli embrioni materni crispanti con difetti di estensione dell'asse simili a quelli corrispondenti alla sindrome aploide possono non essere distinguibili per l'analisi durante la generazione di aploidi materni34. In questi casi, si consiglia al ricercatore di condurre l'analisi direttamente utilizzando linee stabili per la conferma gene-fenotipo.
Una limitazione dell'attuale protocollo del crispant materno è che identifica i geni dell'effetto materno solo da difetti morfologici grossolani. Per aumentare la sensibilità del metodo e renderlo più specifico per alcuni aspetti dello sviluppo precoce, i reporter transgenici potrebbero essere utilizzati per evidenziare strutture o tipi di cellule specifici, come è stato fatto per altri schermi 9,10,35. Ad esempio, la miscela CRISPR-Cas9 potrebbe essere iniettata nella linea transgenica Buc-GFP per identificare geni non letali che regolano la formazione e lo sviluppo delle cellule germinali primordiali36. Un'altra limitazione del protocollo del crispante materno è che, sebbene utile per i geni espressi esclusivamente durante lo sviluppo precoce, potrebbe non essere efficace per i geni con funzione sia materna che zigotica poiché il targeting CRISPR-Cas9 del gene potrebbe essere letale per l'embrione in via di sviluppo. Per studiare la funzione materna dei geni espressi durante lo sviluppo, l'attività di Cas9 potrebbe essere mirata alla linea germinale37, lasciando così inalterata la funzione somatica del gene e permettendo la sopravvivenza delle femmine F0 fino all'età adulta.
I crispanti materni sono uno strumento efficace per identificare nuovi geni di effetto materno necessari per lo sviluppo precoce. La combinazione di RNA guida multiplexing verso un singolo bersaglio e la capacità di editing biallelico di Cas9 consente di osservare il fenotipo dell'effetto materno in una singola generazione, evitando schemi di allevamento multi-generazione tipicamente necessari quando si esegue l'editing genico mirato. Il bypassare più generazioni diminuisce la quantità di spazio e risorse necessarie per identificare i geni dell'effetto materno.
Oltre a identificare nuovi geni per effetto materno, questo protocollo consente a qualsiasi laboratorio di zebrafish di fenocopiare e studiare qualsiasi mutante noto con effetto materno senza stabilire e mantenere linee stabili, facilitando l'analisi dettagliata dei percorsi genetici. In linea di principio, questo approccio croccante materno può anche determinare la funzione dei prodotti materni nelle specie modello non genetiche.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri passati e attuali dello staff zootecnico del laboratorio Pelegri per la loro cura della struttura acquatica. Siamo anche grati per i commenti e le intuizioni sul manoscritto di Ryan Trevena e Diane Hanson. Il finanziamento è stato fornito dalla sovvenzione NIH a F.P. (GM065303)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
| 100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
| 70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
| Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
| Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
| Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
| Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
| Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
| Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
| General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Gloves | Any Maker | ||
| Ice Bucket | Any Maker | ||
| Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Female zebrafish | |||
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
| Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
| MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
| Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
| Micropipeters | Any Maker | ||
| Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
| Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
| Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
| Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
| nuclease-free water | Any Maker | ||
| Paper Towel | Any Maker | ||
| Pastro Pipettes | Any Maker | ||
| PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
| Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
| Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
| Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
| Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatula | Any Maker | ||
| Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
| Tape | Any Maker | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
| Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
| UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
| Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
| 1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse free ethanol | any maker | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
| Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agarose | any maker | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | any maker | ||
| Dissecting Forcepts | any maker | ||
| Dissecting Microscope | any maker | ||
| Dissecting Scissors | any maker | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
| Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fish Net | any maker | fine mesh | |
| Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
| Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
| Gel Electropheresis System | any maker | ||
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
| Glass Dishes | any maker | ||
| Gloves | any maker | ||
| Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ice Bucket | any maker | ||
| Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
| In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Male and Female zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Microinjector | |||
| Microneedle Slide | |||
| Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
| Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
| Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
| Microplastic slide | |||
| Microwave | any maker | ||
| MiliQ Water | any maker | ||
| mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Narrow Spatula | any maker | ||
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Paper Towel | any maker | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
| PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
| Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
| Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software for sanger sequencing Analysis | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterlie H2O | any brand | ||
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Tape | any brand | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
| UV lamp | UVP | ||
| UV safety glasses | any maker | ||
| Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
| Zebrafish mating boxes | any maker | ||
| PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |
References
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