Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Определение роли матерински-экспрессированных генов в раннем развитии с материнскими криспантами

Published: December 21, 2021 doi: 10.3791/63177
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

Раннее развитие зависит от продуктов, унаследованных матерью, и роль многих из этих продуктов в настоящее время неизвестна. Здесь мы описали протокол, который использует CRISPR-Cas9 для идентификации фенотипов материнского эффекта в одном поколении.

Abstract

Раннее развитие зависит от пула материнских факторов, включенных в зрелую яйцеклетку во время оогенеза, которые выполняют все клеточные функции, необходимые для развития, до активации зиготического генома. Как правило, генетическое нацеливание на эти материнские факторы требует дополнительного поколения для выявления фенотипов материнского эффекта, препятствуя способности определять роль матерински-экспрессированных генов во время развития. Открытие возможностей биаллельного редактирования CRISPR-Cas9 позволило провести скрининг эмбриональных фенотипов в соматических тканях введенных эмбрионов или «хрустящих веществ», усилив понимание роли зиготически экспрессированных генов в программах развития. В этой статье описывается протокол, который является расширением метода crispant. В этом методе биаллельное редактирование половых клеток позволяет выделить фенотип материнского эффекта в одном поколении, или «материнские хрустящие вещества». Мультиплексирование направляющих РНК к одной мишени способствует эффективному производству материнских хрустящих веществ, в то время как анализ последовательности материнских хрустящих гаплоидов обеспечивает простой метод подтверждения генетических поражений, которые производят фенотип материнского эффекта. Использование материнских криспантов способствует быстрой идентификации основных генов, экспрессируемых матерью, тем самым облегчая понимание раннего развития.

Introduction

Пул материнских продуктов (например, РНК, белков и других биомолекул) необходим для всех ранних клеточных процессов до тех пор, пока не будет активирован зиготный геном эмбриона1. Преждевременное истощение этих продуктов из ооцита, как правило, является эмбриональным летальным. Несмотря на важность этих генов в развитии, роль многих материнских экспрессированных генов в настоящее время неизвестна. Прогресс в технологии редактирования генов у рыбок данио, такой как CRISPR-Cas9, позволяет нацеливаться на гены, экспрессируемые матерью 2,3,4. Однако идентификация фенотипа материнского эффекта требует дополнительного поколения по сравнению с зиготным фенотипом, что требует больше ресурсов. В последнее время возможность биаллельного редактирования CRISPR-Cas9 была использована для скрининга эмбриональных фенотипов в соматических тканях инъекционных (F0) эмбрионов, известных как «хрустящие вещества» 5,6,7,8,9,10. Метод crispant позволяет проводить ресурсосберегающий скрининг генов-кандидатов в соматических клетках, облегчая понимание конкретных аспектов развития. Протокол, описанный в этой статье, позволяет идентифицировать фенотипы материнского эффекта, или «материнские хрустящие жидкости», в одном поколении11. Эта схема достижима путем мультиплексирования направляющих РНК к одному гену и стимулирования событий биаллельного редактирования в зародышевой линии. Эти материнские хрустящие эмбрионы могут быть идентифицированы по грубым морфологическим фенотипам и подвергнуться первичной характеристике, такой как маркировка границ клеток и паттерн ДНК11. Комбинированный анализ наблюдаемого фенотипа и базовой молекулярной характеристики индуцированных INDL позволяет прогнозировать роль целевого гена в раннем развитии.

У рыбок данио в течение первых 24 ч после оплодотворения (HPF) небольшая группа клеток развивается в первичные половые клетки, предшественник зародышевой линии 12,13,14,15. В кладках, заложенных самками F0, доля восстановленных материнских хрустящих эмбрионов зависит от того, сколько половых клеток содержат биаллелевое событие редактирования в целевом гене. В целом, чем раньше происходит событие редактирования у эмбриона, тем выше вероятность мутаций CRISPR-Cas9, наблюдаемых в зародышевой линии. В большинстве случаев фенотипы материнских хрустящих эмбрионов происходят из-за потери функции в двух материнских аллелях, присутствующих в развивающейся яйцеклетке. Когда яйцеклетка завершает мейоз, один из материнских аллелей выдавливается из эмбриона через полярное тело, в то время как другой аллель включается в материнский пронуклеус. Секвенирование нескольких материнских хрустящих гаплоидов будет представлять собой смесь мутаций (вставок и/или делеций (INDL)), присутствующих в зародышевой линии, которые способствуют фенотипу11.

Следующий протокол описывает необходимые шаги для создания мутаций CRISPR-Cas9 в генах материнского эффекта и идентификации соответствующего фенотипа с использованием материнского криспантного подхода (рисунок 1). В первом разделе будет объяснено, как эффективно проектировать и создавать направляющие РНК, в то время как во втором и третьем разделах содержатся критические шаги по созданию материнских хрустящих кислот путем микроинъекции. После инъекции смеси CRISPR-Cas9 введенные эмбрионы проверяются на соматические правки с помощью ПЦР (раздел четвертый). Как только введенные эмбрионы F0 развиваются и достигают половой зрелости, самки F0 скрещиваются с самцами дикого типа, а их потомство проверяется на фенотипы материнского эффекта (раздел пятый). Шестой раздел включает инструкции по созданию материнских хрустящих гаплоидов, которые могут быть объединены с секвенированием Сэнгера для идентификации CRISPR-Cas9-индуцированных INDEL. Кроме того, Обсуждение содержит изменения, которые могут быть внесены в протокол для повышения чувствительности и мощности этого метода.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В исследованиях, приведших к разработке этого протокола, все жилища и эксперименты рыбок данио были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Висконсина-Мэдисона (IACUC-M005268-R2).

1. Синтез направляющих РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Зиготные хрустящие вещества были созданы с использованием одной направляющей РНК или мультиплексирования нескольких направляющих РНК в одну мишень 5,6,7,8,9,10. Мультиплексирование направляющих РНК увеличивает процент эмбрионов, демонстрирующих зиготный хрустящий фенотип10. Из-за этой повышенной частоты эмбрионов, демонстрирующих фенотип, материнские хрустящие вещества создаются путем мультиплексирования четырех направляющих РНК в один ген. Более подробный протокол по использованию CHOPCHOP для разработки направляющих РНК и метод отжига для синтеза направляющих РНК для рыбок данио можно найти в другом месте 16,17,18,19,20.

  1. Чтобы идентифицировать материнско-экспрессированный ген для мишени, определите уровни транскрипта мРНК во время развития с помощью базы данных последовательностей РНК, которая предоставляет информацию о транскриптоме от зиготы до 5 дней21. В целом, материнские специфические гены высоко экспрессируются в раннем эмбрионе и деградируют после активации зиготического генома22.
  2. После того, как ген-мишень с материнской экспрессией был идентифицирован, определите первый прогнозируемый белковый домен, используя раздел «домены и особенности», доступный в браузере генома Ensembl23. Используйте этот домен в качестве целевого региона для четырех направляющих РНК.
  3. Используйте программу выбора направляющей РНК CHOPCHOP для идентификации четырех целевых сайтов направляющей РНК в первом активном домене. Разработка ген-специфических олигонуклеотидов, как показано ниже для каждого целевого участка. В геноспецифическом олигонуклеотиде секцияN20 соответствует целевой последовательности за вычетом сайта PAM (NGG) из CHOPCHOP. Упорядочивайте эти геноспецифические олигонуклеотиды и постоянный олигонуклеотид с помощью стандартной опреснительной очистки (см. Таблицу материалов).
    Геноспецифический олигонуклеотид:
    5' ТААТАКГАКТКАКТАТА- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3'
  4. Чтобы создать шаблон направляющей РНК для каждого геноспецифического олигонуклеотида, отожгите его до постоянного олигонуклеотида и заполните выступы Т4-ДНК-полимеразой, как описано ранее16. После того, как четыре шаблона направляющей РНК собраны, очистите и сконцентрируйте их вместе с помощью комплекта для очистки ДНК и концентратора в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  5. Синтезируйте смесь sgRNA из объединенного шаблона направляющей РНК с помощью набора транскрипции in vitro T7 (см. Таблицу материалов). Выполните транскрипцию in vitro в соответствии с инструкциями производителя. Использование полуреакций набора транскрипции T7 может снизить стоимость одной реакции.
  6. После синтеза РНК очищают полученный пул sgRNAs с использованием протокола этанола/ацетата аммония, как описано ранее 16,20,24. После того, как РНК была выделена, повторно суспендируйте ее в 20 мкл воды без нуклеазы. Если для транскрибирования пула sgRNAs использовались полуреакции набора транскрипции T7, повторно суспендировали очищенную РНК в 10-15 мкл воды без нуклеазы.
  7. Количественно оцените количество объединенных sgRNAs, которые были созданы с помощью спектрофотометра. Разбавляют пул sgRNAs в безнуклеазной воде до разбавления 1500 нг/мкл ± 500 нг/мкл. Как правило, конечный объем рабочего разбавления колеблется в пределах 30-50 мкл.
  8. После определения концентрации пула sgRNAs, проверьте целостность sgRNAs на 1% агарозном геле.
    1. Отлить 1% агарозы/0,5 мкг/мл бромида этидия/Геля TBE. Как только гель затвердеет, поместите его в буфер работы TBE.
    2. Смешайте 1 мкл смеси сгРНК и 1 мкл нагрузочного буфера РНК-геля (см. Таблицу материалов). Загрузите этот образец в гель и запустите гель при 100 В в течение 5 минут.
  9. Визуализируйте полосы с помощью ультрафиолетового (УФ) света. Пул sgRNAs должен отображаться как единая полоса. Если наблюдается мазок, вероятно, произошла деградация РНК.
  10. Храните пул sgRNAs в одноразовых аликвотах объемом 1 мкл в безнуклеазных ленточных трубках ПЦР в морозильной камере -80 °C. Для больших объемов смеси sgRNAs (30 мкл или более) аликвотирует половину объема в безнуклеазные трубки ПЦР-полоски, а другую половину хранит в виде большего объема в микроцентрифужной трубке без нуклеазы. Оттаивайте и аликвотируйте, когда это необходимо.
  11. Чтобы предотвратить деградацию РНК, убедитесь, что образцы в трубке микроцентрифуги проходят не более двух циклов замораживания-оттаивания.

2. Подготовка реагентов и материалов для микроинъекции

ПРИМЕЧАНИЕ: У рыбок данио инъекция мРНК Cas9 может создать зиготные хрустящие тона. Однако исследования показали, что белок Cas9 более эффективен в создании INDEL у введенных эмбрионов 16,25. Этот протокол использует белок Cas9 для генерации материнских криспантов, потому что этот белок не испытывает такого же отставания в активности, как инъекционная мРНК Cas9. Теоретически, это должно увеличить вероятность биаллельной мутации на ранней стадии развития, что приведет к увеличению вероятности поражения более обширного участка зародышевой линии. Другие протоколы и ресурсы, подробно описывающие, как подготовиться к микроинъекциям, можно найти в другом месте24,26.

  1. Покупка или генерация белка Cas9 (см. Таблицу материалов). Повторно суспендировать белок Cas9 в воде без нуклеазы, чтобы получить раствор 2 мг/мл и аликвотировать 1 мкл в полипропиленовые микроцентрифужные трубки без РНКазы. Храните их в виде одноразовых трубок при -80 °C.
  2. Во второй половине дня перед инъекцией используйте съемник микропипетки, чтобы вытянуть стеклянный капилляр и создать инъекционную иглу. Храните неповрежденную иглу в закрытом держателе иглы до утра микроинъекций.
  3. Чтобы создать инъекционную пластину, залейте 20 мл 1,5% агарозы/стерильнойH2O, чтобы заполнить половину чашки Петри размером 100 мм X 15 мм и подождите, пока она затвердеет. После того, как раствор агарозы установлен, добавьте 20 мл 1,5% агарозы/стерильнойH2Oв чашку Петри и поместите пластиковую форму (см. Таблицу материалов) в жидкую агарозу и дайте ей затвердеть.
  4. После того, как агароза затвердеет, снимите пластиковую форму и храните инжекторную пластину вверх ногами в холодильнике до утра инъекций. Одна пластина может быть использована для нескольких закачек, если скважины сохраняют свою целостность.

3. Микроинъекция коктейля CRISPR-Cas9 в одноклеточный эмбрион рыбки данио для получения материнских хрустящих веществ

ПРИМЕЧАНИЕ: Больше ресурсов для микроинъекции эмбрионов рыбок данио можно найти в других местах 24,26,27. Введение смеси CRISPR-Cas9 в развивающийся бластодиск одноклеточных эмбрионов может увеличить вероятность создания материнских хрустящих хлопьев. Смесь также может быть введена в желточный мешок до 2-клеточной стадии. Однако смеси, вводимые в желток, зависят от ооплазматического потока, чтобы достичь бластодиска, поэтому CRISPR-Cas9, введенный в желток, может снизить эффективность резки CRISPR-Cas928.

  1. Во второй половине дня перед микроинъекциями установите дикие скрещивания в брачных ящиках рыбок данио. Держите самцов и самок рыб в одном аквариуме, но разделяйте их разделителем брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
  2. Утром в день эксперимента вынимают одну аликвоту 2 мг/мл белка Cas9 и одну аликвоту пула sgRNAs. В трубке полипропиленовой микроцентрифуги без РНКазы, содержащей белок Cas9, соберите инъекционную смесь объемом 5 мкл, которая включает пул sgRNAs, 1 мкл 0,5% фенольного красного раствора и воду без нуклеазы. Стремитесь к конечной концентрации 400 нг/мкл белка Cas9 и 200 нг/мкл объединенных sgRNAs в воде без РНКазы или соотношения белка Cas9 к sgRNAs в введенном эмбрионе 2:1. Эту инъекционную смесь можно хранить на льду в течение утра инъекции.
  3. Извлеките инъекционную пластину из холодильника и дайте ей нагреться до комнатной температуры (RT) не менее 20 минут.
  4. После того, как коктейль для инъекций собран, позвольте самцу и самке спариваться, например, удалив разделитель брачного ящика или поместив самца в ту же яйцекладущую вставку, что и самка, в зависимости от обстоятельств.
  5. После того, как рыба уложится, но до того, как эмбрионы будут собраны, отрежьте кончик неповрежденной иглы, используя новое лезвие бритвы или тонкие щипцы, чтобы создать иглу, которая имеет отверстие, достаточно маленькое, чтобы избежать повреждения эмбриона, но достаточно широкое, чтобы оно не засорилось инъекционной смесью. После того, как игла была разрезана, загрузите иглу инъекционной смесью, используя наконечник пипетки микрозагрузчика, вставленный в задний конец капилляра (см. Таблицы материалов).
  6. После того, как игла заполнена, инкубируйте иглу в течение 5 минут на RT для сборки комплексов Cas9-sgRNA.
  7. Включите микроинжектор и вставьте иглу в микроманипулятор. Поместите каплю минерального масла на микрометровый слайд и откалибруйте иглу, регулируя давление впрыска, пока игла не выдаст болюс 1 нЛ в минеральное масло.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При впрыскивании в минеральное масло болюс 1 нЛ будет иметь диаметр приблизительно 0,125 мм (или радиус 0,062 мм), измеренный с помощью микрометрового слайда.
  8. Чтобы синхронизировать эмбрионы, соберите их через 10 мин с помощью пластикового ситечка и промойте их в чашку Петри, используя 1 среду E3 (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl2, 0,33 мМ MgSO4, и добавьте 20 мкл 0,03 М метиленового синего на 1 л 1x E3). Удалите 10-15 эмбрионов и поместите их в отдельную чашку Петри, которая будет храниться в качестве неинъективного контроля.
  9. Перенесите остальные развивающиеся эмбрионы в лунки инъекционной пластины.
  10. Вводят 1 нл раствора (в общей сложности 400 пг белка Cas9 и 200 пг sgRNAs) в развивающийся бластодиск одноклеточного эмбриона. Если кончик иглы забивается, используйте щипцы, чтобы сломать наконечник назад и повторно откалибровать иглу, чтобы извлечь болюс 1 нЛ. Убедитесь, что введены все эмбрионы в течение первых 40 минут развития после оплодотворения.
  11. После того, как инъекция будет завершена, верните введенные эмбрионы в меченую чашку Петри, которая содержит 1 среду E3 и позвольте им развиваться в течение дня. Удалите все эмбрионы, которые не оплодотворены или не развиваются нормально в соответствии с серией29 стадий рыбок данио.

4. Скрининг на соматические INPEL у эмбрионов, введенных f0

ПРИМЕЧАНИЕ: Другие методы идентификации INPEL, такие как анализ эндонуклеазы T7 I или анализ плавления с высоким разрешением, могут быть использованы при определении того, содержат ли эмбрионы соматические INDELs 30.

  1. На следующий день после инъекций удалите дефектные и лизированные эмбрионы из чашки Петри и замените 1 среду E3 для поддержания здоровья эмбрионов.
  2. После очистки посуды соберите шесть здоровых введенных эмбрионов и два контрольных эмбриона из неинъецированной пластины. Поместите каждый эмбрион по отдельности в одну лунку трубки для полоски ПЦР и пометьте верхнюю часть трубок.
  3. Чтобы извлечь геномную ДНК отдельных эмбрионов, удалите излишки среды E3 из лунок ленточной трубки и добавьте 100 мкл 50 мМ NaOH на лунку.
  4. Инкубируют эмбрионы при 95 °C в течение 20 мин. Затем охладите образцы до 4 °C, добавьте 10 мкл 1 M Tris HCL (рН 7,5) и вращайте их в течение 5-10 с. Эта извлеченная ДНК может храниться при -20 °C в течение не менее 6 месяцев без значительной деградации ДНК.
  5. Разработайте уникальные экранирующие праймеры для каждого направляющего участка, чтобы усилить фрагмент ДНК 100-110 bp, который включает в себя целевой сайт CRISPR-Cas9. Если возможно, поместите целевой сайт в середину усиленного фрагмента, что позволит идентифицировать более крупные удаления.
  6. Для каждого из четырех направляющих целевых участков настройте восемь 25 мкл ПЦР-реакций с использованием 5 мкл подготовленной геномной ДНК одного эмбриона, смеси ПЦР и направляющих скрининговых праймеров для выявления соматических мутаций в целевом участке (таблица 1).
  7. Отлите 2,5% агарозы/0,5 мкг/мл этидия бромида/Геля TBE с использованием гребней, которые создают скважины шириной около 0,625 см. Эта широкая гребень обеспечивает лучшее разрешение при обнаружении изменений размера геномной последовательности. После того, как гель затвердеет, поместите его в камеру электрофореза, которая содержит работающий буфер TBE.
  8. Добавьте 5 мкл 6-кратного нагрузочного красителя в продукт ПЦР и загрузите 25 мкл этой смеси в гель. Убедитесь, что введенные и контрольные образцы выполняются на одном ряду геля. После того, как все образцы загружены, добавьте 5 мкл бромида этидия на 1 л работающего буфера TBE к положительному концу гелевой коробки.
  9. Запускайте гель при 120 В до тех пор, пока полосы ДНК не разрешатся или ДНК не приблизится к концу полосы. Если Cas9 создал INDL в целевом участке, мазок обычно наблюдается в введенных образцах, но не в контрольных элементах.
  10. Если мазки наблюдаются как минимум в трех из четырех направляющих участков у эмбрионов, вводимых четырьмя направляющими РНК, растут эмбрионы, которым вводят эмбрионы.
  11. Всякий раз, когда введенные образцы не содержат мазков в необходимом количестве направляющих участков, разрабатывайте новые направляющие РНК для замены тех, которые не работали, и создавайте новый пул направляющих РНК, который включает те, которые работали, и вновь разработанные. Введите и протестируйте новый пул на наличие соматических INDL, как описано выше.

5. Идентификация фенотипов материнского эффекта у материнских хрустящих эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Как только введенные самки F0 достигают половой зрелости, их клетки зародышевой линии могут генерировать смесь материнских хрустящих и диких эмбрионов. Несмотря на то, что эта смесь позволяет осуществлять внутренний контроль за оплодотворением и сроками развития, все же полезно установить скрещивание дикого типа в качестве внешнего контроля в случае, если сцепление от самки F0 содержит только материнские хрустящие эмбрионы.

  1. Во второй половине дня перед экспериментом настройте самок F0 против самцов дикого типа и контролируйте скрещивания дикого типа в стандартных брачных ящиках для рыбок данио. Поместите самца и самку рыб в один аквариум, но разделите их разделителем брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
  2. Утром в день эксперимента позвольте самцу и самке начать спаривание, например, удалив разделитель брачного ящика или поместив самца в ту же яйцекладущую вставку, что и самка.
  3. Собирайте эмбрионы каждые 10 минут, перемещая яйцекладущую вставку в новое дно брачного резервуара, которое содержит пресную системную воду, и маркируйте резервуар меткой, идентифицирующей особую самку F0. Возьмите старый брачный бак и налейте воду через чайное ситечко, чтобы собрать эмбрионы из одной индивидуальной 10-минутной кладки.
  4. После того, как эмбрионы из одной 10-минутной муфты будут собраны в ситечке, перенесите их в чашку Петри, содержащую 1 среду E3. Пометьте чашку Петри временем сбора и информацией о рыбе.
  5. Под рассекающим микроскопом с прошедшим источником света наблюдайте за эмбрионами, подвергающимися развитию, каждый час в течение первых 6-8 ч и ежедневно в течение следующих 5 дней.
  6. Идентифицировать потенциальные материнские хрустящие эмбрионы по грубым морфологическим изменениям в их развитии по сравнению с контрольными группами дикого типа29.
  7. Переместите потенциальные материнские хрустящие эмбрионы в чашку Петри, которая содержит 1 среду E3 и анализ на морфологический фенотип при 24 л.с.ф. и жизнеспособность (например, инфляция плавательного пузыря) через 5 дней после оплодотворения.

6. Секвенирование аллелей в материнских хрустящих гаплоидах

ПРИМЕЧАНИЕ: Материнские хрустящие гаплоиды содержат один аллель в целевом локусе, что позволяет идентифицировать INDELs в гене-мишени с помощью секвенирования Сэнгера. Эмбрионы материнских хрустящих гаплоидов также могут быть проанализированы с использованием анализов секвенирования следующего поколения. Ожидается, что эмбрионы, которые показывают фенотип материнского хрустящего вещества, будут нести поражение по крайней мере в одном из четырех целевых участков (см. Обсуждение).

  1. Во второй половине дня перед экспериментом установили спаривание пар самок F0, которые, как известно, производят материнские хрустящие эмбрионы, скрещенные с самцами дикого типа. Держите самцов дикого типа физически отделенными от самок с помощью разделителя брачного ящика или поместите самку в вставку для яйцекладки.
  2. Утром в день эксперимента удалите физическую перегородку или поместите самцов и самок в яйцекладущую вставку, чтобы начать спаривание. При первых признаках яйцекладки прерывают размножение, разделяя самца и самок F0. Держите каждую отдельную самку F0 в отдельных брачных коробках.
  3. Готовят обработанный УФ-излучением раствор спермы с использованием яичек одного самца дикого типа на каждые 100 мкл раствора Хэнка (таблица 2), достаточные для оплодотворения экструдированных яйцеклеток одной самки, как описано ранее31.
  4. Вручную экструдируйте зрелые яйцеклетки из предварительно отобранных самок F0 и выполняйте экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) с использованием очищенных УФ-излучением сперматозоидов31.
  5. После экстракорпорального оплодотворения позвольте гаплоидным эмбрионам развиваться до тех пор, пока не будет наблюдаться фенотип материнского хрустящего вещества, и поместите эти эмбрионы в другую чашку Петри.
  6. После того, как материнские гаплоидные эмбрионы были идентифицированы, позвольте им развиваться в течение не менее 6 часов после оплодотворения.
  7. Чтобы извлечь геномную ДНК по меньшей мере из десяти материнских гаплоидных эмбрионов, поместите один гаплоидный эмбрион в отдельный колодец трубки для полосы ПЦР, удалите излишки среды E3 из скважины и добавьте 50 мкл 50 мМ NaOH.
  8. Инкубируют эмбрионы при 95 °C в течение 20 мин. Затем охладите образцы до 4 °C, добавьте 5 мкл 1 M Tris HCL (рН 7,5) и вихрь в течение 5-10 с. Извлеченная ДНК может храниться при -20 °C до 6 месяцев.
  9. Чтобы определить, какие направляющие сайты содержат INDL, разработайте праймеры секвенирования для амплификации фрагмента ДНК, который включает в себя все четыре целевых сайта CRISPR-Cas9. Эти буквари по виртуализации позволяют идентифицировать INDL, которые охватывают несколько направляющих сайтов.
  10. Настройте две реакции ПЦР по 25 мкл на эмбрион, используя 5 мкл подготовленной геномной ДНК и праймеры для секвенирования.
  11. После завершения ПЦР очистите и сконцентрируйте два образца с помощью комплекта для очистки ДНК и концентратора (см. Таблицу материалов). Затем отправьте фрагмент ДНК на секвенирование Сэнгера, используя как прямые, так и обратные праймеры секвенирования.
  12. После того, как гаплоидный фрагмент материнского хрустящего вещества был секвенирован, выровняйте его по последовательности дикого типа и идентифицируйте INDL в целевых участках с помощью программы выравнивания последовательностей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспериментальный подход, описанный в этом протоколе, позволяет быстро и эффективно идентифицировать фенотипы материнского эффекта (рисунок 1).

Производство материнских хрустящих кислот:
При разработке четырех направляющих РНК для нацеливания на один ген материнского эффекта-кандидата особое внимание следует уделить тому, где направляющие РНК будут связываться с ДНК. В общем, все они должны быть сгруппированы вместе с минимальными или отсутствующими перекрывающимися областями между направляющими РНК в начале первого прогнозируемого белкового домена (рисунок 2A). Нацеливание направляющих РНК на этот домен увеличивает вероятность того, что как внутрикадровая, так и внекадровая INDL повлияет на функцию белка. Другими переменными, которые следует учитывать при разработке направляющих РНК, являются снижение эффективности и количества нецелевых участков в геноме.

После инъекции раствора CRISPR-Cas9 соматическую активность Cas9 можно определить, запустив небольшой фрагмент ПЦР, приблизительно 100 bp, на агарозном геле. Если INDEL были созданы в введенном эмбрионе, мазок должен наблюдаться в введенных образцах, но не в неинъецированном контроле (рисунок 2B). Каждый направляющий сайт должен быть протестирован независимо на активность Cas9 в соматических клетках. Если мазки видны по крайней мере на трех направляющих участках, введенные эмбрионы братьев и сестер должны быть выращены и проверены на фенотипы материнских хрустящих веществ.

Идентификация материнских хрустящих кислот:
Чтобы определить, создаются ли материнские хрустящие вещества в естественных скрещиваниях, эмбрионы самки рыбы F0 можно сравнить с подобранными по времени контрольными группами дикого типа, чтобы наблюдать любые изменения в раннем развитии. Кладки F0 также должны быть оценены в 24 л.с. и 5 дней после оплодотворения, чтобы изучить развитие основного плана тела и жизнеспособность, соответственно, чтобы определить материнские факторы, которые могут регулировать более поздние стадии эмбрионального развития. Идентификация общего фенотипа в кладках у разных самок F0 облегчает различение эффектов, вызванных потерей функции гена-мишени, от нецелевых или неспецифических эффектов.

Кроме того, кладки, содержащие материнские хрустящие вещества, как правило, мозаичные (то есть они включают как фенотипические эмбрионы дикого типа, так и материнские хрустящие эмбрионы), что позволяет эмбрионам дикого типа действовать в качестве внутреннего контроля для таких переменных, как сроки оплодотворения и скорость развития. В среднем, кладки от самок F0 будут содержать примерно 69% материнских хрустящих эмбрионов, причем кладки содержат до 100% материнских хрустящих эмбрионов11.

После идентификации материнских хрустящих эмбрионов они могут быть использованы для первичной молекулярной характеристики, т.е. иммуномаркировки границ клеток или окрашивания ДНК с помощью DAPI, что может дать представление о клеточной природе пораженного процесса развития11. Метод материнского хрустящего вещества также может быть использован для фенокопии известных мутаций материнского эффекта, таких как пестрая, тми и аура (рисунок 3)11.

Секвенирование материнских хрустящих гаплоидов:
Чтобы идентифицировать генетические поражения, которые способствуют фенотипу материнского хрустящего тона, обработанные УФ-излучением сперматозоиды и ЭКО объединяются для создания материнских хрустящих гаплоидов (рисунок 4). УФ-обработанная сперма обеспечивает центриоль, но не вносит вклад в отцовскую ДНК, что позволяет происходить клеточному делению только с материнским геномным материалом. Создание гаплоида позволяет Сэнгеру секвенировать материнский аллель и идентифицировать материнские хрустящие INPEL (рисунок 4). В среднем наблюдалось два аллеля на кладку материнского хрустящего гаплоида. INDL, идентифицированные с помощью последовательности Сэнгера, включают в себя изменения как на сайтах с одним руководством, так и удаления, охватывающие несколько направляющих сайтов (рисунок 4C, таблица 3). Исследование материнских гаплоидных INDL с хрустящими веществами у разных самок F0 показывает, что одни и те же направляющие участки редактируются у нескольких эмбрионов, и большинство восстановленных мутаций являются преждевременными стоп-кодонами (таблица 3)11.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс материнского хрустящего вещества. Чтобы создать материнскую хрустящую жидкость, начните с разработки четырех гРНК, которые нацелены на первый активный домен гена. 1) Затем синтезируют четыре гРНК в одной реакции. 2) После синтеза и очистки гРНК создайте коктейль CRISPR-Cas9 и введите его в бластодиск одноклеточного эмбриона. 3) Затем просканируйте введенные эмбрионы на соматические мутации с помощью ПЦР и гелевого электрофореза. Если бы INDL были созданы в инъекционных образцах, мазок появился бы в введенных эмбрионах, в отличие от плотной полосы контроля дикого типа. 4) Позвольте братьям и сестрам введенных эмбрионов расти в течение 3-6 месяцев, чтобы достичь половой зрелости. После достижения половой зрелости скрестите введенную самку F0 с самцом дикого типа. Полученное потомство может представлять собой смесь эмбрионов дикого типа и материнского хрустящих эмбрионов. Определите женщину, которой ввели F0, чьи эмбрионы демонстрируют фенотип материнского эффекта. 5) Чтобы определить поражения, которые способствуют фенотипу, ЭКО выполняется с использованием обработанных ультрафиолетовым излучением сперматозоидов для создания материнских хрустящих гаплоидов для секвенирования Сэнгера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Генерация INDEL в целевых генах. (A) Диаграмма структуры генов, показывающая гипотетические белковые домены (светлые и темно-фиолетовые блоки), расположение гРНК (красные линии) и сайты PAM (красные звезды). GRNAs нацелены на первый активный домен. Экзоны показаны в виде блоков, а интроны — в виде линий. (B) Мазки в 2,5% агарозном геле свидетельствуют о INDEL в соматических клетках у введенных эмбрионов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Материнские хрустящие вещества рекапитулируют фенотип известных мутаций материнского эффекта. Репрезентативное сравнение живых, совпадающих по времени диких типов (левая колонка), известных материнских мутантов (средняя колонка) и материнских хрустящих эмбрионов (правая колонка). (A) пестрые/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) аура/mid1ipIl мутанты/материнские хрустящие вещества демонстрируют дефекты цитокинеза в ранних эмбриональных делениях, что приводит к полностью синцитиальным бластулам (A, B) или частично бесклеточным эмбрионам (C, белый ящик). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Использование материнских хрустящих гаплоидов для секвенирования мутаций, индуцированных CRISPR-Cas9. (A) Введенная F0 самка, скрещенная с самцом дикого типа, приводит к диплоидному эмбриону с фенотипом материнского эффекта. (B) ЭКО проводится с использованием обработанных ультрафиолетовым излучением сперматозоидов для создания материнских хрустящих гаплоидов, что позволяет секвенировать и анализировать индуцированные INDEL в материнском аллеле. (C) Репрезентативное секвенирование материнского хрустящего гаплоида birc5b , показывающее большое удаление между направляющими участками 3 и 4 (в коробке). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПЦР Микс
Добавлять
стерильный H2O 171.12 мл
MgCl2 (1 М) 0.393 мл
Трис-HCl (1 М, рН 8,4) 2.618 мл
ККл (1 м) 13.092 мл
Автоклав в течение 20 мин, затем охладить раствор на льду. Далее добавить
BSA (100 мг/мл) 3.468 мл
дАТП (100 мМ) 0.262 мл
дКТП (100 мМ) 0.262 мл
dGTP (100 мМ) 0.262 мл
дТТП (100 мМ) 0.262 мл
Аликвота в стерильные микроцентрифужные трубки
Рецепт ПЦР на образец
ПЦР Микс 17.9 мкл
F + R Грунтовка (10 мкМ) 0.2 мкл
ROH2O 1.8 мкл
Taq ДНК-полимераза 0.1 мкл
ДНК 5 мкл

Таблица 1: ПЦР-смесь.

Решение Хэнка
Премикс Хэнка Совместите по порядку следующее: (1) 10,0 мл HS #1, (2) 1,0 мл HS #2, (3) 1,0 мл HS #4, (4) 86 мл ddH2O, (5) 1,0 мл HS # 5. Храните все решения HS при температуре 4 °C
Стоковое решение Хэнка No1 8,0 г NaCl, 0,4 г KCl в 100 мл ddH2O
Стоковое решение Хэнка #2 0,358 г Na2HPO4 безводный; 0,60 г K2H2PO4 в 100 мл ddH2O
Стоковое решение Хэнка #4 0,72 гCaCl2 в 50 мл ddH2O
Стоковое решение Хэнка #5 1,23 г MgSO4·7H2Oв 50 мл ddH20
Стоковое решение Хэнка #6 0,35 г NaHCO3 в 10,0 мл ddH20; сделать свежим в день использования
Окончательное рабочее решение Хэнка Объедините 9,9 мл премикса Хэнка с 0,1 мл HS Stock #6

Таблица 2: Решение Хэнка.

birc5b #1 birc5b #2 birc5b #3 prc1l #1 прц1л #2
Общее количество секвенированных эмбрионов 3 9 12 8 10
Общее количество эмбрионов с INDEL 3 9 12 8 10
Мутация в одном сайте 0 0 0 0 0
Мутации в нескольких сайтах 3 9 12 8 10
Расположение INDEL
Путеводитель по сайту 1 0 0 0 0 0
Путеводитель по сайту 2 0 0 0 8 10
Путеводитель по сайту 3 3 9 12 8 10
Путеводитель по сайту 4 3 9 12 0 10
Типы INPEL
Мутация в кадре 1 2 2 7 10
Мутация сдвига кадра 4 7 10 9 10

Таблица 3: Расположение и тип INDEL, обнаруженных в двух различных наборах материнских хрустящих гаплоидов: birc5b и prc1l.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, представленный в этой рукописи, позволяет идентифицировать и первично-молекулярную характеристику фенотипа материнского эффекта в одном поколении вместо нескольких поколений, необходимых как для прямых, так и для обратных генетических методов. В настоящее время роль многих матерински экспрессированных генов неизвестна. Этот недостаток знаний частично связан с дополнительным поколением, необходимым для визуализации фенотипа при идентификации генов материнского эффекта. В прошлом быстрая идентификация генов материнского эффекта у рыбок данио могла быть достигнута путем введения блокирующих трансляцию морфолиноолиголиотидов в культивируемые ооциты32. Этот метод оказался успешным путем фенокопирования нескольких известных генов материнского эффекта, но манипулирование незрелым ооцитом может быть деликатным, трудоемким экспериментом. Материнские РНК также могут быть нацелены на деградацию с использованием комплексов CRISPR-RfxCas13d, но инъекция этих комплексов в одноклеточный эмбрион не может быть нацелена на материнский белок33. Совсем недавно было обнаружено, что CRISPR-Cas9 может индуцировать биаллельные мутации в зародышевой линии, что позволяет быстро идентифицировать новые гены материнского эффекта в одном поколении11.

Этот протокол включает в себя несколько критических шагов, которые способствуют восстановлению материнских хрустящих эмбрионов. Теоретически, поскольку половые клетки определяются в раннем эмбриональном развитии, чем раньше в гене-мишени создается поражение ДНК, тем выше вероятность того, что клетка, содержащая мутации, станет частью зародышевой линии. Этот метод использует белок Cas9, вводимый в развивающийся бластодиск одноклеточного эмбриона, чтобы увеличить вероятность изменений в зародышевой линии. Другим критическим фактором, влияющим на процент восстановленных материнских хрустящих эмбрионов, является эффективность направляющих РНК в создании генетических изменений в целевых участках. Эта процедура включает в себя раздел, посвященный определению способности направляющих РНК создавать соматические INDL при 24 л.с.ф. с помощью ПЦР. Если направляющая РНК не может внести соматические изменения, она имеет низкую вероятность произвести изменения в зародышевой линии с достаточно высокой скоростью, чтобы генерировать материнскую хрустящую жидкость. Этот протокол направляет пользователя на тестирование соматических правок, которые должны быть видны на трех или более сайтах-руководствах.

После наблюдения за фенотипом материнских хрустящих эмбрионов генетическое поражение, способствующее фенотипу, может быть проанализировано на уровне последовательности с помощью ЭКО со спермой, обработанной ультрафиолетовым излучением. Чтобы получить достаточно исходного материала для ПЦР, материнские хрустящие гаплоидные эмбрионы должны развиваться в течение как минимум шести-восьми часов, что позволяет происходить несколько циклов репликации ДНК. Геномная ДНК также должна быть извлечена в 50 мкл 50mM NaOH для концентрации ДНК. Если материнские гаплоидные эмбрионы не могут выжить в течение 6-8 ч, соберите эмбрионы в более ранний момент времени. Чтобы учесть, что эмбрион проходит меньше циклов репликации ДНК, извлеките ДНК в меньшем объеме 50 мМ NaOH, сохраняя при этом ту же пропорцию NaOH и Tris-HCL. Другим вариантом является концентрация извлеченной ДНК с помощью комплекта для очистки и концентратора ДНК. После того, как ДНК была извлечена, фрагмент ПЦР, используемый для секвенирования, должен включать все четыре целевых участка, если это возможно. Этот фрагмент позволит идентифицировать большие делеции, которые охватывают несколько направляющих участков в материнских хрустящих эмбрионах.

При сборе материнских хрустящих гаплоидов для секвенирования Сэнгера соберите все гаплоиды, которые показывают фенотип, и отправьте минимум 10 уникальных образцов гаплоидных эмбрионов на секвенирование Сэнгера. Секвенирование нескольких гаплоидных эмбрионов на кладку позволит идентифицировать несколько INDL, обнаруженных в зародышевой линии. Прошлые данные секвенирования материнских хрустящих гаплоидов показали, что множественные аллели могут быть идентифицированы в наборе материнских хрустящих гаплоидов11. Однако эти аллели не восстанавливаются в ожидаемом соотношении 1 к11. Секвенирование нескольких эмбрионов также поможет поддержать идею о том, что фенотип вызван CRISPR-Cas9 INDEL в гене-мишени. Любая последовательность дикого типа, наблюдаемая у секвенированных гаплоидных эмбрионов, которые показывают определенный фенотип, будет предполагать, что фенотип не связан с целевым геном. Любые новые фенотипы материнского эффекта, идентифицированные путем нацеливания на ранее нехарактеризованные гены, также должны быть подтверждены путем установления стабильной линии с использованием братьев и сестер F0 мужчин11.

В некоторых случаях может быть сложно идентифицировать INDEL с помощью гаплоидного анализа, где идентифицированный материнский хрустящий фенотип имеет определенную фенотипическую характеристику. Например, материнские хрустящие гаплоидные эмбрионы, которые кажутся неоплодотворенными или лизисными на стадии расщепления, может быть невозможно выбрать. Материнские хрустящие эмбрионы с дефектами расширения оси, аналогичными тем, которые соответствуют гаплоидному синдрому, также могут быть не различимы для анализа при генерации материнских гаплоидов34. В таких случаях исследователю рекомендуется проводить анализ непосредственно с использованием стабильных линий для подтверждения гена-фенотипа.

Одним из ограничений нынешнего протокола материнского хрустящего вещества является то, что он идентифицирует гены материнского эффекта только по грубым морфологическим дефектам. Чтобы повысить чувствительность метода и сделать его более специфичным для определенных аспектов раннего развития, трансгенные репортеры могут быть использованы для выделения конкретных структур или типов клеток, как это было сделано для других экранов 9,10,35. Например, смесь CRISPR-Cas9 может быть введена в трансгенную линию Buc-GFP для идентификации нелетальных генов, которые регулируют формирование и развитие первичных половых клеток36. Другим ограничением протокола материнского хрустящего вещества является то, что, хотя он полезен для генов, экспрессируемых исключительно во время раннего развития, он может быть неэффективным для генов с материнской и зиготической функцией, поскольку нацеливание crispr-Cas9 на ген может быть смертельным для развивающегося эмбриона. Чтобы изучить материнскую функцию генов, экспрессируемых на протяжении всего развития, активность Cas9 может быть нацелена на зародышевую линию37, таким образом, оставляя соматическую функцию гена незатронутой и позволяя выживать самкам F0 во взрослом возрасте.

Материнские чипсанты являются эффективным инструментом для выявления новых генов материнского эффекта, необходимых для раннего развития. Сочетание мультиплексирующих направляющих РНК к одной мишени и способности к редактированию биаллелина Cas9 позволяет наблюдать фенотип материнского эффекта в одном поколении, избегая схем размножения нескольких поколений, обычно необходимых при выполнении целевого редактирования генов. Обход нескольких поколений уменьшает количество пространства и ресурсов, необходимых для идентификации генов материнского эффекта.

В дополнение к выявлению новых генов материнского эффекта, этот протокол позволяет любой лаборатории рыбок данио проводить фенокопию и изучать любой известный мутант материнского эффекта без установления и поддержания стабильных линий, облегчая подробный анализ генетических путей. В принципе, этот подход к материнскому хрустящему покрытию может также определять функцию материнских продуктов у негенетических модельных видов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим бывших и нынешних сотрудников лабораторного животноводства Пелегри за заботу о водном объекте. Мы также благодарны за комментарии и понимание рукописи Райана Тревены и Дианы Хэнсон. Финансирование было предоставлено грантом NIH F.P. (GM065303)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
  3. Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
  4. He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
  5. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
  6. Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  7. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  8. Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
  9. Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
  10. Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
  11. Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
  12. Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
  13. Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
  14. Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
  15. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
  16. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
  17. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  18. Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  19. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  20. Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
  21. White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
  22. Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
  23. Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  24. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
  25. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
  26. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
  27. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
  28. Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
  31. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
  32. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
  33. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  34. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
  35. Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
  36. Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
  37. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

Tags

Генетика Выпуск 178 раннее развитие CRISPR-Cas9 материнский эффект рыбка данио редактирование генома обратная генетика
Определение роли матерински-экспрессированных генов в раннем развитии с материнскими криспантами
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moravec, C. E., Voit, G. C.,… More

Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter