Summary
Tidlig utvikling er avhengig av mors arvede produkter, og rollen til mange av disse produktene er foreløpig ukjent. Her beskrev vi en protokoll som bruker CRISPR-Cas9 for å identifisere fenotyper med morseffekt i en enkelt generasjon.
Abstract
Tidlig utvikling avhenger av et basseng av maternelle faktorer innlemmet i den modne oocytten under oogenese som utfører alle cellulære funksjoner som er nødvendige for utvikling til zygotisk genomaktivering. Vanligvis krever genetisk målretting av disse maternelle faktorene en ekstra generasjon for å identifisere fenotyper med morseffekt, noe som hindrer evnen til å bestemme rollen som maternalt uttrykte gener under utvikling. Oppdagelsen av de bialleliske redigeringsegenskapene til CRISPR-Cas9 har gjort det mulig å screene embryonale fenotyper i somatisk vev av injiserte embryoer eller "crispants", noe som øker forståelsen av rollen zygotisk uttrykte gener spiller i utviklingsprogrammer. Denne artikkelen beskriver en protokoll som er en utvidelse av crispant-metoden. I denne metoden tillater den bialleliske redigeringen av kimceller isolering av en morseffektfenotype i en enkelt generasjon, eller "mors crispants." Multiplexing guide RNA til et enkelt mål fremmer effektiv produksjon av maternelle crispants, mens sekvensanalyse av mors crispant haploider gir en enkel metode for å bekrefte genetiske lesjoner som produserer en morseffekt fenotype. Bruken av mors crispants støtter rask identifisering av essensielle maternalt uttrykte gener, og letter dermed forståelsen av tidlig utvikling.
Introduction
En pool av maternalt deponerte produkter (f.eks. RNA, proteiner og andre biomolekyler) er nødvendig for alle tidlige cellulære prosesser til embryoets zygotiske genom er aktivert1. For tidlig uttømming av disse produktene fra oocytten er vanligvis embryonal dødelig. Til tross for betydningen av disse genene i utvikling, er rollen til mange maternalt uttrykte gener for tiden ukjent. Fremskritt i genredigeringsteknologi i sebrafisk, som CRISPR-Cas9, muliggjør målretting av maternalt uttrykte gener 2,3,4. Imidlertid krever identifisering av en morseffektfenotype en ekstra generasjon sammenlignet med en zygotisk fenotype, og krever dermed flere ressurser. Nylig har den bialleliske redigeringsevnen til CRISPR-Cas9 blitt brukt til å skjerme for embryonale fenotyper i somatisk vev av injiserte (F0) embryoer, kjent som "crispants"5,6,7,8,9,10. Crispant-teknikken tillater ressurseffektiv screening av kandidatgener i somatiske celler, noe som letter forståelsen av spesifikke aspekter i utviklingen. Protokollen beskrevet i dette papiret gjør det mulig å identifisere fenotyper av morseffekter, eller "maternelle crispants", i en enkelt generasjon11. Denne ordningen er oppnåelig ved multipleksing guide RNA til et enkelt gen og fremme bialleliske redigeringshendelser i kimlinjen. Disse mors sprø embryoene kan identifiseres ved brutto morfologiske fenotyper og gjennomgå primær karakterisering, for eksempel merking for cellegrenser og DNA-mønster11. Kombinert analyse av den observerbare fenotypen og grunnleggende molekylær karakterisering av de induserte INDEL-ene gjør det mulig å forutsi det målrettede genets rolle i tidlig utvikling.
I sebrafisk, i løpet av de første 24 timene etter befruktning (hpf), utvikler en liten gruppe celler seg til de opprinnelige kimcellene, en forløper til kimlinjen12,13,14,15. I koblinger lagt av F0-kvinner avhenger andelen av mors sprø embryoer som gjenvinnes, av hvor mange kimceller som inneholder en biallelisk redigeringshendelse i det målrettede genet. Generelt, jo tidligere redigeringshendelsen oppstår i embryoet, desto større er sannsynligheten for at CRISPR-Cas9-mutasjoner blir observert i kimlinjen. I de fleste tilfeller kommer fenotypene av mors sprø embryoer fra tap av funksjon i de to mors allelene som er tilstede i den utviklende oocytten. Når oocytten fullfører meiose, ekstruderes en av mors alleler fra embryoet via polarlegemet, mens det andre allelet blir innlemmet i mors pronukleus. Sekvenseringen av flere mors sprø haploider vil representere en blanding av mutasjonene (innsettinger og/eller delesjoner (INDELs)) som er tilstede i kimlinjen som bidrar til fenotype11.
Følgende protokoll beskriver de nødvendige trinnene for å lage CRISPR-Cas9-mutasjoner i morseffektgener og identifisere den tilsvarende fenotypen ved hjelp av en mors crispant-tilnærming (figur 1). Del en vil forklare hvordan man effektivt kan designe og lage guide-RNA, mens seksjon to og tre inneholder kritiske trinn for å lage mors crispants ved mikroinjeksjon. Etter injeksjon av CRISPR-Cas9-blandingen, blir injiserte embryoer screenet for somatiske redigeringer via PCR (avsnitt fire). Når de injiserte F0-embryoene utvikler seg og når seksuell modenhet, krysses F0-hunnene til villtypehanner, og deres avkom blir screenet for fenotyper av moderlig effekt (avsnitt fem). Seksjon seks inneholder instruksjoner om å lage mors sprø haploider som kan kombineres med Sanger-sekvensering for å identifisere CRISPR-Cas9-induserte INDELer. I tillegg inneholder diskusjonen endringer som kan gjøres i protokollen for å øke følsomheten og kraften til denne metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I studier som førte til utviklingen av denne protokollen ble alle sebrafiskhus og eksperimenter godkjent av University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2).
1. Syntese av guide-RNA
MERK: Zygotiske crispants har blitt opprettet ved hjelp av en enkelt guide RNA eller multipleksing flere guide RNA til et enkelt mål 5,6,7,8,9,10. Multipleksingen av guide-RNA øker prosentandelen embryoer som viser en zygotisk sprø fenotype10. På grunn av denne økte frekvensen av embryoer som utviser en fenotype, blir maternelle crispants opprettet ved multipleksing av fire guide RNA til et enkelt gen. En mer detaljert protokoll om bruk av CHOPCHOP til å designe guide-RNA og en glødemetode for å syntetisere guide-RNA for sebrafisk finnes andre steder 16,17,18,19,20.
- For å identifisere et maternalt uttrykt gen som skal målrettes, må du fastslå mRNA-transkripsjonsnivåene under utvikling via en RNA-sekvensdatabase som gir transkriptominformasjon fra zygote til 5 dager21. Generelt er morsspesifikke gener sterkt uttrykt i det tidlige embryoet og nedbrytes etter at det zygotiske genomet er aktivert22.
- Når et maternalt uttrykt målgen er identifisert, bestemmer du det første forutsagte proteindomenet ved hjelp av delen "domener og funksjoner" som er tilgjengelig i Ensembl-genomleseren23. Bruk dette domenet som målregion for de fire guide-RNAene.
- Bruk guide RNA-utvalgsprogrammet CHOPCHOP for å identifisere fire guide-RNA-målsteder i det første aktive domenet. Design genspesifikke oligonukleotider, som vist nedenfor for hvert målsted. I det genspesifikke oligonukleotidet tilsvarer N20-delen målsekvensen minus PAM-stedet (NGG) fra CHOPCHOP. Bestill disse genspesifikke oligonukleotidene og det konstante oligonukleotidet ved bruk av standard avsaltrensing (se materialtabell).
Genspesifikt oligonukleotid:
5' TAATACGACTCACTATA- N 20-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - For å lage en guide RNA-mal for hvert genspesifikt oligonukleotid, anneal det til det konstante oligonukleotidet og fyll ut overhengene med T4-DNA-polymerase som tidligere beskrevet16. Etter at de fire guide-RNA-malene er satt sammen, renser og konsentrerer de dem sammen ved hjelp av et DNA-oppryddings- og konsentratorsett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse).
- Syntetiser sgRNA-blandingen fra den samlede guide-RNA-malen ved hjelp av et in vitro T7-transkripsjonssett (se Materialtabell). Utfør in vitro-transkripsjonen i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk av halvreaksjoner av T7-transkripsjonssettet kan redusere kostnaden per reaksjon.
- Etter RNA-syntese, rens det resulterende bassenget av sgRNA ved hjelp av en etanol / ammoniumacetatprotokoll som tidligere beskrevet 16,20,24. Etter at RNA har blitt isolert, resuspender det i 20 μL nukleasefritt vann. Hvis halvreaksjoner av T7-transkripsjonssettet ble brukt til å transkribere bassenget av sgRNAer, resuspender det rensede RNA i 10-15 μL nukleasefritt vann.
- Kvantifiser mengden samlede sgRNA som ble opprettet ved hjelp av et spektrofotometer. Fortynn bassenget av sgRNA i nukleasfritt vann til en fortynning på 1500 ng / μL ± 500 ng / μL. Vanligvis varierer det endelige volumet av arbeidsfortynningen fra 30-50 μL.
- Etter å ha bestemt konsentrasjonen av bassenget av sgRNAer, kontroller integriteten til sgRNAene på en 1% agarosegel.
- Kast en 1% agarose/0,5 μg/ml ethidiumbromid/TBE-gel. Når gelen har størknet, plasser den i TBE kjører buffer.
- Bland 1 μL av sgRNA-blandingen og 1 μL RNA-gelbelastningsbuffer (se materialtabell). Legg denne prøven i gelen og kjør gelen ved 100 V i 5 minutter.
- Visualiser båndene ved hjelp av ultrafiolett (UV) lys. Bassenget av sgRNAer skal vises som et enkelt bånd. Hvis det observeres et smør, har RNA-nedbrytning sannsynligvis skjedd.
- Oppbevar bassenget av sgRNA i engangsbruk 1 μL aliquots i nukleasefrie PCR-strimmelrør i fryseren -80 °C. For store mengder sgRNA-blanding (30 μL eller mer), aliquot halvparten av volumet i de nukleasefrie PCR-striperørene og lagre den andre halvdelen som et større volum i et nukleasefritt mikrosentrifugerør. Tine ut og aliquot når det trengs.
- For å forhindre RNA-nedbrytning, sørg for at prøvene i mikrosentrifugerøret ikke gjennomgår mer enn to fryse-tine-sykluser.
2. Klargjøring av reagenser og materialer for mikroinjeksjon
MERK: I sebrafisk kan injeksjon av Cas9 mRNA skape zygotiske sprø stoffer. Studier har imidlertid vist at Cas9-protein er mer effektivt når det gjelder å skape INDELs i injiserte embryoer16,25. Denne protokollen bruker Cas9-protein til å generere mors crispants fordi dette proteinet ikke opplever samme lag i aktivitet som injisert Cas9 mRNA. I teorien bør dette øke sannsynligheten for at en biallelisk mutasjon tidlig i utviklingen resulterer i økt sjanse for at en mer omfattende del av kimlinjen blir påvirket. Andre protokoller og ressurser som beskriver hvordan man forbereder seg på mikroinjeksjoner, finnes andre steder24,26.
- Kjøp eller generer Cas9-protein (se Materialfortegnelse). Resuspender Cas9-proteinet i nukleasefritt vann for å lage en 2 mg / ml løsning og aliquot 1 μL i RNase-frie polypropylen mikrosentrifugerør. Oppbevar disse som engangsrør ved -80 °C.
- Ettermiddagen før injeksjonen, bruk en mikropipettetrekker til å trekke en glasskapillær og lage en injeksjonsnål. Oppbevar den ubrutte kanylen i en lukket kanyleholder til morgenen med mikroinjeksjoner.
- For å lage en injeksjonsplate, hell 20 ml 1,5% agarose / steril H2O for å fylle halvparten av en 100 mm X 15 mm petriskål og vent til den stivner. Når agaroseoppløsningen er satt, tilsett 20 ml 1,5% agarose / steril H2O til petriskålen og legg plastformen (se materialtabell) i den flytende agarosen og la den herdes.
- Etter at agarose har herdet, fjern plastformen og oppbevar injeksjonsplaten opp ned i kjøleskap til injeksjonsmorgenen. En enkelt plate kan brukes til flere injeksjoner så lenge brønnene opprettholder sin integritet.
3. Mikroinjeksjon av CRISPR-Cas9-cocktail i et encellet sebrafiskembryo for å generere mors crispants
MERK: Flere ressurser for mikroinjeksjon i sebrafiskembryoer finnes andre steder24,26,27. Injisering av CRISPR-Cas9-blandingen i den utviklende blastodiscen av encellede embryoer kan øke sannsynligheten for å skape mors crispants. Blandingen kan også injiseres i eggeplomme sac opp til 2-celletrinnet. Imidlertid er blandinger injisert i eggeplommen avhengig av ooplasmatisk streaming for å nå blastodiscen, så CRISPR-Cas9 injisert i eggeplommen kan redusere skjæreeffektiviteten til CRISPR-Cas928.
- Ettermiddagen før mikroinjeksjoner, sett opp villtypekors i sebrafiskparringsbokser. Hold både hann- og hunnfisken i samme tank, men skill dem med en skillevegg for parringsboks eller plasser hunnen inne i en eggleggingsinnsats.
- På morgenen av forsøket, ta ut en 2 mg / ml aliquot av Cas9 protein og en aliquot av bassenget av sgRNA. I det RNase-frie polypropylenmikrosentrifugerøret som inneholder Cas9-proteinet, sett sammen en 5 μL injeksjonsblanding som inkluderer bassenget av sgRNA, 1 μL 0,5% fenolrød løsning og nukleasefritt vann. Sikt på en endelig konsentrasjon av 400 ng / μL Cas9 protein og 200 ng / μL av de samlede sgRNAene i RNase-fritt vann eller et 2: 1-forhold mellom Cas9-protein og sgRNA i det injiserte embryoet. Denne injeksjonsblandingen kan lagres på is til injeksjonsmorgenen.
- Ta en injeksjonsplate ut av kjøleskapet og la den varmes opp til romtemperatur (RT) i minst 20 minutter.
- Etter at injeksjonscocktailen er satt sammen, la hannen og hunnen parre seg, for eksempel ved å fjerne skillelinjen for parringsboksen eller ved å plassere hannen i samme eggleggingsinnsats som hunnen, etter behov.
- Etter at fisken har lagt, men før embryoene er samlet, kutt spissen av en ubrutt nål ved hjelp av et nytt barberblad eller fine tang for å lage en nål som har en boring som er liten nok til å unngå embryoskade, men er bred nok til at den ikke blir tilstoppet med injeksjonsblanding. Etter at nålen er kuttet, legg nålen med injeksjonsblandingen ved hjelp av en mikroloader pipettespiss satt inn i baksiden av kapillæren (se Tabeller over materialer).
- Etter at nålen er fylt, inkuberer nålen i 5 minutter ved RT for å montere Cas9-sgRNA-komplekser.
- Slå på mikroinjektoren og stikk nålen inn i mikromanipulatoren. Plasser en dråpe mineralolje på et mikrometerglass og kalibrer nålen ved å justere injeksjonstrykket til nålen kaster ut en 1 nL bolus i mineraloljen.
MERK: Ved injeksjon i mineraloljen vil en 1 nL bolus ha en diameter på ca. 0,125 mm (eller radius på 0,062 mm) målt med mikrometerglasset. - For å synkronisere embryoene, samle dem etter 10 minutter ved hjelp av en plastsil og skyll dem i en petriskål ved hjelp av 1x E3-medier (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, og tilsett 20 μL 0,03 M metylenblå per 1 liter 1x E3). Fjern 10-15 embryoer og legg dem i en egen petriskål som skal holdes som uinjiserte kontroller.
- Overfør resten av de utviklende embryoene til brønnene på injeksjonsplaten.
- Injiser 1 ml oppløsning (totalt 400 pg Cas9-protein og 200 pg sgRNA) i den utviklende blastodisken til et encellet embryo. Hvis spissen av nålen blir tilstoppet, bruk tang for å bryte spissen tilbake og kalibrere nålen på nytt for å løse ut en 1 nL bolus. Sørg for å injisere alle embryoer i løpet av de første 40 minuttene av utviklingen etter befruktning.
- Etter at injeksjonen er fullført, returner de injiserte embryoene i en merket petriskål som inneholder 1x E3-medier og la dem utvikle seg gjennom dagen. Fjern eventuelle embryoer som ikke er befruktet eller ikke utvikler seg normalt i henhold til sebrafiskens iscenesettelsesserie29.
4. Screening for somatiske INDELs i F0 injiserte embryoer
MERK: Andre metoder for å identifisere INDELs, for eksempel T7 endonuklease I-analyse eller høyoppløselig smelteanalyse, kan brukes til å bestemme om embryoene inneholder somatiske INDELs 30.
- Neste dag etter injeksjoner, fjern defekte og lyserte embryoer fra petriskålen og erstatt 1x E3-mediet for å opprettholde embryohelsen.
- Etter å ha renset ut parabolen, samle seks friske injiserte embryoer og to kontrollembryoer fra den uinjiserte platen. Plasser hvert embryo individuelt i en enkelt brønn i et PCR-striperør og merk toppen av rørene.
- For å trekke ut genomisk DNA fra individuelle embryoer, fjern overflødig E3-media fra brønnene i striperøret og tilsett 100 μL 50 mM NaOH per brønn.
- Inkuber embryoene ved 95 °C i 20 minutter. Avkjøl deretter prøvene til 4 °C, tilsett 10 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5), og virvle dem i 5 til 10 s. Dette ekstraherte DNA kan lagres ved -20 ° C i minst 6 måneder uten signifikant DNA-nedbrytning.
- Design unike screeningprimere for hvert guidested for å forsterke et 100-110 bp DNA-fragment som inkluderer CRISPR-Cas9-målstedet. Hvis mulig, plasser målstedet midt i det forsterkede fragmentet, noe som gjør det mulig å identifisere større slettinger.
- For hvert av de fire guidemålstedene, sett opp åtte 25 μL PCR-reaksjoner ved bruk av 5 μL av det forberedte enkeltembryogenomiske DNA, PCR-blandingen og de guidespesifikke screeningprimerne for å identifisere somatiske mutasjoner på målstedet (tabell 1).
- Støp en 2,5 % agarose/0,5 μg/ml ethidiumbromid/TBE-gel ved bruk av kammer som lager ca. 0,625 cm brede brønner. Denne brede kammen gir bedre oppløsning når det oppdages størrelsesendringer i genomsekvensen. Etter at gelen har størknet, plasser den i et elektroforesekammer som inneholder TBE løpende buffer.
- Tilsett 5 μL 6x lastfargestoff til PCR-produktet og fyll 25 μL av denne blandingen i gelen. Forsikre deg om at injeksjons- og kontrollprøvene kjøres på samme rad av gelen. Etter at alle prøvene er lastet, tilsett 5 μL ethidiumbromid per 1 liter TBE løpende buffer til den positive enden av gelboksen.
- Kjør gelen ved 120 V til DNA-båndene løser seg eller DNA har nærmet seg enden av banen. Hvis Cas9 opprettet INDELs i målstedet, observeres vanligvis et smør i injiserte prøver, men ikke kontrollene.
- Hvis det observeres utstryk på minst tre av de fire føringsstedene i embryoer injisert med fire guide-RNA, vokser opp søskeninjiserte embryoer.
- Når de injiserte prøvene ikke inneholder utstryk i det nødvendige antall guidesteder, utformer du nye guide-RNAer for å erstatte de som ikke fungerte og oppretter et nytt basseng med guide-RNAer som inkluderer de som fungerte og de nydesignede. Injiser og test det nye bassenget for somatiske INDELs som beskrevet ovenfor.
5. Identifisering av fenotyper med morseffekt hos mors sprø embryoer
MERK: Når de injiserte F0-hunnene har nådd seksuell modenhet, har deres germline-celler potensial til å generere en blanding av mors sprø og villtype embryoer. Selv om denne blandingen tillater interne kontroller for befruktning og utviklingstiming, er det fortsatt fordelaktig å sette opp en villtype incross som en ekstern kontroll i tilfelle en clutch fra F0-kvinne bare inneholder mors sprø embryoer.
- Ettermiddagen før eksperimentet, sette opp F0 injisert kvinner mot vill-type hanner og kontroll wild-type kryss i standard sebrafisk parring bokser. Plasser både hann- og hunnfisken i samme tank, men skill dem med en skillevegg for parringsboks eller plasser hunnen inne i en eggleggingsinnsats.
- På morgenen av forsøket, la hannen og hunnen starte parring, for eksempel ved å fjerne parringsboksdeleren eller plassere hannen i samme eggleggingsinnsats som hunnen.
- Samle embryoene hvert 10. minutt ved å flytte eggleggingsinnsatsen inn i en ny parringstankbunn som inneholder ferskt systemvann og merk tanken med en tag som identifiserer den enkelte F0-hunnen. Ta den gamle parringstanken og hell vannet gjennom en tesil for å samle embryoene fra en individuell 10-minutters clutch.
- Når embryoene fra en enkelt 10-minutters clutch er samlet i silen, overfører du dem til en petriskål som inneholder 1x E3-medier. Merk petriskålen med tidspunktet for innsamling og fiskeinformasjonen.
- Under et dissekeringsmikroskop med en overført lyskilde, observer embryoene som gjennomgår utvikling hver time i de første 6-8 timene og daglig de neste 5 dagene.
- Identifiser potensielle mors sprø embryoer ved brutto morfologiske endringer i deres utvikling sammenlignet med tidsmatchede villtypekontroller29.
- Flytt de potensielle mors sprø embryoene til en petriskål som inneholder 1x E3-medier og analyse for morfologisk fenotype ved 24 hkf og levedyktighet (f.eks. Svømmeblæreinflasjon) 5 dager etter befruktning.
6. Sekvensering av alleler i mors sprø haploider
MERK: Mors crispant haploider inneholder et enkelt allel i det målrettede locus, noe som gjør det mulig å identifisere INDELs i målgenet via Sanger-sekvensering. Maternal crispant haploids embryoer kan også analyseres ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsanalyser. Embryoer som viser en mors sprø fenotype forventes å bære en lesjon i minst ett av de fire målstedene (se diskusjon).
- Ettermiddagen før eksperimentet, satte opp parringspar av F0-hunner kjent for å produsere mors sprø embryoer krysset til villtype hanner. Hold villtypehannene fysisk atskilt fra hunnene ved hjelp av en skillevegg for parringsboks, eller plasser hunnen i eggleggingsinnsatsen.
- På morgenen av forsøket, fjern den fysiske partisjonen eller plasser både hannene og hunnene i eggleggingsinnsatsen for å starte parring. Ved første tegn på egglegging, avbryt avl ved å skille hann- og F0-hunnene. Hold hver separert F0-hunn i individuelle parringsbokser.
- Forbered UV-behandlet sædløsning ved hjelp av testikler fra en villtype hann for hver 100 μL av Hanks løsning (tabell 2), tilstrekkelig til å befrukte ekstruderte egg fra en kvinne, som tidligere beskrevet31.
- Ekstruder modne egg manuelt fra de forhåndsvalgte F0-hunnene og utfør in vitro-befruktning (IVF) ved hjelp av UV-behandlet sæd31.
- Etter in vitro befruktning, la de haploide embryoene utvikle seg til mors sprø fenotype er observert og plasser disse embryoene i en annen petriskål.
- Når mors sprø haploide embryoer er identifisert, la dem utvikle seg i minst 6 timer etter befruktning.
- For å trekke ut genomisk DNA fra minst ti maternelle sprø haploide embryoer, plasser et enkelt haploid embryo i en individuell brønn i et PCR-striperør, fjern overflødig E3-media fra brønnen og tilsett 50 μL 50 mM NaOH.
- Inkuber embryoene ved 95 °C i 20 minutter. Avkjøl deretter prøvene til 4 °C, tilsett 5 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) og virvel i 5-10 s. Det ekstraherte DNA kan lagres ved -20 °C i opptil 6 måneder.
- For å identifisere hvilke guidesteder som inneholder INDEL-er, må du designe sekvenseringsprimere for å forsterke et DNA-fragment som inkluderer alle fire CRISPR-Cas9-målstedene. Disse sekvenseringsprimerne gjør det mulig å identifisere INDEL-er som spenner over flere guidesteder.
- Sett opp to 25 μL PCR-reaksjoner per embryo ved bruk av 5 μL av det forberedte genomiske DNA og sekvenseringsprimerne.
- Etter at PCR er ferdig, rens og konsentrer de to prøvene ved hjelp av et DNA-oppryddings- og konsentratorsett (se Tabell over materialer). Send deretter DNA-fragmentet til Sanger-sekvensering ved hjelp av primerne både fremover og bakover.
- Etter at det haploide mors crispant-fragmentet er sekvensert, juster det til villtypesekvensen og identifiser INDELer i målstedene ved hjelp av et sekvensjusteringsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den eksperimentelle tilnærmingen beskrevet i denne protokollen gjør det mulig å identifisere fenotyper av maternelle effekter på en rask og ressurseffektiv måte (figur 1).
Genererer mors crispants:
Ved utforming av de fire guide-RNAene for å målrette mot et enkelt kandidat morseffektgen, bør det tas særlig hensyn til hvor guide-RNAene vil binde seg til DNA. Generelt bør de alle grupperes sammen med minimale eller ingen overlappende regioner mellom guide-RNA ved starten av det første forutsagte proteindomenet (figur 2A). Målretting av guide-RNA til dette domenet øker sjansen for at både in-frame og out-of-frame INDELs vil påvirke proteinets funksjon. Andre variabler som bør vurderes ved utforming av guide-RNA, reduserer effektiviteten og antall off-target-steder i genomet.
Etter injeksjon av CRISPR-Cas9-løsningen kan den somatiske aktiviteten til Cas9 bestemmes ved å kjøre et lite PCR-fragment, ca. 100 bp, på en agarosegel. Hvis INDELs ble opprettet i det injiserte embryoet, bør det observeres et smør i de injiserte prøvene, men ikke den ikke-injiserte kontrollen (figur 2B). Hvert guidested bør testes uavhengig for Cas9-aktivitet i somatiske celler. Hvis det ses utstryk på minst tre føringssteder, bør søskeninjiserte embryoer dyrkes opp og screenes for mors sprø fenotyper.
Identifisering av mors crispants:
For å avgjøre om mors crispants er opprettet i naturlige kryss, kan embryoene fra en F0 kvinnelig fisk sammenlignes med tidsmatchede villtypekontroller for å observere eventuelle endringer i tidlig utvikling. F0-koblinger bør også scores ved 24 hpf og 5 dager etter befruktning for å undersøke utviklingen av henholdsvis grunnleggende kroppsplan og levedyktighet for å identifisere mors faktorer som kan regulere senere stadier av embryonal utvikling. Å identifisere en delt fenotype i clutcher fra forskjellige F0-kvinner letter skilleeffekter forårsaket av tap av funksjon av et målgen fra off-target eller ikke-spesifikke effekter.
I tillegg er clutcher som inneholder mors crispants typisk mosaikk (dvs. de inkluderer både fenotypiske villtype og mors sprø embryoer), slik at villtypeembryoer kan fungere som en intern kontroll for variabler som befruktningstid og utviklingshastighet. I gjennomsnitt vil clutcher fra F0-hunner inneholde omtrent 69% mors sprø embryoer, med clutcher som inneholder opptil 100% mors sprø embryoer observert11.
Etter å ha identifisert maternelle crispant embryoer, kan de brukes til primær molekylær karakterisering, dvs. immunmerking for cellegrenser eller farging av DNA med DAPI, som kan gi innsikt i den cellulære naturen til den berørte utviklingsprosessen11. Mors crispant-metoden kan også brukes til å fenokopiere kjente morseffektmutasjoner, som motley, tmi og aura (figur 3)11.
Sekvensering av mors sprø haploider:
For å identifisere de genetiske lesjonene som bidrar til mors sprø fenotype, kombineres UV-behandlet sæd og IVF for å lage mors sprø haploider (figur 4). UV-behandlet sæd gir en sentriole, men bidrar ikke faderlig DNA, og tillater dermed cellulær deling å forekomme med bare mors genomisk materiale. Opprettelsen av en haploid tillater Sanger-sekvensering av morsallelen og identifisering av mors crispant INDELs (figur 4). I gjennomsnitt ble det observert to alleler per clutch av mors sprø haploid. INDEL-ene som identifiseres via Sanger-sekvensering, omfatter redigeringer både på enkeltveiledningssider og slettinger som spenner over flere veiledningssider (figur 4C, tabell 3). En undersøkelse av mors sprø haploide INDELs fra forskjellige F0-hunner viser at de samme guidestedene er redigert i flere embryoer, og de fleste av de gjenopprettede mutasjonene er for tidlige stoppkodoner (tabell 3) 11.
Figur 1: Mors skarpe arbeidsflyt. For å lage en mors crispant, begynn med å designe fire gRNA som retter seg mot det første aktive domenet til genet. 1) Syntetiser deretter de fire gRNA-ene i en enkelt reaksjon. 2) Etter å ha syntetisert og renset gRNA-ene, lag en CRISPR-Cas9-cocktail og injiser den i blastodiscen til et enkeltcellet embryo. 3) Kontroller deretter de injiserte embryoene for somatiske mutasjoner ved hjelp av PCR og gelelektroforese. Hvis INDELs ble opprettet i injiserte prøver, ville det oppstå et smør i de injiserte embryoene, i motsetning til det stramme båndet til villtypekontrollen. 4) La søsknene til de injiserte embryoene vokse i 3-6 måneder for å nå seksuell modenhet. Etter at seksuell modenhet er nådd, kryss en F0 injisert kvinne mot en villtype hann. Det resulterende avkommet kan være en blanding av villtype og mors sprø embryoer. Identifiser en F0-injisert kvinne hvis embryoer viser morseffektfenotypen. 5) For å identifisere lesjonene som bidrar til fenotypen, utføres IVF ved hjelp av UV-behandlet sæd for å lage mors sprø haploider for Sanger-sekvensering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Generering av INDELs i målrettede gener. (A) Genstrukturdiagram som viser hypotetiske proteindomener (lyse og mørke lilla blokker), plassering av gRNA (røde linjer) og PAM-steder (røde stjerner). GRNA-ene er rettet mot det første aktive domenet. Exons vises som blokker, og introner vises som linjer. (B) Smører i en 2,5% agarosegel er indikativ for INDELs i somatiske celler i injiserte embryoer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Mors crispants rekapitulerer fenotypen av kjente maternaleffektmutasjoner. Representativ sammenligning av levende, tidsmatchet villtype (venstre kolonne), kjente morsmutanter (midtre kolonne) og mors sprø embryoer (høyre kolonne). (A) motley/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura/mid1ipIl mutanter/maternelle crispants viser defekter i cytokinese i tidlige embryonale divisjoner, noe som fører til fullt syncytiell blastula (A, B), eller delvis acellulære embryoer (C, hvit boks). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bruk av mors sprø haploider for å sekvensere CRISPR-Cas9-induserte mutasjoner . (A) En F0 injisert kvinne krysset mot en villtype mann resulterer i et diploid embryo med en maternal effekt fenotype. (B) IVF utføres ved bruk av UV-behandlet sæd for å lage mors sprø haploider, noe som muliggjør sekvensering og analyse av induserte INDELs i mors allel. (C) Representativ sekvensering av birc5b mors sprø haploid som viser en stor sletting mellom guidesteder 3 og 4 (boks). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| PCR-miks | ||
| Tilføye | ||
| steril H2O | 171,12 ml | |
| MgCl2 (1 m) | 0,393 ml | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8,4) | 2,618 ml | |
| KCl (1 M) | 13,092 ml | |
| Autoklav i 20 min, og avkjøl deretter løsningen på is. Neste legg til | ||
| BSA (100 mg/ml) | 3,468 ml | |
| dATP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dCTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dGTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dTTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| Aliquot i sterile mikrosentrifugerør | ||
| PCR-oppskrift | per prøve | |
| PCR-miks | 17,9 μL | |
| F + R primtall (10 μM) | 0,2 μL | |
| ROH2O | 1,8 μL | |
| Taq DNA Polymerase | 0,1 μL | |
| DNA | 5 μL | |
Tabell 1: PCR-blanding.
| Hanks løsning | |||
| Hank's Premix | Kombiner følgende i rekkefølge: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Oppbevar alle HS-løsninger ved 4 °C | ||
| Hank's Stock Løsning # 1 | 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl i 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Løsning # 2 | 0,358 g Na2HPO4 vannfri; 0,60 g K 2 H 2 PO4 i 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Løsning # 4 | 0,72 g CaCl 2 i 50 ml ddH2 O | ||
| Hank's Stock Løsning # 5 | 1,23 g MgSO4·7T 2 O i 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Løsning # 6 | 0,35 g NaHCO3 i 10,0 ml ddH20; Gjør fersk på bruksdagen | ||
| Hanks endelige arbeidsløsning | Kombiner 9,9 ml Hank's Premix med 0,1 ml HS Stock #6 | ||
Tabell 2: Hanks løsning.
| Birc5b # 1 | Birc5b # 2 | Birc5b # 3 | PRC1L # 1 | PRC1L # 2 | ||
| Totalt antall embryoer sekvensert | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Totalt antall embryoer med INDELs | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Mutasjon på ett sted | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Mutasjoner på flere steder | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Plassering av INDELs | ||||||
| Guide nettsted 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Guide nettsted 2 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | |
| Guide nettsted 3 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Guide nettsted 4 | 3 | 9 | 12 | 0 | 10 | |
| Typer INDELs | ||||||
| In-frame mutasjon | 1 | 2 | 2 | 7 | 10 | |
| Ramme skift mutasjon | 4 | 7 | 10 | 9 | 10 | |
Tabell 3: Plassering og type INDELs funnet i to forskjellige sett med mors sprø haploider: birc5b og prc1l.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som presenteres i dette manuskriptet tillater identifisering og primærmolekylær karakterisering av en morseffektfenotype i en enkelt generasjon i stedet for flere generasjoner som kreves for både fremover og bakover genetiske teknikker. For tiden er rollen til mange maternalt uttrykte gener ukjent. Denne mangelen på kunnskap skyldes delvis den ekstra generasjonen som kreves for å visualisere en fenotype når man identifiserer morseffektgener. Tidligere kunne rask identifisering av morseffektgener i sebrafisk oppnås ved å injisere translasjonsblokkerende morfolinooligonukleotider i dyrkede oocytter32. Denne metoden ble bevist vellykket ved fenokopiering av flere kjente morseffektgener, men manipulering av en umoden oocytt kan være et delikat, tidkrevende eksperiment. Maternelle RNA kan også målrettes for nedbrytning ved bruk av CRISPR-RfxCas13d-komplekser, men injeksjonen av disse kompleksene i ettcelleembryoet kan ikke målrette maternalt tilført protein33. Mer nylig har det blitt oppdaget at CRISPR-Cas9 kan indusere bialleliske mutasjoner i kimlinjen, noe som muliggjør rask identifisering av nye morseffektgener i en enkelt generasjon11.
Denne protokollen inneholder flere kritiske trinn som bidrar til utvinning av mors sprø embryoer. I teorien, fordi kimceller er spesifisert i tidlig embryonal utvikling, jo tidligere en DNA-lesjon opprettes i et målgen, desto større er sannsynligheten for at en celle som inneholder mutasjoner vil bli en del av kimlinjen. Denne metoden bruker Cas9-protein injisert i den utviklende blastodiscen til et encellet embryo for å øke sannsynligheten for redigeringer i kimlinjen. En annen kritisk faktor som påvirker prosentandelen av gjenopprettede mors sprø embryoer er effektiviteten til guide-RNAene i å skape genetiske redigeringer på målsteder. Denne prosedyren inkluderer et avsnitt om å bestemme evnen til guide-RNA til å lage somatiske INDELs ved 24 hpf ved PCR. Hvis et guide-RNA ikke klarer å gjøre somatiske redigeringer, har det lav sannsynlighet for å produsere redigeringer i kimlinjen med høy nok hastighet til å generere en mors crispant. Denne protokollen instruerer brukeren til å teste somatiske redigeringer, som skal være synlige på tre eller flere guidesider.
Etter å ha observert fenotypen av mors sprø embryoer, kan de genetiske lesjonene som bidrar til fenotypen analyseres på sekvensnivå via IVF med UV-behandlet sæd. For å skaffe nok utgangsmateriale for PCR, bør mors sprø haploide embryoer utvikle seg i minst seks til åtte timer, slik at flere sykluser med DNA-replikasjon kan forekomme. Det genomiske DNA bør også ekstraheres i 50 μL på 50mM NaOH for å konsentrere DNA. Hvis mors sprø haploide embryoer ikke kan overleve i 6-8 timer, samle embryoene på et tidligere tidspunkt. For å ta hensyn til embryoet som gjennomgår færre sykluser av DNA-replikasjon, trekker du ut DNA i et mindre volum på 50 mM NaOH samtidig som det opprettholder samme andel NaOH og Tris-HCL. Et annet alternativ er å konsentrere det ekstraherte DNA ved hjelp av et DNA-oppryddings- og konsentratorsett. Etter at DNA er ekstrahert, bør PCR-fragmentet som brukes til sekvensering inkludere alle fire målstedene, om mulig. Dette fragmentet vil gjøre det mulig å identifisere store delesjoner som spenner over flere guidesteder i mors sprø embryoer.
Når du samler mors crispant haploider for Sanger-sekvensering, samle alle haploidene som viser fenotypen og send minst 10 unike haploide embryoprøver til Sanger-sekvensering. Sekvenseringen av flere haploide embryoer per clutch vil tillate identifisering av flere INDELs funnet i kimlinjen. Tidligere sekvenseringsdata for mors sprø haploider har vist at flere alleler kan identifiseres i et sett med mors sprø haploider11. Disse allelene gjenfinnes imidlertid ikke i forventet 1 til 1-forhold11. Sekvenseringen av flere embryoer vil også bidra til å støtte ideen om at fenotypen er forårsaket av en CRISPR-Cas9 INDEL i målgenet. Enhver villtypesekvens observert i sekvenserte haploide embryoer som viser en bestemt fenotype, vil foreslå at fenotypen ikke er assosiert med det målrettede genet. Eventuelle nye fenotyper med morseffekt identifisert ved målretting av tidligere ukarakteriserte gener bør også bekreftes ved å etablere en stabil linje ved hjelp av søsken F0-hannene11.
I noen tilfeller kan det være utfordrende å identifisere INDELs via haploid analyse der den identifiserte maternelle crispant fenotypen har en viss fenotypisk egenskap. For eksempel kan mors sprø haploide embryoer som ser ut til å være unfertilized eller lysis under spaltningsstadiet være umulig å velge. Maternelle sprø embryoer med akseforlengelsesdefekter som ligner de som tilsvarer det haploide syndromet, kan heller ikke skilles for analyse ved generering av maternelle haploider34. I slike tilfeller anbefales forskeren å gjennomføre analysen direkte ved hjelp av stabile linjer for genfenotypebekreftelse.
En begrensning av den nåværende mors crispant-protokollen er at den bare identifiserer mormor-effekt-gener ved brutto morfologiske defekter. For å øke metodens følsomhet og gjøre den mer spesifikk for visse aspekter av tidlig utvikling, kan transgene reportere brukes til å markere spesifikke strukturer eller celletyper, slik det har blitt gjort for andre skjermer 9,10,35. For eksempel kan CRISPR-Cas9-blandingen injiseres i Buc-GFP-transgen linje for å identifisere ikke-dødelige gener som regulerer dannelsen og utviklingen av primordiale kimceller36. En annen begrensning av mors crispant-protokollen er at selv om den er nyttig for gener som utelukkende uttrykkes under tidlig utvikling, kan det ikke være effektivt for gener med både mors og zygotisk funksjon siden CRISPR-Cas9-målrettingen av genet kan være dødelig for det utviklende embryoet. For å studere mors funksjon av gener uttrykt gjennom utvikling, kan Cas9-aktivitet målrettes mot kimlinje37, og dermed forlate genets somatiske funksjon upåvirket og tillate overlevelse av F0-hunnene til voksen alder.
Maternelle crispants er et effektivt verktøy for å identifisere nye morseffektgener som er nødvendige for tidlig utvikling. Kombinasjonen av multipleksing guide RNA til et enkelt mål og den bialleliske redigeringsevnen til Cas9 gjør at masernal-effekt fenotypen kan observeres i en enkelt generasjon, og unngår flergenerasjons avlsordninger som vanligvis trengs når man utfører målrettet genredigering. Omgåelsen av flere generasjoner reduserer mengden plass og ressurser som er nødvendige for å identifisere morseffektgener.
I tillegg til å identifisere nye morseffektgener, tillater denne protokollen ethvert sebrafisklaboratorium å fenokopiere og studere enhver kjent morseffektmutant uten å etablere og opprettholde stabile linjer, noe som letter detaljert analyse av genetiske veier. I prinsippet kan denne mors crispant-tilnærmingen også bestemme funksjonen til mors produkter i ikke-genetiske modellarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker tidligere og nåværende Pelegri lab husdyrhold ansatte for deres omsorg for akvatiske anlegget. Vi er også takknemlige for kommentarer og innsikt i manuskriptet av Ryan Trevena og Diane Hanson. Finansiering ble gitt av NIH-tilskudd til F.P. (GM065303)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
| 100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
| 70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
| Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
| Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
| Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
| Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
| Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
| Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
| General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Gloves | Any Maker | ||
| Ice Bucket | Any Maker | ||
| Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Female zebrafish | |||
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
| Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
| MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
| Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
| Micropipeters | Any Maker | ||
| Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
| Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
| Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
| Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
| nuclease-free water | Any Maker | ||
| Paper Towel | Any Maker | ||
| Pastro Pipettes | Any Maker | ||
| PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
| Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
| Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
| Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
| Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatula | Any Maker | ||
| Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
| Tape | Any Maker | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
| Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
| UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
| Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
| 1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse free ethanol | any maker | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
| Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agarose | any maker | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | any maker | ||
| Dissecting Forcepts | any maker | ||
| Dissecting Microscope | any maker | ||
| Dissecting Scissors | any maker | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
| Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fish Net | any maker | fine mesh | |
| Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
| Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
| Gel Electropheresis System | any maker | ||
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
| Glass Dishes | any maker | ||
| Gloves | any maker | ||
| Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ice Bucket | any maker | ||
| Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
| In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Male and Female zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Microinjector | |||
| Microneedle Slide | |||
| Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
| Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
| Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
| Microplastic slide | |||
| Microwave | any maker | ||
| MiliQ Water | any maker | ||
| mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Narrow Spatula | any maker | ||
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Paper Towel | any maker | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
| PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
| Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
| Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software for sanger sequencing Analysis | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterlie H2O | any brand | ||
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Tape | any brand | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
| UV lamp | UVP | ||
| UV safety glasses | any maker | ||
| Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
| Zebrafish mating boxes | any maker | ||
| PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |
References
- Pelegri, F.
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
- He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
- Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
- Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
- Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
- Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
- Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
- Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
- Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
- Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
- White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
- Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
- Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
- Xu, Q.
- Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
- Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
