Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

Published: December 21, 2021 doi: 10.3791/63177
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Genetics, University of Wisconsin-Madison

Summary

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

Abstract

ההתפתחות המוקדמת תלויה במאגר של גורמים אימהיים המשולבים בביצית הבוגרת במהלך האוגנזה המבצעים את כל הפונקציות התאיות הדרושות להתפתחות עד להפעלת הגנום הזיגוטי. בדרך כלל, מיקוד גנטי של גורמים אימהיים אלה דורש דור נוסף כדי לזהות פנוטיפים של השפעה אימהית, המעכב את היכולת לקבוע את תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם במהלך ההתפתחות. גילוי יכולות העריכה הדו-אליליות של CRISPR-Cas9 איפשר הקרנה של פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים או "קריספונים", מה שהגביר את ההבנה של התפקיד שממלאים גנים בעלי ביטוי זיגוטי בתוכניות התפתחותיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול שהוא הרחבה של שיטת ה-crispant. בשיטה זו, העריכה הדו-אלילית של תאי הנבט מאפשרת בידוד של פנוטיפ בעל אפקט אימהי בדור אחד, או "קריספנטים אימהיים". ריבוי רנ"א מנחה למטרה אחת מקדם ייצור יעיל של קריספנטים אימהיים, בעוד שניתוח רצף של ההפלואידים הקריפנטים האימהיים מספק שיטה פשוטה לאימות נגעים גנטיים המייצרים פנוטיפ אפקט אימהי. השימוש בקריספנטים אימהיים תומך בזיהוי מהיר של גנים חיוניים המתבטאים באופן אימהי, ובכך מקל על ההבנה של התפתחות מוקדמת.

Introduction

מאגר של מוצרים שהופקדו על ידי האם (למשל, רנ"א, חלבונים וביו-מולקולות אחרות) נחוץ לכל התהליכים התאיים המוקדמים עד להפעלת הגנום הזיגוטי של העובר1. הידלדלות מוקדמת של מוצרים אלה מהביצית היא בדרך כלל קטלנית עוברית. למרות חשיבותם של גנים אלה בהתפתחות, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע כיום. התקדמות בטכנולוגיית עריכת גנים בדגי זברה, כגון CRISPR-Cas9, מאפשרת מיקוד של גנים המתבטאים באופן אימהי 2,3,4. עם זאת, זיהוי של פנוטיפ אפקט אימהי דורש דור נוסף בהשוואה לפנוטיפ זיגוטי, ולכן דורש יותר משאבים. לאחרונה, יכולת העריכה הדו-אלילית של CRISPR-Cas9 שימשה לסינון פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים (F0), המכונים "פרישנים"5,6,7,8,9,10. טכניקת ה-crispant מאפשרת סינון חסכוני במשאבים של גנים מועמדים בתאים סומטיים, מה שמקל על ההבנה של היבטים ספציפיים בהתפתחות. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי של פנוטיפים בעלי השפעה אימהית, או "פרישים אימהיים", בדור אחד11. סכימה זו ניתנת להשגה על ידי ריבוי רנ"א מנחה לגן יחיד וקידום אירועי עריכה ביאליים בגרמלין. עוברים חדים אימהיים אלה ניתנים לזיהוי על ידי פנוטיפים מורפולוגיים גסים ועוברים אפיון ראשוני, כגון תיוג עבור גבולות התא ותבנית DNA11. ניתוח משולב של הפנוטיפ הנצפה והאפיון המולקולרי הבסיסי של ה-INDELs המושרים מאפשר לחזות את תפקידו של הגן הממוקד בהתפתחות מוקדמת.

בדגי זברה, במהלך 24 השעות הראשונות שלאחר ההפריה (hpf), קבוצה קטנה של תאים מתפתחת לתאי הנבט הקדמוניים, מבשר לנבט12,13,14,15. במצמדים שהונחו על ידי נקבות F0, שיעור העוברים החדים האימהיים שהתאוששו תלוי בכמה תאי נבט מכילים אירוע עריכה ביאלי בגן הממוקד. באופן כללי, ככל שאירוע העריכה מתרחש מוקדם יותר בעובר, כך גדלה ההסתברות לצפייה במוטציות CRISPR-Cas9 בגרמן. ברוב המקרים, הפנוטיפים של עוברים פריכים אימהיים נובעים מאובדן תפקוד בשני האללים האימהיים הקיימים בביצית המתפתחת. כאשר הביצית מסיימת את המיוזה, אחד האללים האימהיים מובלט מהעובר דרך גוף הקוטב, ואילו האלל השני משתלב בפרונוקלאוס האימהי. הריצוף של מספר הפלואידים החד-קרניים האימהיים ייצג תערובת של המוטציות (החדרות ו/או מחיקות (INDELs)) הקיימות בגרמלין התורמות לפנוטיפ11.

הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים ליצירת מוטציות CRISPR-Cas9 בגנים בעלי השפעה אימהית ולזיהוי הפנוטיפ המתאים באמצעות גישה של פרישנט אימהי (איור 1). החלק הראשון יסביר כיצד לתכנן וליצור באופן יעיל רנ"א מנחה, בעוד שסעיפים 2 ו-3 מכילים שלבים קריטיים ליצירת קריספנטים אימהיים על ידי מיקרו-הזרקה. לאחר הזרקת תערובת CRISPR-Cas9, עוברים מוזרקים נבדקים לעריכות סומטיות באמצעות PCR (סעיף 4). לאחר שעוברי F0 המוזרקים מתפתחים ומגיעים לבגרות מינית, נקבות ה-F0 עוברות לזכרים מסוג בר, וצאצאיהן נבדקים לפנוטיפים בעלי השפעה אימהית (סעיף 5). החלק השישי כולל הוראות להכנת הפלואידים קריספנטים אימהיים שניתן לשלב עם ריצוף סנגר כדי לזהות את ה-INDELs המושרים על ידי CRISPR-Cas9. בנוסף, הדיון מכיל שינויים שניתן לבצע בפרוטוקול כדי להגביר את הרגישות והעוצמה של שיטה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

במחקרים שהובילו לפיתוח פרוטוקול זה, כל הדיור והניסויים של דגי זברה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (IACUC-M005268-R2).

1. סינתזה של רנ"א מנחה

הערה: קריספנטים זיגוטיים נוצרו באמצעות RNA מנחה יחיד או ריבוי רנ"א מנחה מרובים למטרה אחת 5,6,7,8,9,10. ריבוי הרנ"א המנחה מגדיל את אחוז העוברים המציגים פנוטיפ פריך זיגוטי10. בשל התדירות המוגברת הזו של עוברים המציגים פנוטיפ, קריספנטים אימהיים נוצרים על ידי ריבוי ארבעה רנ"א מנחים לגן יחיד. פרוטוקול מפורט יותר על שימוש ב- CHOPCHOP לתכנון רנ"א מנחה ושיטת חישול לסינתזה של RNAs מנחים עבור דגי זברה ניתן למצוא במקומות אחרים 16,17,18,19,20.

  1. כדי לזהות גן בעל ביטוי אימהי שיש להתמקד בו, ודא את רמות השעתוק של mRNA במהלך הפיתוח באמצעות מסד נתונים של רצף RNA המספק מידע על תעתיק מזיגוטה עד 5 ימים21. באופן כללי, גנים ספציפיים לאמהות באים לידי ביטוי גבוה בעובר המוקדם ומתפרקים לאחר הפעלת הגנום הזיגוטי22.
  2. לאחר זיהוי גן מטרה בעל ביטוי אימהי, קבע את תחום החלבון החזוי הראשון באמצעות סעיף "תחומים ותכונות" הזמין בדפדפן הגנום של Ensembl23. השתמש בתחום זה כאזור היעד עבור ארבעת הרנ"א המנחים.
  3. השתמש בתוכנית בחירת ה-RNA המנחה CHOPCHOP כדי לזהות ארבעה אתרי יעד של RNA מנחה בתחום הפעיל הראשון. תכנון אוליגונוקלאוטידים ספציפיים לגנים, כפי שמוצג להלן עבור כל אתר יעד. באוליגונוקלאוטיד הספציפי לגן, מקטע N20 מתאים לרצף המטרה מינוס אתר PAM (NGG) מ-CHOPCHOP. סדרו את האוליגונוקלאוטידים הספציפיים לגנים האלה ואת האוליגונוקלאוטיד הקבוע באמצעות טיהור סטנדרטי של חומרים (ראו טבלת חומרים).
    אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן:
    5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGGATAGAAATAGCAAG 3'
  4. כדי ליצור תבנית RNA מנחה עבור כל אוליגונוקלאוטיד ספציפי לגן, יש להצמיד אותה לאוליגונוקלאוטיד הקבוע ולמלא את השלוחות בפולימראז T4-DNA כפי שתואר קודם לכן16. לאחר הרכבת ארבע תבניות ה-RNA המנחות, יש לטהר ולרכז אותן יחד באמצעות ערכת ניקוי DNA וריכוז בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
  5. סנתז את תערובת ה-sgRNA מתבנית ה-RNA של המדריך באמצעות ערכת שעתוק T7 במבחנה (ראו טבלת חומרים). בצע את התמלול במבחנה בהתאם להוראות היצרן. שימוש בחצאי תגובות של ערכת השעתוק T7 יכול להפחית את העלות לתגובה.
  6. לאחר סינתזת RNA, טהרו את המאגר שנוצר של sgRNA באמצעות פרוטוקול אתנול/אמוניום אצטט כפי שתואר קודם לכן 16,20,24. לאחר שהרנ"א בודד, יש להשעות אותו ב-20 μL של מים נטולי נוקלאז. אם נעשה שימוש בחצי תגובות של ערכת השעתוק T7 כדי לתמלל את מאגר ה-sgRNA, יש להשהות את הרנ"א המטוהר ל-10-15 מיקרון מים נטולי נוקלאז.
  7. לכמת את כמות ה-sgRNAs המאוגדים שנוצרו באמצעות ספקטרופוטומטר. לדלל את מאגר ה-sgRNAs במים נטולי נוקלאז לדילול של 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. בדרך כלל, הנפח הסופי של דילול העבודה נע בין 30-50 μL.
  8. לאחר קביעת הריכוז של מאגר ה- sgRNAs, ודא את שלמות ה- sgRNAs על ג'ל אגרוז של 1%.
    1. יצוק 1% אגרוז/0.5 מיקרוגרם/מ"ל אתידיום ברומיד/ג'ל TBE. לאחר שהג'ל התמצק, הניחו אותו במאגר TBE.
    2. יש לערבב 1 μL מתערובת sgRNA ו-1 μL של מאגר טעינת ג'ל RNA (ראו טבלת חומרים). טען דגימה זו בג'ל והפעל את הג'ל ב 100 V במשך 5 דקות.
  9. דמיינו את הפסים באמצעות אור אולטרה סגול (UV). מאגר ה-sgRNAs אמור להופיע כלהקה אחת. אם נצפה מריחה, סביר להניח שהתרחשה השפלת RNA.
  10. אחסנו את מאגר ה-sgRNAs באליקוטים חד-פעמיים של 1 μL בצינורות רצועת PCR נטולי נוקלאז במקפיא של -80 מעלות צלזיוס. עבור כמויות גדולות של תערובת sgRNAs (30 μL או יותר), aliquot מחצית מהנפח לתוך צינורות רצועת PCR ללא נוקלאז ולאחסן את החצי השני כנפח גדול יותר בצינור microcentrifuge ללא נוקלאזה. להפשיר ולהציף בעת הצורך.
  11. כדי למנוע התדרדרות RNA, ודא שהדגימות בצינור המיקרוצנטריפוגה עוברות לא יותר משני מחזורי הפשרה בהקפאה.

2. הכנת ריאגנטים וחומרים למיקרו הזרקה

הערה: בדגי זברה, הזרקת Cas9 mRNA יכולה ליצור פריכים זיגוטיים. עם זאת, מחקרים הראו כי חלבון Cas9 יעיל יותר ביצירת INDELs בעוברים מוזרקים16,25. פרוטוקול זה משתמש בחלבון Cas9 כדי לייצר פריסנטים אימהיים מכיוון שחלבון זה אינו חווה את אותה פיגור בפעילות כמו ה-mRNA של Cas9 שהוזרק. בתיאוריה, זה אמור להגדיל את ההסתברות למוטציה ביאלית בשלב מוקדם בהתפתחות, וכתוצאה מכך גדל הסיכוי שמקטע נרחב יותר של הנבט יושפע. פרוטוקולים ומשאבים אחרים המפרטים כיצד להתכונן למיקרו-הזרקות ניתן למצוא במקומות אחרים24,26.

  1. רכשו או הפיקו חלבון Cas9 (ראו טבלת חומרים). יש למרוח את חלבון Cas9 במים נטולי נוקלאז כדי ליצור תמיסה של 2 מ"ג/מ"ל ו-aliquot 1 μL לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מפוליפרופילן ללא RNase. אחסן אותם כצינורות חד-פעמיים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. אחר הצהריים לפני ההזרקה, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך נימי זכוכית וליצור מחט הזרקה. אחסנו את המחט הלא שבורה במחזיק מחט סגור עד לבוקר המיקרו-הזרקות.
  3. כדי ליצור צלחת הזרקה, יוצקים 20 מ"ל של 1.5% אגרוז / סטרילי H2O כדי למלא מחצית צלחת פטרי 100 מ"מ X 15 מ"מ ולחכות שהיא תתמצק. לאחר הגדרת תמיסת האגרוז, הוסיפו 20 מ"ל של 1.5% אגרוז/סטרילי H2O לצלחת הפטרי והכניסו את תבנית הפלסטיק (ראו טבלת חומרים) לתוך האגרוז הנוזלי ותנו לו להתקשות.
  4. לאחר שהאגרוז התקשה, מוציאים את תבנית הפלסטיק ומאחסנים את צלחת ההזרקה במהופך במקרר עד לבוקר ההזרקות. ניתן להשתמש בצלחת אחת להזרקות מרובות כל עוד הבארות שומרות על שלמותן.

3. מיקרו-הזרקה של קוקטייל CRISPR-Cas9 לעובר של דג זברה חד-תאי ליצירת קריספנטים אימהיים

הערה: משאבים נוספים למיקרו-הזרקה לעוברים של דגי זברה ניתן למצוא במקומות אחרים24,26,27. הזרקת תערובת CRISPR-Cas9 לבלסטודיסק המתפתח של עוברים חד-תאיים עשויה להגדיל את ההסתברות ליצירת פריכים אימהיים. ניתן גם להזריק את התערובת לשק החלמון עד לשלב 2 התאים. עם זאת, תערובות המוזרקות לחלמון תלויות בזרימה אופלסמית כדי להגיע לבלסטודיסק, כך ש-CRISPR-Cas9 המוזרק לחלמון יכול להפחית את יעילות החיתוך של ה-CRISPR-Cas928.

  1. אחר הצהריים לפני המיקרו-הזרקות, הציבו צלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות של דגי זברה. החזיקו את הדגים הזכריים והנקביים באותו מיכל אך הפרידו ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או הניחו את הנקבה בתוך מיכל הטלת ביצים.
  2. בבוקר הניסוי, הוציאו אליקוט אחד של 2 מ"ג/מ"ל של חלבון Cas9 ואליקוט אחד של מאגר ה-sgRNA. בצינור המיקרו-צנטריפוגה נטול הפוליפרופילן נטול RNase המכיל את החלבון Cas9, הרכיבו תערובת הזרקה של 5 μL הכוללת את מאגר ה-sgRNAs, 1 μL של תמיסה אדומה פנול 0.5% ומים נטולי נוקלאז. יש לשאוף לריכוז סופי של 400 ng/μL חלבון Cas9 ו-200 ng/μL של ה-sgRNAs המאוגדים במים נטולי RNase או יחס של 2:1 של חלבון Cas9 ל-sgRNA בעובר המוזרק. תערובת הזרקה זו יכולה להיות מאוחסנת על קרח לבוקר ההזרקה.
  3. הוציאו צלחת הזרקה מהמקרר ותנו לה להתחמם לטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות לפחות.
  4. לאחר הרכבת קוקטייל ההזרקה, אפשרו לזכר ולנקבה להזדווג, למשל על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות או על ידי הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה, לפי הצורך.
  5. לאחר שהדגים הניחו אך לפני שהעוברים נאספו, חתכו את קצה המחט הלא שבורה באמצעות סכין גילוח חדש או מלקחיים עדינים כדי ליצור מחט שיש לה בור קטן מספיק כדי למנוע נזק לעובר אך היא רחבה מספיק כדי שלא תיסתם בתערובת הזרקה. לאחר חיתוך המחט, יש לטעון את המחט עם תערובת ההזרקה באמצעות קצה פיפטה של microloader המוחדר לקצה האחורי של הנימי (ראו טבלאות חומרים).
  6. לאחר מילוי המחט, דגירה של המחט למשך 5 דקות ב-RT כדי להרכיב קומפלקסים של Cas9-sgRNA.
  7. הפעל את המיקרו-אינז'קטור והכנס את המחט למיקרומניפולטור. מניחים טיפת שמן מינרלי על מגלשה של מיקרומטר ומכיילים את המחט על ידי התאמת לחץ ההזרקה עד שהמחט פולטת בולוס של 1 ננומטר לתוך השמן המינרלי.
    הערה: בעת הזרקת השמן המינרלי, בולוס 1 nL יהיה בקוטר של כ-0.125 מ"מ (או רדיוס של 0.062 מ"מ) כפי שנמדד בשקופית המיקרומטר.
  8. כדי לסנכרן את העוברים, אספו אותם לאחר 10 דקות באמצעות מסננת פלסטיק ושטפו אותם לצלחת פטרי באמצעות מדיה אחת E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, והוסיפו 20 μL של 0.03 M מתילן כחול לכל 1 ליטר של 1x E3). מוציאים 10-15 עוברים ומכניסים אותם לצלחת פטרי נפרדת כדי להישמר כבקרות לא מוזרקות.
  9. העבירו את שאר העוברים המתפתחים לבארות של צלחת ההזרקה.
  10. להזריק 1 nL של תמיסה (סך של 400 pg של חלבון Cas9 ו 200 pg של sgRNAs) לתוך blastodisc המתפתח של עובר חד-תאי. אם קצה המחט נסתם, השתמש במלקחיים כדי לשבור את הקצה בחזרה ולכייל מחדש את המחט כדי להוציא בולוס 1 nL. הקפידו להזריק את כל העוברים במהלך 40 הדקות הראשונות של ההתפתחות לאחר ההפריה.
  11. לאחר השלמת ההזרקה, החזירו את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי מסומנת המכילה מדיה E3 אחת ואפשרו להם להתפתח לאורך כל היום. הסר את כל העוברים שאינם מופרים או שאינם מתפתחים באופן תקין על פי סדרת ההיערכות של דגי הזברה29.

4. הקרנה ל-INDELs סומטיים בעוברים מוזרקים F0

הערה: ניתן להשתמש בשיטות אחרות לזיהוי INDELs, כגון בדיקת T7 endonuclease I או ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה, כאשר קובעים אם העוברים מכילים INDELs סומטיים 30.

  1. למחרת לאחר הזריקות, הסר עוברים פגומים ופגומים מצלחת פטרי והחלף את המדיה 1x E3 כדי לשמור על בריאות העובר.
  2. לאחר ניקוי המנה, אספו שישה עוברים מוזרקים בריאים ושני עוברי בקרה מהצלחת הלא מוזרקת. הכניסו כל עובר בנפרד לתוך באר אחת של צינור רצועת PCR ותייגו את החלק העליון של הצינורות.
  3. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי של עוברים בודדים, הסר את המדיה העודפת של E3 מהבארות של צינור הרצועה והוסף 100 μL של 50 mM NaOH לכל באר.
  4. לדגור על העוברים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס, מוסיפים 10 μL של 1 M Tris HCL (pH 7.5), ומערבבים אותן במשך 5 עד 10 שניות. ניתן לאחסן דנ"א מופק זה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות ללא פגיעה משמעותית בדנ"א.
  5. תכנן פריימרים ייחודיים לסינון עבור כל אתר מדריך כדי להגביר מקטע DNA של 100-110 bp הכולל את אתר היעד CRISPR-Cas9. במידת האפשר, מקם את אתר היעד באמצע הקטע המוגבר, המאפשר זיהוי של מחיקות גדולות יותר.
  6. עבור כל אחד מארבעת אתרי היעד המנחים, הגדר שמונה תגובות PCR של 25 μL באמצעות 5 μL של הדנ"א הגנומי המוכן לעובר יחיד, תערובת PCR וראשוני הסינון הספציפיים למדריך כדי לזהות מוטציות סומטיות באתר היעד (טבלה 1).
  7. יצוק ג'ל אתידיום ברומיד/TBE של 2.5% אגרוז/0.5 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות מסרקים היוצרים בארות ברוחב של כ-0.625 ס"מ. מסרק רחב זה מאפשר רזולוציה טובה יותר בעת זיהוי שינויי גודל ברצף הגנומי. לאחר שהג'ל התמצק, הכניסו אותו לתא אלקטרופורזה המכיל חיץ פועל של TUBE.
  8. הוסיפו 5 μL של 6x צבע טעינה למוצר PCR וטענו 25 μL של תערובת זו לתוך הג'ל. ודא שדגימות ההזרקה והבקרה מופעלות באותה שורה של הג'ל. לאחר טעינת כל הדגימות, יש להוסיף 5 μL של אתידיום ברומיד לכל 1 ליטר של חיץ ריצה TBE לקצה החיובי של קופסת הג'ל.
  9. הפעל את הג'ל ב-120 וולט עד שרצועות הדנ"א יתפתרו או שהדנ"א יתקרב לקצה הנתיב. אם ה-Cas9 יצר INDELs באתר היעד, בדרך כלל נצפה כתם בדגימות שהוזרקו, אך לא בפקדים.
  10. אם נצפו מריחות במינימום של שלושה מתוך ארבעת אתרי ההדרכה בעוברים שהוזרקו להם ארבעה רנ"א מנחים, גדלו העוברים המוזרקים על ידי האחים.
  11. בכל פעם שהדגימות המוזרקות אינן מכילות מריחות במספר הנדרש של אתרי מדריך, תכננו רנ"א מדריך חדש שיחליף את אלה שלא עבדו וצרו מאגר חדש של רנ"א מדריך הכולל את אלה שעבדו ואת אלה שעוצבו לאחרונה. להזריק ולבדוק את הבריכה החדשה עבור INDELs סומטיים כמתואר לעיל.

5. זיהוי פנוטיפים של אפקט אימהי בעוברים חדים אימהיים

הערה: ברגע שנקבות F0 המוזרקות הגיעו לבגרות מינית, לתאי הנבט שלהן יש פוטנציאל ליצור תערובת של עוברים אימהיים פריכים ועוברי בר. אף על פי שתערובת זו מאפשרת בקרות פנימיות להפריה ולתזמון התפתחותי, עדיין מועיל להגדיר צלב מסוג בר כבקרה חיצונית למקרה שמצמד מנקבת F0 מכיל רק עוברים פריכים אימהיים.

  1. אחר הצהריים שלפני הניסוי, הציבו את הנקבות המוזרקות F0 נגד זכרים מסוג בר ושלטו בצלבים מסוג בר בתיבות הזדווגות סטנדרטיות של דגי זברה. מניחים גם את הדגים הזכריים וגם את הדגים הנקביים באותו מיכל אך מפרידים ביניהם באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או מניחים את הנקבה בתוך מיכל מטיל ביצים.
  2. בבוקר הניסוי, אפשרו לזכר ולנקבה להתחיל להזדווג, למשל על ידי הסרת מחיצת תיבת ההזדווגות או הצבת הזכר באותה תוספת הטלת ביצים כמו הנקבה.
  3. אספו את העוברים כל 10 דקות על ידי הזזת התוסף המטיל את הביצים לתחתית מיכל הזדווגות חדשה המכילה מי מערכת מתוקים ותייגו את המיכל עם תג המזהה את נקבת ה-F0 הבודדת. לוקחים את מיכל ההזדווגות הישן ויוצקים את המים דרך מסננת תה כדי לאסוף את העוברים ממצמד בודד אחד של 10 דקות.
  4. לאחר שנאספו העוברים ממצמד יחיד של 10 דקות במסננת, העבירו אותם לצלחת פטרי המכילה מדיה E3 אחת. תייג את צלחת הפטרי עם זמן האיסוף ופרטי הדגים.
  5. תחת מיקרוסקופ מנתח עם מקור אור המועבר, צפו בעוברים העוברים העוברים התפתחות כל שעה במשך 6-8 השעות הראשונות ומדי יום במשך 5 הימים הבאים.
  6. זהה עוברים חדים אימהיים פוטנציאליים על ידי שינויים מורפולוגיים גולמיים בהתפתחותם בהשוואה לבקרות מסוג בר תואמות זמן29.
  7. העבירו את העוברים הפריכים האימהיים הפוטנציאליים לצלחת פטרי המכילה 1x E3 ובדיקה לפנוטיפ מורפולוגי ב-24 כ"ס וכדאיות (למשל, ניפוח שלפוחית השתן בשחייה) 5 ימים לאחר ההפריה.

6. ריצוף אללים בהפלואידים פריכים אימהיים

הערה: ההפלואידים החד-קרניים האימהיים מכילים אלל יחיד במוקד הממוקד, מה שמאפשר זיהוי של INDELs בגן המטרה באמצעות ריצוף סנגר. ניתן גם לנתח עוברי ההפלואידים הפריכים של האם באמצעות מבחני ריצוף מהדור הבא. עוברים המראים פנוטיפ פריך אימהי צפויים לשאת נגע לפחות באחד מארבעת אתרי היעד (ראו דיון).

  1. אחר הצהריים שלפני הניסוי, הקימו זוגות הזדווגות של נקבות F0 הידועות כמייצרות עוברים חדים אימהיים שעברו לזכרים מסוג בר. יש להפריד פיזית את הזכרים מסוג בר מהנקבות באמצעות מחיצה של תיבת הזדווגות או להניח את הנקבה בתא הטלת הביצים.
  2. בבוקר הניסוי, הסירו את המחיצה הפיזית או הניחו גם את הזכרים וגם את הנקבות בתוך התוסף המטיל ביצים כדי ליזום הזדווגות. בסימן הראשון של הטלת ביצים, להפסיק את הרבייה על ידי הפרדת הזכר ואת נקבות F0. יש לשמור כל נקבת F0 מופרדת בתיבות הזדווגות נפרדות.
  3. הכינו תמיסת זרע שטופלה ב-UV באמצעות אשכים של זכר אחד מסוג פרא עבור כל 100 μL של התמיסה של האנק (טבלה 2), מספיק כדי להפרות ביציות שהוברחו מנקבה אחת, כפי שתואר קודםלכן 31.
  4. חילוץ ידני של ביציות בוגרות מנקבות F0 שנבחרו מראש וביצוע הפריה חוץ גופית (IVF) באמצעות זרע31 שטופל ב-UV.
  5. לאחר הפריה חוץ גופית , אפשרו לעוברים ההפלואידים להתפתח עד לתצפית על הפנוטיפ הפריך האימהי והכניסו את העוברים הללו לצלחת פטרי אחרת.
  6. לאחר שזוהו עוברי ההפלואידים האימהיים, אפשרו להם להתפתח לפחות 6 שעות לאחר ההפריה.
  7. כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי מלפחות עשרה עוברים חד-פעמיים חד-הוריים, הנח עובר הפלואיד יחיד לתוך באר בודדת של צינור רצועת PCR, הסר מדיה עודפת של E3 מהבאר והוסף 50 μL של 50 mM NaOH.
  8. לדגור על העוברים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס, מוסיפים 5 מיקרון ליטר של 1 M Tris HCL (pH 7.5), ומערבולות במשך 5-10 שניות. ניתן לאחסן את הדנ"א המופק בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
  9. כדי לזהות אילו אתרים מנחים מכילים INDELs, תכננו פריימרים לריצוף כדי להגביר מקטע דנ"א הכולל את כל ארבעת אתרי היעד של CRISPR-Cas9. פריימרים ריצוף אלה מאפשרים זיהוי של INDELs המשתרעים על פני מספר אתרי מנחה.
  10. הגדר שתי תגובות PCR של 25 μL לכל עובר באמצעות 5 μL של הדנ"א הגנומי המוכן והפריימרים של הריצוף.
  11. לאחר סיום ה-PCR, יש לטהר ולרכז את שתי הדגימות באמצעות ערכת ניקוי DNA וריכוז (ראו טבלת חומרים). לאחר מכן הגש את מקטע הדנ"א לריצוף סנגר באמצעות פריימרים של ריצוף קדימה ואחורה.
  12. לאחר ריצוף מקטע הקריספנט האימהי ההפלואידי, יישרו אותו לרצף מסוג פראי וזהו INDELs באתרי היעד באמצעות תוכנית יישור רצף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הגישה הניסויית המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת זיהוי של פנוטיפים של השפעה אימהית באופן מהיר וחסכוני במשאבים (איור 1).

יצירת פריכיות אימהית:
כאשר מתכננים את ארבעת הרנ"א המנחים כך שיתמקדו בגן בעל השפעה אימהית מועמד יחיד, יש לתת את הדעת במיוחד למקום שבו הרנ"א המנחה ייקשר לדנ"א. באופן כללי, כולם צריכים להיות מקובצים יחד עם אזורים חופפים מינימליים עד ללא חפיפה בין רנ"א מנחה בתחילת תחום החלבון החזוי הראשון (איור 2A). התמקדות ב-RNA המנחה לתחום זה מגדילה את הסיכוי שגם INDELs בתוך המסגרת וגם מחוץ למסגרת ישפיעו על תפקוד החלבון. משתנים נוספים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון רנ"א מנחים הם יעילות החיתוך ומספר האתרים מחוץ למטרה בגנום.

לאחר הזרקת תמיסת CRISPR-Cas9, ניתן לקבוע את הפעילות הסומטית של Cas9 על ידי הפעלת שבר PCR קטן, כ -100 bp, על ג'ל אגרוז. אם INDELs נוצרו בעובר המוזרק, יש לראות כתם בדגימות שהוזרקו, אך לא בבקרה הלא מוזרקת (איור 2B). כל אתר מדריך צריך להיבדק באופן עצמאי עבור פעילות Cas9 בתאים סומטיים. אם רואים מריחות לפחות בשלושה אתרי הדרכה, יש לגדל את העוברים המוזרקים לאחים ולבדוק פנוטיפים חדים אימהיים.

זיהוי של קריספנטים אימהיים:
כדי לקבוע אם קריספנטים אימהיים נוצרים בצלבים טבעיים, ניתן להשוות את העוברים מנקבת דג F0 לבקרות מסוג בר תואמות זמן כדי לבחון כל שינוי בהתפתחות המוקדמת. מצמדי F0 צריכים לקבל ניקוד גם ב-24 כ"ס ו-5 ימים לאחר ההפריה כדי לבחון את התפתחות תוכנית הגוף הבסיסית ואת הכדאיות, בהתאמה, כדי לזהות גורמים אימהיים שיכולים לווסת שלבים מאוחרים יותר של התפתחות עוברית. זיהוי פנוטיפ משותף במצמדים מנקבות F0 שונות מאפשר להבחין בין השפעות הנגרמות כתוצאה מאובדן תפקוד של גן מטרה לבין השפעות מחוץ למטרה או לא ספציפיות.

בנוסף, מצמדים המכילים פרישנטים אימהיים הם בדרך כלל פסיפס (כלומר, הם כוללים גם עוברי פרא פנוטיפיים וגם עוברי פריכות אימהיים), המאפשרים לעוברים מסוג בר לשמש כבקרה פנימית למשתנים כגון תזמון ההפריה וקצב ההתפתחות. בממוצע, מצמדים מנקבות F0 יכילו כ-69% עוברים פריכים אימהיים, כאשר מצמדים יכילו עד 100% עוברים פריכים אימהיים שנצפו11.

לאחר זיהוי עוברים חדים אימהיים, הם יכולים לשמש לאפיון מולקולרי ראשוני, כלומר, תיוג חיסוני לגבולות התא או צביעת דנ"א עם DAPI, מה שיכול לספק תובנה לגבי האופי התאי של התהליך ההתפתחותי המושפע11. השיטה החד-משמעית האימהית יכולה לשמש גם לפנוסקופיה של מוטציות ידועות בעלות השפעה אימהית, כגון מוטלי, TMI והילה (איור 3)11.

ריצוף של הפלואידים פריכים אימהיים:
כדי לזהות את הנגעים הגנטיים שתורמים לפנוטיפ הקריפנט האימהי הקריספנטי, זרע והפריה חוץ גופית שטופלו ב-UV משולבים כדי ליצור הפלואידים חד-קרניים אימהיים (איור 4). זרע שטופל ב-UV מספק צנטריול אך אינו תורם דנ"א אבהי, ובכך מאפשר חלוקת תאים עם חומר גנומי אימהי בלבד. יצירת הפלואיד מאפשרת לסנגר רצף של האלל האימהי וזיהוי של INDELs חדים אימהיים (איור 4). בממוצע, נצפו שני אללים לכל מצמד של הפלואיד פריך אימהי. ה-INDELs שזוהו באמצעות רצף סנגר כוללים עריכות הן באתרי מדריך יחיד והן מחיקות המתפרשות על פני אתרי מדריך מרובים (איור 4C, טבלה 3). סקר של INDELs חד-מפלואידיים אימהיים מנקבות F0 שונות מראה כי אותם אתרי הדרכה נערכים במספר עוברים, ורוב המוטציות שהתאוששו הן קודוני עצירה מוקדמים (טבלה 3)11.

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה אימהית חדה. כדי ליצור חדווה אימהית, התחילו בתכנון ארבעה gRNAs המכוונים לתחום הפעיל הראשון של הגן. 1) לאחר מכן סנתז את ארבעת ה- gRNAs בתגובה אחת. 2) לאחר סינתזה וטיהור של ה-gRNA, צרו קוקטייל CRISPR-Cas9 והזריקו אותו לבלסטודיסק של עובר חד-תאי. 3) לאחר מכן, לסנן את העוברים המוזרקים עבור מוטציות סומטיות באמצעות PCR ואלקטרופורזה ג'ל. אם INDELs נוצרו בדגימות מוזרקות, כתם היה מופיע בעוברים המוזרקים, בניגוד לרצועה ההדוקה של הבקר מסוג בר. 4) לאפשר לאחים של העוברים המוזרקים לגדול במשך 3-6 חודשים כדי להגיע לבגרות מינית. לאחר שמגיעים לבגרות מינית, חוצים נקבה מוזרקת F0 כנגד זכר מסוג פראי. הצאצאים המתקבלים יכולים להיות תערובת של עוברים פריכים מסוג בר ואימהות. זהה נקבה מוזרקת F0 שהעוברים שלה מציגים את הפנוטיפ בעל ההשפעה האימהית. 5) כדי לזהות את הנגעים התורמים לפנוטיפ, הפריה חוץ גופית מבוצעת באמצעות זרע שטופל ב- UV כדי ליצור הפלואידים חדים אימהיים לריצוף סנגר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: יצירת INDELs בגנים ממוקדים. (A) דיאגרמת מבנה גנים המציגה תחומי חלבונים היפותטיים (בלוקים סגולים בהירים וכהים), מיקום של gRNAs (קווים אדומים) ואתרי PAM (כוכבים אדומים). ה-gRNAs מכוונים לתחום הפעיל הראשון. אקסונים מוצגים כבלוקים, ואינטרונים מוצגים כקווים. (B) מריחות בג'ל אגרוז של 2.5% מעידות על INDELs בתאים סומטיים בעוברים מוזרקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פריסנטים אימהיים משחזרים את הפנוטיפ של מוטציות ידועות בעלות השפעה אימהית. השוואה מייצגת של עוברי בר חיים ומותאמים לזמן (עמודה שמאלית), מוטנטים אימהיים ידועים (עמודה אמצעית) ועוברים חדים אימהיים (עמודה ימנית). (A) motley/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) מוטציות הילה/mid1ipIl/קריספנטים אימהיים מראים פגמים בציטוקיניזה בחלוקות עובריות מוקדמות, מה שמוביל לבלסטולה סינקטיאלית מלאה (A, B), או עוברים תאיים חלקית (C, קופסה לבנה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: שימוש בהפלואידים חד-קרניים אימהיים כדי לרצף מוטציות הנגרמות על-ידי CRISPR-Cas9 . (A) נקבה מוזרקת F0 שנחצתה כנגד זכר מסוג בר גורמת לעובר דיפלואידי עם פנוטיפ של אפקט אימהי. (B) הפריה חוץ גופית מבוצעת באמצעות זרע שטופל ב-UV ליצירת הפלואידים חדים אימהיים, המאפשרים ריצוף וניתוח של INDELs המושרים באלל האימהי. (C) ריצוף מייצג של birc5b חד-קרני אימהי הפלואיד מראה מחיקה גדולה בין אתרי המדריך 3 ו-4 (בקופסה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תערובת PCR
הוסף
סטרילי H2O 171.12 מ"ל
מ.ג.ל.2 (1 מטר) 0.393 מ"ל
טריס-HCl (1 M, pH 8.4) 2.618 מ"ל
קק"ל (1 מטר) 13.092 מ"ל
Autoclave במשך 20 דקות, ולאחר מכן לצנן את הפתרון על קרח. ההוספה הבאה
BSA (100 מ"ג/מ"ל) 3.468 מ"ל
dATP (100 מ"מ) 0.262 מ"ל
dCTP (100 מ"מ) 0.262 מ"ל
dGTP (100 מ"ר) 0.262 מ"ל
dTTP (100 מ"מ) 0.262 מ"ל
Aliquot לתוך צינורות microcentrifuge סטרילי
מתכון PCR לכל דגימה
תערובת PCR 17.9 מיקרון ליטר
פריימר F + R (10 מיקרומטר) 0.2 מיקרון
ROH2O 1.8 מיקרון
Taq DNA פולימראז 0.1 מיקרון
דנ א 5 מיקרון

טבלה 1: תערובת PCR.

הפתרון של האנק
הפרמיקס של האנק שלב את הדברים הבאים לפי הסדר: (1) 10.0 מ"ל של HS #1, (2) 1.0 מ"ל של HS #2, (3) 1.0 מ"ל של HS #4, (4) 86 מ"ל של ddH2O, (5) 1.0 מ"ל של HS #5. אחסן את כל פתרונות HS בטמפרטורה של 4°C
פתרון המניות של האנק #1 8.0 גרם של NaCl, 0.4 גרם של KCl ב 100 מ"ל של ddH2O
פתרון המניות של האנק #2 0.358 גרם של Na2HPO4 נטול מים; 0.60 גרם של K 2 H 2 PO4 ב 100 מ"ל של ddH2O
פתרון המניות של האנק #4 0.72 גרם של CaCl 2 ב 50 מ"ל של ddH2O
פתרון המניות של האנק #5 1.23 גרם של MgSO4·7H 2 O ב 50 מ"ל של ddH20
פתרון המניות של האנק #6 0.35 גרם של NaHCO3 ב 10.0 מ"ל של ddH20; להכין טרי ביום השימוש
פתרון העבודה הסופי של האנק שלבו 9.9 מ"ל של ה-Premix של האנק עם 0.1 מ"ל של HS Stock #6

טבלה 2: הפתרון של האנק.

Birc5B #1 Birc5B #2 Birc5B #3 PRC1L #1 PRC1L #2
המספר הכולל של עוברים ברצף 3 9 12 8 10
המספר הכולל של עוברים עם INDELs 3 9 12 8 10
מוטציה באתר אחד 0 0 0 0 0
מוטציות במספר אתרים 3 9 12 8 10
מיקום של INDELs
מדריך אתר 1 0 0 0 0 0
מדריך אתר 2 0 0 0 8 10
מדריך אתר 3 3 9 12 8 10
מדריך אתר 4 3 9 12 0 10
סוגי INDELs
מוטציה בתוך המסגרת 1 2 2 7 10
מוטציה של הזזת מסגרת 4 7 10 9 10

טבלה 3: המיקום והסוג של INDELs שנמצאו בשתי קבוצות שונות של הפלואידים חדים אימהיים: birc5b ו- prc1l.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה מאפשר זיהוי ואפיון מולקולרי ראשוני של פנוטיפ אפקט אימהי בדור אחד במקום הדורות המרובים הנדרשים לטכניקות גנטיות קדימה ואחורה. נכון לעכשיו, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע. חוסר ידע זה נובע בחלקו מהדור הנוסף הנדרש כדי לדמיין פנוטיפ בעת זיהוי גנים בעלי השפעה אימהית. בעבר, זיהוי מהיר של גנים בעלי השפעה אימהית בדגי זברה יכול היה להיות מושג על ידי הזרקת מורפולינו אוליגונוקלאוטידים חוסמי תרגום לביציות מתורבתות32. שיטה זו הוכחה כמוצלחת על ידי פנוקופיה של מספר גנים ידועים בעלי השפעה אימהית, אך מניפולציה של ביצית לא בשלה יכולה להיות ניסוי עדין וגוזל זמן. רנ"א אימהי יכול גם להיות ממוקד לפירוק באמצעות קומפלקסים של CRISPR-RfxCas13d, אך הזרקת קומפלקסים אלה לעובר חד-תאי אינה יכולה להתמקד בחלבון33 המסופק על ידי האם. לאחרונה, התגלה כי CRISPR-Cas9 יכול לגרום למוטציות ביאליות בחיידק, מה שמאפשר זיהוי מהיר של גנים חדשים בעלי השפעה אימהית בדור יחיד11.

פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים התורמים להחלמתם של עוברים חדים אימהיים. בתיאוריה, מאחר שתאי נבט מוגדרים בהתפתחות עוברית מוקדמת, ככל שנגע דנ"א נוצר מוקדם יותר בגן מטרה, כך גדלה ההסתברות שתא המכיל מוטציות יהפוך לחלק מהנבט. שיטה זו משתמשת בחלבון Cas9 המוזרק לתוך הבלסטודיסק המתפתח של עובר חד-תאי כדי להגדיל את ההסתברות לעריכות ב-germline. גורם קריטי נוסף שמשפיע על אחוז העוברים האימהיים שהתאוששו הוא היעילות של ה-RNA המנחה ביצירת עריכות גנטיות באתרי יעד. הליך זה כולל פרק על קביעת היכולת של רנ"א מנחה ליצור INDELs סומטיים ב 24 hpf על ידי PCR. אם רנ"א מנחה אינו מצליח לבצע עריכות סומטיות, יש לו סבירות נמוכה לייצר עריכות ב-germline בקצב גבוה מספיק כדי ליצור פריך אימהי. פרוטוקול זה מכוון את המשתמש לבדוק עריכות סומטיות, שאמורות להיות גלויות בשלושה אתרי הדרכה או יותר.

לאחר התבוננות בפנוטיפ של עוברים חדים אימהיים, ניתן לנתח את הנגעים הגנטיים התורמים לפנוטיפ ברמת הרצף באמצעות הפריה חוץ גופית עם זרע שטופל ב- UV. כדי לרכוש מספיק חומר מוצא ל-PCR, עוברים חד-הוריים חד-הוריים צריכים להתפתח במשך שש עד שמונה שעות לפחות, מה שמאפשר להתרחשות מחזורים מרובים של שכפול דנ"א. הדנ"א הגנומי צריך להיות מופק גם ב-50 μL של 50mM NaOH כדי לרכז את הדנ"א. אם העוברים החד-הוריים אינם יכולים לשרוד במשך 6-8 שעות, אספו את העוברים בנקודת זמן מוקדמת יותר. כדי להסביר את העובדה שהעובר עובר פחות מחזורים של שכפול דנ"א, חלצו את הדנ"א בנפח קטן יותר של 50 mM NaOH תוך שמירה על אותו שיעור של NaOH ו-Tris-HCL. אפשרות נוספת היא לרכז את הדנ"א שחולץ באמצעות ערכת ניקוי וריכוז דנ"א. לאחר חילוץ הדנ"א, מקטע ה-PCR המשמש לריצוף צריך לכלול את כל ארבעת אתרי היעד, במידת האפשר. קטע זה יאפשר זיהוי של מחיקות גדולות המשתרעות על פני מספר אתרי הדרכה בעוברים חדים אימהיים.

בעת איסוף הפלואידים הפריכים האימהיים לריצוף של סנגר, אסוף את כל ההפלואידים המראים את הפנוטיפ ושלח לפחות 10 דגימות עוברי haploid ייחודיות לריצוף של סנגר. ריצוף של מספר עוברי הפלואידים לכל מצמד יאפשר זיהוי של מספר INDELs הנמצאים בחיידק. נתוני ריצוף קודמים של הפלואידים חדים אימהיים הראו כי ניתן לזהות אללים מרובים בקבוצה של ההפלואידים הקרסים האימהיים11. עם זאת, אללים אלה אינם משוחזרים ביחס הצפוי של 1 ל-111. ריצוף של עוברים מרובים יעזור גם לתמוך ברעיון שהפנוטיפ נגרם על ידי CRISPR-Cas9 INDEL בגן המטרה. כל רצף מסוג בר שנצפה בעוברים ההפלואידים מרוצפים המציגים פנוטיפ מסוים יציע כי הפנוטיפ אינו קשור לגן הממוקד. כל פנוטיפים חדשים בעלי השפעה אימהית שזוהו באמצעות מיקוד גנים שלא אופיינו בעבר צריכים להיות מאושרים גם על ידי יצירת קו יציב באמצעות זכרי F0 האחים11.

במקרים מסוימים, זה עשוי להיות מאתגר לזהות INDELs באמצעות ניתוח haploid שבו פנוטיפ חד אימהי מזוהה יש מאפיין פנוטיפי מסוים. לדוגמה, עוברים חד-הוריים פריכים אימהיים שנראים לא מופרים או תזה בשלב הביקוע עשויים להיות בלתי אפשריים לבחירה. עוברים חדים אימהיים עם פגמים בהארכת ציר הדומים לאלה המתאימים לתסמונת ההפלואידים עשויים גם הם להיות לא ניתנים להבחנה לניתוח בעת יצירת הפלואידים אימהיים34. במקרים כאלה, מומלץ לחוקר לבצע את הניתוח ישירות באמצעות קווים יציבים לאישור גן-פנוטיפ.

מגבלה אחת של פרוטוקול ה-crispant האימהי הנוכחי היא שהוא מזהה גנים בעלי השפעה אימהית רק על ידי פגמים מורפולוגיים גסים. כדי להגביר את הרגישות של השיטה ולהפוך אותה לספציפית יותר עבור היבטים מסוימים של התפתחות מוקדמת, ניתן להשתמש בכתבים מהונדסים כדי להדגיש מבנים או סוגי תאים ספציפיים, כפי שנעשה עבור מסכים אחרים 9,10,35. לדוגמה, ניתן להזריק את תערובת CRISPR-Cas9 לקו המהונדס Buc-GFP כדי לזהות גנים לא קטלניים המווסתים את היווצרותם והתפתחותם של תאי נבט קדמוניים36. מגבלה נוספת של פרוטוקול הקריפנט האימהי היא שלמרות שהוא שימושי לגנים המתבטאים אך ורק במהלך ההתפתחות המוקדמת, ייתכן שהוא אינו יעיל עבור גנים בעלי תפקוד אימהי וזיגוטי כאחד, שכן מיקוד CRISPR-Cas9 של הגן עלול להיות קטלני לעובר המתפתח. כדי לחקור את התפקוד האימהי של גנים המתבטאים במהלך ההתפתחות, פעילות Cas9 יכולה להיות ממוקדת לחיידק37, ובכך להשאיר את הפונקציה הסומטית של הגן ללא השפעה ולאפשר את הישרדותן של נקבות F0 לבגרות.

קריספנטים אימהיים הם כלי יעיל לזיהוי גנים חדשים בעלי השפעה אימהית הנחוצים להתפתחות מוקדמת. השילוב של ריבוי RNA מנחה למטרה אחת ויכולת העריכה הדו-ערכית של Cas9 מאפשרת לצפות בפנוטיפ אפקט האם בדור אחד, תוך הימנעות מסכמות רבייה רב-דוריות הדרושות בדרך כלל בעת ביצוע עריכת גנים ממוקדת. עקיפה של דורות מרובים מקטינה את כמות השטח והמשאבים הדרושים לזיהוי גנים בעלי השפעה אימהית.

בנוסף לזיהוי גנים חדשים בעלי השפעה אימהית, פרוטוקול זה מאפשר לכל מעבדה של דגי זברה לבצע פנוסקופיה ולחקור כל מוטציה ידועה של השפעה אימהית מבלי לבסס ולשמור על קווים יציבים, מה שמקל על ניתוח מפורט של מסלולים גנטיים. באופן עקרוני, גישה חדה אימהית זו יכולה גם לקבוע את תפקודם של מוצרים אימהיים במיני מודלים שאינם גנטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

אנו מודים בעבר ובהווה לאנשי צוות גידול בעלי החיים במעבדה של פלגרי על טיפולם במתקן הימי. אנו מודים גם על ההערות והתובנות על כתב היד מאת ריאן טרבנה ודיאן הנסון. המימון ניתן על ידי מענק NIH ל- F.P. (GM065303)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
  3. Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
  4. He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
  5. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
  6. Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  7. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  8. Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
  9. Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
  10. Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
  11. Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
  12. Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
  13. Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
  14. Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
  15. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
  16. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
  17. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  18. Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  19. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  20. Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
  21. White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
  22. Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
  23. Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  24. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
  25. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
  26. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
  27. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).
  28. Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
  31. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
  32. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
  33. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  34. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
  35. Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
  36. Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
  37. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 178 התפתחות מוקדמת CRISPR-Cas9 אפקט אימהי דג זברה עריכת גנום גנטיקה הפוכה
קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moravec, C. E., Voit, G. C.,… More

Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter