Summary
Vroege ontwikkeling is afhankelijk van moederlijk overgeërfde producten en de rol van veel van deze producten is momenteel onbekend. Hierin beschreven we een protocol dat CRISPR-Cas9 gebruikt om fenotypen met maternale effecten in een enkele generatie te identificeren.
Abstract
Vroege ontwikkeling hangt af van een pool van maternale factoren die tijdens oogenese in de volwassen eicel zijn opgenomen en die alle cellulaire functies uitvoeren die nodig zijn voor de ontwikkeling tot zygotische genoomactivering. Typisch vereist genetische targeting van deze maternale factoren een extra generatie om fenotypen met maternale effecten te identificeren, waardoor het vermogen om de rol van maternale tot expressie gebrachte genen tijdens de ontwikkeling te bepalen, wordt belemmerd. De ontdekking van de biallelische bewerkingsmogelijkheden van CRISPR-Cas9 heeft screening van embryonale fenotypes in somatische weefsels van geïnjecteerde embryo's of "crispants" mogelijk gemaakt, waardoor het begrip van de rol die zygotisch tot expressie gebrachte genen spelen in ontwikkelingsprogramma's wordt vergroot. Dit artikel beschrijft een protocol dat in het verlengde ligt van de crispantmethode. In deze methode maakt de biallelische bewerking van geslachtscellen de isolatie van een fenotype met moedereffect in een enkele generatie mogelijk, of "maternale crispants". Multiplexing leidt RNA's naar een enkel doelwit bevordert de efficiënte productie van maternale crispants, terwijl sequentieanalyse van maternale crispant haploïden een eenvoudige methode biedt om genetische laesies te bevestigen die een fenotype met maternale effecten produceren. Het gebruik van maternale crispants ondersteunt de snelle identificatie van essentiële maternale tot expressie gebrachte genen, waardoor het begrip van vroege ontwikkeling wordt vergemakkelijkt.
Introduction
Een pool van maternale afgezette producten (bijv. RNA's, eiwitten en andere biomoleculen) is noodzakelijk voor alle vroege cellulaire processen totdat het zygote genoom van het embryo wordt geactiveerd1. De voortijdige uitputting van deze producten uit de eicel is typisch embryonaal dodelijk. Ondanks het belang van deze genen in de ontwikkeling, is de rol van veel moederlijk tot expressie gebrachte genen momenteel onbekend. Vooruitgang in genbewerkingstechnologie in zebravissen, zoals CRISPR-Cas9, maakt het mogelijk om moederlijk tot expressie gebrachte genente richten 2,3,4. De identificatie van een fenotype met maternale effecten vereist echter een extra generatie in vergelijking met een zygotisch fenotype, waardoor meer middelen nodig zijn. Onlangs is de biallelische bewerkingsmogelijkheid van CRISPR-Cas9 gebruikt om te screenen op embryonale fenotypen in somatische weefsels van geïnjecteerde (F0) embryo's, bekend als "crispants"5,6,7,8,9,10. De crispant-techniek maakt resource-efficiënte screening van kandidaatgenen in somatische cellen mogelijk, waardoor het begrip van specifieke aspecten in ontwikkeling wordt vergemakkelijkt. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, maakt de identificatie mogelijk van fenotypen met maternale effecten, of "maternale crispants", in een enkele generatie11. Dit schema is haalbaar door RNA's te multiplexen naar een enkel gen en biallelische bewerkingsgebeurtenissen in de kiembaan te bevorderen. Deze maternale crispante embryo's kunnen worden geïdentificeerd door grove morfologische fenotypen en ondergaan primaire karakterisering, zoals etikettering voor celgrenzen en DNA-patronen11. Gecombineerde analyse van het waarneembare fenotype en elementaire moleculaire karakterisering van de geïnduceerde INDELs maakt het mogelijk om de rol van het beoogde gen in de vroege ontwikkeling te voorspellen.
Bij zebravissen ontwikkelt zich tijdens de eerste 24 uur na de bevruchting (hpf) een kleine groep cellen tot de primordiale geslachtscellen, een voorloper van de kiembaan 12,13,14,15. In klauwen gelegd door F0-vrouwtjes hangt het aandeel van de maternale crispant-embryo's die worden hersteld af van het aantal geslachtscellen dat een biallelische bewerkingsgebeurtenis in het beoogde gen bevat. Over het algemeen geldt dat hoe eerder de bewerkingsgebeurtenis in het embryo plaatsvindt, hoe groter de kans dat CRISPR-Cas9-mutaties in de kiembaan worden waargenomen. In de meeste gevallen zijn de fenotypen van maternale crispante embryo's afkomstig van het verlies van functie in de twee maternale allelen die aanwezig zijn in de zich ontwikkelende eicel. Naarmate de eicel meiose voltooit, wordt een van de maternale allelen via het polaire lichaam uit het embryo geëxtrudeerd, terwijl het andere allel wordt opgenomen in de maternale pronucleus. De sequencing van meerdere maternale crispante haploïden vertegenwoordigt een mengsel van de mutaties (inserties en/of deleties (INDELs)) die aanwezig zijn in de kiembaan en die bijdragen aan fenotype11.
Het volgende protocol beschrijft de noodzakelijke stappen om CRISPR-Cas9-mutaties in maternale-effectgenen te creëren en het overeenkomstige fenotype te identificeren met behulp van een maternale crispantbenadering (figuur 1). In sectie één wordt uitgelegd hoe u effectief gids-RNA's kunt ontwerpen en maken, terwijl secties twee en drie kritieke stappen bevatten voor het maken van maternale crispants door micro-injectie. Na het injecteren van het CRISPR-Cas9 mengsel worden geïnjecteerde embryo's gescreend op somatische bewerkingen via PCR (sectie vier). Zodra de geïnjecteerde F0-embryo's zich ontwikkelen en geslachtsrijp zijn, worden de F0-vrouwtjes gekruist met mannetjes van het wilde type en worden hun nakomelingen gescreend op fenotypen met maternale effecten (sectie vijf). Sectie zes bevat instructies voor het maken van maternale crispante haploïden die kunnen worden gecombineerd met Sanger-sequencing om de CRISPR-Cas9-geïnduceerde INDELs te identificeren. Daarnaast bevat de discussie wijzigingen die in het protocol kunnen worden aangebracht om de gevoeligheid en kracht van deze methode te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In studies die hebben geleid tot de ontwikkeling van dit protocol, werden alle zebravishuisvesting en experimenten goedgekeurd door de University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2).
1. Synthese van guide-RNA's
OPMERKING: Zygotische crispants zijn gemaakt met behulp van een enkel gids-RNA of multiplexing van meerdere gids-RNA's naar een enkel doel 5,6,7,8,9,10. Het multiplexen van gids-RNA's verhoogt het percentage embryo's met een zygotisch crispant fenotype10. Vanwege deze verhoogde frequentie van embryo's die een fenotype vertonen, worden maternale crispants gemaakt door vier geleide RNA's te multiplexen naar een enkel gen. Een meer gedetailleerd protocol over het gebruik van CHOPCHOP om gids-RNA's te ontwerpen en een gloeimethode om gids-RNA's voor zebravissen te synthetiseren, is elders te vinden 16,17,18,19,20.
- Om een maternale tot expressie gebracht gen te identificeren om te targeten, moet u de mRNA-transcriptniveaus tijdens de ontwikkeling vaststellen via een RNA-sequentiedatabase die transcriptoominformatie biedt van zygote tot 5 dagen21. Over het algemeen zijn maternale specifieke genen sterk tot expressie gebracht in het vroege embryo en worden ze afgebroken nadat het zygotische genoom is geactiveerd22.
- Zodra een maternale tot expressie gebracht doelgen is geïdentificeerd, bepaalt u het eerste voorspelde eiwitdomein met behulp van de sectie "domeinen en kenmerken" die beschikbaar is in de Ensembl-genoombrowser23. Gebruik dit domein als doelgebied voor de vier leidende RNA's.
- Gebruik het gids-RNA-selectieprogramma CHOPCHOP om vier gids-RNA-doellocaties in het eerste actieve domein te identificeren. Ontwerp genspecifieke oligonucleotiden, zoals hieronder weergegeven voor elke doellocatie. In het genspecifieke oligonucleotide komt de N20-sectie overeen met de doelsequentie minus de PAM-site (NGG) van CHOPCHOP. Bestel deze genspecifieke oligonucleotiden en het constante oligonucleotide met behulp van standaard desaltzuivering (zie Materiaaltabel).
Genspecifiek oligonucleotide:
5' TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG 3' - Om een gids-RNA-sjabloon te maken voor elk genspecifiek oligonucleotide, gloeit u het naar het constante oligonucleotide en vult u de overhangen in met T4-DNA-polymerase zoals eerder beschreven16. Nadat de vier gids-RNA-sjablonen zijn samengesteld, zuivert en concentreert u ze samen met behulp van een DNA-opruim- en concentratorkit volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
- Synthetiseer het sgRNA-mengsel uit de gepoolde gids-RNA-sjabloon met behulp van een in-vitro T7-transcriptiekit (zie Materiaaltabel). Voer de in-vitro transcriptie uit volgens de instructies van de fabrikant. Het gebruik van halve reacties van de T7 Transcriptie kit kan de kosten per reactie verlagen.
- Na RNA-synthese zuivert u de resulterende pool van sgRNA's met behulp van een ethanol/ ammoniumacetaatprotocol zoals eerder beschreven 16,20,24. Nadat het RNA is geïsoleerd, resuspenseert u het in 20 μL nucleasevrij water. Als halve reacties van de T7 Transcriptiekit werden gebruikt om de pool van sgRNA's te transcriberen, resuspenseer het gezuiverde RNA in 10-15 μL nucleasevrij water.
- Kwantificeer de hoeveelheid gepoolde sgRNA's die zijn gemaakt met behulp van een spectrofotometer. Verdun de pool van sgRNA's in nucleasevrij water tot een verdunning van 1500 ng/μL ± 500 ng/μL. Doorgaans varieert het uiteindelijke volume van de werkverdunning van 30-50 μL.
- Controleer na het bepalen van de concentratie van de pool van sgRNA's de integriteit van de sgRNA's op een 1% agarose gel.
- Giet een 1% agarose/0,5 μg/ml ethidiumbromide/TBE-gel. Zodra de gel is gestold, plaatst u deze in de TBE-loopbuffer.
- Meng 1 μL van het sgRNA-mengsel en 1 μL RNA-gellabuffer (zie Materiaaltabel). Laad dit monster in de gel en laat de gel gedurende 5 minuten op 100 V draaien.
- Visualiseer de banden met ultraviolet (UV) licht. De pool van sgRNA's moet als één band worden weergegeven. Als een uitstrijkje wordt waargenomen, is waarschijnlijk RNA-afbraak opgetreden.
- Bewaar de pool van sgRNA's in aliquots voor eenmalig gebruik in nucleasevrije PCR-stripbuizen in de vriezer van -80 °C. Voor grote volumes sgRNA-mengsel (30 μL of meer) voert u de helft van het volume op in de nucleasevrije PCR-stripbuizen en slaat u de andere helft op als een groter volume in een nucleasevrije microcentrifugebuis. Ontdooien en aliquot wanneer nodig.
- Om RNA-afbraak te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de monsters in de microcentrifugebuis niet meer dan twee vries-dooicycli ondergaan.
2. Reagentia en materialen voorbereiden voor micro-injectie
OPMERKING: Bij zebravissen kan de injectie van Cas9-mRNA zygotische crispants creëren. Studies hebben echter aangetoond dat Cas9-eiwit efficiënter is in het maken van INDELs in geïnjecteerde embryo's16,25. Dit protocol gebruikt Cas9-eiwit om maternale crispants te genereren, omdat dit eiwit niet dezelfde vertraging in activiteit ervaart als geïnjecteerd Cas9-mRNA. In theorie zou dit de kans op een biallelische mutatie vroeg in de ontwikkeling moeten vergroten, wat resulteert in een verhoogde kans dat een uitgebreider deel van de kiembaan wordt aangetast. Andere protocollen en bronnen die gedetailleerd beschrijven hoe u zich kunt voorbereiden op micro-injecties zijn elders te vinden24,26.
- Cas9-eiwit kopen of genereren (zie materiaaltabel). Resuspendeer het Cas9-eiwit in nucleasevrij water om een 2 mg / ml-oplossing te maken en aliquot 1 μL in RNase-vrije polypropyleen microcentrifugebuizen. Bewaar deze als buizen voor eenmalig gebruik bij -80 °C.
- Gebruik de middag voor de injectie een micropipettetrekker om een glazen capillair te trekken en een injectienaald te maken. Bewaar de ongebroken naald in een ingesloten naaldhouder tot de ochtend van micro-injecties.
- Om een injectieplaat te maken, giet je 20 ml 1,5% agarose / steriel H2O om de helft van een petrischaal van 100 mm X 15 mm te vullen en wacht je tot deze stolt. Zodra de agarose-oplossing is ingesteld, voegt u 20 ml 1,5% agarose / steriel H2O toe aan de petrischaal en plaatst u de plastic mal (zie materiaaltabel) in de vloeibare agarose en laat deze uitharden.
- Nadat de agarose is uitgehard, verwijdert u de plastic mal en bewaart u de injectieplaat ondersteboven in een koelkast tot de ochtend van injecties. Een enkele plaat kan worden gebruikt voor meerdere injecties zolang de putten hun integriteit behouden.
3. Micro-injectie van CRISPR-Cas9-cocktail in een eencellig zebravisembryo om maternale crispants te genereren
OPMERKING: Meer middelen voor micro-injectie in zebravisembryo's zijn elders te vinden 24,26,27. Het injecteren van het CRISPR-Cas9-mengsel in de zich ontwikkelende blastodisc van eencellige embryo's kan de kans op het creëren van maternale crispants vergroten. Het mengsel kan ook in de dooierzak worden geïnjecteerd tot aan het 2-celstadium. Mengsels die in de dooier worden geïnjecteerd, zijn echter afhankelijk van ooplasmatische streaming om de blastodisc te bereiken, dus CRISPR-Cas9 geïnjecteerd in de dooier kan de snij-efficiëntie van de CRISPR-Cas928 verminderen.
- De middag voor micro-injecties, zet wild-type kruisen op in zebravis paringskasten. Houd zowel de mannelijke als de vrouwelijke vissen in dezelfde tank, maar scheid ze met een paringsdoosverdeler of plaats het vrouwtje in een ei-leggende insert.
- Op de ochtend van het experiment, neem een 2 mg / ml aliquot Cas9-eiwit en een aliquot van de pool van sgRNA's. Monteer in de RNase-vrije polypropyleen microcentrifugebuis die het Cas9-eiwit bevat een injectiemengsel van 5 μL dat de pool van sgRNA's, 1 μL 0,5% fenolrode oplossing en nucleasevrij water omvat. Streef naar een eindconcentratie van 400 ng/μL Cas9-eiwit en 200 ng/μL van de gepoolde sgRNA's in RNase-vrij water of een 2:1 verhouding cas9-eiwit tot sgRNA's in het geïnjecteerde embryo. Dit injectiemengsel kan op ijs worden bewaard voor de ochtend van de injectie.
- Haal een injectieplaat uit de koelkast en laat deze minstens 20 min opwarmen tot kamertemperatuur (RT).
- Nadat de injectiecocktail is samengesteld, laat u het mannetje en het vrouwtje paren, bijvoorbeeld door de scheidingskast te verwijderen of door het mannetje in dezelfde ei-leggende insert te plaatsen als het vrouwtje, naargelang het geval.
- Nadat de vis heeft gelegd, maar voordat de embryo's zijn verzameld, snijdt u de punt van een ongebroken naald met behulp van een nieuw scheermesje of een fijne tang om een naald te maken die klein genoeg is om embryoschade te voorkomen, maar breed genoeg is zodat deze niet verstopt raakt met injectiemengsel. Nadat de naald is gesneden, laadt u de naald met het injectiemengsel met behulp van een microladerpipetpunt die in de achterkant van het capillair is ingebracht (zie Materiaaltabellen).
- Nadat de naald is gevuld, incubeer de naald gedurende 5 minuten bij RT om Cas9-sgRNA-complexen te assembleren.
- Zet de microinjector aan en steek de naald in de micromanipulator. Plaats een druppel minerale olie op een micrometerschuif en kalibreer de naald door de injectiedruk aan te passen totdat de naald een bolus van 1 nL in de minerale olie uitwerpt.
OPMERKING: Bij het injecteren in de minerale olie heeft een bolus van 1 nL een diameter van ongeveer 0,125 mm (of een straal van 0,062 mm) zoals gemeten met de micrometerschuif. - Om de embryo's te synchroniseren, verzamelt u ze na 10 minuten met een plastic zeef en spoelt u ze in een petrischaaltje met behulp van 1x E3-media (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4 en voeg 20 μL van 0,03 M methyleenblauw toe per 1 L van 1x E3). Verwijder 10-15 embryo's en plaats ze in een aparte petrischaal om als niet-geïnjecteerde controles te worden bewaard.
- Breng de rest van de zich ontwikkelende embryo's over in de putten van de injectieplaat.
- Injecteer 1 nL oplossing (in totaal 400 pg Cas9-eiwit en 200 pg sgRNA's) in de zich ontwikkelende blastodisc van een eencellig embryo. Als de punt van de naald verstopt raakt, gebruik dan een tang om de punt terug te breken en de naald opnieuw te kalibreren om een bolus van 1 nL uit te werpen. Zorg ervoor dat alle embryo's worden geïnjecteerd tijdens de eerste 40 minuten van de ontwikkeling na de bevruchting.
- Nadat de injectie is voltooid, brengt u de geïnjecteerde embryo's terug in een gelabeld petrischaaltje dat 1x E3-media bevat en laat u ze gedurende de dag ontwikkelen. Verwijder alle embryo's die onbevrucht zijn of zich niet normaal ontwikkelen volgens de zebravis ensceneringsreeks29.
4. Screening op somatische INDELs bij met F0 geïnjecteerde embryo's
OPMERKING: Andere methoden voor het identificeren van INDELs, zoals de T7-endonuclease I-test of de smeltanalyse met hoge resolutie, kunnen worden gebruikt om te bepalen of de embryo's somatische INDELs 30 bevatten.
- Verwijder de volgende dag na injecties defecte en gelyseerde embryo's uit de petrischaal en vervang de 1x E3-media om de gezondheid van het embryo te behouden.
- Na het schoonmaken van het gerecht, verzamel zes gezonde geïnjecteerde embryo's en twee controle-embryo's van de niet-geïnjecteerde plaat. Plaats elk embryo afzonderlijk in een enkele put van een PCR-stripbuis en label de bovenkant van de buizen.
- Om het genomische DNA van individuele embryo's te extraheren, verwijdert u de overtollige E3-media uit de putten van de stripbuis en voegt u 100 μL van 50 mM NaOH per put toe.
- Incubeer de embryo's bij 95 °C gedurende 20 minuten. Koel de monsters vervolgens af tot 4 °C, voeg 10 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) toe en vortex ze gedurende 5 tot 10 s. Dit geëxtraheerde DNA kan gedurende ten minste 6 maanden bij -20 °C worden bewaard zonder significante DNA-afbraak.
- Ontwerp unieke screeningprimers voor elke gidslocatie om een DNA-fragment van 100-110 bp te versterken dat de CRISPR-Cas9-doellocatie bevat. Plaats indien mogelijk de doellocatie in het midden van het versterkte fragment, zodat grotere deleties kunnen worden geïdentificeerd.
- Stel voor elk van de vier geleide doellocaties acht PCR-reacties van 25 μL in met behulp van 5 μL van het bereide genomische DNA met één embryo, pcr-mix en de gidsspecifieke screeningprimers om somatische mutaties in de doellocatie te identificeren (tabel 1).
- Giet een 2,5% agarose/0,5 μg/ml ethidiumbromide/TBE-gel met behulp van kammen die ongeveer 0,625 cm brede putten creëren. Deze brede kam zorgt voor een betere resolutie bij het detecteren van grootteveranderingen in de genomische sequentie. Nadat de gel is gestold, plaatst u deze in een elektroforesekamer die TBE-loopbuffer bevat.
- Voeg 5 μL 6x ladende kleurstof toe aan het PCR-product en laad 25 μL van dit mengsel in de gel. Zorg ervoor dat de geïnjecteerde en controlemonsters op dezelfde rij van de gel worden uitgevoerd. Nadat alle monsters zijn geladen, voegt u 5 μL ethidiumbromide per 1 L TBE-loopbuffer toe aan het positieve uiteinde van de gelbox.
- Laat de gel op 120 V draaien totdat de DNA-banden verdwijnen of het DNA het einde van de baan heeft bereikt. Als de Cas9 INDELs op de doellocatie heeft gemaakt, wordt meestal een uitstrijkje waargenomen in geïnjecteerde monsters, maar niet in de controles.
- Als uitstrijkjes worden waargenomen op minimaal drie van de vier gidsplaatsen in embryo's die zijn geïnjecteerd met vier gids-RNA's, kweek dan de door de broer of zus geïnjecteerde embryo's.
- Wanneer de geïnjecteerde monsters geen uitstrijkjes bevatten in het vereiste aantal gidslocaties, ontwerp dan nieuwe gids-RNA's om de RNA's te vervangen die niet werkten en maak een nieuwe pool van gids-RNA's met de RNA's die werkten en de nieuw ontworpen. Injecteer en test de nieuwe pool voor somatische INDELs zoals hierboven beschreven.
5. Identificatie van fenotypen met maternale werking in maternale crispante embryo's
OPMERKING: Zodra de geïnjecteerde F0-vrouwtjes geslachtsrijp zijn, hebben hun kiembaancellen het potentieel om een mengsel van maternale crispant en wild-type embryo's te genereren. Hoewel dit mengsel interne controles voor bevruchting en ontwikkelingstijd mogelijk maakt, is het nog steeds gunstig om een wild-type incross in te stellen als een externe controle in het geval dat een koppeling van F0-vrouw alleen maternale crispant-embryo's bevat.
- De middag voor het experiment, zet de F0 geïnjecteerde vrouwtjes op tegen wild-type mannetjes en controleer wild-type kruisingen in standaard zebravis paringsboxen. Plaats zowel de mannelijke als de vrouwelijke vissen in dezelfde tank, maar scheid ze met een paringsdoosverdeler of plaats het vrouwtje in een ei-leggende insert.
- Laat op de ochtend van het experiment het mannetje en het vrouwtje beginnen met paren, bijvoorbeeld door de scheidingskast te verwijderen of het mannetje in dezelfde eilegplaats te plaatsen als het vrouwtje.
- Verzamel de embryo's elke 10 minuten door de ei-leggende insert in een nieuwe paringstankbodem te verplaatsen die vers systeemwater bevat en label de tank met een tag die het individuele F0-vrouwtje identificeert. Neem de oude paringstank en giet het water door een theezeef om de embryo's van één individuele koppeling van 10 minuten te verzamelen.
- Zodra de embryo's van een enkele koppeling van 10 minuten in de zeef zijn verzameld, brengt u ze over naar een petrischaal met 1x E3-media. Label de petrischaal met het tijdstip van verzamelen en de visinformatie.
- Observeer onder een ontleedmicroscoop met een doorgelaten lichtbron de embryo's die de eerste 6-8 uur en de komende 5 dagen dagelijks in ontwikkeling zijn.
- Identificeer potentiële maternale crispant embryo's door grove morfologische veranderingen in hun ontwikkeling in vergelijking met tijd-gematchte wild-type controles29.
- Verplaats de potentiële maternale crispante embryo's naar een petrischaal die 1x E3-media bevat en test op morfologisch fenotype bij 24 pkf en levensvatbaarheid (bijv. Zwemblaasinflatie) 5 dagen na de bevruchting.
6. Sequencing allelen in maternale crispant haploïden
OPMERKING: Maternale crispante haploïden bevatten een enkel allel in de beoogde locus, waardoor indels in het doelgen kunnen worden geïdentificeerd via Sanger-sequencing. Maternale crispant haploïden embryo's kunnen ook worden geanalyseerd met behulp van next-generation sequencing assays. Embryo's die een maternale crispant fenotype vertonen, zullen naar verwachting een laesie dragen op ten minste één van de vier doellocaties (zie discussie).
- De middag voor het experiment, het opzetten van paring paring paren van F0 vrouwtjes waarvan bekend is dat ze maternale knapperige embryo's produceren die zijn gekruist met mannetjes van het wilde type. Houd de wilde mannetjes fysiek gescheiden van de vrouwtjes met behulp van een paringsdoosverdeler of plaats het vrouwtje in de ei-leggende insert.
- Verwijder op de ochtend van het experiment de fysieke scheidingswand of plaats zowel de mannetjes als de vrouwtjes in de ei-leggende insert om de paring te initiëren. Bij het eerste teken van het leggen van eieren, onderbreek het fokken door de mannelijke en F0-vrouwtjes te scheiden. Bewaar elk gescheiden F0-vrouwtje in individuele paringsboxen.
- Bereid uv-behandelde sperma-oplossing met behulp van teelballen van één wild type mannetje voor elke 100 μL Hank's oplossing (tabel 2), voldoende om geëxtrudeerde eieren van één vrouwtje te bevruchten, zoals eerder beschreven31.
- Extrudeer handmatig rijpe eieren van de vooraf geselecteerde F0-vrouwtjes en voer in-vitrofertilisatie (IVF) uit met behulp van het UV-behandelde sperma31.
- Laat na in-vitrofertilisatie de haploïde embryo's zich ontwikkelen totdat het maternale crispante fenotype wordt waargenomen en plaats die embryo's in een andere petrischaal.
- Zodra de maternale knapperige haploïde embryo's zijn geïdentificeerd, laat ze zich ontwikkelen gedurende ten minste 6 uur na de bevruchting.
- Om het genomische DNA uit ten minste tien maternale knapperige haploïde embryo's te extraheren, plaatst u een enkel haploïde embryo in een individuele put van een PCR-stripbuis, verwijdert u overtollige E3-media uit de put en voegt u 50 μL 50 mM NaOH toe.
- Incubeer de embryo's bij 95 °C gedurende 20 minuten. Koel vervolgens de monsters af tot 4 °C, voeg 5 μL 1 M Tris HCL (pH 7,5) toe en vortex gedurende 5-10 s. Het geëxtraheerde DNA kan maximaal 6 maanden bij -20 °C worden bewaard.
- Om te bepalen welke gidssites INDELs bevatten, ontwerpt u sequencingprimers om een DNA-fragment te versterken dat alle vier CRISPR-Cas9-doellocaties bevat. Deze sequencingprimers maken de identificatie mogelijk van INDELs die meerdere gidslocaties omvatten.
- Stel twee PCR-reacties van 25 μL per embryo in met behulp van 5 μL van het bereide genomische DNA en de sequencingprimers.
- Nadat de PCR is voltooid, zuivert en concentreert u de twee monsters met behulp van een DNA-opruim- en concentratorkit (zie materiaaltabel). Dien vervolgens het DNA-fragment in bij Sanger-sequencing met behulp van zowel de voorwaartse als de omgekeerde sequencingprimers.
- Nadat het haploïde maternale crispantfragment is gesequenced, lijnt u het uit op de wildtypesequentie en identificeert u INDELs op de doellocaties met behulp van een sequentie-uitlijningsprogramma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De experimentele aanpak die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om fenotypen met maternale effecten op een snelle, hulpbronnenefficiënte manier te identificeren (figuur 1).
Het genereren van maternale crispants:
Bij het ontwerpen van de vier gids-RNA's om zich te richten op een enkel kandidaat-gen met moedereffect, moet speciale aandacht worden besteed aan waar de gids-RNA's aan DNA zullen binden. Over het algemeen moeten ze allemaal samen worden geclusterd met minimale tot geen overlappende regio's tussen gids-RNA's aan het begin van het eerste voorspelde eiwitdomein (figuur 2A). Het richten van de gids-RNA's op dit domein verhoogt de kans dat zowel in-frame als out-of-frame INDELs de functie van het eiwit beïnvloeden. Andere variabelen waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van gids-RNA's zijn het verminderen van de efficiëntie en het aantal off-target sites in het genoom.
Na het injecteren van de CRISPR-Cas9-oplossing kan de somatische activiteit van Cas9 worden bepaald door een klein PCR-fragment, ongeveer 100 bp, op een agarose-gel te laten lopen. Als in het geïnjecteerde embryo INDELs zijn gemaakt, moet een uitstrijkje worden waargenomen in de geïnjecteerde monsters, maar niet in de niet-geïnjecteerde controle (figuur 2B). Elke geleidingsplaats moet onafhankelijk worden getest op Cas9-activiteit in somatische cellen. Als uitstrijkjes worden gezien op ten minste drie gidsplaatsen, moeten de door de broer of zus geïnjecteerde embryo's worden gekweekt en gescreend op maternale crispante fenotypen.
Identificatie van maternale crispants:
Om te bepalen of maternale crispants worden gemaakt in natuurlijke kruisingen, kunnen de embryo's van een F0-vrouwelijke vis worden vergeleken met op tijd afgestemde wildtypecontroles om eventuele veranderingen in de vroege ontwikkeling te observeren. F0-koppelingen moeten ook worden gescoord op 24 pkf en 5 dagen na de bevruchting om respectievelijk de ontwikkeling van het basislichaamsplan en de levensvatbaarheid te onderzoeken om maternale factoren te identificeren die latere stadia van embryonale ontwikkeling kunnen reguleren. Het identificeren van een gedeeld fenotype in koppelingen van verschillende F0-vrouwen vergemakkelijkt het onderscheiden van effecten veroorzaakt door het verlies van functie van een doelgen van off-target of niet-specifieke effecten.
Bovendien zijn koppelingen met maternale crispants meestal mozaïek (d.w.z. ze omvatten zowel fenotypische wild-type als maternale crispant embryo's), waardoor wild-type embryo's kunnen fungeren als een interne controle voor variabelen zoals bevruchting timing en ontwikkelingssnelheid. Gemiddeld bevatten de klauwen van F0-vrouwtjes ongeveer 69% maternale crispant-embryo's, met legsels die tot 100% maternale crispant-embryo's bevatten11.
Na het identificeren van maternale crispante embryo's, kunnen ze worden gebruikt voor primaire moleculaire karakterisering, d.w.z. immunolabeling voor celgrenzen of kleuring van DNA met DAPI, wat inzicht kan geven in de cellulaire aard van het aangetaste ontwikkelingsproces11. De maternale crispantmethode kan ook worden gebruikt voor fenocopie van bekende mutaties met maternale effecten, zoals bont, tmi en aura (figuur 3)11.
Volgorde van maternale krokante haploïden:
Om de genetische laesie(s) te identificeren die bijdragen aan het maternale crispant fenotype, worden UV-behandeld sperma en IVF gecombineerd om maternale crispante haploïden te creëren (figuur 4). UV-behandeld sperma levert een centriole, maar draagt geen vaderlijk DNA bij, waardoor cellulaire deling kan plaatsvinden met alleen maternale genomisch materiaal. De creatie van een haploïde maakt Sanger-sequencing van het maternale allel en identificatie van maternale crispante INDELs mogelijk (figuur 4). Gemiddeld werden twee allelen per legsel maternale crispant haploïd waargenomen. De INDELs die via Sanger-sequencing zijn geïdentificeerd, omvatten bewerkingen zowel in afzonderlijke gidssites als verwijderingen die meerdere gidssites omvatten (figuur 4C, tabel 3). Een onderzoek van maternale crispante haploïde INDELs van verschillende F0-vrouwtjes toont aan dat dezelfde gidsplaatsen in meerdere embryo's worden bewerkt en dat de meeste herstelde mutaties voortijdige stopcodons zijn (tabel 3)11.
Figuur 1: Maternale crispant workflow. Om een maternale crispant te maken, begin je met het ontwerpen van vier gRNA's die zich richten op het eerste actieve domein van het gen. 1) Synthetiseer vervolgens de vier gRNA's in een enkele reactie. 2) Na het synthetiseren en zuiveren van de gRNA's, maak je een CRISPR-Cas9-cocktail en injecteer je deze in de blastodisc van een eencellig embryo. 3) Screen vervolgens de geïnjecteerde embryo's op somatische mutaties met behulp van PCR en gel-elektroforese. Als INDELs werden gemaakt in geïnjecteerde monsters, zou er een uitstrijkje verschijnen in de geïnjecteerde embryo's, in tegenstelling tot de strakke band van de wild-type controle. 4) Laat de broers en zussen van de geïnjecteerde embryo's gedurende 3-6 maanden groeien om geslachtsrijp te worden. Nadat de geslachtsrijpheid is bereikt, kruist u een F0-geïnjecteerd vrouwtje tegen een wild type mannetje. Het resulterende nageslacht kan een mengsel zijn van wilde en maternale knapperige embryo's. Identificeer een F0-geïnjecteerd vrouwtje waarvan de embryo's het fenotype met maternale effecten vertonen. 5) Om de laesies te identificeren die bijdragen aan het fenotype, wordt IVF uitgevoerd met behulp van UV-behandeld sperma om maternale crispante haploïden te creëren voor Sanger-sequencing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Generatie van INDELs in gerichte genen. (A) Genstructuurdiagram met hypothetische eiwitdomeinen (licht- en donkerpaarse blokken), locatie van gRNA's (rode lijnen) en PAM-sites (rode sterren). De gRNA's zijn gericht op het eerste actieve domein. Exonen worden weergegeven als blokken en introns worden weergegeven als lijnen. (B) Uitstrijkjes in een 2,5% agarosegel zijn indicatief voor INDELs in somatische cellen in geïnjecteerde embryo's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Maternale crispants recapituleren het fenotype van bekende mutaties met maternale effecten. Representatieve vergelijking van levende, op tijd afgestemde wild-type (linkerkolom), bekende maternale mutanten (middelste kolom) en maternale crispant embryo's (rechterkolom). (A) bont/birc5b, (B) tmi/prc1l, (C) aura/mid1ipIl mutanten/maternale crispants vertonen defecten in cytokinese in vroege embryonale delingen, wat leidt tot volledig syncytiële blastula (A, B) of gedeeltelijk acellulaire embryo's (C, white box). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Het gebruik van maternale crispante haploïden om CRISPR-Cas9-geïnduceerde mutaties te sequencen. (A) Een F0-geïnjecteerd vrouwtje gekruist tegen een wild-type mannetje resulteert in een diploïde embryo met een fenotype met een maternale effect. (B) IVF wordt uitgevoerd met behulp van UV-behandeld sperma om maternale crispante haploïden te creëren, waardoor de volgorde en analyse van geïnduceerde INDELs in het maternale allel mogelijk is. (C) Representatieve volgorde van birc5b maternale crispant haploïd met een grote deletie tussen gidsplaatsen 3 en 4 (ingepakt). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| PCR-mix | ||
| Toevoegen | ||
| steriel H2O | 171,12 ml | |
| MgCl2 (1 m) | 0,393 ml | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8,4) | 2.618 ml | |
| KCl (1 M) | 13,092 ml | |
| Autoclaaf gedurende 20 minuten en koel de oplossing vervolgens op ijs. Volgende toevoegen | ||
| BSA (100 mg/ml) | 3.468 ml | |
| dATP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dCTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dGTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| dTTP (100 mM) | 0,262 ml | |
| Aliquot in steriele microcentrifugebuizen | ||
| PCR Recept | per monster | |
| PCR-mix | 17,9 μL | |
| F + R Primer (10 μM) | 0,2 μL | |
| ROH2O | 1,8 μL | |
| Taq DNA Polymerase | 0,1 μL | |
| DNA | 5 μL | |
Tabel 1: PCR-mix.
| Hank's oplossing | |||
| Hank's Premix | Combineer het volgende in volgorde: (1) 10,0 ml HS #1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Bewaar alle HS-oplossingen bij 4 °C | ||
| Hank's Stock Oplossing #1 | 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Oplossing #2 | 0,358 g Watervrij Na2HPO4 ; 0,60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Oplossing #4 | 0,72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Oplossing #5 | 1,23 g MgSO4·7H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Oplossing #6 | 0,35 g NaHCO3 in 10,0 ml ddH20; maak vers op de dag van gebruik | ||
| Hank's uiteindelijke werkoplossing | Combineer 9,9 ml Hank's Premix met 0,1 ml HS Stock #6 | ||
Tabel 2: De oplossing van Hank.
| Birc5b # 1 | Birc5b # 2 | Birc5b # 3 | prc1l # 1 | prc1l # 2 | ||
| Totaal aantal gesequencede embryo's | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Totaal aantal embryo's met INDELs | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Mutatie op één plek | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Mutaties op meerdere locaties | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Locatie van INDELs | ||||||
| Gids site 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| Gids site 2 | 0 | 0 | 0 | 8 | 10 | |
| Gids site 3 | 3 | 9 | 12 | 8 | 10 | |
| Gids site 4 | 3 | 9 | 12 | 0 | 10 | |
| Soorten INDELs | ||||||
| In-frame mutatie | 1 | 2 | 2 | 7 | 10 | |
| Frame shift mutatie | 4 | 7 | 10 | 9 | 10 | |
Tabel 3: De locatie en het type INDELs die worden aangetroffen in twee verschillende sets maternale krokante haploïden: birc5b en prc1l.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, maakt de identificatie en primaire moleculaire karakterisering van een fenotype met moedereffect in een enkele generatie mogelijk in plaats van de meerdere generaties die nodig zijn voor zowel voorwaartse als omgekeerde genetische technieken. Momenteel is de rol van veel moederlijk tot expressie gebrachte genen onbekend. Dit gebrek aan kennis is deels te wijten aan de extra generatie die nodig is om een fenotype te visualiseren bij het identificeren van maternale-effectgenen. In het verleden kon de snelle identificatie van maternale-effectgenen in zebravissen worden bereikt door translatieblokkerende morfolino-oligonucleotiden in gekweekte eicellen te injecteren32. Deze methode bleek succesvol door fenocopy van meerdere bekende maternale-effectgenen, maar het manipuleren van een onrijpe eicel kan een delicaat, tijdrovend experiment zijn. Maternale RNA's kunnen ook worden gericht op afbraak met crispr-rfxcas13d-complexen, maar de injectie van deze complexen in het eencellige embryo kan zich niet richten op het door de moeder geleverde eiwit33. Meer recent is ontdekt dat CRISPR-Cas9 biallelische mutaties in de kiembaan kan induceren, waardoor nieuwe genen met maternale effecten in één generatie11 snel kunnen worden geïdentificeerd.
Dit protocol bevat verschillende kritieke stappen die bijdragen aan het herstel van maternale crispant embryo's. In theorie, omdat geslachtscellen worden gespecificeerd in de vroege embryonale ontwikkeling, hoe eerder een DNA-laesie wordt gemaakt in een doelgen, hoe groter de kans dat een cel met mutaties deel gaat uitmaken van de kiembaan. Deze methode maakt gebruik van Cas9-eiwit geïnjecteerd in de zich ontwikkelende blastodisc van een eencellig embryo om de kans op bewerkingen in de kiembaan te vergroten. Een andere kritische factor die het percentage herstelde maternale crispant embryo's beïnvloedt, is de efficiëntie van de gids-RNA's bij het maken van genetische bewerkingen op doellocaties. Deze procedure omvat een sectie over het bepalen van het vermogen van geleide-RNA's om somatische INDELs te maken bij 24 hpf door PCR. Als een gids-RNA er niet in slaagt om somatische bewerkingen uit te voeren, heeft het een lage kans om bewerkingen in de kiembaan te produceren met een snelheid die hoog genoeg is om een maternale crispant te genereren. Dit protocol geeft de gebruiker de opdracht om somatische bewerkingen te testen, die zichtbaar moeten zijn op drie of meer gidssites.
Na observatie van het fenotype van maternale crispante embryo's, kunnen de genetische laesie (s) die bijdragen aan het fenotype worden geanalyseerd op sequentieniveau via IVF met UV-behandeld sperma. Om voldoende uitgangsmateriaal voor PCR te verkrijgen, moeten maternale knapperige haploïde embryo's zich gedurende ten minste zes tot acht uur ontwikkelen, waardoor meerdere cycli van DNA-replicatie kunnen plaatsvinden. Het genomische DNA moet ook worden geëxtraheerd in 50 μL van 50mM NaOH om het DNA te concentreren. Als de maternale knapperige haploïde embryo's 6-8 uur niet kunnen overleven, verzamel de embryo's dan op een eerder tijdstip. Om rekening te houden met het embryo dat minder cycli van DNA-replicatie ondergaat, extraheer het DNA in een kleiner volume van 50 mM NaOH met behoud van hetzelfde aandeel NaOH en Tris-HCL. Een andere optie is om het geëxtraheerde DNA te concentreren met behulp van een DNA-opruim- en concentratorkit. Nadat het DNA is geëxtraheerd, moet het PCR-fragment dat wordt gebruikt voor sequencing alle vier de doellocaties omvatten, indien mogelijk. Dit fragment maakt de identificatie mogelijk van grote deleties die meerdere gidslocaties in maternale crispant-embryo's omvatten.
Verzamel bij het verzamelen van maternale crispant haploïden voor Sanger-sequencing alle haploïden die het fenotype vertonen en stuur minimaal 10 unieke haploïde embryomonsters naar Sanger-sequencing. De sequencing van meerdere haploïde embryo's per koppeling zal de identificatie van meerdere INDELs in de kiembaan mogelijk maken. Eerdere sequencinggegevens van maternale crispante haploïden hebben aangetoond dat meerdere allelen kunnen worden geïdentificeerd in een set maternale crispant haploïden11. Deze allelen worden echter niet teruggewonnen in de verwachte 1 op 1 verhouding11. De sequencing van meerdere embryo's zal ook helpen het idee te ondersteunen dat het fenotype wordt veroorzaakt door een CRISPR-Cas9 INDEL in het doelgen. Elke wild-type sequentie waargenomen in gesequencede haploïde embryo's die een specifiek fenotype vertonen, zal suggereren dat het fenotype niet geassocieerd is met het beoogde gen. Alle nieuwe fenotypen met maternale effecten die worden geïdentificeerd door zich te richten op voorheen niet-gekarakteriseerde genen, moeten ook worden bevestigd door een stabiele lijn vast te stellen met behulp van de broer of zus F0-mannetjes11.
In sommige gevallen kan het een uitdaging zijn om INDELs te identificeren via haploïde analyse waarbij het geïdentificeerde maternale crispante fenotype een bepaald fenotypisch kenmerk heeft. Maternale crispante haploïde embryo's die onbevrucht of lysis lijken te zijn tijdens de splitsingsfase, kunnen bijvoorbeeld onmogelijk te selecteren zijn. Maternale crispante embryo's met asverlengingsdefecten die vergelijkbaar zijn met die welke overeenkomen met het haploïdsyndroom, kunnen ook niet worden onderscheiden voor analyse bij het genereren van maternale haploïden34. In dergelijke gevallen wordt de onderzoeker geadviseerd om de analyse rechtstreeks uit te voeren met behulp van stabiele lijnen voor gen-fenotypebevestiging.
Een beperking van het huidige maternale crispantprotocol is dat het alleen maternale-effectgenen identificeert door grove morfologische defecten. Om de gevoeligheid van de methode te vergroten en specifieker te maken voor bepaalde aspecten van de vroege ontwikkeling, kunnen transgene verslaggevers worden gebruikt om specifieke structuren of celtypen te markeren, zoals is gedaan voor andere schermen 9,10,35. Het CRISPR-Cas9-mengsel zou bijvoorbeeld in de Buc-GFP transgene lijn kunnen worden geïnjecteerd om niet-dodelijke genen te identificeren die de vorming en ontwikkeling van primordiale geslachtscellen reguleren36. Een andere beperking van het maternale crispantprotocol is dat, hoewel het nuttig is voor genen die alleen tot expressie komen tijdens de vroege ontwikkeling, het mogelijk niet effectief is voor genen met zowel maternale als zygote functie, omdat de CRISPR-Cas9-targeting van het gen dodelijk kan zijn voor het zich ontwikkelende embryo. Om de maternale functie van genen die tijdens de ontwikkeling tot expressie komen te bestuderen, kan Cas9-activiteit worden gericht op de kiembaan37, waardoor de somatische functie van het gen onaangetast blijft en de overleving van de F0-vrouwtjes tot volwassenheid mogelijk wordt.
Maternale crispants zijn een effectief hulpmiddel om nieuwe maternale-effectgenen te identificeren die nodig zijn voor een vroege ontwikkeling. De combinatie van multiplexing leidt RNA's naar een enkel doelwit en de biallelische bewerkingscapaciteit van Cas9 maakt het mogelijk om het fenotype met maternale effecten in één generatie te observeren, waardoor fokschema's van meerdere generaties worden vermeden die doorgaans nodig zijn bij het uitvoeren van gerichte genbewerking. Het omzeilen van meerdere generaties vermindert de hoeveelheid ruimte en middelen die nodig zijn om genen met een moedereffect te identificeren.
Naast het identificeren van nieuwe maternale effectgenen, staat dit protocol elk zebravislaboratorium toe om fenocopy en studie van elke bekende maternale-effectmutant te bestuderen zonder stabiele lijnen vast te stellen en te behouden, waardoor gedetailleerde analyse van genetische routes wordt vergemakkelijkt. In principe kan deze maternale crispantbenadering ook de functie van maternale producten bij niet-genetische modelsoorten bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken voormalige en huidige medewerkers van pelegri lab animal husbandry voor hun zorg voor de waterfaciliteit. We zijn ook dankbaar voor de commentaren en inzichten op het manuscript van Ryan Trevena en Diane Hanson. Financiering werd verstrekt door NIH-subsidie aan F.P. (GM065303)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
| 10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
| 100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
| 100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
| 5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
| 70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
| Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
| Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
| CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
| Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
| Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
| Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
| Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
| Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
| Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
| General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
| Gloves | Any Maker | ||
| Ice Bucket | Any Maker | ||
| Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
| Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
| KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
| KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
| Male & Female zebrafish | |||
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
| Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
| MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
| MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
| Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
| Micropipeters | Any Maker | ||
| Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
| Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
| Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
| Microwave | Any Maker | ||
| Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
| MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
| Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
| NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
| NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
| Nanodrop | Any Maker | ||
| NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
| nuclease-free water | Any Maker | ||
| Paper Towel | Any Maker | ||
| Pastro Pipettes | Any Maker | ||
| PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
| Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
| Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
| Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
| Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
| Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
| RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
| RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
| Scale | Any Maker | ||
| Sharpie | Any Maker | ||
| Spatula | Any Maker | ||
| Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
| Tape | Any Maker | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
| Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
| Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
| Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Thermocycler | Any Maker | ||
| Transilluminator | Any Maker | ||
| UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
| UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
| Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
| 1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
| 10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
| 100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
| 100% RNAse free ethanol | any maker | ||
| 5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
| 70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
| Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
| Agarose | any maker | ||
| CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
| Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
| Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
| ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
| Computer | any maker | ||
| Dissecting Forcepts | any maker | ||
| Dissecting Microscope | any maker | ||
| Dissecting Scissors | any maker | ||
| DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
| EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
| Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
| Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
| Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
| Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
| Fish Net | any maker | fine mesh | |
| Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
| Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
| Gel Electropheresis System | any maker | ||
| Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
| Glass Dishes | any maker | ||
| Gloves | any maker | ||
| Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
| Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
| Hanks Solution | |||
| Hank's Solution | https://www.jove.com/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
| Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
| Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
| Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
| HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
| Ice Bucket | any maker | ||
| Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
| In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
| KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Male and Female zebrafish | |||
| Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
| methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
| MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
| Microimicromanipulator | |||
| Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
| Microinjector | |||
| Microneedle Slide | |||
| Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
| Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
| Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
| Microplastic slide | |||
| Microwave | any maker | ||
| MiliQ Water | any maker | ||
| mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
| Na2HPO4 | Sigma | ||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaHC02 | Sigma | 223441 | |
| Nanodrop | |||
| NaOH | Sigma | 567530 | |
| Narrow Spatula | any maker | ||
| Needle Puller | Sutter | P-97 | |
| Paper Towel | any maker | ||
| Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
| PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
| Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
| Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
| Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Plastic Spoon | any maker | ||
| Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Razor Blade | Uline | H-595B | |
| RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
| RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
| RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
| RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| Scale | any maker | ||
| Sharpie | any maker | ||
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
| Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
| Software for sanger sequencing Analysis | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterlie H2O | any brand | ||
| T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
| Tape | any brand | ||
| TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
| Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
| Thermocycler | |||
| Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
| Transilluminator | |||
| Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
| Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
| Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
| UV lamp | UVP | ||
| UV safety glasses | any maker | ||
| Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
| Zebrafish mating boxes | any maker | ||
| PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |
References
- Pelegri, F.
- Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).
- He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).
- Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).
- Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
- Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
- Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
- Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536 (2021).
- Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
- Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
- Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
- Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
- Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).
- White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
- Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
- Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
- Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
- Xu, Q.
- Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- D'Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
- Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
- Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
- Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).
- Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
