Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

دودة قرن التبغ كنظام نموذجي للحشرات للدراسات ما قبل السريرية للقنب

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63228
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 4
1Institute of Cannabis Research, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo, 3Department of Chemistry, Colorado State University-Pueblo, 4Chuncheon Bioindustry Foundation

Summary

يوفر البروتوكول الحالي معلومات تعليمية لاستخدام دودة قرن التبغ Manduca sexta في أبحاث القنب. تتضمن الطريقة الموضحة هنا جميع الإمدادات والبروتوكولات اللازمة لرصد التغيرات الفسيولوجية والسلوكية لنموذج الحشرات استجابة لعلاج الكانابيديول (CBD).

Abstract

مع زيادة الاهتمام بالقنب في الطب ، تم استخدام العديد من الكائنات الحية النموذجية للثدييات لتوضيح وظائفها الصيدلانية غير المعروفة. ومع ذلك ، لا تزال هناك العديد من الصعوبات في أبحاث الثدييات ، مما يستلزم تطوير كائنات حية نموذجية غير ثديية لأبحاث القنب. يقترح المؤلفون دودة قرن التبغ Manduca sexta كنظام نموذجي جديد للحشرات. يوفر هذا البروتوكول معلومات حول إعداد النظام الغذائي الاصطناعي بكميات متفاوتة من الكانابيديول (CBD) ، وإنشاء بيئة زراعية ، ومراقبة التغيرات الفسيولوجية والسلوكية استجابة لعلاج اتفاقية التنوع البيولوجي. باختصار ، عند تلقي بيض الدودة القرنية ، سمح للبيض 1-3 أيام عند 25 درجة مئوية في دورة 12:12 فاتحة مظلمة للفقس قبل توزيعها عشوائيا في السيطرة (نظام غذائي اصطناعي قائم على جرثومة القمح; AD) ، مركبة (AD + 0.1 ٪ زيت الدهون الثلاثية متوسطة السلسلة ؛ زيت MCT) ومجموعات العلاج (AD + 0.1٪ MCT + 1 mM أو 2 mM من CBD). بمجرد إعداد الوسائط ، تم وضع يرقات 1st instar بشكل فردي في أنبوب اختبار سعة 50 مل مع عصا سيخ خشبية ، ثم تم تغطية أنبوب الاختبار بقماش قطني. تم أخذ القياسات في فترات 2 أيام للاستجابات الفسيولوجية والسلوكية لإدارة اتفاقية التنوع البيولوجي. يسمح إجراء الزراعة البسيط هذا للباحثين باختبار عينات كبيرة في تجربة معينة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن دورات الحياة القصيرة نسبيا تمكن الباحثين من دراسة تأثير علاجات القنب على مدى أجيال متعددة من السكان المتجانسين ، مما يسمح للبيانات بدعم التصميم التجريبي في الكائنات الحية النموذجية للثدييات العليا.

Introduction

على مدى السنوات الماضية ، تركز اهتمام الجمهور على القنب بسبب إمكاناته العلاجية ، بما في ذلك علاج الصرع1 ومرض باركنسون2 والتصلب المتعدد3 وأشكال مختلفة من السرطان4،5،6 مع الكانابيديول (CBD). نظرا لأن القنب يتم تقنينه كسلعة زراعية في قانون التحسين الزراعي لعام 2018 ، والقانون العام 115-334 (مشروع قانون المزرعة لعام 2018) ، فقد زاد القنب ومشتقاته من القنب في الصناعات الغذائية ومستحضرات التجميل والصناعات الدوائية بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار العزلات السريرية من القنب الفردي ومخاليط القنب بنجاح في البشر7 ، وخطوط الخلايا5،8 ، وأنظمة النماذج الحيوانية المتنوعة9،10.

ستكون التجربة السريرية مثالية للتحقق من فعالية القنب وآثاره الضارة على مرض معين. ومع ذلك ، هناك العديد من التحديات في التجارب السريرية ، بما في ذلك الموافقة الأخلاقية / IRB ، والتوظيف ، والاحتفاظ بالموضوعات11. للتغلب على هذه العقبات، تم استخدام خطوط الخلايا البشرية المختلفة لأن خطوط الخلايا المشتقة من الإنسان فعالة من حيث التكلفة، وسهلة التعامل معها، ويمكن أن تتجاوز القضايا الأخلاقية، وتوفر نتائج متسقة وقابلة للتكرار لأن خطوط الخلايا هي "مجموعة نقية من الخلايا التي ليس لديها تلوث متبادل للخلايا والمواد الكيميائية الأخرى"12.

اختبر Alves et al. (2021)13 CBD بطريقة تعتمد على الجرعة في الأرومات الغاذية المشيمة ، وهي خلايا متخصصة في المشيمة تلعب دورا أساسيا في زرع الجنين والتفاعل مع رحم الأم المختل14. أظهرت نتائجهم أن اتفاقية التنوع البيولوجي تسببت في فقدان صلاحية الخلية ، واضطراب تطور دورة الخلية ، وتحريض موت الخلايا المبرمج. وتبين هذه الملاحظات الآثار السلبية المحتملة لتعاطي القنب من جانب النساء الحوامل(13). وبالمثل ، تم استخدام سلسلة من خطوط الخلايا أيضا لفحص الآثار الدوائية لاتفاقية التنوع البيولوجي في الأمراض البشرية ، ولا سيما أشكال مختلفة من السرطان. أظهرت الدراسات المخبرية بنجاح تأثيرات مضادة للسرطان في خلايا سرطان البنكرياس15 والثدي8 وسرطان القولون والمستقيم16. ومع ذلك ، في حين أن خطوط الخلايا المحددة مثل HeLa و HEK293 متاحة على نطاق واسع وسهلة التعامل معها ، إلا أنها عرضة للتغيرات الجينية والمظهرية بسبب التغيرات في ظروف نموها أو التعامل معها17.

في أبحاث القنب ، تم استخدام العديد من أنظمة النماذج الحيوانية ، بدءا من الحيوانات الصغيرة مثل mouse18 و guinea-pig19 و rabbit19 إلى الحيوانات الكبيرة مثل canine20 و piglet21 و monkey22 و horse23 ، لاستكشاف الآثار العلاجية غير المعروفة. كانت الفئران أكثر أنظمة النماذج الحيوانية تفضيلا لأبحاث القنب بسبب تشابهها التشريحي والفسيولوجي والجيني مع البشر24. الأهم من ذلك ، أن الفئران لديها مستقبلات CB1/2 في نظامها العصبي ، والتي توجد في البشر. كما أن لديها دورة حياة أقصر من البشر ، مع سهولة الصيانة والموارد الوراثية الوفيرة ، مما يجعل من الأسهل بكثير مراقبة آثار القنب طوال دورة الحياة بأكملها. يستخدم نظام الثدييات على نطاق واسع وقد أثبت بنجاح أن اتفاقية التنوع البيولوجي تخفف من اضطرابات النوبات1 ، واضطراب ما بعد الصدمة9 ، وقرحة الفم25 ، والأعراض الشبيهة بالخرف10. كما مكن نموذج الفأر من إجراء دراسة للتفاعل الاجتماعي للأفراد داخل مجتمع صعب للغاية في الحيوانات الكبيرة والبشر26.

على الرغم من جميع مزايا نظام النموذج الحيواني ، إلا أنه لا يزال مكلفا ويتطلب عناية مركزة أثناء إعطاء الدواء وجمع البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، هناك تدقيق في استخدام الفئران في البحث بسبب عدم إمكانية التكرار وسوء تلخيص الظروف البشرية بسبب القيود المفروضة على التصميم التجريبي والصرامة27.

مع تزايد الطلب على الدراسات الطبية / ما قبل السريرية للقنب ، هناك حاجة إلى نظام نموذجي غير الثدييات. تمنح نماذج اللافقاريات تقليديا فوائد مميزة على نماذج الفقاريات. وتشمل الفوائد الهامة سهولة وانخفاض تكلفة تربية العديد من العينات وتمكين الباحثين من مراقبة أجيال متعددة من السكان المتجانسين وراثيا28. أثبتت دراسة حديثة أن ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، هي نظام نموذج حشري فعال للتحقيق في الوظائف الدوائية للقنب في تعديل سلوكيات التغذية29. من بين أنظمة نماذج الحشرات ، ركز المؤلفون على دودة قرن التبغ ، Manduca sexta ، المعروفة أيضا باسم عثة أبو الهول كارولينا أو عثة الصقر ، كنظام نموذج حشري جديد لأبحاث القنب.

ينتمي Manduca sexta إلى عائلة Sphingidae. الحشرة هي الآفة النباتية الأكثر شيوعا في جنوب الولايات المتحدة ، حيث تتغذى على النباتات الباذنجانية. يتمتع نموذج الحشرات بتاريخ طويل في البحث في فسيولوجيا الحشرات والكيمياء الحيوية والبيولوجيا العصبية ودراسات التفاعل الدوائي. تتضمن محفظة أبحاث ماندوكا سيكستا مسودة تسلسل الجينوم، مما يسمح بفهم العمليات الخلوية الأساسية على المستوى الجزيئي30. فائدة حاسمة أخرى لهذا النظام النموذجي هي حجمه الكبير ، حيث يصل طوله إلى أكثر من 100 مم ووزنه 10 جم في 18-25 يوما من تطور اليرقات. يتيح الحجم الكبير للباحثين مراقبة التغيرات المورفولوجية والسلوكية بسهولة في الوقت الفعلي استجابة لعلاج اتفاقية التنوع البيولوجي. أيضا ، بسبب الحجم ، تم فحص الاستجابات الكهروفسيولوجية مع الجهاز العصبي البطني ، بما في ذلك العقد التي تم تشريحها من اليرقات دون إعدادات مجهر عالية الدقة. تسمح الميزة الفريدة للباحثين بالتحقيق بسهولة في الاستجابات الحادة والطويلة الأجل للقنب (القنب) الذي يتم إعطاؤه.

على الرغم من هذا التنوع ، لم يتم استكشاف M. sexta إلا مؤخرا لملاءمته كنموذج تجريبي لدراسات القنب والقنب. في عام 2019 ، استخدم المؤلفون نظام نموذج الحشرات لأول مرة لمعالجة الفرضية القائلة بأن القنب قد تطور لإنتاج الكانابيديول لحماية نفسه من الحيوانات العاشبة الحشرية30,31. وأظهرت النتيجة بوضوح أن النباتات استغلت اتفاقية التنوع البيولوجي كرادع للتغذية ومنعت نمو حشرة الآفات M. sexta caterpillar ، فضلا عن التسبب في زيادة الوفيات31. وأظهرت الدراسة أيضا آثار إنقاذ اتفاقية التنوع البيولوجي على يرقات الإيثانول المخمورة ، وتحديد تأثير السيارة المحتمل للإيثانول كحامل لاتفاقية التنوع البيولوجي. كما هو موضح ، قام نظام نموذج الحشرات بالتحقيق بفعالية في الآثار العلاجية للقنب في غضون 3-4 أسابيع مع عمالة وتكاليف أقل من الأنظمة الحيوانية الأخرى. على الرغم من أن نموذج الحشرات يفتقر إلى مستقبلات القنب (أي عدم وجود مستقبلات CB1/2) ، فإن النظام النموذجي يوفر أداة قيمة لفهم الأدوار الدوائية للقنب من خلال طريقة مستقلة عن مستقبلات القنب.

عمل مؤلفو هذه الدراسة سابقا مع دودة قرن التبغ كنظام نموذجي لأبحاث القنب31. بعد دراسة متأنية لفوائد ومخاطر استخدام M. sexta ، قدمنا طريقة تنطوي على الرعاية المناسبة وإعداد النظام الغذائي للتجارب قبل السريرية التي تسمح بفرص للاستخدام المختبري قبل السريري في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الدودة القرنية وعلاج الكانابيديول

  1. الحصول على 150-200 M قابلة للحياة. بيض السيكستا والوجبات الغذائية الاصطناعية القائمة على جرثومة القمح (انظر جدول المواد).
  2. ضع بيض الدودة القرنية في طبق بتري من البوليسترين مع طبقة نظام غذائي اصطناعي قائم على جرثومة القمح (AD) وانقل البيض إلى غرفة تربية الحشرات (انظر جدول المواد) مع الحفاظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 40٪ -60٪.
  3. السماح لبيض دودة قرن التبغ لمدة 1-3 أيام بالفقس داخل غرفة تربية الحشرات التي يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 40٪ -60٪.
  4. قم بإعداد محلول مخزون الكانابيديول (CBD) (200 mM) عن طريق إضافة 1.26 جم من عزل CBD >98٪ من النقاء في 20 مل من زيت EtOH (200 دليل) أو 100٪ من زيت الدهون الثلاثية متوسطة السلسلة (MCT) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: عزل CBD حساس للضوء ، لذا تعامل معه في الظلام.
  5. أضف 5 مل و 10 مل من محلول مخزون CBD 200 mM إلى 1000 g من AD لجلب التركيزات النهائية للوجبات الغذائية 1 mM و 2 mM من CBD ، على التوالي.
    ملاحظة: تأكد من خلط النظام الغذائي ومحلول مخزون CBD جيدا حتى يتم تشكيل خليط متجانس تماما. امزج مخزون AD الذي يحتوي على CBD في كيس بلاستيكي لمدة 45 دقيقة على الأقل باليد.
    تنبيه: يبدو أن خلاط القهوة أو أي مطحنة معدنية أخرى غير فعالة.
  6. قم بتوزيع 20 جم من الوسائط الثلاثة ، والتحكم (AD) ، والمركبة (AD + 0.1٪ من زيت EtOH أو MCT) ، و CBD التي تحتوي على وسائط (AD + 0.1٪ من زيت EtOH أو MCT + 1 mM / 2 mM من CBD) إلى أسفل أنبوب 50 مل.
  7. قم بتوزيع يرقات النجم الأول عشوائيا (~ 2 مم) بشكل فردي في أنبوب اختبار سعة 50 مل وقم بتغطيته بغطاء مثقب أو قماش قطني (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: ضع الأنبوب رأسا على عقب وقم بزراعة الحشرات في غرفة تربية الحشرات مع الحفاظ على 25 درجة مئوية مع رطوبة نسبية 40٪ -60٪.
  8. قم بزراعتها داخل غرفة تربية الحشرات (انظر جدول المواد) التي يتم الحفاظ عليها عند 25 درجة مئوية مع دورة ضوء / قتامة 12 ساعة.

2. نمو يرقات M. sexta ، واستهلاك النظام الغذائي ، وقياسات الوفيات

  1. قياس نمو اليرقات (أي الحجم والوزن) مع توازن تحليلي والوفيات على فترات 2 أيام بعد نقلها إلى حاويات فردية حتى يتم التعرف على الجرو على أنه اللون البني الداكن لطبقة الجلد الخارجي الصلبة.
    1. سجل الكتلة الأولية (بالجرام) لكل مجموعة من اليرقات قبل إدخال اليرقات إلى وجباتها الغذائية واطرح كتلة اليرقات عند كل قياس من الكتلة الأولية لتحديد مكاسب الكتلة بين مراحل نمو اليرقات حتى تكمل اليرقات مرحلة الجرو.
    2. سجل عدد الأيام بين مراحل نمو instar لفهم الاختلافات في الإطار الزمني التنموي بين مراحل نمو اليرقات حتى الجرو على كل نظام غذائي.
      ملاحظة: كشط المادة البرازية من الحاوية لتجنب أي تلوث بالعفن. جمع المسألة للاختبار المستقبلي اعتمادا على أغراض التجربة (على سبيل المثال ، حساب معدل تراكم اتفاقية التنوع البيولوجي ، والتنميط الميكروبي). من المهم التعامل بعناية مع الحشرة خلال الفترات الهشة من الأكسدة أو ecdysis. عند إخراج اليرقات من حاوية ، أمسك بلطف بالجسم الرئيسي للحشرة باستخدام ملقط مسطح وواسع ولا تجبر على إزالة الطبقة الخارجية من الجلد عندما تكون الحشرة في طور التساقط.
  2. قياس استهلاك النظام الغذائي31 عن طريق وزن فقدان النظام الغذائي للحاوية بين يرقات 1st instar والجرو. سجل الجرامات الأولية من النظام الغذائي في بداية التجربة واطرح الكمية الأولية من الكمية المتبقية من النظام الغذائي عندما دخلت اليرقات مرحلة الجرو الكاملة.
    ملاحظة: يجب استبعاد المادة البرازية من قياس النظام الغذائي. يمكن إزالة المادة البرازية وغيرها من الحطام (أي حظائر الجلد) بسهولة من الوسائط عن طريق وضع الحاوية رأسا على عقب.
  3. بالنسبة لقياسات التنقل، اسمح للحشرة الخاضعة بالتأقلم مع بيئة الحجرة لمدة 5 دقائق على الأقل وتتبع المسافات31 التي قطعتها ثلاث مجموعات من الحشرات النجمية الخامسة (بطول 80-100 مم) باستخدام غرفة تكييف خوف آلية ومحوسبة (انظر جدول المواد).
  4. قم بتحليل استجابة التنقل31 من خلال الفيديو المسجل 60 إطارا / ثانية لمدة 5 دقائق باستخدام برنامج اكتشاف الحركة (انظر جدول المواد) الذي يولد مؤشر حركة.

3. التحليل الإحصائي

  1. تحليل الاختلافات في نمو اليرقات (أي الحجم والوزن) ومؤشر الحركة عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار توكي اللاحق32.
  2. استخدم اختبار رتبة السجل (Mantel-Cox)33 لمقارنات منحنى البقاء على قيد الحياة.
    ملاحظة: أجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج التحليل الإحصائي (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ماندوكا سيكستا كنظام نموذجي لفحص سمية القنب
يوضح الشكل 1 المكونات الرئيسية لتجربة اتفاقية التنوع البيولوجي باستخدام دودة قرن التبغ Manduca sexta. تم تربية أعداد كبيرة من الحشرات (>20) بشكل فردي عند 25 درجة مئوية على 12 ساعة: 12 ساعة = الضوء: دورة مظلمة. تم قياس حجم الحشرات ووزنها ووفياتها على فترات يومين لرصد الاستجابات قصيرة وطويلة الأجل بعد العلاج بجرعة عالية من اتفاقية التنوع البيولوجي (2 ملليمتر).

يوضح الشكل 2 الآثار الضارة لاتفاقية التنوع البيولوجي على نمو الحشرة وتطورها. أظهرت الحشرات التي تربت على نظام غذائي اصطناعي (AD) أفضل أداء للنمو. كما أظهر التحكم في السيارة الذي استخدم زيت الدهون الثلاثية متوسط السلسلة (MCT) بنسبة 0.1٪ كعامل إذابة لعزل CBD نموا طبيعيا دون أي آثار ضارة. ومع ذلك ، فإن جرعة عالية من اتفاقية التنوع البيولوجي (2 ملليمتر) تسببت في فقدان الوزن (الشكل 2C) وأدت إلى معدل وفيات أعلى من تلك الموجودة في مجموعات التحكم والمركبات (الشكل 2D).

في اليوم 24 ، كان متوسط حجم اليرقات التي تتغذى على AD 63.9 ملم (ن = 20-22). ومع ذلك ، كان حجم اليرقات التي تربى على AD والتي تحتوي على 2 mM من CBD 50.7 ملم ، وهو أصغر بنسبة 21٪ تقريبا من اليرقات المزروعة على AD (الخط الأحمر في الشكل 2C)31. في اليوم 24 ، كان متوسط وزن اليرقة التي تربى على AD 6.5 جم ، وهو ما كان أكبر ب 2.2 مرة من تلك الخاصة باليرقات التي تربى على AD مع 2 mM من CBD (n = 12-16 ، p < 0.00001)31. ومن الجدير بالذكر أن الجرعة العالية من اتفاقية التنوع البيولوجي (2 ملليمتر) زادت بشكل كبير من معدل الوفيات بنسبة تصل إلى 40٪ ، في حين أظهرت مجموعات التحكم والمركبات معدل وفيات بنسبة 20٪ فقط (الشكل 2D)31. أشارت النتائج إلى أن الجرعة العالية من اتفاقية التنوع البيولوجي (2 ملليمتر) في النظام الغذائي ضارة بتطور الحشرات وترتبط بزيادة الوفيات.

ماندوكا سيكستا كنظام نموذجي لاستكشاف الوظائف العلاجية غير المعروفة للقنب
ويبين الشكل 2 أن نظام نموذج الحشرات يرصد بفعالية أي آثار ضارة لاتفاقية التنوع البيولوجي من خلال رصد تغيراتها المورفولوجية والفسيولوجية. أشارت النتيجة الأولية إلى أن >1٪ من الإيثانول (EtOH) يرتبط سلبا بنموها وحركتها واستهلاكها الغذائي ومعدل البقاء على قيد الحياة. لفحص ما إذا كانت اتفاقية التنوع البيولوجي تحسن حركة الحشرات وسلوك التغذية في يرقات M. sexta المخمورة EtOH ، تم قياس إجمالي كمية النظام الغذائي التي تستهلكها الحشرات والمسافة التي قطعتها لمدة 10 دقائق من الحشرات المزروعة في ظل ثلاثة ظروف تغذية (AD ، AD + 1٪ EtOH ، و AD + 1٪ EtOH + 1 mM CBD). ويبين الشكل 3 ألف أن م. استهلكت يرقات sexta التي تربى على AD والتي تحتوي على 1 mM من CBD ما لا يقل عن 3.1 أضعاف كتلة النظام الغذائي من تلك التي تربى على النظام الغذائي المضاف EtOH31. ومع ذلك ، فإن استهلاك النظام الغذائي للحشرات التي تربى على 2 mM من الوسائط المضافة إلى CBD لم يكن مختلفا اختلافا كبيرا عن استهلاك اليرقات التي تربى على الوجبات الغذائية EtOH فقط (p > 0.05)31.

كما تم تتبع حركة اليرقات لفحص ما إذا كانت اتفاقية التنوع البيولوجي تؤثر على حركتها عند سكرها مع EtOH. يتم عرض مؤشر الهاتف المحمول كنسبة مئوية (٪) من التجميد. يقارن الشكل 3B مؤشر الهاتف المحمول ل M. يرقات sexta تربى في ظروف مختلفة. أظهرت النتائج أن 1٪ من اليرقات المعالجة ب EtOH لم تؤثر على الحركة (p > 0.05). كما أن إدارة اتفاقية التنوع البيولوجي 1 ملليمتر لم تؤثر على التنقل (p > 0.05)31. تبين أن علاجات EtOH بنسبة 2٪ قاتلة ليرقات M. sexta . ولذلك، لم يسجل أي مؤشر للتنقل. مع إضافة جرعة عالية من CBD (2 mM) إلى AD تحتوي على 2٪ EtOH ، ظل التنقل منخفضا (تجميد 80٪)31.

Figure 1
الشكل 1: العملية الموجزة لاستخدام دودة قرن التبغ Manduca sexta caterpillars في دراسة الكانابيديول (A) بيض الدودة القرنية يفقس في حاوية كبيرة منفصلة مع طبقة من النظام الغذائي الاصطناعي. (ب) استخدمت حقنة لملء الحاوية لمنع أي نظام غذائي من الالتصاق بجوانب الحاويات. (ج) دودة قرن التبغ 2nd instar في أنبوب اختبار 50 مل مع القماش القطني. (د) دودة قرن التبغ 3rd instar. (ه) تم قياس طول الدودة القرنية (مم) ووزنها (جم) على مقياس. (و) 5th instar دودة التبغ القرنية التي تخضع ل ecdysis وجاهزة للجرو. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: آثار الكانابيديول (CBD) على نمو ووفيات دودة قرن التبغ Manduca sexta. (A) يرقات دودة قرن التبغ في 5th و 3rd instar و pupation المبكر. حجم (B) والوزن (C) والوفيات (D) من M. sexta عندما تتغذى على النظام الغذائي الاصطناعي (AD) ، AD + 0.1 ٪ من الدهون الثلاثية متوسطة السلسلة (MCT) ، و AD + 0.1 ٪ من MCT + 2 mM من CBD. وللتحليلات الإحصائية المتعلقة بنمو الحشرات ومعدل بقائها، استخدم اختبار ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة لتوكي (n = 20-22، p < 0.05) واختبار Mantel-Cox (n = 20-22، p < 0.05)، على التوالي. الشكل مقتبس من المرجع 31. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: آثار الكانابيديول (CBD) على سلوك تغذية الحشرات وحركتها. (أ) استهلاك النظام الغذائي لليرقات دودة قرن التبغ التي تربى على النظام الغذائي الاصطناعي (AD) ، AD + 1-2 ٪ من الإيثانول (EtOH) ، و AD + 1-2 ٪ من EtOH + 1-2mM من CBD (ANOVA أحادي الاتجاه ، مقارنة Tukey المتعددة عند p < 0.05). (ب) تنقل الحشرات. يتم تصوير التنقل على أنه تجميد ٪. يشير إلى p < 0.01. الشكل مقتبس من المرجع 31. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أظهرت دراسة التغذية أن الجرعات العالية من اتفاقية التنوع البيولوجي (2 ملليمتر) منعت نمو الحشرة وزادت من الوفيات31. أظهر نموذج الحشرات أيضا حساسية للإيثانول. ومع ذلك ، فإن اتفاقية التنوع البيولوجي تزيل السموم بشكل فعال من سمية الإيثانول ، مما زاد من معدل بقائها على قيد الحياة ، واستهلاك النظام الغذائي ، وسلوكيات البحث عن الطعام إلى مستويات مماثلة للمجموعة الضابطة (الشكل 3A ، B)31. يتكون نظام نموذج الحشرات الموصوف من ثلاث خطوات حاسمة: (1) ضمان تفريخ بيض M. sexta بشكل موحد في الحجم والتوقيت ، (2) إعداد وسائط النمو الممزوجة بشكل متجانس مع القنب إلى تركيز مستهدف ، و (3) الحفاظ على وسائط النمو لتكون خالية من التلوث الفطري مع الحفاظ على مستوى الرطوبة المثالي عند 40٪ -60٪. مكننا نظام نموذج الحشرات من معالجة سؤال البحث في غضون 25 يوما ، من إعداد الوسائط إلى جمع البيانات وتفسيرها. الأهم من ذلك ، أن نظام الحشرات أنتج نتائج متسقة من عينات كبيرة.

لضمان نجاح يرقات M. sexta المزروعة ، من الضروري الحفاظ على الرطوبة النسبية عند 40٪ -60٪ داخل الحاوية. إذا فشلت الحاوية في الاحتفاظ بالرطوبة العالية ، تجفيف نظام غذائي اصطناعي يحتوي على القنب بسرعة ، مما يتسبب في إنهاء التجربة مبكرا بسبب موت الحشرات. ومع ذلك ، في نظام مغلق ، توفر الرطوبة العالية حالة مثالية لتفشي الفطريات ، والتي يصعب القضاء عليها. يقترح المؤلفون استخدام غطاء مثقب أو قماش قطني لتوفير دوران هواء كاف مع تقليل فقدان الماء من الوسائط. في البيئة الطبيعية، تفضل اليرقات أن تتغذى على الجانب المحوري من الورقة حيث تكون الرطوبة أعلى مع تقديم عدد أقل من التريكومات من مساحة سطح الورقة34. وبالتالي ، كان وضع حاوية رأسا على عقب مفيدا بشكل استثنائي أثناء توفير منطقة ملجأ أو عصا خشبية زاحفة. هذا يساعد أيضا على إزالة البراز من منطقة الوسائط ويجعل من السهل جمع النفايات لمزيد من الفحوصات.

نظرا لأن مستقبلات القنب غائبة في اللافقاريات35 ، فقد لا تكون دودة قرن التبغ M. sexta مناسبة للدراسات العلاجية التي يتوسط فيها نظام endocannabinoid. ومع ذلك ، مع الفوائد العديدة التي أظهرتها دراستنا التجريبية ، ينبغي اعتبار الحشرة نظاما نموذجيا جديدا للتحقيق في الوظائف الدوائية للقنب ، وخاصة الدراسات التي تنطوي على الحرائك الدوائية غير المستقبلة بوساطة مستقبلات CB. تسمح دورة الحياة القصيرة نسبيا ل M. sexta للباحثين بفهم آثار النظام الغذائي المحتوي على القنب على مدى أجيال متعددة ، مما يسمح بتصميم تجريبي في الكائنات الحية النموذجية للثدييات الأعلى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من قبل معهد أبحاث القنب في جامعة ولاية كولورادو - بويبلو ووزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (2021-DD-UP-0379) ، ومدينة تشنتشون (القنب R & D والتصنيع ، 2020-2021).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytic balance Mettler Instrument Corp. AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%) Lilu's Garden
Cheesecloth VWR INTERNATIONAL 470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes VWR 89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof Sigma-Aldrich EX0276-1
Fear conditioning chamber Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber Darwin Chambers INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil Walmart
Motion detection software (Actimetrics) Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) VWR INTERNATIONAL 688161
Tobacco hormworm artificial diet Carolina Biological Supply Company Item # 143908 Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs Carolina Biological Supply Company Item # 143880 Unit of 30-50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
  2. Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
  3. Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
  4. Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
  5. Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
  6. Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
  7. Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
  8. de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
  9. Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
  10. Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
  11. Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
  14. Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
  15. Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
  16. Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
  17. Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
  18. Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
  19. Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
  20. Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
  21. Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
  22. Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
  23. Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
  24. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  25. Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
  26. Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
  27. Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
  28. Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
  29. He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
  30. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  31. Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
  32. Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  33. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  34. Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
  35. McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. Cannabinoid receptors in invertebrates. Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).

Tags

علم الأحياء ، العدد 178 ، القنب ، القنب ساتيفا ، القنب ، ديدان قرن التبغ ماندوكا سيكستا
دودة قرن التبغ كنظام نموذجي للحشرات للدراسات ما قبل السريرية للقنب
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, S. H., Koch, S., Richardson,… More

Park, S. H., Koch, S., Richardson, K., Pauli, C., Han, J. H., Kwon, T. H. Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies. J. Vis. Exp. (178), e63228, doi:10.3791/63228 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter