Summary
Mevcut protokol, kannabinoid araştırmalarında tütün boynuz kurdu Manduca sexta'yı kullanmak için eğitici bilgiler sağlar. Burada açıklanan yöntem, kannabidiol (CBD) tedavisine yanıt olarak böcek modelinin fizyolojik ve davranışsal değişikliklerini izlemek için gerekli tüm malzemeleri ve protokolleri içerir.
Abstract
Tıpta kannabinoidlere daha fazla dikkat çekmekle, bilinmeyen farmasötik işlevlerini aydınlatmak için birkaç memeli model organizma kullanılmıştır. Bununla birlikte, kannabinoid araştırmaları için memeli olmayan model organizmaların geliştirilmesini gerektiren memeli araştırmalarında birçok zorluk devam etmektedir. Yazarlar tütün boynuz kurdu Manduca sexta'yı yeni bir böcek modeli sistemi olarak önermektedir. Bu protokol, yapay diyetin çeşitli miktarlarda kannabidiol (CBD) ile hazırlanması, bir yetiştirme ortamı kurulması ve CBD tedavisine yanıt olarak fizyolojik ve davranışsal değişikliklerinin izlenmesi hakkında bilgi sağlar. Kısaca, boynuz kurdu yumurtaları aldıktan sonra, yumurtaların kontrole rastgele dağıtılmadan önce 12:12 açık-karanlık bir döngüde 25 ° C'de 1-3 gün yumurtadan çıkmasına izin verildi (buğday tohumu bazlı yapay diyet; AD), araç (AD + % 0.1 orta zincirli trigliserit yağı; MCT yağı) ve tedavi grupları (AD + %0,1 MCT + 1 mM veya 2 mM CBD). Ortam hazırlandıktan sonra, 1. MİA yönetimine fizyolojik ve davranışsal yanıtlar için 2 günlük aralıklarla ölçümler yapıldı. Bu basit yetiştirme prosedürü, araştırmacıların belirli bir deneyde büyük örnekleri test etmelerini sağlar. Ek olarak, nispeten kısa yaşam döngüleri, araştırmacıların kannabinoid tedavilerinin homojen bir popülasyonun birden fazla nesli üzerindeki etkisini incelemelerini sağlayarak, verilerin daha yüksek memeli model organizmalarda deneysel bir tasarımı desteklemesine izin verir.
Introduction
Son yıllarda, epilepsi1, Parkinson hastalığı2, multipl skleroz3 ve kannabidiol (CBD) ile çeşitli kanser formları da dahil olmak üzere terapötik potansiyelleri nedeniyle halkın ilgisi kannabinoidlere odaklanmıştır. Esrar, 2018 yılı Tarımsal İyileştirme Yasası'nda tarımsal bir mal olarak yasal hale getir edildiğinden, 115-334 sayılı Kamu Kanunu (2018 Çiftlik Yasa Tasarısı), Esrar ve gıda, kozmetik ve ilaç endüstrilerindeki kannabinoid türevleri katlanarak artmıştır. Ek olarak, tek kannabinoidlerin ve kannabinoid karışımlarının klinik sınıf izoleleri insan deneklerde başarıyla test edilmiştir7, hücre hatları5,8 ve çeşitli hayvan modeli sistemleri9,10.
Klinik bir çalışma, kannabinoidlerin belirli bir hastalık üzerindeki etkinliğini ve olumsuz etkilerini doğrulamak için ideal olacaktır. Bununla birlikte, klinik çalışmalarda etik / IRB onayı, işe alım ve konuların tutulması dahil olmak üzere çok sayıda zorluk vardır11. Bu engelleri aşmak için, insan kaynaklı hücre hatları uygun maliyetli, kullanımı kolay, etik sorunları atlayabilen ve hücre hatları 'diğer hücrelerin ve kimyasalların çapraz kontaminasyonu olmayan saf bir hücre popülasyonu' olduğu için tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayabildiği için çeşitli insan hücre hatları kullanılmıştır 12.
Alves ve ark. (2021)13, embriyo implantasyonunda ve desidualize anne uterus ile etkileşimde önemli bir rol oynayan plasetanın özel hücreleri olan plasetal trofoplastlarda cbd'yi doza bağımlı bir şekilde test etti14. Sonuçları CBD'nin hücre canlılığı kaybına, hücre döngüsü ilerleme bozulmasına ve apoptoz indüksiyona neden olduğunu göstermiştir. Bu gözlemler hamile kadınlar tarafından Esrar kullanımının potansiyel olumsuz etkilerini göstermektedir13. Aynı şekilde, CBD'nin insan hastalıklarındaki farmakolojik etkilerini, özellikle de çeşitli kanser türlerini incelemek için bir dizi hücre hattı da kullanılmıştır. Tüp bebek çalışmaları pankreas15, meme8 ve kolorektal kanser hücrelerinde kanser önleyici etkileri başarıyla göstermiştir16. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılabilir ve kullanımı kolay olmakla birlikte, HeLa, HEK293 gibi belirli hücre hatları, büyüme koşullarındaki veya elleçlemelerindeki değişiklikler nedeniyle genetik ve fenotipik değişikliklere eğilimlidir17.
Esrar araştırmalarında, fare18, kobay19 ve tavşan19 gibi küçük hayvanlardan köpek20, piglet21, monkey22, horse23 gibi büyük hayvanlara kadar çeşitli hayvan modeli sistemleri bilinmeyen terapötik etkileri araştırmak için kullanılmıştır. Fareler anatomik, fizyolojik ve genetik olarak insanlara olan benzerlikleri nedeniyle kannabinoid araştırmaları için en çok tercih edilen hayvan modeli sistemi olmuştur24. En önemlisi, farelerin sinir sisteminde insanlarda bulunan CB1/2 reseptörleri vardır. Ayrıca, daha kolay bakım ve bol miktarda genetik kaynaklarla insan deneklerden daha kısa bir yaşam döngüsüne sahiptirler, böylece tüm yaşam döngüsü boyunca kannabinoidlerin etkilerini izlemeyi çok daha kolay hale getirirler. Memeli sistemi yaygın olarak kullanılmaktadır ve CBD'nin nöbet bozukluklarını hafiflettiği başarıyla gösterilmiştir1, travma sonrası stres bozukluğu9, oral ülser25 ve demans benzeri semptomlar10. Fare modeli ayrıca büyük hayvanlarda ve insanlarda son derece zor olan bir topluluk içindeki bireylerin sosyal etkileşim çalışmasını sağlamıştır26.
Hayvan modeli sisteminin tüm avantajlarına rağmen, ilaç yönetimi ve veri toplama sırasında hala maliyetlidir ve yoğun bakım gerektirir. Ek olarak, deneysel tasarım ve titizlikteki sınırlamalar nedeniyle insan koşullarının geri alınamazlığı ve zayıf rekapitülasyonu nedeniyle araştırmalarda farelerin kullanılması incelanmaktadır27.
Kannabinoidlerin tıbbi/preklinik çalışmalarına artan taleple birlikte memeli olmayan bir model sistemine ihtiyaç duyulmaktadır. Omurgasız modeller geleneksel olarak omurgalı modellere göre farklı faydalar sağlar. Önemli faydalar arasında birçok örneği yetiştirme kolaylığı ve düşük maliyeti ve araştırmacıların genetik olarak homojen popülasyonların birden fazla neslini izlemelerini sağlamak28 sayılacaktır. Yeni bir çalışma, meyve sineği Drosophila melanogaster'ın, beslenme davranışlarını modüle etmede kannabinoidlerin farmakolojik işlevlerini araştırmak için etkili bir böcek modeli sistemi olduğunu kanıtladı29. Böcek modeli sistemleri arasında, yazarlar tütün boynuz kurdu, Carolina sfenks güvesi veya şahin güvesi olarak da bilinen Manduca sexta'ya kannabinoid araştırmaları için yeni bir böcek modeli sistemi olarak odaklandılar.
Manduca sexta Sphingidae ailesine aittir. Böcek, solanaceous bitkilerle beslendikleri güney Amerika Birleşik Devletleri'ndeki en yaygın bitki zararlısıdır. Böcek modeli, böcek fizyolojisi, biyokimya, nörobiyoloji ve ilaç etkileşimi çalışmalarında uzun bir geçmişe sahiptir. Manduca sexta'nın araştırma portföyü, temel hücresel süreçlerin moleküler düzeyde anlaşılmasını sağlayan bir taslak genom dizisi içerir30. Bu model sisteminin bir diğer önemli faydası, 18-25 günlük larva gelişiminde 100 mm'den uzunluğa ve 10 g ağırlığa ulaşan büyük boyutudur. Büyük boyut, araştırmacıların CBD tedavisine yanıt olarak morfolojik ve davranışsal değişiklikleri gerçek zamanlı olarak kolayca izlemelerini sağlar. Ayrıca, büyüklüğü nedeniyle, yüksek çözünürlüklü mikroskop ayarları olmadan larvalardan incelenen gangliyonlar da dahil olmak üzere karın sinir sistemi ile elektrofizyolojik yanıtlar incelendi. Benzersiz özellik, araştırmacıların uygulanan kannabinoidlere akut ve uzun vadeli yanıtları kolayca araştırmalarını sağlar.
Bu kadar çok yönlü olmasına rağmen, M. sexta esrar ve kannabinoid çalışmaları için deneysel bir model olarak uygunluğu için sadece son zamanlarda araştırılmıştır. 2019'da yazarlar, Esrar'ın böcek otçullarından korunmak için Kannabidiol üretmek için evrimleştiği hipotezini ele almak için ilk kez böcek modeli sistemini kullandılar30,31. Sonuç, bitkilerin CBD'yi bir beslenme caydırıcısı olarak sömürdüğünü ve haşere böceği M. sexta tırtılının büyümesini engellediğini ve mortalitenin artmasına neden olduğunu açıkça göstermiştir31. Çalışma ayrıca CBD'nin sarhoş etanol larvalarına olan kurtarılma etkilerini göstererek, CBD taşıyıcısı olarak etanolün potansiyel araç etkisini tanımladı. Gösterildiği gibi, böcek modeli sistemi, diğer hayvan sistemlerine göre daha az işçilik ve maliyetle 3-4 hafta içinde kannabinoidlerin terapötik etkilerini etkili bir şekilde araştırdı. Böcek modeli kannabinoid reseptörlerinden yoksun olsa da (yani CB1/2 reseptörleri yoktur), model sistemi kannabinoid reseptörden bağımsız bir şekilde kannabinoidlerin farmakolojik rollerini anlamak için değerli bir araç sağlar.
Bu çalışmanın yazarları daha önce tütün boynuz kurdu ile kannabinoid araştırmaları için bir model sistemi olarak çalışmışlardır31. M. sexta kullanmanın yararları ve riskleri dikkatlice göz önünde bulundurulduktan sonra, gelecekteki preklinik laboratuvar kullanımı için fırsatlar sağlayan preklinik denemeler için diyetin uygun bakımı ve hazırlanmasını içeren bir yöntem sağladık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Boynuz kurdu hazırlama ve kannabidiol tedavisi
- 150-200 uygulanabilir M elde edin. sexta yumurtaları ve buğday tohumu bazlı yapay diyetler (bkz. Malzeme Tablosu).
- Boynuz kurdu yumurtalarını buğday tohumu bazlı yapay diyet (AD) tabakasına sahip bir polistiren Petri kabına yerleştirin ve yumurtaları% 40-60 bağıl nem ile 25 ° C'de tutulan bir böcek yetiştirme odasına aktarın (bkz. Malzeme Masası).
- Tütün boynuz kurdu yumurtalarının% 40-% 60 bağıl nem ile 25 ° C'de tutulan böcek yetiştirme odasının içinde yumurtadan çıkmasına izin verin.
- 20 mL EtOH (200 prova) veya %100 orta zincirli trigliserit (MCT) yağına 1,26 g >98% saflıkta CBD izolesi ekleyerek kannabidiol (CBD) stok çözeltisi (200 mM) hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: CBD izolesi ışığa duyarlıdır, bu nedenle karanlıkta işleyin. - Diyetlerin son konsantrasyonlarını sırasıyla 1 mM ve 2 mM CBD getirmek için 1.000 g AD'ye 200 mM CBD stok çözeltisinin 5 mL ve 10 mL'sini ekleyin.
NOT: Tamamen homojen bir karışım oluşana kadar diyet ve CBD stok çözeltisinin iyice harmanlandığından emin olun. CBD stoğu içeren AD'yi plastik bir torbada en az 45 dakika boyunca elle karıştırın.
DİkKAT: Kahve karıştırıcı veya başka bir metal öğütücü etkisiz görünüyordu. - Üç ortamın 20 g'ını, kontrol (AD), aracı (ETOH veya MCT yağının AD + % 0,1'i) ve 50 mL tüpün altına ortam içeren CBD 'yi (AD + EtOH veya MCT yağının% 0,1'i + 1 mM/2 mM CBD) dağıtın.
- 1. instar larvalarını (~2 mm uzunluğunda) 50 mL'lik bir test tüpüne tek tek dağıtın ve delikli bir kapak veya cheesecloth ile örtün (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Tüpü baş aşağı yerleştirin ve % 40-% 60 bağıl nem ile 25 ° C tutulan bir böcek yetiştirme odasına böcek yetiştirin. - Onları 12 saat açık / karanlık bir döngü ile 25 ° C'de tutulan bir böcek yetiştirme odasının içinde yetiştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
2 . M. sexta larva büyümesi, diyet tüketimi ve mortalite ölçümleri
- Larva büyümesini (yani boyut ve ağırlık) analitik bir denge ve mortalite ile, yavru sertleştirilmiş bir eksokül tabakasının koyu kahverengi renklendirmesi olarak kabul edilene kadar tek tek kaplara transfer edildikten sonra 2 günlük aralıklarla ölçün.
- Larvaları ilgili diyetlerine sokmadan önce her larva grubunun ilk kütlesini (gram cinsinden) kaydedin ve larvalar yavru aşamasını tamamlayana kadar larva gelişim aşamaları arasındaki kütle kazanımlarını belirlemek için larvaların kütlesini ilk kütleden çıkarın.
- Her diyette yavruya kadar larva büyüme aşamaları arasındaki gelişimsel zaman dilimindeki farklılıkları anlamak için başlangıç gelişim aşamaları arasındaki gün sayısını kaydedin.
NOT: Herhangi bir küf kirlenmesini önlemek için dışkı maddesini kaptan kazıyın. Deney amaçlarına bağlı olarak gelecekteki testler için konuyu toplayın (örneğin, CBD biriktirme hızı hesaplaması, mikrobiyal profil oluşturma). Apolysis veya ecdysis'in kırılgan dönemlerinde böceği dikkatlice işlemek önemlidir. Larvaları bir kaptan çıkarırken, böceğin ana gövdesini düz uçlu ve geniş bir tokmak ile hafifçe tutun ve bir böcek dökülme sürecindeyken cildin dış tabakasını çıkarmaya zorlamayın.
- 1. instar larvaları ve yavru arasında kabın diyet kaybını tartarak diyet tüketimini31 ölçün. Deneyin başında ilk diyet gramını kaydedin ve larvalar tam yavru aşamasına girdiğinde kalan diyet miktarından başlangıç miktarını çıkarın.
NOT: Dışkı maddesi diyet ölçümünün dışında tutulmalıdır. Dışkı maddesi ve diğer döküntüler (yani cilt dökülmeleri) kabı baş aşağı yerleştirerek ortamdan kolayca çıkarılabilir. - Hareketlilik ölçümleri için, tabi böceğin oda ortamını en az 5 dakika boyunca alıştırmasına izin verin ve 5. başlangıç böceklerinden oluşan üç grubun (80-100 mm uzunluğunda) otomatik, bilgisayarlı bir korku şartlandırma odası kullanarak kat ettiği mesafeleri31 izleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
- Hareket indeksi oluşturan bir hareket algılama yazılımı (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak 5 dakika boyunca 60 kare/sn kaydedilen video aracılığıyla mobilite tepkisini31 analiz edin.
3. İstatistiksel analiz
- Tukey'in test sonrası 32'si ile larva büyümesindeki (yani boyut ve ağırlık) ve hareket indekslerindeki farklılıkları tek yönlü ANOVA ile analiz edin.
- Hayatta kalma eğrisi karşılaştırmaları için günlük rütbesi (Mantel-Cox) test33'üni kullanın.
NOT: Tüm istatistiksel analizler istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçeklenmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kannabinoid toksisitesini incelemek için bir model sistemi olarak Manduca sexta
Şekil 1 , tütün boynuz kurdu Manduca sexta kullanarak CBD deneyinin temel bileşenlerini tasvir eder. Çok sayıda böcek (>20) 12 saat:12 saat = ışık: karanlık döngü üzerinde 25 ° C'de ayrı ayrı yetiştirildi. Böceklerin büyüklüğü, ağırlığı ve mortalitesi, yüksek doz CBD (2 mM) tedavisinden sonra kısa ve uzun süreli yanıtları izlemek için 2 günlük aralıklarla ölçüldü.
Şekil 2 , CBD'nin böceğin büyümesi ve gelişmesi üzerindeki olumsuz etkilerini göstermektedir. Yapay bir diyette (AD) yetiştirilen böcekler en iyi büyüme performansını gösterdi. CBD izole için çözünen bir ajan olarak% 0.1 orta zincirli trigliserit (MCT) yağı kullanan araç kontrolü de herhangi bir zararlı etki olmadan normal büyüme gösterdi. Bununla birlikte, yüksek dozda CBD (2 mM) indüklenen kilo kaybı (Şekil 2C) ve kontrol ve araç gruplarından daha yüksek ölüm oranına yol açmıştır (Şekil 2D).
24. günde, AD ile beslenen larvaların ortalama büyüklüğü 63,9 mm idi (n = 20-22). Bununla birlikte, 2 mM CBD içeren AD'de yetiştirilen larvaların büyüklüğü 50,7 mm idi, bu da AD'de yetişen larvalardan ~% 21 daha küçüktü ( Şekil 2C'deki kırmızı çizgi)31. 24. günde, AD'de yetiştirilen larvaların ortalama ağırlığı 6,5 g idi, bu da 2 mM CBD ile AD'de yetiştirilen larvalardan 2,2 kat daha fazlaydı (n = 12-16, s < 0,00001)31. Özellikle, yüksek doz CBD (2 mM) ölüm oranını% 40'a kadar önemli ölçüde artırırken, kontrol ve araç grupları sadece% 20 ölüm oranı gösterdi (Şekil 2D)31. Sonuçlar, diyetteki yüksek doz cbd (2 mM) böcek gelişimine zararlı olduğunu ve artan mortalite ile ilişkili olduğunu gösterdi.
Kannabinoidlerin bilinmeyen terapötik fonksiyonlarını keşfetmek için bir model sistemi olarak Manduca sexta
Şekil 2 , böcek modeli sisteminin morfolojik ve fizyolojik değişikliklerini izleyerek CBD'nin zararlı etkilerini etkili bir şekilde izlediğini göstermiştir. İlk sonuç, %>1 etanol (EtOH) büyüme, hareketlilik, diyet tüketimi ve sağkalım oranları ile olumsuz ilişkili olduğunu göstermiştir. CBD'nin EtOH sarhoş M. sexta larvalarında böceğin hareketliliğini ve beslenme davranışını iyileştirip iyileştirmediğini incelemek için, böcekler tarafından tüketilen toplam diyet miktarı ve 10 dakika boyunca kat ettikleri mesafe üç beslenme koşulu altında yetiştirilen böceklerden ölçüldü (AD, AD + % 1 EtOH ve AD + % 1 EtOH + 1 mM CBD). Şekil 3A gösteriyor ki M. 1 mM CBD içeren AD'de yetiştirilen sexta larvaları, EtOH eklenmiş diyette yetiştirilenlerden en az 3,1 kat daha fazla diyet kütlesi tüketti31. Bununla birlikte, CBD eklenmiş 2 mM medyada yetiştirilen böceklerin diyet tüketimi, sadece EtOH diyetlerinde yetiştirilen larvalardan önemli ölçüde farklı değildi (p > 0.05)31.
Larva hareketliliği, CBD'nin EtOH ile sarhoş olduğunda hareketliliklerini etkileyıp etkilemediğinde incelemek için de izlendi. Mobil dizin donma yüzdesi (%) olarak sunulur. Şekil 3B , M'nin mobil dizinini karşılaştırır. sexta larvaları farklı koşullarda yetiştirildi. Sonuçlar% 1 EtOH ile tedavi edilen larvaların hareketliliği etkilemediğini göstermektedir (p > 0.05). 1 mM CBD yönetimi de hareketliliği etkilemedi (p > 0.05)31. % 2 EtOH tedavilerinin M. sexta larvaları için ölümcül olduğu ortaya çıktı; bu nedenle, hareketlilik endeksi kaydedilmedi. Yüksek dozda CBD'nin (2 mM) %2 EtOH içeren AD'ye eklenmesiyle hareketlilik düşük kaldı (%80 donma)31.
Şekil 1: Tütün boynuz kurdu Manduca sexta tırtıllarının kannabidiol çalışmasında kullanılmasının özetlenmiş süreci. (A) Boynuz kurdu yumurtaları yapay bir diyet tabakası ile ayrı bir büyük kapta yumurtadan çıkmıştır. (B) Herhangi bir diyetin kapların kenarlarına yapışmasını önlemek için kabı doldurmak için bir şırınna kullanıldı. (C) Cheesecloth ile 50 mL test tüpünde 2. (D) 3. bir instar tütün boynuz kurdu. (E) Boynuz kurdu uzunluğu (mm) ve ağırlığı (g) bir ölçekte ölçüldü. (F) Ekdysis geçiren ve yavruya hazır 5. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Cannabidiol 'un (CBD) tütün boynuz kurdu Manduca sexta'nın büyümesi ve mortalitesi üzerindeki etkileri. (A) Tütün boynuz kurdu tırtılları 5., 3. M'nin büyüklüğü (B), ağırlığı (C) ve mortalitesi (D). yapay diyet (AD), AD + orta zincirli trigliseritin %0,1'i (MCT) ve AD + MCT+2 mM CBD'nin %0,1'i ile beslendiğinde sexta. Böcek büyüme ve sağkalım oranına ilişkin istatistiksel analizlerde sırasıyla Tukey'in çoklu karşılaştırma testi (n = 20-22, p < 0.05) ve Mantel-Cox testi (n = 20-22, p < 0.05) ile tek yönlü anova kullanılmıştır. Şekil Reference31'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kannabidiol'ün (CBD) böcek besleme davranışı ve hareketliliği üzerindeki etkileri. (A) Yapay diyette yetiştirilen tütün boynuz kurdu tırtıllarının diyet tüketimi (AD), AD + etanolün % 1-2'si (EtOH) ve AD + EtOH+ 1-2m CBD'nin% 1-2'si (tek yönlü ANOVA, Tukey'in p < 0.05'teki çoklu karşılaştırması). (B) Böcek hareketliliği. Hareketlilik %donma olarak tasvir edilir. p < 0,01'i gösterir. Şekil Reference31'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beslenme çalışması, yüksek dozda CBD'nin (2 mM) böceğin büyümesini engellediğini ve mortaliteyi artırdığını göstermiştir31. Böcek modeli de etanol hassasiyeti gösterdi; bununla birlikte, CBD etkili bir şekilde etanol toksisitesini detokse etti, hayatta kalma oranını, diyet tüketimini ve yiyecek arama davranışlarını kontrol grubuna benzer seviyelere yükseltti (Şekil 3A,B)31. Açıklanan böcek modeli sistemi üç kritik adımdan oluşur: (1) M. sexta'nın yumurtalarının boyut ve zamanlama olarak eşit şekilde yumurtadan çıkmasını sağlamak, (2) kannabinoidlerle homojen bir şekilde karıştırılan büyüme ortamını hedeflenen bir konsantrasyona hazırlamak ve (3) ideal nem seviyesini% 40-60 oranında korurken büyüme medyasını mantar kontaminasyonundan arındırmak. Böcek modeli sistemi, medya hazırlamadan veri toplama ve yorumlamaya kadar araştırma sorusunu 25 gün içinde ele almamızı sağladı. En önemlisi, böcek sistemi büyük örneklerden tutarlı sonuçlar üretti.
Ekili M. sexta larvalarının başarısını sağlamak için, kabın içindeki bağıl nemi% 40-% 60 oranında korumak esastır. Bir kap yüksek nemi tutamazsa, kannabinoidleri içeren yapay bir diyet hızla kuruyacak ve böceklerin ölümü nedeniyle erken deney sonlandırmasına neden olacaktır. Bununla birlikte, kapalı bir sistemde, yüksek nem, yok edilmesi zor olan mantar salgını için ideal bir durum sağlar. Yazarlar, medyadan su kaybını en aza indirirken yeterli hava sirkülasyonunu sağlamak için delikli bir kapak veya cheesecloth kullanılmasını önermektedir. Doğal bir ortamda, tırtıllar yaprağın yüzey alanından daha az trikom sunarken nemin daha yüksek olduğu bir yaprağın abaksiyel tarafında beslenmeyi tercih eder34. Bu nedenle, bir kabı baş aşağı yerleştirmek, bir sığınak alanı sağlarken veya ahşap çubuğu sürünürken son derece yardımcı oldu. Bu aynı zamanda dışkı maddelerini medya alanından çıkarmaya yardımcı olur ve daha fazla test için atıkların toplanmasına kolay hale getirir.
Kannabinoid reseptörleri invertabrates35'te bulunmadığından, tütün boynuz kurdu M. sexta endocannabinoid sisteminin aracılık ettiği terapötik çalışmalar için uygun olmayabilir. Bununla birlikte, pilot çalışmamızda gösterilen sayısız fayda ile, böcek kannabinoidlerin farmakolojik işlevlerini, özellikle CB reseptör aracılı olmayan farmakokinetikleri içeren çalışmaları araştırmak için yeni bir model sistemi olarak düşünülmelidir. M. sexta'nın nispeten kısa yaşam döngüsü, araştırmacıların kannabinoid içeren bir diyetin birden fazla nesil üzerindeki etkilerini anlamalarını sağlayarak daha yüksek memeli model organizmalarda deneysel bir tasarıma izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma Colorado Eyalet Üniversitesi-Pueblo Esrar Araştırma Enstitüsü ve Bilim ve Bİt Bakanlığı (2021-DD-UP-0379) ve Chuncheon şehri (Kenevir Ar-Ge ve sanayileşme, 2020-2021) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
- Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
- Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
- Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
- Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
- Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
- de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
- Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
- Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
- Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
- Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
- Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
- Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
- Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
- Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
- Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
- Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
- Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
- Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
- Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
- Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
- He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
- Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
- McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M.
