Summary
Den nuværende protokol giver instruktionsinformation til brug af tobak hornorm Manduca sexta i cannabinoid forskning. Den metode, der er beskrevet her, omfatter alle nødvendige forsyninger og protokoller til at overvåge fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer af insektmodellen som reaktion på cannabidiol (CBD) behandling.
Abstract
Med øget opmærksomhed på cannabinoider i medicin er flere pattedyrsmodelorganismer blevet brugt til at belyse deres ukendte farmaceutiske funktioner. Der er dog stadig mange vanskeligheder i pattedyrsforskning, hvilket kræver udvikling af ikke-pattedyrs modelorganismer til cannabinoidforskning. Forfatterne foreslår tobak hornorm Manduca sexta som en ny insekt model system. Denne protokol giver oplysninger om forberedelse af den kunstige kost med varierende mængder cannabidiol (CBD), opsætning af et dyrkningsmiljø og overvågning af deres fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer som reaktion på CBD-behandling. Kort sagt, efter at have modtaget hornorm æg, æggene fik lov 1-3 dage ved 25 °C på en 12:12 lyse-mørk cyklus til at luge, før de tilfældigt distribueres til kontrol (hvedekim-baseret kunstig kost; AD), køretøj (AD + 0,1% mellemkædet triglyceridolie; MCT olie) og behandlingsgrupper (AD + 0,1% MCT + 1 mM eller 2 mM CBD). Når mediet var forberedt, blev 1. instar larver individuelt placeret i et 50 mL reagensglas med en træspydpind, og derefter blev reagensglasset dækket af en osteklud. Målinger blev taget med 2 dages intervaller for fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner på CBD-administrationen. Denne enkle dyrkningsprocedure gør det muligt for forskere at teste store prøver i et givet eksperiment. Derudover gør de relativt korte livscyklus det muligt for forskere at studere virkningen af cannabinoidbehandlinger over flere generationer af en homogen befolkning, hvilket giver mulighed for data til støtte for et eksperimentelt design i højere pattedyrmodelorganismer.
Introduction
I løbet af de seneste år har offentlighedens opmærksomhed været centreret om cannabinoider på grund af deres terapeutiske potentiale, herunder behandling af epilepsi1, Parkinsons sygdom2, multipel sklerose3 og forskellige former for kræft4,5,6 med cannabidiol (CBD). Da Cannabis er legaliseret som en landbrugsvare i Agricultural Improvement Act of 2018, er offentlig lov 115-334 (farm billen fra 2018), cannabis og dets cannabinoidderivater i fødevare-, kosmetik- og medicinalindustrien steget eksponentielt. Derudover, kliniske kvalitet isolater af enkelte cannabinoider og cannabinoid blandinger er blevet testet med succes i mennesker7, cellelinjer5,8, og forskellige dyr model systemer9,10.
Et klinisk forsøg ville være ideelt til validering af effekten og bivirkningerne af cannabinoider på en bestemt sygdom. Der er dog mange udfordringer i kliniske forsøg, herunder etisk/IRB-godkendelse, rekruttering og fastholdelse af forsøgspersonerne11. For at overvinde disse forhindringer blev forskellige menneskelige cellelinjer brugt, fordi menneskeafledte cellelinjer er omkostningseffektive, nemme at håndtere, kan omgå de etiske spørgsmål og give ensartede og reproducerbare resultater, da cellelinjerne er en 'ren population af celler, der ikke har krydskontaminering af andre celler og kemikalier'12.
Alves et al. (2021)13 testede CBD på en dosisafhængig måde i placental trofoblaster, som er specialiserede celler i moderkagen, der spiller en væsentlig rolle i embryoimplantatering og interaktion med den cidualiserede moderlige livmoder14. Deres resultater viste, at CBD forårsagede tab af celle levedygtighed, afbrydelse af cellecyklusforløbet og apoptose induktion. Disse observationer viser de potentielle negative virkninger af cannabisbrug af gravide kvinder13. Ligeledes blev en række cellelinjer også brugt til at undersøge de farmakologiske virkninger af CBD i menneskelige sygdomme, især forskellige former for kræft. In vitro-undersøgelserne viste med succes anti-cancer effekter i bugspytkirtlen15, bryst8, og kolorektal cancerceller16. Men, mens der er bredt tilgængelige og let at håndtere, specifikke cellelinjer såsom HeLa, HEK293 er tilbøjelige til genetiske og fænotypiske ændringer på grund af ændringer i deres vækstbetingelser eller håndtering17.
I Cannabis forskning, forskellige dyr model systemer, lige fra små dyr som mouse18, marsvin19, og kanin19 til store dyr som hunde20, gris21, monkey22, horse23, er blevet brugt til at udforske ukendte terapeutiske virkninger. Mus har været det mest foretrukne dyremodelsystem til cannabinoidforskning på grund af deres anatomiske, fysiologiske og genetiske lighed med mennesker24. Mest markant har mus CB1/2 receptorer i deres nervesystem, som er til stede hos mennesker. De har også en kortere livscyklus end mennesker, med lettere vedligeholdelse og rigelige genetiske ressourcer, hvilket gør det meget lettere at overvåge virkningerne af cannabinoider gennem en hel livscyklus. Pattedyrsystemet er meget udbredt og har med succes vist, at CBD lindrer anfaldsforstyrrelser1, posttraumatisk stressforstyrrelse9, orale sår25 og demenslignende symptomer10. Musemodellen har også muliggjort en social interaktionsundersøgelse af individer i et samfund, som er yderst vanskeligt hos store dyr og mennesker26.
På trods af alle fordelene ved dyremodelsystemet er det stadig dyrt og kræver intensiv pleje under lægemiddeladministration og dataindsamling. Derudover er der kontrol af at bruge mus i forskning på grund af uigenkaldelighed og dårlig rekapitulation af menneskelige forhold på grund af begrænsninger i eksperimentelt design og stringens27.
Med den stigende efterspørgsel efter medicinske / prækliniske undersøgelser af cannabinoider er der behov for et ikke-pattedyrmodelsystem. Hvirvelløse modeller traditionelt tillagt karakteristiske fordele i forhold til hvirveldyr modeller. De betydelige fordele omfatter den lette og lave pris ved at opdrætte mange prøver og gøre det muligt for forskere at overvåge flere generationer af genetisk homogene populationer28. En nylig undersøgelse viste, at frugtfluen, Drosophila melanogaster, var et effektivt insektmodelsystem til at undersøge farmakologiske funktioner af cannabinoider i modulerende fodringsadfærd29. Blandt insektmodelsystemerne fokuserede forfatterne på tobakshornormen Manduca sexta, også kendt som Carolina sfinxmot eller hawk moth, som et nyt insektmodelsystem til cannabinoidforskning.
Manduca sexta tilhører Sphingidaes familie. Insektet er det mest almindelige plante skadedyr i det sydlige USA, hvor de fodrer med solanaceous planter. Insektmodellen har en lang historie inden for forskning i insektfysiologi, biokemi, neurobiologi og lægemiddelinteraktionsstudier. Manduca sextas forskningsportefølje omfatter et udkast til genomsekvens, der giver mulighed for en molekylær forståelse af væsentlige cellulære processer30. En anden afgørende fordel ved dette modelsystem er dets store størrelse og når mere end 100 mm i længden og 10 g i vægt i de 18-25 dages larveudvikling. Den store størrelse gør det muligt for forskere nemt at overvåge morfologiske og adfærdsmæssige ændringer i realtid som reaktion på CBD-behandlingen. På grund af størrelsen blev elektrofysiologiske reaktioner også undersøgt med abdominalnervesystemet, herunder ganglier dissekeret fra larverne uden mikroskopindstillinger i høj opløsning. Den unikke funktion gør det muligt for forskere at let undersøge akutte og langsigtede reaktioner på de administrerede cannabinoid(er).
På trods af en sådan alsidighed er M. sexta først for nylig blevet undersøgt for sin egnethed som en eksperimentel model for Cannabis og cannabinoidstudier. I 2019 brugte forfatterne insektmodelsystemet for første gang til at adressere hypotesen om, at Cannabis har udviklet sig til at producere Cannabidiol for at beskytte sig mod insekt planteædere30,31. Resultatet viste tydeligt, at planterne udnyttede CBD som en fodrings afskrækkende virkning og hæmmede væksten af skadedyrsinsekttet M. sexta larve, samt forårsagede øget dødelighed31. Undersøgelsen viste også, at CBD's redning af virkningerne på berusede ethanollarver identificerede den potentielle køretøjseffekt af ethanol som bærer af CBD. Som vist undersøgte insektmodelsystemet effektivt de terapeutiske virkninger af cannabinoider inden for 3-4 uger med mindre arbejdskraft og omkostninger end andre dyresystemer. Selvom insektmodellen mangler cannabinoidreceptorer (dvs. ingen CB1/2-receptorer), giver modelsystemet et værdifuldt værktøj til at forstå cannabinoidernes farmakologiske roller gennem en cannabinoid receptor-uafhængig måde.
Forfatterne af denne undersøgelse har tidligere arbejdet med tobak hornorm som et modelsystem for cannabinoid forskning31. Efter nøje overvejelse af fordele og risici ved at bruge M. sexta, har vi givet en metode, der involverer korrekt pleje og forberedelse af kost til prækliniske forsøg, der giver mulighed for fremtidig præklinisk laboratoriebrug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hornorm forberedelse og cannabidiol behandling
- Opnå 150-200 levedygtige M. sextaæg og kunstig kost af hvedekim (se Materialetabel).
- Læg hornormæggene i en polystyren petriskål med et hvedekimbaseret kunstigt kostlag (AD), og overfør æggene til et insektopdrætskammer (se materialetabellen), der holdes ved 25 °C med 40%-60% relativ luftfugtighed.
- Lad tobakshornormæg i 1-3 dage klække inde i insektopdrætskammeret, der holdes ved 25 °C med 40%-60% relativ luftfugtighed.
- Forbered cannabidiol (CBD) lageropløsning (200 mM) ved at tilføje 1,26 g >98% renhed CBD isolere i 20 mL EtOH (200 bevis) eller 100% medium kæde triglycerider (MCT) olie (se Materialetabel).
BEMÆRK: CBD-isolate er lysfølsomt, så håndtaget i mørke. - Tilføj 5 mL og 10 mL af 200 mM CBD-lagerløsningen til 1.000 g AD for at bringe de endelige koncentrationer af diæterne henholdsvis 1 mM og 2 mM CBD.
BEMÆRK: Sørg for, at kost- og CBD-lageropløsningen er godt blandet, indtil der dannes en helt homogen blanding. Blend AD indeholdende lager af CBD i en plastikpose i mindst 45 minutter i hånden.
FORSIGTIG: Kaffeblander eller enhver anden metalkværn syntes at være ineffektiv. - Dispenser 20 g af de tre medier, kontrol (AD), køretøj (AD + 0,1% af EtOH eller MCT-olie) og CBD-holdige medier (AD + 0,1% af EtOH eller MCT-olie + 1 mM / 2 mM CBD) til bunden af 50 mL-røret.
- Fordel tilfældigt 1. instar larver (~ 2 mm lang) individuelt i et 50 mL reagensglas og dække med et perforeret låg eller ostelærred (se Materialebord).
BEMÆRK: Placer røret på hovedet, og dyrk insekter på et insektopdrætskammer, der holdes 25 °C med 40%-60% relativ luftfugtighed. - Dyrk dem inde i et insektopdrætskammer (se materialebordet), der vedligeholdes ved 25 °C med en 12 timers lys/mørk cyklus.
2. M. sexta larval vækst, kost forbrug, og dødelighed målinger
- Mål larvevæksten (dvs. størrelse og vægt) med en analytisk balance og dødelighed med 2 dages mellemrum efter at være blevet overført til individuelle beholdere, indtil hvalpen er anerkendt som den mørkebrune farve af et hærdet exocuticlelag.
- Registrer den oprindelige masse (i gram) af hver gruppe larver, før larverne introduceres til deres respektive kostvaner og trækker larvernes masse ved hver måling fra den oprindelige masse for at bestemme massegevinster mellem larvernes udviklingsstadier, indtil larverne fuldfører hvalpestadiet.
- Registrer antallet af dage mellem instar udviklingsstadierne for at forstå forskelle i udviklingsfristen mellem stadier af larvervækst indtil hvalp på hver kost.
BEMÆRK: Skrab fækalt materiale af beholderen for at undgå skimmelforurening. Saml sagen til fremtidig test afhængig af eksperimentformål (f.eks. CBD-beregning af akkumuleringshastighed, mikrobiel profilering). Det er vigtigt at omhyggeligt håndtere insektet i de skrøbelige perioder med apolyse eller ecdysis. Når du tager ud af larverne fra en beholder, skal du forsigtigt gribe insektets hovedkrop med en flad spids og brede sammenkædning og ikke tvinge til at fjerne det ydre lag af huden, når et insekt er i færd med at kaste.
- Mål kostforbruget31 ved at veje beholderens kosttab mellem 1. instar larver og hvalp. Registrer de første gram kost i begyndelsen af eksperimentet og træk det oprindelige beløb fra den resterende mængde kost, da larverne kom ind i det komplette hvalpstadium.
BEMÆRK: Fækalt stof bør udelukkes fra kostmålingen. Fækalt stof og andet snavs (dvs. hudskure) kan nemt fjernes fra medierne ved at placere beholderen på hovedet. - Ved mobilitetsmålinger skal det udsatte insekt akklimatisere kammermiljøet i mindst 5 min og spore de afstande31 , som tre grupper af 5. instarinsekter (80-100 mm i længden) rejste ved hjælp af et automatiseret, edb-frygtkonditioneringskammer (se Materialetabel).
- Analyser mobilitetsresponsen31 via video optaget 60 billeder/s i 5 min ved hjælp af en bevægelsesdetekteringssoftware (se Materialetabel), som genererer et bevægelsesindeks.
3. Statistisk analyse
- Analysere forskellene i larvevæksten (dvs. størrelse og vægt) og bevægelsesindekset med envejs ANOVA med Tukeys post-test32.
- Brug log-rank (Mantel-Cox) test33 for overlevelse kurve sammenligninger.
BEMÆRK: Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af statistisk analysesoftware (se Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manduca sexta som model system til at undersøge cannabinoider toksicitet
Figur 1 skildrer de vigtigste komponenter i CBD-eksperimentet ved hjælp af tobakshornorm Manduca sexta. Et stort antal insekter (>20) blev individuelt opdrættet ved 25 °C på en 12 h:12 h = lys: mørk cyklus. Insekternes størrelse, vægt og dødelighed blev målt med 2 dages mellemrum for at overvåge for kort- og langsigtede reaktioner efter højdosis CBD (2 mM) behandling.
Figur 2 viser de negative virkninger af CBD på insektets vækst og udvikling. Insekterne opdrættet på en kunstig kost (AD) viste den bedste vækstpræstation. Køretøjets kontrol, der brugte 0,1% mediumkædet triglyceridolie (MCT) som opløsende middel til CBD-isolate, viste også normal vækst uden skadelige virkninger. En høj dosis CBD (2 mM) fremkaldte imidlertid vægttab (Figur 2C) og førte til en højere dødelighed end kontrol- og køretøjsgrupper (figur 2D).
På dag 24 var den gennemsnitlige størrelse af larverne fodret på AD 63,9 mm (n = 20-22). Størrelsen af larver opdrættet på AD indeholdende 2 mM CBD var imidlertid 50,7 mm, hvilket var ~ 21% mindre end larverne dyrket på AD (rød linje i figur 2C) 31. På dag 24 var den gennemsnitlige vægt af larve opdrættet på AD 6,5 g, hvilket var 2,2 gange større end larver opdrættet på AD med 2 mM CBD (n = 12-16, p < 0,00001)31. Især den høje dosis CBD (2 mM) øgede dødeligheden betydeligt op til 40%, mens kontrol- og køretøjsgrupperne kun viste en 20% dødelighed (Figur 2D)31. Resultaterne viste, at den høje dosis CBD (2 mM) i kosten er skadelig for insektudvikling og korrelerer med øget dødelighed.
Manduca sexta som model system til at udforske ukendte terapeutiske funktioner af cannabinoider
Figur 2 viste, at insektmodelsystemet effektivt overvåger eventuelle skadelige virkninger af CBD ved at overvåge deres morfologiske og fysiologiske ændringer. Det foreløbige resultat viste, at >1% ethanol (EtOH) er negativt relateret til deres vækst, mobilitet, kostforbrug og overlevelsesrate. For at undersøge, om CBD forbedrer insektets mobilitet og fodringsadfærd i de EtOH-berusede M. sexta larver, blev den samlede mængde kost, der forbruges af insekter og den afstand, de rejste i 10 minutter, målt fra insekter dyrket under tre fodringsforhold (AD, AD + 1% EtOH og AD + 1% EtOH + 1 mM CBD). Figur 3A viser, at M. sexta larver opdrættet på AD, der indeholder 1 mM CBD, forbruges mindst 3,1 gange større kostmasse end dem, der opdrættes på EtOH-tilsat diæt31. Kostforbruget af de insekter, der blev opdrættet på 2 mM CBD-tilsatte medier, var imidlertid ikke signifikant anderledes end forbruget af larver opdrættet på EtOH-only kostvaner (p > 0,05) 31.
Larval mobilitet blev også sporet for at undersøge, om CBD påvirkede deres mobilitet, når de var berusede med EtOH. Mobilindekset præsenteres som procentdelen (%) af fastfrysning. Figur 3B sammenligner mobilindekset for M. sexta larver opdrættet på forskellige forhold. Resultaterne viser, at 1% EtOH-behandlede larver ikke påvirkede mobiliteten (p > 0,05). 1 mM CBD-administrationen påvirkede heller ikke mobiliteten (p > 0,05)31. De 2% EtOH behandlinger viste sig at være dødelige for M. sexta larver; Der blev derfor ikke registreret noget mobilitetsindeks. Med tilsætning af den høje dosis CBD (2 mM) i AD, der indeholder 2% EtOH, forblev mobiliteten lav (80% fryse)31.
Figur 1: Den sammenfattede proces med at bruge tobak hornorm Manduca sexta larver i cannabidiol undersøgelse. (A) Hornorm æg udklækket i en separat stor beholder med et lag af kunstig kost. B) Der blev anvendt en sprøjte til at fylde beholderen for at forhindre, at der blev klæbet til beholdernes sider. (C) En anden instar tobak hornorm i en 50 mL reagensglas med ostelærred. (D) En tredje instar tobak hornorm. E) Hornormens længde (mm) og vægten (g) blev målt i en skala. F) 5. instar tobak hornorm, der gennemgår ecdysis og klar til pupation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Virkninger af Cannabidiol (CBD) på væksten og dødeligheden af tobakshornorm Manduca sexta. (A) Tobakshornorm larver på 5., 3. instar og tidlig hvalp. Størrelsen (B), vægten (C) og dødelighed (D) af M. sexta , når den fodres med kunstig kost (AD), AD + 0,1% af mediumkædet triglycerid (MCT) og AD + 0,1% af MCT + 2 mM CBD. Til statistiske analyser af insektvækst og overlevelsesrate blev der anvendt en envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest (n = 20-22, p < 0,05) og Mantel-Cox-test (n = 20-22, p < 0,05). Tallet er tilpasset reference31. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Virkningerne af Cannabidiol (CBD) på insektfoderadfærd og mobilitet. (A) Kostforbrug af tobakshornorm larver opdrættet på kunstig kost (AD), AD + 1-2% ethanol (EtOH) og AD + 1-2% af EtOH + 1-2mM CBD (envejs ANOVA, Tukeys multiple sammenligning på p < 0,05). b) Insektmobilitet. Mobiliteten er afbildet som fryse %. angiver p < 0,01. Tallet er tilpasset reference31. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fodringsundersøgelsen viste, at høje doser af CBD (2 mM) hæmmede insektets vækst og øgede dødelighed31. Insektmodellen viste også følsomhed over for ethanol; CBD afgiftede dog effektivt ethanoltoksiciteten og øgede deres overlevelsesrate, kostforbrug og madsøgningsadfærd til lignende niveauer som kontrolgruppen (Figur 3A, B)31. Det beskrevne insektmodelsystem består af tre kritiske trin: (1) at sikre , at M. sextas æg udklækkes ensartet i størrelse og timing, (2) forberedelse af vækstmedierne, der homogent blandes med cannabinoider til en målrettet koncentration, og (3) opretholdelse af vækstmedierne for at være fri for svampeforurening, samtidig med at der opretholdes et ideelt fugtighedsniveau på 40%-60%. Insektmodelsystemet gjorde det muligt for os at behandle forskningsspørgsmålet inden for 25 dage, fra medieforberedelse til dataindsamling og -fortolkning. Vigtigst af alt producerede insektsystemet ensartede resultater fra store prøver.
For at sikre succesen af de dyrkede M. sexta larver er det vigtigt at opretholde den relative fugtighed på 40% -60% inde i beholderen. Hvis en beholder ikke holder den høje luftfugtighed, vil en kunstig kost, der indeholder cannabinoiderne, blive udtørret hurtigt, hvilket forårsager tidlig eksperimentafslutning på grund af insekternes død. Men i et lukket system giver den høje luftfugtighed en ideel betingelse for svampeudbruddet, som er svært at udrydde. Forfatterne foreslår at bruge en perforeret låg eller cheesecloth til at levere tilstrækkelig luftcirkulation og samtidig minimere vandtab fra medierne. I et naturligt miljø foretrækker larverne at fodre på abaxialsiden af et blad, hvor fugtigheden er højere, samtidig med at de præsenterer færre trichomes end bladets overfladeareal34. Således var det usædvanligt nyttigt at placere en beholder på hovedet, samtidig med at der blev et tilflugtssted eller kravlende træpind. Dette hjælper også med at fjerne fækalt stof fra medieområdet og gør det nemt at indsamle affaldet til yderligere analyser.
Da cannabinoider receptorer er fraværende i invertabrates35, tobak hornorm M. sexta måske ikke være egnet til terapeutiske undersøgelser medieret af endocannabinoid system. Men med de mange fordele, der er påvist i vores pilotundersøgelse, bør insektet betragtes som et nyt modelsystem til at undersøge cannabinoidernes farmakologiske funktioner, især undersøgelser, der involverer ikke-CB-receptormedieret farmakokinetik. Den relativt korte livscyklus af M. sexta giver forskerne mulighed for at forstå virkningerne af en cannabinoid-holdige kost over flere generationer, hvilket giver mulighed for et eksperimentelt design i højere pattedyr model organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Institute of Cannabis Research ved Colorado State University-Pueblo og Ministeriet for Videnskab og IKT (2021-DD-UP-0379) og Chuncheon by (Hemp R &D og industrialisering, 2020-2021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
- Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
- Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
- Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
- Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
- Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
- de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
- Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
- Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
- Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
- Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
- Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
- Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
- Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
- Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
- Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
- Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
- Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
- Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
- Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
- Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
- He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
- Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
- McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M.
