Summary
Det nuvarande protokollet ger instruktionsinformation för användning av tobakshornmask Manduca sexta i cannabinoidforskning. Metoden som beskrivs här innehåller alla nödvändiga förnödenheter och protokoll för att övervaka fysiologiska och beteendemässiga förändringar av insektsmodellen som svar på cannabidiol (CBD) behandling.
Abstract
Med ökad uppmärksamhet på cannabinoider i medicin har flera däggdjursmodellorganismer använts för att klargöra sina okända farmaceutiska funktioner. Många svårigheter kvarstår dock inom däggdjursforskningen, vilket kräver utveckling av icke-däggdjursmodellorganismer för cannabinoidforskning. Författarna föreslår tobak hornworm Manduca sexta som ett nytt insektsmodellsystem. Detta protokoll ger information om att förbereda den konstgjorda kosten med olika mängder cannabidiol (CBD), inrätta en odlingsmiljö och övervaka deras fysiologiska och beteendemässiga förändringar som svar på CBD-behandling. Kort, efter att ha fått hornworm ägg, ägg tilläts 1-3 dagar vid 25 °C på en 12:12 ljus-mörk cykel att kläcka innan de slumpmässigt fördelas i kontroll (vete groddar-baserade konstgjorda kost; AD), fordon (AD + 0,1% medelkedjig triglyceridolja; MCT-olja) och behandlingsgrupper (AD + 0,1% MCT + 1 mM eller 2 mM CBD). När mediet var förberett placerades 1: a instar larver individuellt i ett 50 ml provrör med en träspettpinne, och sedan var provröret täckt med en ostduk. Mätningar gjordes i 2-dagars intervall för fysiologiska och beteendemässiga svar på CBD-administrationen. Detta enkla odlingsförfarande gör det möjligt för forskare att testa stora exemplar i ett givet experiment. Dessutom gör de relativt korta livscykeln det möjligt för forskare att studera effekten av cannabinoidbehandlingar över flera generationer av en homogen population, vilket möjliggör data för att stödja en experimentell design i högre däggdjursmodellorganismer.
Introduction
Under de senaste åren har allmänhetens uppmärksamhet varit centrerad på cannabinoider på grund av deras terapeutiska potential, inklusive behandling av epilepsi1, Parkinsons sjukdom2, multipel skleros3 och olika former av cancer4,5,6 med cannabidiol (CBD). Eftersom Cannabis legaliseras som en jordbruksvara i Agricultural Improvement Act från 2018 har offentlig lag 115-334 (2018 Farm Bill), Cannabis och dess cannabinoidderivat inom livsmedels-, kosmetika- och läkemedelsindustrin ökat exponentiellt. Dessutom har isolat av enstaka cannabinoider och cannabinoidblandningar framgångsrikt testats hos människor7, cellinjer5,8 och olika djurmodellsystem9,10.
En klinisk prövning skulle vara idealisk för att validera effekten och de negativa effekterna av cannabinoider på en specifik sjukdom. Det finns dock många utmaningar i kliniska prövningar, inklusive etiskt/IRB-godkännande, rekrytering och kvarhållande av försökspersonerna11. För att övervinna dessa hinder användes olika mänskliga cellinjer eftersom mänskliga cellinjer är kostnadseffektiva, lätta att hantera, kan kringgå de etiska frågorna och ge konsekventa och reproducerbara resultat eftersom cellinjerna är en "ren population av celler som inte har någon korskontaminering av andra celler och kemikalier"12.
(2021)13 testade CBD på ett dosberoende sätt i placentatrofoblasterna, som är specialiserade celler i moderkakan som spelar en viktig roll i embryoimplantation och interaktion med dencidualiserade moderns livmoder14. Deras resultat visade att CBD orsakade celllivsförlust, störningar i cellcykelns progression och apoptosinduktion. Dessa observationer visar de potentiella negativa effekterna av cannabisanvändning av gravida kvinnor13. På samma sätt användes också en serie cellinjer för att undersöka de farmakologiska effekterna av CBD i mänskliga sjukdomar, i synnerhet olika former av cancer. In vitro-studierna visade framgångsrikt anti-cancer effekter i bukspottskörteln15, bröst8 och kolorektal cancerceller16. Men samtidigt som de är allmänt tillgängliga och lätta att hantera, är specifika cellinjer som HeLa, HEK293 benägna att genetiska och fenotypiska förändringar på grund av förändringar i deras tillväxtförhållanden eller hantering17.
I cannabisforskning har olika djurmodellsystem, allt från små djur som mus18, marsvin19 och kanin19 till stora djur som hund20, gris21, monkey22, häst23, använts för att utforska okända terapeutiska effekter. Möss har varit det mest föredragna djurmodellsystemet för cannabinoidforskning på grund av deras anatomiska, fysiologiska och genetiska likhet med människor24. Mest signifikant har möss CB1/2-receptorer i nervsystemet, som finns hos människor. De har också en kortare livscykel än människor, med enklare underhåll och rikliga genetiska resurser, vilket gör det mycket lättare att övervaka effekterna av cannabinoider under en hel livscykel. Däggdjurssystemet används ofta och har framgångsrikt visat att CBD lindrar anfallsstörningar1, posttraumatiskt stressyndrom9, munsår25 och demensliknande symtom10. Musmodellen har också möjliggjort en social interaktionsstudie av individer i ett samhälle som är extremt svårt hos stora djur och människor26.
Trots alla fördelar med djurmodellsystemet är det fortfarande kostsamt och kräver intensivvård under läkemedelsadministration och datainsamling. Dessutom finns det granskning av att använda möss i forskning på grund av irreproduktivitet och dålig rekapitulation av mänskliga förhållanden på grund av begränsningar i experimentell design och rigor27.
Med den ökande efterfrågan på medicinska/prekliniska studier av cannabinoider behövs ett icke-däggdjursmodellsystem. Ryggradslösa djurmodeller gav traditionellt distinkta fördelar jämfört med ryggradsdjursmodeller. De betydande fördelarna inkluderar den enkla och låga kostnaden för att föda upp många exemplar och göra det möjligt för forskare att övervaka flera generationer av genetiskt homogena populationer28. En ny studie visade att fruktflugan, Drosophila melanogaster, är ett effektivt insektsmodellsystem för att undersöka farmakologiska funktioner hos cannabinoider för att modulera utfodringsbeteenden29. Bland insektsmodellsystemen fokuserade författarna på tobakshornmasken, Manduca sexta, även känd som Carolina sfinxmoth eller hawk moth, som ett nytt insektsmodellsystem för cannabinoidforskning.
Manduca sexta tillhör familjen Sphingidae. Insekten är det vanligaste växtskadedjuret i södra USA, där de matar på solanaceous växter. Insektsmodellen har en lång historia inom forskning inom insektsfysiologi, biokemi, neurobiologi och läkemedelsinteraktionsstudier. Manduca sextas forskningsportfölj innehåller ett utkast till genomsekvens, vilket möjliggör en molekylär förståelse av viktiga cellulära processer30. En annan viktig fördel med detta modellsystem är dess stora storlek, som når mer än 100 mm i längd och 10 g i vikt under 18-25 dagars larvutveckling. Den stora storleken gör det möjligt för forskare att enkelt övervaka morfologiska och beteendemässiga förändringar i realtid som svar på CBD-behandlingen. På grund av storleken undersöktes också elektrofysiologiska svar med buk nervsystemet, inklusive ganglier dissekerade från larverna utan högupplösta mikroskopinställningar. Den unika funktionen gör det möjligt för forskare att enkelt undersöka akuta och långsiktiga svar på de administrerade cannabinoiderna.
Trots sådan mångsidighet har M. sexta nyligen utforskats för sin lämplighet som en experimentell modell för cannabis- och cannabinoidstudier. År 2019 använde författarna insektsmodellsystemet för första gången för att ta itu med hypotesen att Cannabis har utvecklats för att producera Cannabidiol för att skydda sig mot insekts växtätare30,31. Resultatet visade tydligt att växterna utnyttjade CBD som en utfodring avskräckande och hämmade tillväxten av skadedjuret M. sexta caterpillar, samt orsakade ökad dödlighet31. Studien visade också de räddande effekterna av CBD på berusade etanollarver och identifierade etanolens potentiella fordonseffekt som bärare av CBD. Som visats undersökte insektsmodellsystemet effektivt cannabinoidernas terapeutiska effekter inom 3-4 veckor med mindre arbete och kostnader än andra djursystem. Även om insektsmodellen saknar cannabinoidreceptorer (dvs. inga CB1/2-receptorer), ger modellsystemet ett värdefullt verktyg för att förstå cannabinoidernas farmakologiska roller genom ett cannabinoidreceptoroberoende sätt.
Författarna till denna studie har tidigare arbetat med tobakshornmasken som ett modellsystem för cannabinoidforskning31. Efter noggrant övervägande av fördelarna och riskerna med att använda M. sexta, har vi tillhandahållit en metod som innebär korrekt vård och förberedelse av kost för prekliniska prövningar som möjliggör möjligheter för framtida preklinisk laboratorieanvändning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hornworm beredning och cannabidiol behandling
- Få 150-200 livskraftiga M. sextaägg och vetegroddarbaserade konstgjorda dieter (se Tabell över material).
- Placera hornmaskäggen i en polystyren Petri-skål med ett vetegroddarbaserat artificiellt dietskikt (AD) och överför äggen till en insektsuppfödningskammare (se Materialtabell) som hålls vid 25 °C med 40-60% relativ fuktighet.
- Låt ägg av hornmasktoar för tobak i 1-3 dagar kläcka inuti insektsuppfödningskammaren vid 25 °C med 40-60% relativ fuktighet.
- Förbered cannabidiol (CBD) lagerlösning (200 mM) genom att tillsätta 1,26 g >98% renhet CBD-isolat i 20 ml EtOH (200 bevis) eller 100% medelkedjiga triglycerider (MCT) olja (se Tabell över material).
OBS: CBD-isolat är ljuskänsligt, så hantera i mörker. - Lägg till 5 mL och 10 ml av 200 mM CBD-buljonglösningen till 1 000 g AD för att få de slutliga koncentrationerna av dieterna 1 mM respektive 2 mM CBD.
OBS: Se till att kost- och CBD-stamlösningen är väl blandad tills en helt homogen blandning bildas. Blanda AD som innehåller lager av CBD i en plastpåse i minst 45 minuter för hand.
VARNING: Kaffeblandare eller annan metallkvarn verkade vara ineffektiv. - Dispensera 20 g av de tre medierna, kontrollen (AD), fordonet (AD + 0,1% av EtOH- eller MCT-oljan) och CBD som innehåller media (AD + 0,1% av EtOH- eller MCT-olja + 1 mM / 2 mM CBD) till botten av 50 ml-röret.
- Fördela slumpmässigt 1: a instar larver (~ 2 mm långa) individuellt i ett 50 ml provrör och täck med perforerat lock eller ostduk (se Tabell över material).
OBS: Placera röret upp och ner och odla insekter vid en insektsuppfödningskammare som upprätthålls 25 °C med 40-60% relativ fuktighet. - Odla dem i en insektsuppfödningskammare (se Materialtabell) vid 25 °C med en ljus/mörk cykel på 12 timmar.
2. M. sexta larvtillväxt, kostkonsumtion och dödlighetsmätningar
- Mät larvtillväxten (dvs. storlek och vikt) med en analytisk balans och dödlighet med 2 dagars intervall efter att ha överförts till enskilda behållare tills pupering erkänns som mörkbrun färgning av ett härdat exocuticleskikt.
- Registrera den ursprungliga massan (i gram) av varje grupp larver innan larverna introduceras till sina respektive dieter och subtrahera larvernas massa vid varje mätning från den ursprungliga massan för att bestämma massvinster mellan larvernas utvecklingsstadier tills larverna slutför poppningsstadiet.
- Registrera antalet dagar mellan instar-utvecklingsstadierna för att förstå skillnader i utvecklings tidsramen mellan stadier av larver tillväxt tills pupation på varje diet.
OBS: Skrapa bort avföringen från behållaren för att undvika mögelföroreningar. Samla in frågan för framtida tester beroende på experimentändamål (t.ex. beräkning av CBD-ackumuleringshastighet, mikrobiell profilering). Det är viktigt att noggrant hantera insekten under de bräckliga perioderna av apolys eller ecdysis. När du tar ut larverna från en behållare, ta försiktigt tag i insektens huvudkropp med en platt spets och breda tångar och tvinga inte att ta bort det yttre hudskiktet när en insekt är i färd med att kasta.
- Mät kostkonsumtionen31 genom att väga behållarens kostförlust mellan 1: a instar larver och pupering. Registrera de första gram dieten i början av experimentet och subtrahera den ursprungliga mängden från den återstående mängden diet när larverna gick in i hela poppningsstadiet.
OBS: Fekal materia bör uteslutas från kostmätningen. Fekal materia och annat skräp (dvs. hudskjul) kan enkelt avlägsnas från mediet genom att placera behållaren upp och ner. - För mobilitetsmätningar, låt den utsatta insekten acklimatisera kammarmiljön i minst 5 minuter och spåra de avstånd31 som tre grupper av 5: e instar-insekter (80-100 mm långa) reste med hjälp av en automatiserad, datoriserad skräckkonditioneringskammare (se materialtabell).
- Analysera mobilitetssvaret31 genom video inspelade 60 bildrutor/s i 5 minuter med hjälp av en rörelsedetekteringsprogramvara (se Tabell över material) som genererar ett rörelseindex.
3. Statistisk analys
- Analysera skillnaderna i larvtillväxt (dvs. storlek och vikt) och rörelseindex med enkelriktad ANOVA med Tukeys post-test32.
- Använd log-rank (Mantel-Cox) test33 för överlevnadskurvor jämförelser.
OBS: Alla statistiska analyser utfördes med hjälp av programvara för statistisk analys (se Tabell över material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Manduca sexta som modellsystem för att undersöka cannabinoidernas toxicitet
Figur 1 visar de viktigaste komponenterna i CBD-experimentet med hjälp av tobakshornmask Manduca sexta. Ett stort antal insekter (>20) uppföddes individuellt vid 25 °C på en 12 h:12 h = ljus: mörk cykel. Insekternas storlek, vikt och dödlighet mättes med 2 dagars intervall för att övervaka för kort- och långsiktiga svar efter hög dos CBD (2 mM) behandling.
Figur 2 visar de negativa effekterna av CBD på insektens tillväxt och utveckling. Insekterna som föds upp på en konstgjord diet (AD) visade den bästa tillväxtprestandan. Fordonskontrollen som använde 0,1% medelkedjig triglyceridolja (MCT) som upplösningsmedel för CBD-isolat visade också normal tillväxt utan några skadliga effekter. En hög dos CBD (2 mM) inducerade dock viktminskning (figur 2C) och ledde till en högre dödlighet än för kontroll- och fordonsgrupper (figur 2D).
På dag 24 var den genomsnittliga storleken på larverna som utfodrades på AD 63,9 mm (n = 20-22). Storleken på larver som föds upp på AD som innehåller 2 mM CBD var dock 50,7 mm, vilket var ~ 21% mindre än larverna som odlades på AD (röd linje i figur 2C)31. På dag 24 var den genomsnittliga vikten av larva uppfödd på AD 6,5 g, vilket var 2,2 gånger större än för larver som uppföddes på AD med 2 mM CBD (n = 12-16, s < 0,00001)31. Noterbart är att den höga dosen av CBD (2 mM) avsevärt ökade dödligheten upp till 40%, medan kontroll- och fordonsgrupperna endast visade en 20% dödlighet (figur 2D)31. Resultaten visade att den höga dosen av CBD (2 mM) i kosten är skadlig för insektsutvecklingen och korrelerar till ökad dödlighet.
Manduca sexta som modellsystem för att utforska okända terapeutiska funktioner hos cannabinoider
Figur 2 visade att insektsmodellsystemet effektivt övervakar eventuella skadliga effekter av CBD genom att övervaka deras morfologiska och fysiologiska förändringar. Det preliminära resultatet visade att >1% etanol (EtOH) är negativt relaterad till deras tillväxt, rörlighet, kostkonsumtion och överlevnad. För att undersöka om CBD förbättrar insektens rörlighet och utfodringsbeteende i de EtOH-berusade M. sexta larverna, mättes den totala mängden kost som konsumeras av insekter och avståndet de reste i 10 minuter från insekter som odlades under tre utfodringsförhållanden (AD, AD + 1% EtOH och AD + 1% EtOH + 1 mM CBD). Figur 3A visar att M. sexta larver uppfödda på AD som innehåller 1 mM CBD konsumerade minst 3,1 gånger större kostmassa än de som föds upp på EtOH-tillsatt diet31. Dietkonsumtionen av insekterna som fötts upp på 2 mM CBD-tillsatta medier var dock inte signifikant annorlunda än för larver som uppföddes på EtOH-endast dieter (s > 0,05)31.
Larvens rörlighet spårades också för att undersöka om CBD påverkade deras rörlighet när de var berusade med EtOH. Mobilindexet presenteras som procentandelen (%) frysning. I figur 3B jämförs det mobila indexet för M. sexta larver uppfödda på olika förhållanden. Resultaten visar att 1% EtOH-behandlade larver inte påverkade rörligheten (p > 0,05). 1 mM CBD-administrationen påverkade inte heller rörligheten (s > 0,05)31. 2% EtOH-behandlingarna visade sig vara dödliga för M. sexta larver; Därför registrerades inget mobilitetsindex. Med tillägg av den höga dosen av CBD (2 mM) i AD som innehåller 2% EtOH, rörligheten förblev låg (80% frysning)31.
Figur 1: Den sammanfattade processen att använda tobakshornmask Manduca sexta larver i cannabidiol studie. (A) Hornworm ägg kläckta i en separat stor behållare med ett lager av konstgjord kost. (B) En spruta användes för att fylla behållaren för att förhindra att någon diet fastnar på behållarnas sidor. C) En 2:a instar-hornmask i ett provrör på 50 ml med ostduk. D) En tredje instar tobakshornmask. E) Hornmasklängd (mm) och vikt g mättes på en skala. F) 5:e instar-hornmasken som genomgår ekdys och är redo för pupering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Effekter av Cannabidiol (CBD) på tillväxten och dödligheten hos tobakshornmask Manduca sexta. (A) Tobak hornworm larver vid 5: e, 3: e instar och tidig pupering. Storlek (B), vikt (C) och dödlighet (D) på M. sexta när den matas på konstgjord kost (AD), AD + 0,1% av medelkedjiga triglycerider (MCT) och AD + 0,1% av MCT + 2 mM CBD. För statistiska analyser av insektstillväxt och överlevnadsgrad användes en enkelriktad ANOVA med Tukeys multipla jämförelsetest (n = 20-22, p < 0,05) och Mantel-Cox-test (n = 20-22, p < 0,05). Figuren är anpassad från Reference31. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Effekterna av Cannabidiol (CBD) på insektsmatningsbeteende och rörlighet. (A) Dietkonsumtion av tobakshornmasklarver uppfödda på konstgjord kost (AD), AD + 1-2% etanol (EtOH) och AD + 1-2% av EtOH + 1-2mM CBD (enkelriktad ANOVA, Tukeys flera jämförelse vid p < 0,05). B) Insektsrörlighet. Mobiliteten beskrivs som frys %. anger p < 0,01. Figuren är anpassad från Reference31. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utfodringsstudien visade att höga doser av CBD (2 mM) hämmade insektens tillväxt och ökad dödlighet31. Insektsmodellen visade också känslighet för etanol; CBD avtättade dock effektivt etanoltoxiciteten, vilket ökade deras överlevnadsgrad, kostkonsumtion och matsökningsbeteenden till liknande nivåer som kontrollgruppen (figur 3A, B)31. Det beskrivna insektsmodellsystemet består av tre kritiska steg: (1) se till att M. sextas ägg kläcks jämnt i storlek och timing, (2) förbereda tillväxtmedierna som homogent blandas med cannabinoider till en riktad koncentration och (3) upprätthålla tillväxtmediet för att vara fritt från svampförorening samtidigt som den ideala fuktighetsnivån bibehålls på 40-60%. Insektsmodellsystemet gjorde det möjligt för oss att ta itu med forskningsfrågan inom 25 dagar, från medieförberedelse till datainsamling och tolkning. Viktigast av allt producerade insektssystemet konsekventa resultat från stora exemplar.
För att säkerställa framgången för de odlade M. sexta larverna är det viktigt att upprätthålla den relativa fuktigheten vid 40%-60% inuti behållaren. Om en behållare inte håller den höga luftfuktigheten kommer en konstgjord diet som innehåller cannabinoiderna att torkas snabbt, vilket orsakar tidig experimentavslutning på grund av insekternas död. Men i ett slutet system ger den höga luftfuktigheten ett idealiskt villkor för svamputbrottet, vilket är svårt att utrota. Författarna föreslår att man använder ett perforerat lock eller ostduk för att leverera tillräcklig luftcirkulation samtidigt som vattenförlusten från media minimeras. I en naturlig miljö föredrar larverna att mata på den abaxiella sidan av ett löv där luftfuktigheten är högre samtidigt som de presenterar färre trichomes än bladets yta34. Således var det exceptionellt användbart att placera en behållare upp och ner samtidigt som det gav ett fristadsområde eller krypande träpinne. Detta bidrar också till att avlägsna fekal materia från medieområdet och gör det enkelt att samla in avfallet för ytterligare analyser.
Eftersom cannabinoidreceptorer saknas i ryggradslösa 35, kanske tobakshornmasken M. sexta inte är lämplig för terapeutiska studier som förmedlas av det endocannabinoida systemet. Men med de många fördelar som visats i vår pilotstudie bör insekten betraktas som ett nytt modellsystem för att undersöka cannabinoidernas farmakologiska funktioner, särskilt studier som involverar icke-CB-receptormedierad farmakokinetik. Den relativt korta livscykeln för M. sexta gör det möjligt för forskare att förstå effekterna av en cannabinoidinnehållande diet under flera generationer, vilket möjliggör en experimentell design i högre däggdjursmodellorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Institute of Cannabis Research vid Colorado State University-Pueblo och Ministry of Science and ICT (2021-DD-UP-0379) och Chuncheon City (Hemp R&D och industrialization, 2020-2021).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
- Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
- Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
- Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
- Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
- Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
- de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
- Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
- Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
- Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
- Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
- Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
- Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
- Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
- Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
- Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
- Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
- Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
- Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
- Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
- Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
- He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
- Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
- McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. Cannabinoid receptors in invertebrates. Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).
