Summary
本方案为在大麻素研究中使用烟草角虫 Manduca sexta 提供了教学信息。 这里描述的方法包括所有必要的用品和方案，以监测昆虫模型的生理和行为变化，以响应大麻二酚（CBD）治疗。
Abstract
随着医学中对大麻素的日益关注，几种哺乳动物模式生物已被用于阐明其未知的药物功能。然而，哺乳动物研究仍然存在许多困难，这需要开发用于大麻素研究的非哺乳动物模式生物。作者建议将烟草角虫 Manduca sexta 作为一种新的昆虫模型系统。该协议提供了有关用不同量的大麻二酚（CBD）制备人造饮食的信息，建立培养环境，并监测其对CBD治疗的生理和行为变化。简而言之，在接受角虫卵后，在25°C下以12：12的明暗循环允许卵1-3天孵化，然后随机分配到对照组（基于小麦胚芽的人造饮食;AD），载体（AD + 0.1%中链甘油三酯油;MCT油）和治疗组（AD + 0.1%MCT + 1 mM或2mM CBD）。一旦培养基准备好，将1龄 幼虫单独放入带有木制烤串棒的50 mL试管中，然后用干酪布覆盖试管。以2天的间隔进行测量，以对CBD管理的生理和行为反应。这种简单的培养程序使研究人员能够在给定的实验中测试大型标本。此外，相对较短的生命周期使研究人员能够研究大麻素治疗对同质种群多代的影响，从而允许数据支持高等哺乳动物模式生物的实验设计。
Introduction
在过去几年中，公众的注意力一直集中在大麻素上，因为它们具有治疗潜力，包括治疗癫痫1，帕金森病2，多发性硬化症3以及各种形式的癌症4，5，6 与大麻二酚（CBD）。由于 大麻 在2018年的"农业改进法"中作为农业商品合法化，公法115-334（2018年农业法案）， 大麻 及其大麻素衍生物在食品，化妆品和制药行业中呈指数级增长。此外，单一大麻素和大麻素混合物的临床级分离株已在人类受试者7、细胞系5、8和各种动物模型系统中成功测试9，10。
临床试验是验证大麻素对特定疾病的疗效和不良反应的理想选择。然而，临床试验中存在许多挑战，包括伦理/IRB批准、招募和保留受试者11。为了克服这些障碍，使用了各种人类细胞系，因为人源性细胞系具有成本效益，易于处理，可以绕过伦理问题，并提供一致且可重复的结果，因为细胞系是"纯细胞群，没有其他细胞和化学物质的交叉污染"12。
Alves等人（2021）13 在胎盘滋养层中以剂量依赖性方式测试CBD，胎盘滋养层细胞是胎盘的特化细胞，在胚胎植入和与蜕膜化母体子宫的相互作用中起着至关重要的作用14。他们的结果表明，CBD导致细胞活力丧失，细胞周期进展破坏和细胞凋亡诱导。这些观察结果表明了孕妇使用 大麻 的潜在负面影响13。同样，一系列细胞系也用于检查CBD在人类疾病中的药理作用，特别是各种形式的癌症。 体外 研究成功地证明了胰腺癌细胞15、breast8和结直肠癌细胞16的抗癌作用。然而，虽然具有广泛可用且易于处理的特定细胞系，但由于其生长条件或处理的改变，HeLa，HEK293等特定细胞系容易发生遗传和表型变化17。
在大麻研究中，各种动物模型系统，从小鼠18，豚鼠19和兔子19等小动物到犬20，仔猪21，猴子22，马23等大型动物，已被用于探索未知的治疗效果。小鼠一直是大麻素研究的首选动物模型系统，因为它们的解剖学，生理学和遗传相似性与人类24。最重要的是，小鼠的神经系统中有CB1 / 2受体，这些受体存在于人类中。它们的生命周期也比人类受试者短，更容易维护和丰富的遗传资源，因此更容易在整个生命周期中监测大麻素的影响。哺乳动物系统被广泛使用，并已成功证明CBD可缓解癫痫发作1，创伤后应激障碍9，口腔溃疡25和痴呆样症状10。小鼠模型还使社区内个体的社会互动研究成为可能，这在大型动物和人类中非常困难26。
尽管动物模型系统具有所有优点，但它仍然成本高昂，并且在药物管理和数据收集期间需要重症监护。此外，由于实验设计和严谨性的局限性，在研究中使用小鼠的不可重复性和对人类条件的概括性差，因此存在审查27。
随着对大麻素的医学/临床前研究的需求不断增加，需要一个非哺乳动物模型系统。传统上，无脊椎动物模型比脊椎动物模型具有独特的优势。显著的好处包括饲养许多标本的便利性和低成本，并使研究人员能够监测多代遗传同质种群28。最近的一项研究证明，果蝇 黑腹果 蝇是一种有效的昆虫模型系统，用于研究大麻素在调节进食行为中的药理功能29。在昆虫模型系统中，作者专注于烟草角虫 Manduca sexta，也称为卡罗来纳狮身人面像蛾或鹰蛾，作为大麻素研究的新型昆虫模型系统。
Manduca sexta 属于Sphingidae家族。这种昆虫是美国南部最常见的植物害虫，它们以茄科植物为食。昆虫模型在昆虫生理学，生物化学，神经生物学和药物相互作用研究方面有着悠久的历史。 Manduca sexta的研究组合包括一个基因组序列草案，允许对基本细胞过程进行分子水平的理解30。该模型系统的另一个关键好处是其大尺寸，在幼虫发育的18-25天内长度超过100毫米，重量达到10克以上。大尺寸使研究人员能够轻松实时监测形态和行为变化，以响应CBD治疗。此外，由于大小，用腹部神经系统检查电生理反应，包括在没有高分辨率显微镜设置的情况下从幼虫上解剖的神经节。独特的功能使研究人员能够轻松调查对施用大麻素的急性和长期反应。
尽管有这种多功能性， 但M. sexta 直到最近才被探索，因为它适合作为 大麻 和大麻素研究的实验模型。2019年，作者首次使用昆虫模型系统来解决 大麻 已经进化到产生大麻二酚以保护自己免受昆虫食草动物侵害的假设30，31。结果清楚地表明，这些植物利用CBD作为喂养威慑，并抑制了害虫 M. sexta caterpillar的生长，并导致死亡率增加31。该研究还证明了CBD对中毒乙醇幼虫的拯救作用，确定了乙醇作为CBD载体的潜在载体效应。如图所示，昆虫模型系统在3-4周内有效地研究了大麻素的治疗效果，并且比其他动物系统更少的劳动力和成本。虽然昆虫模型缺乏大麻素受体（即没有CB1/2受体），但模型系统提供了一个有价值的工具，通过大麻素受体无关的方式了解大麻素的药理作用。
本研究的作者以前曾使用烟草角虫作为大麻素研究的模型系统31。在仔细考虑了使用 M. sexta的益处和风险之后，我们提供了一种方法，涉及适当的护理和准备临床前试验的饮食，为未来的临床前实验室使用提供了机会。
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Protocol
1. 角虫制备及大麻二酚处理
- 获得150-200可行 M。 六角 蛋和小麦胚芽为基础的人造饮食（见 材料表）。
- 将角虫卵放入具有小麦胚芽人造饮食（AD）层的聚苯乙烯培养皿中，并将卵转移到保持25°C且相对湿度为40%-60%的昆虫饲养室（ 见材料表）。
- 让烟草角虫卵在相对湿度保持在25°C且相对湿度为40%-60%的昆虫饲养室内孵化1-3天。
- 通过将1.26克>98%纯度的CBD分离物加入20毫升EtOH（200度）或100%中链甘油三酯（MCT）油中，制备大麻二酚（CBD）储备溶液（200mM）（见 材料表）。
注意：CBD隔离物对光敏感，因此请在黑暗处处理。 - 向1，000g AD中添加5 mL和10 mL的200 mM CBD储备溶液，使日粮的最终浓度分别为1 mM和2mM CBD。
注意：确保饮食和CBD储备溶液充分混合，直到形成完全均匀的混合物。用手将含有CBD库存的AD混合在塑料袋中至少45分钟。
注意：咖啡搅拌机或任何其他金属研磨机似乎无效。 - 将20g三种培养基，对照（AD），载体（AD + 0.1%的EtOH或MCT油）和含有CBD的培养基（AD + 0.1%的EtOH或MCT油+ 1mM / 2mM CBD）分配到50 mL管的底部。
- 将1龄幼虫（约2毫米长）随机分布在50 mL试管中，并用穿孔盖或干酪布盖住（见 材料表）。
注意：将管子倒置，在保持25°C且相对湿度为40%-60%的昆虫饲养室中生长昆虫。 - 在昆虫饲养室（见 材料表）内种植它们，保持在25°C，具有12小时的光/暗循环。
2. 六分枝 杆菌幼虫生长、饮食消耗和死亡率测量
- 在转移到单个容器后，以分析天平和死亡率以2天间隔测量幼虫生长（即大小和重量），直到化蛹被识别为硬化的外胚层的深棕色。
- 在将幼虫引入各自的饮食之前，记录每组幼虫的初始质量（以克为单位），并在每次测量时从初始质量中减去幼虫的质量，以确定幼虫发育阶段之间的质量增益，直到幼虫完成化蛹阶段。
- 记录幼虫发育阶段之间的天数，以了解幼虫生长阶段之间发育时间框架的差异，直到每种饮食的化蛹。
注意：从容器中刮掉粪便，以避免任何霉菌污染。根据实验目的收集物质以供将来测试（例如，CBD积累率计算，微生物分析）。重要的是在多发性或蜕皮的脆弱时期仔细处理昆虫。从容器中取出幼虫时，用平尖和宽镊子轻轻抓住昆虫的主体，并且在昆虫脱落过程中不要强行去除皮肤的外层。
- 通过权衡1龄幼虫和化蛹之间容器的饮食损失来测量饮食消耗31。在实验开始时记录初始饮食克数，并在幼虫进入完全化蛹阶段时从剩余的饮食量中减去初始量。
注意：粪便物质应从饮食测量中排除。通过将容器倒置，可以很容易地从介质中去除粪便和其他碎屑（即皮肤脱落物）。 - 对于移动性测量，允许受试昆虫在腔室环境中适应至少5分钟，并使用自动计算机化的恐惧调节室跟踪三组5龄昆虫（长度为80-100毫米）行进的距离31（见材料表）。
- 使用运动检测软件（参见材料表）分析移动响应31，使用视频录制 60 帧/秒，持续 5 分钟，生成运动指数。
3. 统计分析
- 利用Tukey的后测试32，通过单因子方差分析幼虫生长（即大小和重量）和运动指数的差异。
- 使用对数秩（Mantel-Cox）测试33 进行生存曲线比较。
注：所有统计分析均使用统计分析软件进行（见 材料表）。
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Representative Results
曼杜卡六分仪 作为检查大麻素毒性的模型系统
图1 描述了使用烟草角虫 Manduca sexta的CBD实验的关键组成部分。大量昆虫（>20）在25°C下以12小时：12小时=光：暗循环单独饲养。每隔2天测量昆虫的大小，体重和死亡率，以监测高剂量CBD（2mM）治疗后的短期和长期反应。
图2 显示了CBD对昆虫生长和发育的不利影响。在人工饮食（AD）上饲养的昆虫表现出最佳的生长性能。使用0.1%中链甘油三酯（MCT）油作为CBD分离物溶解剂的载体对照组也显示出正常生长，没有任何不利影响。然而，高剂量的CBD（2mM）诱导体重减轻（图2C），并导致死亡率高于对照组和载体组（图2D）。
在第24天，以AD为食的幼虫的平均大小为63.9毫米（n = 20-22）。然而，在含有2 mM CBD的AD上饲养的幼虫的大小为50.7 mm，比AD上生长的幼虫（ 图2C中的红线）小约21%31。第24天，AD饲养的幼虫平均重量为6.5 g，是AD上饲养的幼虫的2.2倍，CBD为2 mM（n = 12-16， p <0.00001）31。值得注意的是，高剂量的CBD（2mM）显着增加了死亡率高达40%，而对照组和载体组仅显示20%的死亡率（图2D）31。结果表明，饮食中的高剂量CBD（2mM）对昆虫发育有害，并且与死亡率增加相关。
Manduca sexta 作为探索大麻素未知治疗功能的模型系统
图2 显示，昆虫模型系统通过监测CBD的形态和生理变化，有效地监测了CBD的任何有害影响。初步结果表明，>1%乙醇（EtOH）与其生长、流动性、饮食消耗和存活率呈负相关。为了研究CBD是否改善了EtOH中毒的 M. sexta 幼虫的昆虫的活动性和摄食行为，从三种摄食条件下生长的昆虫（AD，AD + 1%EtOH和AD + 1%EtOH + 1 mM CBD）测量了昆虫消耗的饮食总量和它们行进10分钟的距离。 图 3A 显示 M.在含有1 mM CBD的AD上饲养的 六性 幼虫消耗的饮食质量至少是EtOH添加饮食饲养的3.1倍31。然而，在2 mM添加CBD培养基上饲养的昆虫的饮食消耗量与仅EtOH日粮饲养的幼虫的饮食消耗量没有显着差异（p >0.05）31。
还跟踪幼虫的移动性，以检查CBD在中毒EtOH时是否会影响它们的移动性。移动指数显示为冻结的百分比 （%）。 图 3B 比较了 M 的移动索引。 六分 体幼虫在不同条件下饲养。结果表明，1%EtOH处理的幼虫不影响活动性（p >0.05）。1 mM CBD管理也不影响流动性（p >0.05）31。2%的EtOH处理对 M. sexta 幼虫是致命的;因此，没有记录任何移动指数。随着高剂量的CBD（2mM）加入含有2%EtOH的AD中，迁移率保持低（80%冷冻）31。
图1：在大麻二酚研究中使用烟草角虫Manduca sexta caterpilla的总结过程（A）角虫卵在单独的大容器中孵化，并带有一层人造饮食。（B）使用注射器填充容器，以防止任何饮食粘在容器的侧面。（C）2龄烟草角虫在50毫升试管中，加有干酪布。（D）三龄烟草角虫。（E）在秤上测量角虫长度（毫米）和重量（g）。（F）5龄烟草角虫，经历蜕皮并准备化蛹。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：大麻二酚（CBD）对烟草角虫Manduca sexta的生长和死亡率的影响（A）烟草角虫毛虫在5龄，3龄和早期化蛹。M 的大小 （B）、体重 （C） 和死亡率 （D）。当以人工饮食（AD）喂养时，AD + 0.1%的中链甘油三酯（MCT）和AD + 0.1%的MCT + 2 mM的CBD。为了对昆虫生长和存活率进行统计分析，分别使用Tukey多重比较检验（n = 20-22，p <0.05）和Mantel-Cox检验（n = 20-22，p <0.05）的单因子方差分析。该图改编自参考文献31。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：大麻二酚（CBD）对昆虫摄食行为和移动性的影响（A）在人工饮食（AD）上饲养的烟草角虫毛毛虫的饮食消费量，AD + 1-2%的乙醇（EtOH）和AD + 1-2%的EtOH + 1-2mM的CBD（单因素方差分析，Tukey在p<0.05的多重比较）。（B）昆虫的活动性。移动性表示为冻结 %。表示 p < 0.01。该图改编自参考文献31。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
喂养研究表明，高剂量的CBD（2 mM）抑制了昆虫的生长并增加了死亡率31。昆虫模型还显示出对乙醇的敏感性;然而，CBD有效地解毒了乙醇毒性，将其存活率，饮食消耗和食物搜索行为提高到与对照组相似的水平（图3A，B）31。所描述的昆虫模型系统由三个关键步骤组成：（1）确保 M. sexta的卵在大小和时间上均匀孵化，（2）制备与大麻素均匀混合到目标浓度的生长培养基，以及（3）保持生长培养基不受真菌污染，同时保持理想的湿度水平在40%-60%。昆虫模型系统使我们能够在25天内解决研究问题，从培养基制备到数据收集和解释。最重要的是，昆虫系统从大型标本中产生了一致的结果。
为了确保培养的 M. sexta 幼虫的成功，容器内的相对湿度保持在40%-60%是必不可少的。如果容器无法容纳高湿度，则含有大麻素的人造饮食将被迅速干燥，导致由于昆虫死亡而提前终止实验。然而，在封闭的系统中，高湿度为真菌爆发提供了理想的条件，而真菌爆发很难根除。作者建议使用穿孔盖子或干酪布来提供足够的空气流通，同时最大限度地减少介质的水分损失。在自然环境中，毛毛虫更喜欢在湿度较高的叶子的轴向侧觅食，同时呈现的毛状体比叶子的表面积少34。因此，将容器倒置在提供避难区或爬行木棍时非常有帮助。这也有助于从培养基区域去除粪便物质，并使其易于收集废物以进行进一步测定。
由于无脊椎动物中不存在大麻素受体35，烟草角虫 M. sexta 可能不适合由内源性大麻素系统介导的治疗研究。然而，由于我们的试点研究证明了许多好处，昆虫应该被认为是一种新的模型系统，以研究大麻素的药理学功能，特别是涉及非CB受体介导的药代动力学的研究。 M. sexta 相对较短的生命周期使研究人员能够了解含大麻素的饮食对多代的影响，从而允许在高等哺乳动物模型生物中进行实验设计。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了科罗拉多州立大学普韦布洛分校大麻研究所、科学与信息通信技术部（2021-DD-UP-0379）和春川市（大麻研发和工业化，2020-2021）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
- Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
- Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
- Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
- Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
- Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
- de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
- Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
- Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
- Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
- Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
- Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
- Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
- Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
- Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
- Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
- Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
- Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
- Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
- Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
- Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
- He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
- Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
- McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. Cannabinoid receptors in invertebrates. Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).
