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Biology

El gusano del cuerno del tabaco como sistema modelo de insectos para estudios preclínicos de cannabinoides

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63228
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 4, 4
1Institute of Cannabis Research, Colorado State University-Pueblo, 2Department of Biology, Colorado State University-Pueblo, 3Department of Chemistry, Colorado State University-Pueblo, 4Chuncheon Bioindustry Foundation

Summary

El presente protocolo proporciona información instructiva para el uso del gusano del tabaco Manduca sexta en la investigación de cannabinoides. El método descrito aquí incluye todos los suministros y protocolos necesarios para monitorear los cambios fisiológicos y de comportamiento del modelo de insecto en respuesta al tratamiento con cannabidiol (CBD).

Abstract

Con una mayor atención a los cannabinoides en la medicina, se han utilizado varios organismos modelo de mamíferos para dilucidar sus funciones farmacéuticas desconocidas. Sin embargo, siguen existiendo muchas dificultades en la investigación con mamíferos, lo que requiere el desarrollo de organismos modelo no mamíferos para la investigación de cannabinoides. Los autores sugieren el gusano del tabaco Manduca sexta como un nuevo sistema modelo de insectos. Este protocolo proporciona información sobre la preparación de la dieta artificial con cantidades variables de cannabidiol (CBD), la creación de un entorno de cultivo y el monitoreo de sus cambios fisiológicos y de comportamiento en respuesta al tratamiento con CBD. Brevemente, al recibir los huevos de gusano del cuerno, a los huevos se les permitió 1-3 días a 25 ° C en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 para eclosionar antes de ser distribuidos al azar en el control (dieta artificial basada en germen de trigo; AD), vehículo (AD + 0.1% aceite de triglicéridos de cadena media; Aceite MCT) y grupos de tratamiento (AD + 0,1% MCT + 1 mM o 2 mM de CBD). Una vez que se preparó el medio, las larvas de 1st instar se colocaron individualmente en un tubo de ensayo de 50 ml con un palo de pincho de madera, y luego el tubo de ensayo se cubrió con una gasa. Las mediciones se tomaron en intervalos de 2 días para las respuestas fisiológicas y conductuales a la administración de CBD. Este sencillo procedimiento de cultivo permite a los investigadores probar muestras grandes en un experimento determinado. Además, los ciclos de vida relativamente cortos permiten a los investigadores estudiar el impacto de los tratamientos con cannabinoides en múltiples generaciones de una población homogénea, lo que permite que los datos respalden un diseño experimental en organismos modelo de mamíferos superiores.

Introduction

En los últimos años, la atención pública se ha centrado en los cannabinoides debido a su potencial terapéutico, incluyendo el tratamiento de la epilepsia1, la enfermedad de Parkinson2, la esclerosis múltiple3 y diversas formas de cáncer4,5,6 con cannabidiol (CBD). Desde que el cannabis se legalizó como un producto agrícola en la Ley de Mejora Agrícola de 2018, la Ley Pública 115-334 (la Ley Agrícola de 2018), el cannabis y sus derivados cannabinoides en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica han aumentado exponencialmente. Además, se han probado con éxito aislados de grado clínico de cannabinoides individuales y mezclas de cannabinoides en sujetos humanos7, líneas celulares5,8 y diversos sistemas de modelos animales9,10.

Un ensayo clínico sería ideal para validar la eficacia y los efectos adversos de los cannabinoides en una enfermedad específica. Sin embargo, existen numerosos desafíos en los ensayos clínicos, incluida la aprobación ética / IRB, el reclutamiento y la retención de los sujetos11. Para superar estos obstáculos, se utilizaron varias líneas celulares humanas porque las líneas celulares derivadas de humanos son rentables, fáciles de manejar, pueden eludir los problemas éticos y proporcionar resultados consistentes y reproducibles, ya que las líneas celulares son una "población pura de células que no tienen contaminación cruzada de otras células y productos químicos"12.

Alves et al. (2021)13 probaron el CBD de manera dosis-dependiente en los trofoblastos placentarios, que son células especializadas de la placenta que desempeñan un papel esencial en la implantación embrionaria y la interacción con el útero materno decidualizado14. Sus resultados mostraron que el CBD causó pérdida de viabilidad celular, interrupción de la progresión del ciclo celular e inducción de la apoptosis. Estas observaciones demuestran los posibles impactos negativos del consumo de Cannabis por parte de las mujeres embarazadas13. Del mismo modo, también se utilizaron una serie de líneas celulares para examinar los efectos farmacológicos del CBD en enfermedades humanas, en particular, diversas formas de cáncer. Los estudios in vitro demostraron con éxito efectos anticancerígenos en células de cáncer de páncreas15, mama8 y colorrectal16. Sin embargo, aunque están ampliamente disponibles y son fáciles de manejar, las líneas celulares específicas como HeLa, HEK293 son propensas a cambios genéticos y fenotípicos debido a alteraciones en sus condiciones de crecimiento o manejo17.

En la investigación del cannabis, se han utilizado varios sistemas de modelos animales, que van desde animales pequeños como el ratón18, el conejillo de indias19 y el conejo19 hasta animales grandes como canino20, lechón21, mono22, caballo23, para explorar efectos terapéuticos desconocidos. Los ratones han sido el sistema modelo animal preferido para la investigación de cannabinoides debido a su similitud anatómica, fisiológica y genética con los humanos24. Lo más significativo es que los ratones tienen receptores CB1/2 en su sistema nervioso, que están presentes en los humanos. También tienen un ciclo de vida más corto que los sujetos humanos, con un mantenimiento más fácil y abundantes recursos genéticos, lo que hace que sea mucho más fácil monitorear los efectos de los cannabinoides a lo largo de todo un ciclo de vida. El sistema de mamíferos es ampliamente utilizado y ha demostrado con éxito que el CBD alivia los trastornos convulsivos1, el trastorno de estrés postraumático9, las úlceras orales25 y los síntomas similares a la demencia10. El modelo de ratón también ha permitido un estudio de interacción social de individuos dentro de una comunidad que es extremadamente difícil en animales grandes y humanos26.

A pesar de todas las ventajas del sistema de modelo animal, sigue siendo costoso y requiere cuidados intensivos durante la administración de medicamentos y la recopilación de datos. Además, existe un escrutinio del uso de ratones en la investigación debido a la irreproducibilidad y la mala recapitulación de las condiciones humanas debido a las limitaciones en el diseño experimental y el rigor27.

Con la creciente demanda de estudios médicos / preclínicos de cannabinoides, se necesita un sistema modelo no mamífero. Los modelos de invertebrados tradicionalmente conferían beneficios distintivos sobre los modelos de vertebrados. Los beneficios significativos incluyen la facilidad y el bajo costo de criar muchos especímenes y permitir a los investigadores monitorear múltiples generaciones de poblaciones genéticamente homogéneas28. Un estudio reciente demostró que la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un sistema modelo de insecto eficaz para investigar las funciones farmacológicas de los cannabinoides en la modulación de los comportamientos de alimentación29. Entre los sistemas modelo de insectos, los autores se centraron en el gusano del tabaco, Manduca sexta, también conocido como polilla de la esfinge de Carolina o polilla halcón, como un nuevo sistema modelo de insecto para la investigación de cannabinoides.

Manduca sexta pertenece a la familia de los Sphingidae. El insecto es la plaga de plantas más común en el sur de los Estados Unidos, donde se alimentan de plantas solanáceas. El modelo de insecto tiene una larga historia en la investigación en fisiología de insectos, bioquímica, neurobiología y estudios de interacción farmacológica. La cartera de investigación de Manduca sexta incluye un borrador de secuencia genómica, lo que permite una comprensión a nivel molecular de los procesos celulares esenciales30. Otro beneficio crucial de este sistema modelo es su gran tamaño, alcanzando más de 100 mm de longitud y 10 g de peso en los 18-25 días de desarrollo larvario. El gran tamaño permite a los investigadores monitorear fácilmente los cambios morfológicos y de comportamiento en tiempo real en respuesta al tratamiento con CBD. Además, debido al tamaño, se examinaron las respuestas electrofisiológicas con el sistema nervioso abdominal, incluidos los ganglios diseccionados de las larvas sin ajustes de microscopio de alta resolución. La característica única permite a los investigadores investigar fácilmente las respuestas agudas y a largo plazo a los cannabinoides administrados.

A pesar de tal versatilidad, M. sexta ha sido explorada recientemente por su idoneidad como modelo experimental para estudios de cannabis y cannabinoides. En 2019, los autores utilizaron el sistema modelo de insectos por primera vez para abordar la hipótesis de que el cannabis ha evolucionado para producir cannabidiol para protegerse de los insectos herbívoros30,31. El resultado mostró claramente que las plantas explotaron el CBD como elemento disuasorio de alimentación e inhibieron el crecimiento del insecto plaga M. sexta oruga, además de causar un aumento de la mortalidad31. El estudio también demostró los efectos de rescate del CBD a las larvas de etanol intoxicadas, identificando el posible efecto vehicular del etanol como portador del CBD. Como se muestra, el sistema modelo de insectos investigó efectivamente los efectos terapéuticos de los cannabinoides en 3-4 semanas con menos mano de obra y costos que otros sistemas animales. Aunque el modelo de insecto carece de receptores cannabinoides (es decir, no hay receptores CB1/2), el sistema modelo proporciona una herramienta valiosa para comprender las funciones farmacológicas de los cannabinoides a través de una manera independiente del receptor cannabinoide.

Los autores de este estudio han trabajado previamente con el gusano del tabaco como sistema modelo para la investigación de cannabinoides31. Después de una cuidadosa consideración de los beneficios y riesgos del uso de M. sexta, hemos proporcionado un método que implica el cuidado adecuado y la preparación de la dieta para ensayos preclínicos que permiten oportunidades para el uso futuro en laboratorio preclínico.

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Protocol

1. Preparación del gusano del cuerno y tratamiento con cannabidiol

  1. Obtener 150-200 M viables. sexta huevos y dietas artificiales basadas en germen de trigo (ver Tabla de Materiales).
  2. Coloque los huevos del gusano del cuerno en una placa de Petri de poliestireno con una capa de dieta artificial (AD) a base de germen de trigo y transfiera los huevos a una cámara de cría de insectos (consulte la Tabla de materiales) mantenida a 25 ° C con 40% -60% de humedad relativa.
  3. Permita que los huevos de gusano del cuerno del tabaco durante 1-3 días eclosionen dentro de la cámara de cría de insectos mantenida a 25 ° C con 40% -60% de humedad relativa.
  4. Prepare la solución madre de cannabidiol (CBD) (200 mM) agregando 1.26 g de aislado de CBD de >98% de pureza en 20 ml de aceite de EtOH (prueba de 200) o 100% de triglicéridos de cadena media (MCT) (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: El aislado de CBD es sensible a la luz, así que manipule en la oscuridad.
  5. Agregue 5 ml y 10 ml de la solución madre de CBD de 200 mM a los 1.000 g de AD para llevar las concentraciones finales de las dietas a 1 mM y 2 mM de CBD, respectivamente.
    NOTA: Asegúrese de que la dieta y la solución madre de CBD estén bien mezcladas hasta que se forme una mezcla completamente homogénea. Mezcle el AD que contiene existencias de CBD en una bolsa de plástico durante al menos 45 minutos a mano.
    PRECAUCIÓN: El mezclador de café o cualquier otro molinillo de metal parecía ser ineficaz.
  6. Dispense 20 g de los tres medios, control (AD), vehículo (AD + 0.1% de aceite EtOH o MCT) y medios que contengan CBD (AD + 0.1% de etOH o aceite MCT + 1 mM / 2 mM de CBD) en la parte inferior del tubo de 50 ml.
  7. Distribuya aleatoriamente las larvas de 1er instar (~ 2 mm de largo) individualmente en un tubo de ensayo de 50 ml y cúbralas con una tapa perforada o una gasa (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Coloque el tubo boca abajo y cultive insectos en una cámara de cría de insectos mantenida a 25 ° C con una humedad relativa del 40% al 60%.
  8. Cultivarlos dentro de una cámara de cría de insectos (ver Tabla de Materiales) mantenida a 25 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.

2. Mediciones del crecimiento larvario, el consumo de dieta y la mortalidad de M. sexta

  1. Mida el crecimiento larvario (es decir, el tamaño y el peso) con una balanza analítica y la mortalidad a intervalos de 2 días después de ser transferido a contenedores individuales hasta que se reconozca la pupación como la coloración marrón oscuro de una capa de exocutícula endurecida.
    1. Registre la masa inicial (en gramos) de cada grupo de larvas antes de introducir las larvas en sus respectivas dietas y reste la masa de las larvas en cada medición de la masa inicial para determinar las ganancias de masa entre las etapas de desarrollo de las larvas hasta que las larvas completen la etapa de pupación.
    2. Registre el número de días entre las etapas de desarrollo de instar para comprender las diferencias en el marco de tiempo de desarrollo entre las etapas de crecimiento de las larvas hasta la pupación en cada dieta.
      NOTA: Raspe la materia fecal del recipiente para evitar cualquier contaminación por moho. Recopile el asunto para futuras pruebas dependiendo de los propósitos del experimento (por ejemplo, cálculo de la tasa de acumulación de CBD, perfil microbiano). Es importante manejar cuidadosamente el insecto durante los períodos frágiles de apólisis o ecdisis. Al sacar de las larvas de un recipiente, agarre suavemente el cuerpo principal del insecto con una punta plana y fórceps anchos y no fuerce a eliminar la capa externa de piel cuando un insecto esté en proceso de desprendimiento.
  2. Medir el consumo de dieta31 pesando la pérdida de dieta del recipiente entre larvas de 1ª instar y pupación. Registre los gramos iniciales de dieta al comienzo del experimento y reste la cantidad inicial de la cantidad restante de dieta cuando las larvas entraron en la etapa de pupación completa.
    NOTA: La materia fecal debe excluirse de la medición de la dieta. La materia fecal y otros desechos (es decir, desprendimientos de piel) se pueden eliminar fácilmente de los medios colocando el recipiente boca abajo.
  3. Para las mediciones de movilidad, permita que el insecto sometido aclimate el entorno de la cámara durante al menos 5 minutos y rastree las distancias31 que tres grupos de insectos de 5º instar (80-100 mm de longitud) recorrieron utilizando una cámara de acondicionamiento del miedo automatizada y computarizada (ver Tabla de materiales).
  4. Analice la respuesta de movilidad31 a través de vídeo grabado a 60 fotogramas/s durante 5 min utilizando un software de detección de movimiento (ver Tabla de Materiales) que genera un índice de movimiento.

3. Análisis estadístico

  1. Analizar las diferencias en el crecimiento larvario (es decir, tamaño y peso) y el índice de movimiento por ANOVA unidireccional con el post-test de Tukey32.
  2. Utilice la prueba log-rank (Mantel-Cox)33 para las comparaciones de la curva de supervivencia.
    NOTA: Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando software de análisis estadístico (ver Tabla de Materiales).

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Representative Results

Manduca sexta como sistema modelo para examinar la toxicidad de los cannabinoides
La Figura 1 muestra los componentes clave del experimento de CBD utilizando el gusano del tabaco Manduca sexta. Un gran número de insectos (>20) se criaron individualmente a 25 ° C en un ciclo de 12 h: 12 h = luz: oscuridad. El tamaño, el peso y la mortalidad de los insectos se midieron a intervalos de 2 días para monitorear las respuestas a corto y largo plazo después del tratamiento con dosis altas de CBD (2 mM).

La Figura 2 muestra los efectos adversos del CBD en el crecimiento y desarrollo del insecto. Los insectos criados con una dieta artificial (EA) mostraron el mejor rendimiento de crecimiento. El control del vehículo que utilizó aceite de triglicéridos de cadena media (MCT) al 0,1% como agente disolvente para el aislado de CBD también mostró un crecimiento normal sin ningún efecto perjudicial. Sin embargo, una dosis alta de CBD (2 mM) indujo la pérdida de peso (Figura 2C) y condujo a una tasa de mortalidad más alta que las de los grupos de control y vehículos (Figura 2D).

En el día 24, el tamaño promedio de las larvas alimentadas con EA fue de 63,9 mm (n = 20-22). Sin embargo, el tamaño de las larvas criadas en AD que contenían 2 mM de CBD fue de 50,7 mm, que era ~ 21% más pequeño que las larvas cultivadas en AD (línea roja en la Figura 2C)31. En el día 24, el peso promedio de las larvas criadas en AD fue de 6,5 g, que fue 2,2 veces mayor que el de las larvas criadas en AD con 2 mM de CBD (n = 12-16, p < 0,00001)31. En particular, la alta dosis de CBD (2 mM) aumentó significativamente la tasa de mortalidad hasta en un 40%, mientras que los grupos de control y vehículos mostraron solo una tasa de mortalidad del 20% (Figura 2D)31. Los resultados indicaron que la alta dosis de CBD (2 mM) en la dieta es perjudicial para el desarrollo de insectos y se correlaciona con el aumento de la mortalidad.

Manduca sexta como sistema modelo para explorar funciones terapéuticas desconocidas de los cannabinoides
La Figura 2 mostró que el sistema modelo de insectos monitorea efectivamente cualquier efecto perjudicial del CBD al monitorear sus cambios morfológicos y fisiológicos. El resultado preliminar indicó que el etanol >1% (EtOH) está relacionado negativamente con su crecimiento, movilidad, consumo de dieta y tasa de supervivencia. Para examinar si el CBD mejora la movilidad y el comportamiento de alimentación de los insectos en las larvas de M. sexta intoxicadas por EtOH, se midió la cantidad total de dieta consumida por los insectos y la distancia que viajaron durante 10 minutos de insectos cultivados en tres condiciones de alimentación (AD, AD + 1% EtOH y AD + 1% EtOH + 1 mM CBD). La Figura 3A muestra que M. Las larvas sexta criadas con EA que contienen 1 mM de CBD consumieron al menos 3,1 veces mayor masa dietética que las criadas con dieta etOH añadida31. Sin embargo, el consumo dietético de los insectos criados en 2 mM de medios añadidos con CBD no fue significativamente diferente al de las larvas criadas en dietas solo etOH (p > 0,05)31.

También se rastreó la movilidad larvaria para examinar si el CBD afectaba su movilidad cuando estaba intoxicado con EtOH. El índice móvil se presenta como el porcentaje (%) de congelación. La Figura 3B compara el índice móvil de M. sexta larvas criadas en diferentes condiciones. Los resultados muestran que el 1% de larvas tratadas con EtOH no afectaron la movilidad (p > 0,05). La administración de CBD de 1 mM tampoco afectó la movilidad (p > 0,05)31. Los tratamientos con EtOH al 2% resultaron ser letales para las larvas de M. sexta ; por lo tanto, no se registró ningún índice de movilidad. Con la adición de la alta dosis de CBD (2 mM) en la EA que contiene un 2% de EtOH, la movilidad se mantuvo baja (80% de congelación)31.

Figure 1
Figura 1: El proceso resumido del uso de orugas Manduca sexta del gusano del tabaco en el estudio del cannabidiol. (A) Huevos de gusano del cuerno eclosionados en un recipiente grande separado con una capa de dieta artificial. (B) Se utilizó una jeringa para llenar el recipiente para evitar que cualquier dieta se pegue a los lados de los recipientes. (C) Un 2º gusano de tabaco instar en un tubo de ensayo de 50 ml con gasa. (D) Un 3er gusano del tabaco instar. (E) La longitud del gusano del cuerno (mm) y el peso (g) se midieron en una escala. (F) 5º gusano del tabaco instar que sufre ecdisis y está listo para la pupación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Efectos del cannabidiol (CBD) en el crecimiento y la mortalidad del gusano del tabaco Manduca sexta. (A) Orugas del gusano del cuerno del tabaco en 5º, 3º instar y pupación temprana. El tamaño (B), el peso (C) y la mortalidad (D) de M. sexta cuando se alimenta con dieta artificial (EA), EA + 0,1% de triglicéridos de cadena media (MCT) y AD + 0,1% de MCT + 2 mM de CBD. Para los análisis estadísticos sobre el crecimiento y la tasa de supervivencia de los insectos, se utilizó un ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey (n = 20-22, p < 0,05) y la prueba de Mantel-Cox (n = 20-22, p < 0,05), respectivamente. La figura está adaptada de Reference31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Los efectos del cannabidiol (CBD) en el comportamiento y la movilidad de los insectos en la alimentación. (A) Consumo dietético de orugas del gusano del cuerno del tabaco criadas en dieta artificial (AD), AD + 1-2% de etanol (EtOH) y AD + 1-2% de EtOH + 1-2mM de CBD (ANOVA unidireccional, comparación múltiple de Tukey en p < 0.05). B) Movilidad de insectos. La movilidad se representa como congelación %. indica p < 0,01. La figura está adaptada de Reference31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El estudio de alimentación demostró que altas dosis de CBD (2 mM) inhibieron el crecimiento del insecto y aumentaron la mortalidad31. El modelo de insecto también mostró sensibilidad al etanol; sin embargo, el CBD destoxicó efectivamente la toxicidad del etanol, aumentando su tasa de supervivencia, consumo de dieta y comportamientos de búsqueda de alimentos a niveles similares al grupo de control (Figura 3A, B)31. El sistema modelo de insectos descrito se compone de tres pasos críticos: (1) garantizar que los huevos de M. sexta eclosionen de manera uniforme en tamaño y tiempo, (2) preparar los medios de crecimiento que se mezclan homogéneamente con cannabinoides a una concentración específica, y (3) mantener los medios de crecimiento libres de contaminación por hongos mientras se mantiene el nivel de humedad ideal en 40% -60%. El sistema de modelo de insectos nos permitió abordar la cuestión de la investigación en un plazo de 25 días, desde la preparación de los medios hasta la recopilación e interpretación de datos. Lo más importante es que el sistema de insectos produjo resultados consistentes a partir de especímenes grandes.

Para asegurar el éxito de las larvas cultivadas de M. sexta , es esencial mantener la humedad relativa en un 40%-60% dentro del recipiente. Si un recipiente no contiene la alta humedad, una dieta artificial que contenga los cannabinoides se desecará rápidamente, causando la terminación temprana del experimento debido a la muerte de los insectos. Sin embargo, en un sistema cerrado, la alta humedad proporciona una condición ideal para el brote de hongos, que es difícil de erradicar. Los autores sugieren usar una tapa perforada o una gasa para suministrar suficiente circulación de aire al tiempo que minimiza la pérdida de agua de los medios. En un entorno natural, las orugas prefieren alimentarse en el lado abaxial de una hoja donde la humedad es mayor mientras que presentan menos tricomas que la superficie de la hoja34. Por lo tanto, colocar un recipiente boca abajo fue excepcionalmente útil al tiempo que proporcionaba un área de refugio o un palo de madera que se arrastraba. Esto también ayuda a eliminar la materia fecal del área de los medios y facilita la recolección de los desechos para ensayos adicionales.

Como los receptores cannabinoides están ausentes en los invertabrados35, el gusano del tabaco M. sexta podría no ser adecuado para estudios terapéuticos mediados por el sistema endocannabinoide. Sin embargo, con los numerosos beneficios demostrados en nuestro estudio piloto, el insecto debe considerarse un nuevo sistema modelo para investigar las funciones farmacológicas de los cannabinoides, particularmente los estudios que involucran farmacocinética no mediada por receptores CB. El ciclo de vida relativamente corto de M. sexta permite a los investigadores comprender los impactos de una dieta que contiene cannabinoides durante múltiples generaciones, lo que permite un diseño experimental en organismos modelo de mamíferos superiores.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Investigación de Cannabis de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo y el Ministerio de Ciencia y TIC (2021-DD-UP-0379), y la ciudad de Chuncheon (I + D e industrialización del cáñamo, 2020-2021).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Analytic balance Mettler Instrument Corp. AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%) Lilu's Garden
Cheesecloth VWR INTERNATIONAL 470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes VWR 89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof Sigma-Aldrich EX0276-1
Fear conditioning chamber Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber Darwin Chambers INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil Walmart
Motion detection software (Actimetrics) Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) VWR INTERNATIONAL 688161
Tobacco hormworm artificial diet Carolina Biological Supply Company Item # 143908 Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs Carolina Biological Supply Company Item # 143880 Unit of 30-50

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References

  1. Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
  2. Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
  3. Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
  4. Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
  5. Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
  6. Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
  7. Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
  8. de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
  9. Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
  10. Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
  11. Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
  14. Trophoblast. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021).
  15. Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
  16. Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
  17. Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
  18. Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
  19. Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
  20. Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
  21. Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
  22. Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
  23. Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
  24. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  25. Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
  26. Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
  27. Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
  28. Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. Insect Models for Biomedical Research. , CRC Press. 61-72 (1989).
  29. He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
  30. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  31. Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
  32. Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  33. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  34. Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
  35. McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. Cannabinoid receptors in invertebrates. Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).

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Biología Número 178 Cannabis Cannabis sativa Cannabinoides Gusanos del tabaco Manduca sexta
El gusano del cuerno del tabaco como sistema modelo de insectos para estudios preclínicos de cannabinoides
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Park, S. H., Koch, S., Richardson, K., Pauli, C., Han, J. H., Kwon, T. H. Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies. J. Vis. Exp. (178), e63228, doi:10.3791/63228 (2021).

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