Summary
在这里，我们描述了在特定的糖基转移酶或含有糖基转移酶的区域中 构建气单胞菌 的零突变体，进行运动性测定和鞭毛纯化以确定其编码酶在聚糖生物合成中的参与和功能，以及该聚糖在细菌发病机制中的作用。
Abstract
原核生物糖基化的研究是一个快速增长的领域。细菌在其表面上具有不同的糖基化结构，其聚糖构成菌株特异性条形码。与真核生物相比，相关的聚糖在糖组成和结构上表现出更高的多样性，并且在细菌 - 宿主识别过程和与环境的相互作用中很重要。在致病细菌中，糖蛋白已参与感染过程的不同阶段，聚糖修饰会干扰糖蛋白的特定功能。然而，尽管在理解聚糖组成，结构和生物合成途径方面取得了进展，但对糖蛋白在致病性或与环境相互作用中的作用的理解仍然非常有限。此外，在一些细菌中，蛋白质糖基化所需的酶与其他多糖生物合成途径共享，例如脂多糖和胶囊生物合成途径。糖基化的功能重要性已在几种细菌中阐明，通过突变被认为参与糖基化过程的特定基因，并研究其对目标糖蛋白和修饰聚糖表达的影响。嗜温 性气单胞菌 具有单一和 O-糖基化的极性鞭毛。鞭毛聚糖在 气单胞菌 菌株之间显示出碳水化合物成分和链长的多样性。然而，迄今为止分析的所有菌株都显示假氨基酸衍生物作为修饰丝氨酸或苏氨酸残基的连接糖。假鞭毛组装需要假单胞菌酸衍生物，其损失对粘附、生物膜形成和定植有影响。本文中详述的方案描述了如何使用零突变体的构建来了解含有假定糖基转移酶的基因或基因组区域在鞭毛聚糖的生物合成中的参与。这包括了解所涉及的糖基转移酶的功能和聚糖的作用的潜力。这将通过将缺乏聚糖的突变体与野生型菌株进行比较来实现。
Introduction
蛋白质糖基化已在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌中均有描述，并且由聚糖与氨基酸侧链1，2的共价连接组成。在原核生物中，该过程通常 通过 两种主要的酶机制发生： O- 和 N-糖基化3。在 O-糖基化中，聚糖连接到丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基的羟基上。在 N-糖基化中，聚糖附着在三肽序列Asn-X-Ser/Thr中的天冬酰胺（Asn）残基的侧链酰胺氮上，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸。
聚糖可以采用线性或支链结构，由糖苷键共价连接的单糖或多糖组成。在原核生物中，与真核聚糖4相比，聚糖通常显示出糖组成和结构的多样性。此外，已经描述了两种不同的细菌糖基化途径，它们在聚糖如何组装和转移到受体蛋白方面有所不同：序贯和 整体 糖基化5，6。对于顺序糖基化，复合聚糖通过连续添加单糖直接在蛋白质上建立。在 整体 糖基化中，预组装的聚糖通过专门的寡糖转移酶（OTase）从脂质连接的低聚糖转移到蛋白质中。这两种途径已被证明参与 N- 和 O-糖基化过程7。
蛋白质糖基化在调节蛋白质的物理化学和生物学特性方面具有作用。聚糖的存在可以影响蛋白质与其配体的相互作用，从而影响蛋白质的生物活性，但也可以影响蛋白质的稳定性，溶解度，对蛋白水解的易感性，免疫原性和微生物 - 宿主相互作用8，9。然而，一些糖基化参数，如聚糖的数量，聚糖组成，位置和附着机制，也可能影响蛋白质的功能和结构。
糖基转移酶（GTs）是复合聚糖和糖偶联物生物合成的关键酶。这些酶催化来自活化的供体分子和特定底物受体的糖部分之间的糖苷键形成。GT可以使用核苷酸和非核苷酸作为供体分子，并靶向不同的底物受体，例如蛋白质，糖类，核酸和脂质10。因此，在分子水平上了解GT对于确定其作用机制和特异性非常重要，并且还可以了解修饰相关分子的聚糖的糖组成如何与致病性相关。碳水化合物活性酶数据库（CAZy）11 根据其序列同源性对GT进行分类，这提供了一种预测工具，因为在大多数GT家族中，结构折叠和作用机制是不变的。然而，四个原因使得难以预测许多GT的底物特异性：1）在原核生物中没有确定底物特异性的明确序列基序12，2）许多GT和OT酶显示底物混杂性13，14，3）功能性GT难以以重组形式高产地产生;4）供体和受体底物的鉴定很复杂。尽管如此，最近的诱变研究使得在理解催化机制和减去GT结合方面取得了重大进展。
在细菌中，O-糖基化似乎比 N-糖基化更普遍。 O-糖基化位点不显示一致序列，许多 O-糖基化蛋白是分泌的或细胞表面蛋白，如鞭毛，毛利或自转运蛋白1。鞭毛蛋白糖基化显示受体位点数量、聚糖组成和结构的变异性。例如， Burkholderia spp鞭毛虫只有一个受体位点，而在 空肠弯曲杆菌中，鞭毛林具有多达19个受体位点15，16个。此外，对于某些细菌，聚糖是单一单糖，而其他细菌具有由不同单糖破坏形成寡糖的异质聚糖。这种异质性甚至发生在同一物种的菌株中。鞭毛虫杆菌 仅由假氨基酸（PseAc）17修饰，鞭毛 弯曲杆菌 可以通过PseAc（假氨基酸（PseAm）或军团胺酸（LegAm）的乙酰脒形式）和从这些糖中提取的聚糖与乙酰基， N-乙酰葡糖胺或丙酸取代物18，19进行修饰。在 气单胞菌中，鞭毛被聚糖修饰，其组成范围从单个PseAc酸衍生物到杂多糖20，并且聚糖与鞭毛蛋白单体的连接总是 通过 PseAc衍生物。
一般来说，鞭毛的糖基化对于鞭毛细丝组装、运动性、毒力和宿主特异性至关重要。然而，虽然C. jejuni16，H. pylori17和Aeromonas sp的鞭毛。21不能组装成长丝，除非蛋白质单体被糖基化，假单胞菌属和伯克霍尔德菌属。15 不需要糖基化来组装鞭毛。此外，在一些空肠衣原体菌株中，鞭毛聚糖的糖组成的变化会影响细菌 - 宿主的相互作用，并可能在逃避某些免疫反应中发挥作用16。自凝集是另一种表型特征，受与鞭毛林相关的聚糖组成的修饰的影响。较低的自凝集导致形成微菌落和生物膜22的能力降低。在一些细菌中，鞭毛触发促炎反应的能力与鞭毛蛋白糖基化有关。因此，在铜绿假单胞菌中，糖基化的鞭毛蛋白诱导比未烷基化23更高的促炎反应。
气单胞菌是环境中无处不在的革兰氏阴性细菌，这使得它们能够位于所有One Health组件24的界面处。嗜中性气单胞菌具有单一的极性鞭毛，其构成性地产生。超过一半的临床分离物也表达侧鞭毛蛋白，在高粘度介质或平板中诱导。不同的研究将两种鞭毛类型与细菌发病机制的早期阶段联系起来25。虽然迄今为止报道的极性鞭毛在5-8 Ser或Thr残基的中枢免疫原性结构域处呈O-糖基化，但侧鞭毛林在所有菌株中均未O-糖基化。尽管来自不同菌株的极性鞭毛聚糖在其碳水化合物组成和链长20上显示出多样性，但连接糖已被证明是一种假单胺酸衍生物。
本手稿的目的是描述一种在含有GT的特定GT或染色体区域获得零突变体的方法，以分析它们在相关多糖的生物合成和细菌致病性中的参与，以及聚糖本身的作用。例如，我们鉴定并删除了含有 气单胞菌 GT的染色体区域，以确定其参与极性鞭毛蛋白糖基化并分析鞭毛蛋白聚糖的作用。我们展示了如何删除特定的GT以建立其在该聚糖的生物合成中的功能和修饰聚糖的作用。虽然以 气单胞菌 为例，但该原理可用于鉴定和研究其他革兰氏阴性菌的鞭毛糖基化岛，并分析参与其他聚糖（如O-抗原脂多糖）生物合成的GT的功能。
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Protocol
该过程的示意图如图 1所示。
1. 气单胞菌中鞭毛糖基化岛（FGIs）的生物信息学鉴定
- 要鉴定气单胞菌基因组中的PseAc生物合成簇，请使用NCBI数据库26中的tblastn工具。首先，从测序气单胞菌菌株的数据库中检索拟南芥AH-3的PseC和PseI（识别码为OCA61126.1和OCA61113.1）的直系蛋白，然后使用tblastn工具搜索其翻译的核苷酸序列。
注意： pse 基因位于 气单胞菌 GGI的两侧， pseB 和 pseC 位于簇的一端， pseI 位于另一端。其余的 pse 基因的位置可能因FGI组而异。 - 鉴于许多菌株的那些极性鞭毛蛋白基因与FGI相邻，请使用NCBI数据库中的 tblastn 来查找A . piscicola AH-3的极性鞭毛林FlaA和Flab的直系蛋白质（识别代码为OCA61104.1和OCA61105.1）以及编码它们的基因。
- 此外，参与杂多糖聚糖生物合成的 气单胞菌 FGIs（II组）27 含有几种编码参与脂肪酸合成的酶的基因，如 luxC 和 luxE。使用NCBI数据库中的 tblastn 来查找 A. piscicola AH-3（识别码为OCA61121.1）的LuxC直系蛋白以及编码它的基因。
2. 鞭毛糖基化岛基因中零突变体的产生
注意：这种诱变方法基于使用自杀载体pDM428 （GenBank：KC795686.1）的聚合酶链反应（PCR）帧内缺失产物的等位基因交换。pDM4载体的复制是λ pir 依赖性的，并且通过利用位于载体上的 sacB 基因来强制完全等位基因交换。
- 构建PCR帧内缺失产物。
- 设计两对引物，扩增要删除的选定基因或区域的上游（A和B引物）和下游（C和D引物）的DNA区域（图2B）。
- 确保引物A和D的上游和停止的上游分别超过600 bp，要删除的基因。这两种引物需要在5'末端包括一个内切酶的限制性位点，该位点允许在pDM4中克隆。
注意：A和D引物5'末端包含的限制性位点不应与AB或CD扩增子中的位点相同。 - 确保引物B和C分别位于要删除的基因内或要删除的区域的第一个和最后一个基因内。确保两个引物（B和C）都在框架内，并且位于基因内的5-6个密码子之间。此外，确保两种引物在5'末端包括一个21 bp互补序列（表1），该序列允许加入DNA扩增子AB和CD。
- 在5mL胰蛋白酶大豆汤（TSB）中在30°C下过夜（O / N）中生长选定的 气单胞菌 菌株。 使用市售试剂盒进行基因组DNA纯化，并按照制造商的说明进行操作（材料表）。使用分光光度计定量2μL纯化的DNA。
注意：使用双蒸馏水作为空白，仪器设置为在260nm处记录吸光度。用2μL纯化的DNA记录吸光度3-5次，并计算平均吸光度读数。使用Beer-Lambert定律计算DNA浓度，其中A = Ɛ.c.l.，其中“A”是吸光度，“Ɛ”是DNA的摩尔平均消光系数，“c”是DNA浓度，“l”是路径长度（参考制造商对每种仪器的路径长度的说明）。 - 使用100 ng纯化的染色体DNA作为两组不对称PCR的模板，使用A-B和C-D引物（材料表）。使用 A：B 和 D：C 引物对的摩尔比为 10：1（补充材料）。
注意：非对称PCR允许模板的一条链优先扩增多于另一条链。 - 通过在1%琼脂糖凝胶中电泳分析PCR产物。使用TAE（40 mM三醋酸三酯，1 mM EDTA）作为凝胶电泳缓冲液，功率设置为8 V / cm。为了可视化DNA，将溴化乙锭（0.5μg/ mL）添加到凝胶中，并使用生物成像站可视化PCR产物（材料表）。
- 使用手术刀从凝胶中切除扩增子，按照制造商的协议（材料表）进行纯化并对其进行量化。
- 通过PCR产物3'末端的21 bp重叠序列加入AB和CD扩增子（图3）。将PCR管中每个扩增子（AB和CD）与PCR试剂（AD前PCR）混合100ng，但不使用引物，并使用热循环程序（补充材料）进行扩展。然后，向反应（AD PCR）中加入100μM的A和D引物并作为单个片段（补充材料）扩增。
- 使用步骤2.1.6中描述的条件在1%琼脂糖凝胶中电泳分析PCR产物（AD扩增子），从凝胶中切除扩增子，按照制造商的方案纯化并量化扩增子（材料表）。
- 构建具有帧内缺失的pDM4重组质粒。
- 在30°C下用氯霉素（25μg/ mL）在Luria-Bertani（LB）米勒肉汤（10mL）中培养含有pDM4 的大肠杆菌 cc18λ pir 的O / N培养物。
- 在4°C下以5，000× g 旋转培养物，并将沉淀悬浮在600μL无菌蒸馏水中。按照供应商的说明，使用市售质粒纯化试剂盒进行质粒pDM4的提取和纯化（材料表）。
- 消化1μgpDM4和400ngAD扩增子2小时，内切酶能够消化AD扩增子的两端和pDM4的克隆位点（图3）。遵循酶制造商的反应条件方案（材料表）。
- 使用DNA纯化试剂盒纯化消化的质粒和扩增子，并按照制造商的说明对其进行定量（材料表）。
- 为了防止线性化pDM4的重新连接，请按照制造商的说明使用碱性磷酸酶从两个5'末端除去磷酸基（材料表）。然后，按照步骤2.1.4（材料表）中所述，清理处理后的质粒并使用分光光度计对其进行定量。
- 将150ng的消化和磷酸酶碱性处理的pDM4与95-100ng的消化AD扩增子以1：4的摩尔载体：插入物比组合。按照制造商的说明（材料表）以15μL的体积制备连接反应。
- 在20°C或周末在4°C孵育O / N。 孵育后，在70°C下灭活T4连接酶20分钟。
- 使用连接通过电穿孔将质粒引入 大肠杆菌 MC1061λpir 菌株中。使用电拮抗菌和2 mm间隙电穿孔比色皿。
- 电拮抗 大肠杆菌 的制备及pDM4重组质粒的电穿孔
- 将单个 菌落的大肠杆菌 MC1061λpir 菌株接种到Luria-Bertani（LB）米勒肉汤中，并在30°C下以200rpm振荡生长O / N。
- 在18mL LB肉汤中稀释2mL细菌培养物，并在30°C下振荡（200rpm）孵育，直到达到0.4-0.6之间的光密度（OD 600）。
- 通过在5，000× g 和4°C下离心15分钟来沉淀细菌培养物。弃去上清液并将沉淀悬浮在40mL冷藏蒸馏H2O中。
- 再重复此清洁步骤两次以除去所有培养盐。最后，将沉淀悬浮在4 mL冷藏蒸馏H2O中，并将1 mL悬浮液转移到四个锥形1.5 mL微量离心管中。
- 通过在14，000× g 和4°C下离心5分钟来沉淀细菌培养物。在不干扰沉淀的情况下除去上清液，并将每个沉淀悬浮在100μL冷却蒸馏H2O中。
- 向每个管中加入3-3.5μL连接混合物，并在冰上孵育5分钟。然后，将每个管的内容物转移到冷却的2 mm间隙电穿孔比色皿中，并施加2 kV，129 Ω，时间常数约为5 ms。
注意：在冰上预冷却电穿孔比色皿。在整个过程中保持细菌在冰上。 - 电穿孔后，向四个比色皿中的每一个中加入250μLSOC培养基以恢复其内容物，将它们转移到培养管（约1mL）中，并在30°C下振荡（200rpm）孵育1小时。
- 将转化后的细胞接种在补充氯霉素（25μg/ mL）的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，以确保在平板中生长的所有菌落都具有质粒主链。
- 用氯霉素从LB琼脂平板中挑选一些菌落，并在30°C下孵育O / N。 当菌落生长时，使用pDM4克隆侧两侧的引物：pDM4for和pDM4rev（表1），并通过PCR检查缺失构建体在pDM4中的插入，并以裂解菌落为模板（补充材料）。
- 用无菌牙签选择一个菌落，并将其浸入含有15μL 1%Triton X-100，20mM Tris-HCl pH 8.0，2mM EDTA pH 8.0的1.5mL管中。将管在100°C下孵育5分钟，然后在冰上孵育1分钟。
- 在12，000× g 的微量离心管中旋转10分钟以沉淀细菌和碎片。在PCR反应中使用1μL上清液作为模板（材料表）。引物副的退火温度为50°C，PCR反应需要10%DMSO（补充材料）。
- 用氯霉素（25μg/ mL）接种在10mLLB肉汤中扩增目标产物的菌落，并在30°C下生长O / N。 按照步骤2.2.1-2.2.2中所述从培养物中提取质粒。按照制造商的说明使用pDM4引物进行测序（材料表）。
- 将帧内删除传输到 Aeromonas 应变
注：pDM4重组质粒必须引入所选的 Aeromonas 三心交配引起的应变（图 4). Aeromonas 菌株必须耐利福平，才能在三心肠交配后选择。因此，在30°C下在TSB上生长选定的菌株O / N，在5，000 x下离心2 mL，4 mL和6 mL培养物 g 15分钟，将每个沉淀悬浮在100μLTSB中，并用利福平（100μg/ mL）在TSA中平板。- 用25μg/mL氯霉素（供体菌株）在LB琼脂上用pDM4重组质粒制备 大肠 杆菌MC1061λpir的O / N培养物，用100μg/ mL利福平（受体菌株）对TSA耐药 的气单胞菌 菌株利福平，以及在30°C下用80μg/ mL大观霉素（辅助菌株）在LB琼脂上制备pRK2073质粒 的大肠杆菌 HB101。
- 当菌落生长时，用无菌牙签在三根LB管中用150μL LB轻轻地悬浮相同数量的菌落（10-15个菌落）供体，受体和辅助菌株。
- 然后，在没有抗生素的情况下，在LB琼脂平板上，将三种细菌悬浮液在受体上混合成两滴：辅助者：供体比例为5：1：1（受体50μL，供体10μL和辅助者10μL）。在30°C下将板正面朝上O / N孵育。 使用供体菌株对偶联进行阴性对照，而不使用重组质粒。
注意：辅助菌株携带结合质粒pRK2073并协助pDM4转移到 气单胞菌中。不要使用涡旋暂停供体，受体和辅助菌株，以避免破坏皮球。 - 通过加入1 mL LB肉汤并用无菌玻璃撒布机铺展，从LB琼脂平板中收获细菌，以获得细菌悬浮液。使用移液器将细菌悬浮液转移到锥形1.5 mL微量离心管中并剧烈涡旋。
- 为了选择含有pDM4重组质粒的受体菌落，将收获的细菌悬浮液板100μL放在LB琼脂平板上，用利福平（100μg/ mL）和氯霉素（25μg/ mL）放置。
- 在5，000× g 的微量膨胀中旋转200μL和600μL样品15分钟，将沉淀悬浮在100μLLB肉汤中，并将板放在LB琼脂上，用利福平（100μg/ mL）和氯霉素（25μg/ mL）。将所有板在30°C下孵育24-48小时。
- 拿起生长的菌落，用利福平（100μg/ mL）和氯霉素（25μg/ mL）转移到LB平板上，并在30°C下孵育O / N。 然后，通过氧化酶测试29确认菌落是气单胞菌，并且使用E和F引物（补充材料）通过PCR将pDM4重组质粒插入（第一次重组）到特定的染色体区域中，其结合在用A和D引物扩增的区域之外（材料表）。如步骤2.3.11所述，使用1μL裂解菌落作为模板。
- 为了完成帧内缺失的等位基因交换，将整合的自杀质粒的集落强制进行第二次重组。在2mL LB中用10%蔗糖和不含抗生素，在30°C下O / N中生长重组菌落。
- 将步骤2.4.8的细菌培养物的100μL板用蔗糖（10%）放在LB琼脂平板上。另外，板100μL不同的培养稀释液（10-2-10-4）并在30°C下孵育O / N。
- 为了确认pDM4的丢失，拿起菌落，转移到有和不含氯霉素（25μg/ mL）的LB平板上，在30°C下孵育O / N，然后选择氯霉素敏感菌落。
- 使用E-F引物对和1μL裂解菌落作为模板，通过PCR分析敏感菌落（材料和补充材料表）。选择其PCR产物与已删除构建体的大小相关的菌落。
3. 动力测定
注意：在一些具有糖基化鞭毛的细菌物种中，糖基化或聚糖组成水平的改变会影响鞭毛林的组装，这通常反映为运动性降低或缺乏运动性。因此，对零突变体进行了两次运动性测定。
- 液体培养基中的动力测定
- 培养 气单胞菌 菌株O / N在25-30°C下在1mL TSB中。 要将显微镜盖玻片粘附在挖掘的载玻片上，请用牙签尖端拿起少量硅胶，并在盖玻片的四个角上滴一小滴。然后，将1μL 气单胞菌培养物 沉积在盖玻片的中间，并在一滴新鲜的TSB培养基（2μL）中混合。
- 将挖掘出的载玻片放在盖玻片上。将挖掘与沉积的液滴相匹配，轻轻按压，然后将滑块倒置。
- 使用光学显微镜（材料表）通过光学显微镜分析游泳运动性，使用浸油的物镜为100倍。
注意： 必须使用野生型气单胞菌 菌株作为阳性对照。作为阴性对照，使用非鞭毛细菌，如 克雷伯菌。
- 半固体介质中的运动性测定
- 在25-30°C下培养 气单胞菌 菌株TSB（1 mL）中的O / N。 然后，将3μL培养物转移到软琼脂平板（1%胰蛋白酶，0.5%NaCl，0.25%bacto琼脂）的中心，并在25-30°C下将板面朝上O / N孵育。
- 使用尺子测量细菌通过琼脂从板的中心向外围的迁移。
4. 鞭毛纯化
- 锚定在细菌表面的鞭毛的分离
- 培养 气单胞菌 菌株在25-30°C下在TSB（10 mL）中。 然后，将培养物膨胀到具有TSB（900mL）的烧瓶中，并使其在25-30°C下振荡（200rpm）生长O / N。
- 在4°C下以5，000× g 离心20分钟。 将沉淀悬浮在20mL的100mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.8）中。
- 为了去除锚定的鞭毛，用玻璃棒（直径2-3毫米）在涡旋中剪切悬浮液3-4分钟，然后重复（至少六次）通过21-G注射器。
- 通过在4°C下连续两次离心来沉淀细菌：首先，在8，000× g 下沉淀30分钟。除去上清液并以18，000× g 离心20分钟。收集含有游离鞭毛的上清液。
- 在4°C下以100，000× g 超速离心上清液1小时，并将沉淀悬浮在150μL100mM Tris-HCl（pH 7.8）加2mM EDTA缓冲液中。颗粒含有鞭毛细丝。
- 通过在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳分析步骤4.1.5中重悬的5-10μL沉淀，并使用考马斯蓝色染色可视化蛋白质。
注意：按照制造商的说明进行蛋白质电泳和凝胶染色。作为糖基化鞭毛蛋白的阳性对照，使用野生型菌株的纯化鞭毛。在氯化铯（ClCs）梯度中纯化鞭毛的富集部分。
- 氯化铯梯度纯化鞭毛。
- 将12.1克CsCl与27毫升蒸馏H2O混合。
- 将富含的鞭毛（150μL）转移到薄壁超透明管（14 mm x 89 mm）（材料表）中，并用12 mL CsCl溶液填充。
- 在摆动的桶形转子中以60，000 x g 在4°C下超速离心管48小时（材料表）。
- 用注射器将鞭毛带收集到CsCl梯度中，并透析100mM Tris-HCl（pH 7.8）加2mM EDTA。然后，通过在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶和考马斯蓝色染色（步骤4.1.6）中电泳或通过质谱法分析透析的鞭毛。
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Representative Results
该方法提供了一个有效的系统，可以在 气单胞菌 的基因或染色体区域中产生零突变体，这些突变体可以影响鞭毛糖基化和鞭毛丝的作用（图1）。
该协议从推定的GFI的生物信息学鉴定开始，编码GT的基因存在于该区域。在气单胞菌中，FGIs的染色体定位基于对三种基因的检测：参与拟氨基酸（pseI和pseC）生物合成的基因，极性鞭毛蛋白基因和luxC。其极性鞭毛被单个假阳酸衍生物糖基化的菌株，如嗜水性A. AH-130，在位于FGIs组I27的pse基因之间没有编码GT的基因。属于该FGI组的大多数菌株显示与该区域相邻的极性鞭毛蛋白基因。相比之下，其极性鞭毛与杂多糖聚糖糖基化的菌株，如A. piscicola AH-319，显示出编码luxC下游GT的不同基因，位于FGIs组II27的pse基因之间，并且它们并不总是与极性鞭毛蛋白基因相邻（图2A）。
参与鞭毛杂多糖聚糖生物合成的区域和其中所含的推定GT的功能通过构建零突变体得到证实。每个突变体的产生需要四种引物：A，B，C和D（表1）。引物B退火5-6个密码子的起始基因（fgi-4）或簇的第一个基因（fgi-1）的下游被删除，引物A退火从该基因的起始（fgi-4 或 fgi-1）上游600-800 bp退火。引物C退火的基因（fgi-4）的最后5-6个密码子的上游或簇的最后一个基因（fgi-12）的上游被删除，引物D退火从该基因的停止（fgi-4 或 fgi-12）下游退火600-800 bp（图2B）。用于删除 青 霉菌簇和青霉菌 AH-3的fgi-4 的引物 A 和D在其5'末端含有内切酶 BamHI的限制性位点（表1）。这种内切酶在 AB 或 CD PCR 片段中没有内部靶标。一个重要的步骤是B和C引物的设计。两者都必须在框架内，以免破坏要删除的基因或片段的开放阅读框架。B和C引物5'末端的21 bp互补序列允许产生具有3'末端互补序列的AB和CD扩增子，从而允许这些扩增子的连接和扩展。加入和扩展扩增子的PCR程序包括初始变性步骤和五个循环，退火温度为54°C（补充材料）。然后，添加A和D引物允许扩增扩展片段（图3）。 BamHI的酶促作用产生具有粘性末端的扩增子，与用 BglII消化的自杀载体pDM4的连接相容。
鉴于pDM4是 λpir 依赖性质粒，将连接产物电穿孔到 大肠杆菌 菌株MC1061λpir （thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir） 中，并在氯霉素平板中选择。pDM4没有选择重组克隆的直接系统，并且通过PCR分析了克隆区域两侧的pDM4引物对（pDM4for和pDM4rev）（表1 和 补充材料）的集落。以不含pDM4 的大肠杆菌 菌株MC1061λpir 作为PCR反应的阴性对照。
为了进行等位基因交换，将重组pDM4质粒转移到受体菌株A. piscicola AH-3。鉴于许多气单胞菌不能通过电穿孔转化，重组pDM4通过三心体交配通过共轭转移（图4）。为了选择反共轭菌落，我们使用利福平抗性受体菌株，该菌株允许从结合交配中选择气单胞菌菌株。此外，选定的菌落被提交给氧化酶测试，因为虽然气单胞菌是氧化酶阳性，但大肠杆菌是氧化酶阴性的。通过PCR与扩增区域（AB和CD片段）的外部引物（E和F引物）确认第一和第二次重组（表1，补充材料和图5A）。
在 气单胞菌中，极性鞭毛的糖基化对于鞭毛细丝的组装至关重要。使用具有缺失的GT基因或区域的细菌菌落的运动性测定来分析功能性极鞭毛的存在。光学显微镜测定显示，与野生型菌株相比，两种突变体在液体培养基中的游泳运动性均降低。此外，当在软琼脂上分析运动性时，两者都显示出相对于野生型菌株的径向扩张减少（图5B）。鉴于两种突变体都能够游泳，但相对于野生型菌株的运动性降低，它们的极性鞭毛被纯化，并在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分析鞭毛蛋白分子量。该分析表明，两种突变体的极性鞭毛剂的分子量低于野生型菌株（图5C），这表明鞭毛聚糖的改变。通过CsCl梯度纯化的鞭毛（图5C）将用于质谱测定，以鉴定聚糖组成和用于生物膜，粘附或其他测定的零突变体，以鉴定聚糖和聚糖组合物的作用。
图 1：此过程中使用的步骤概述。 方案中描述的识别鞭毛糖基化岛 气单胞菌 和参与聚糖生物合成的GT的过程方案。 请点击此处查看此图的大图。
图2：染色体区域的生物信息学检测和引物设计。 （A）在嗜水性A. hydrophila AH-1和A. piscicola AH-3中鉴定的染色体区域方案。嗜水性A. AH-1鞭毛糖基化岛是鞭毛聚糖仅具有假丹酸衍生物的菌株的代表，而A. piscicola AH-3鞭毛糖基化岛是其鞭毛聚糖是杂多糖的菌株的代表。以黑色表示的基因参与拟南芥酸的生物合成，而那些以黄色表示的基因是假定的GT。A和D引物中的蓝色盒子含有内切酶的限制性结合位点。B和C引物中的红色盒子包含21 bp互补序列。请点击此处查看此图的大图。
图3：描述构建PCR帧内缺失和连接自杀质粒pDM4的方法的方案。 MCS：多克隆位点，CmR：氯霉素耐药基因， sacB：编码 枯草芽孢杆菌 左旋糖化酶，其表达由蔗糖诱导，对革兰氏阴性菌致死，以及 mob： 动员基因。 请点击此处查看此图的大图。
图4：三心王星结合和用于等位基因置换的程序。 第一次重组是由于没有 λpir 进入 气单胞菌 菌株而发生的，并导致重组质粒整合到所选基因中。10%蔗糖诱导LB生长诱导二次重组，导致 囊B 基因的表达，质粒从染色体上切除。交叉后，野生型或突变基因可以保留在细菌染色体上。通过PCR和外部引物选择零突变体。RifR：利福平耐药;CmR：耐氯霉素;SpcR：耐大观霉素。 请点击此处查看此图的大图。
图5：零突变体的确认和极性鞭毛的表型分析。 （A）PCR与鱼苜蓿AH-3的fgi-4外部引物（EF引物）以确认氯霉素敏感菌落中第二次重组后的等位基因交换。WT巷： A. piscicola AH-3;泳道1-8：第二次重组的氯霉素敏感菌落;St： HyperLadder 1 Kb marker.泳道1-3和5-8显示具有野生型fgi-4基因的菌落作为泳道WT.泳道4显示具有已删除fgi-4基因的菌落。（B）在25°C下，双鱼芋AH-3和fgi区（AH-3ΔFgi）和fgi-4基因（AH-3ΔFgi-4）中的软琼脂和空突变体在25°C下的运动性。 尺寸标准（圣）。请点击此处查看此图的大图。
| 引物名称 | 在 5' 到 3' 方向上序列 | 用于 | ||
| A. piscicola AH-3 | ||||
| A-Flgi1 | CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA | fgi 突变体 | ||
| B-Flgi1 | CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCACCTCGAACTCGAAA | |||
| C-Flgi12 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA | |||
| D-Flgi12 | CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC | |||
| E-Flgi1 | ACCCGCTTCATTCGT | |||
| F-Flgi12 | TCCGATTTTCTGACTCAGGG | |||
| A-Fgi4 | CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA | fgi-4 突变体 | ||
| B-Fgi4 | CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATCTTGCCCCTGAT | |||
| C-Fgi4 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGATGGAGCTAATCACTCGTTT | |||
| D-Fgi4 | CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC | |||
| E-Fgi4 | ATTTCCCTGCCAAATACG | |||
| F-Fgi4 | CCTGCCAACAGGATGTAAG | |||
| pDM4 矢量 | ||||
| pDM4for | AGTGATCTTCCGTCACAGG | 插入 pDM4 矢量 | ||
| pDM4rev | AAGGTTTAACGG TTGTGGA | |||
表1：用于构建零突变体的引物。 引物B和C中的重叠区域带有下划线。 巴姆HI网站在引物A和D中加粗。
补充材料。 用于获得AB和CD扩增子的试剂和反应，用于扩展和获得AD扩增子的前AD和AD PCR，用于验证pDM4载体中缺失构建体插入的pDM4 PCR，以及用于验证第一次和第二次重组的EF PCR。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
该方法的关键早期步骤是鉴定参与鞭毛和推定GT糖基化的区域，因为这些酶显示出高度同源性并参与许多过程。公共数据库中 气单胞菌 基因组的生物信息学分析表明，该区域与极鞭毛区域2相邻，该区域包含许多菌株中的鞭毛蛋白基因，并含有参与拟南芥酸生物合成的基因27。这使得有可能制定检测 气单胞菌 中鞭毛糖基化岛的指南，该指南可用于识别鞭毛聚糖含有假单胺酸衍生物的其他细菌中的该区域。此外，尽管该方法描述了如何分析参与鞭毛糖基化的基因簇，但它也可用于研究编码蛋白质的基因，这些基因可能参与不同革兰氏阴性细菌的鞭毛形成，旋转或调节。
在PCR帧内缺失的产生中，B和C引物的设计也很重要。这些引物应定位于所选基因或区域的起始（B引物）和停止（C引物）下游的5-6个密码子，并且不应破坏开放的阅读框。此外，要考虑的一个重要因素是放大以产生AB和CD扩增子的同源区域的长度。该协议建议两个扩增子都包含每个600-800 bp的同源区域。较短的同源物区域使第一次重组更具挑战性。
气单胞菌 菌株不携带λ pir 基因，这是复制pDM4自杀质粒所必需的。因此，pDM4重组质粒必须整合到染色体DNA中。 在三心体交配后，重要的是要确定发生第一次重组的细菌菌落。这些菌落包含插入同源染色体区域的重组pDM4。重组集落的鉴定是使用PCR反应与靶向要删除的区域外部的引物（E和F引物）进行的。如果使用标准的DNA聚合酶，E-F引物只会导致野生型PCR产物的产生。该引物对不会在pDM4重组质粒已插入染色体DNA的细菌菌落中产生任何PCR产物。缺乏PCR产物是由于E和F引物的退火序列之间的距离。该距离不能被标准聚合酶放大。然而，其他因素也可以阻止PCR产物的形成。因此，可以通过用于长片段扩增的DNA聚合酶或使用由pDM4和外部引物组成的引物对的PCR反应来鉴定第一个重组集落。当大的遗传簇被删除时，野生型菌株中的扩增需要使用DNA聚合酶进行长片段扩增。具有第一次重组的细菌集落可以通过PCR与pDM4外部引物对来鉴定。然而，第一和第二重组通常同时产生，使pDM4具有野生型或重组后与缺失的基因。这导致氯霉素耐药菌落，其使用外部引物的PCR产生具有相同大小的野生型基因或小扩增子的扩增子，其与缺失的基因或片段相关。将显示具有正确重组插入片段的菌落与蔗糖一起孵育以除去未插入的pDM4。蔗糖诱导位于pDM4上的 sacB 基因的表达，pDM4编码革兰氏阴性细菌的致命酶。因此，只有缺乏自杀质粒的菌落才会在含有蔗糖的LB中生长。为了支持含有缺失基因的菌落的同一性，然后可以对用外部引物对扩增的片段进行测序。
在 气单胞菌 中实施这种帧内突变方法可以产生更稳定的零突变体，而无需修改下游基因的表达水平。其他方法，如插入抗生素盒，确保下游基因的转录，但表达水平可以修改。此外，该方法可以外推到其他靶基因和区域，包括其他革兰氏阴性细菌29，31，32，33。
在一些细菌菌株中，与鞭毛利素相连的聚糖的丢失或修饰可导致鞭毛组装的无法或鞭毛丝的不稳定，从而导致极性鞭毛运动性的降低。虽然在液体培养基中使用运动性测定很容易区分非运动表型和运动表型，但运动程度的差异可能难以量化。需要运动板测定来测量运动程度的差异。然而，一些细菌物种，包括许多嗜温性 气单胞菌 菌株，除了本构性极性鞭毛外，在高粘度介质或平板中生长时表达可诱导的侧鞭毛。两种鞭毛类型都有助于半固体板中的细菌运动。因此，极性或侧鞭毛的修饰仅导致迁移直径的减小。因此，AH-3ΔFgi和AH-3ΔFgi-4突变体仅显示出相对于野生型菌株的运动性降低。为了更好地评价极鞭毛旋转产生的运动性，应不仅将零突变体的膨胀直径与野生型菌株进行比较，还应与缺乏极性鞭毛的突变体进行比较。此外，聚糖残基数量的减少或聚糖组成的变化会影响糖基化鞭毛林的电泳运动性。例如，使用SDS-PAGE凝胶观察到的糖基化鞭毛的分子量高于鞭毛蛋白氨基酸序列的预测，并且观察到聚糖的破坏是其分子量的降低。在某些情况下，使用SDS-PAGE可能无法检测到鞭毛蛋白的聚糖修饰的变化。在这些情况下，可能需要对完整蛋白质或鞭毛蛋白肽进行质谱分析，以确认聚糖的存在和质量。
气单胞菌以及其他革兰氏阴性细菌的致病性可能受到鞭毛缺乏的影响，但也受到鞭毛聚糖组成变化的影响。这些变化可以影响细菌与生物和非生物表面的相互作用，自凝集，在逃避免疫反应和/或诱导促炎反应方面发挥作用。因此，需要依从性、生物膜形成和促炎反应测定来评估鞭毛糖基化与气单胞菌致病性之间的关系。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大国家研究委员会、西班牙国家经济和竞争部计划和加泰罗尼亚政府的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
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