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Immunology and Infection

Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63231
Automatic Translation
1, 2,3, 2,4, 1
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

Summary

Ici, nous décrivons la construction de mutants nuls d’Aeromonas dans des glycosyltransférases spécifiques ou des régions contenant des glycosyltransférases, les tests de motilité et la purification des flagelles effectués pour établir l’implication et la fonction de leurs enzymes codées dans la biosynthèse d’un glycane, ainsi que le rôle de ce glycane dans la pathogenèse bactérienne.

Abstract

L’étude de la glycosylation chez les procaryotes est un domaine en croissance rapide. Les bactéries abritent différentes structures glycosylées à leur surface dont les glycanes constituent un code-barres spécifique à la souche. Les glycanes associés présentent une plus grande diversité dans la composition et la structure du sucre que ceux des eucaryotes et sont importants dans les processus de reconnaissance bactérie-hôte et l’interaction avec l’environnement. Chez les bactéries pathogènes, les glycoprotéines ont été impliquées à différentes étapes du processus infectieux, et les modifications du glycane peuvent interférer avec des fonctions spécifiques des glycoprotéines. Cependant, malgré les progrès réalisés dans la compréhension de la composition, de la structure et des voies de biosynthèse des glycanes, la compréhension du rôle des glycoprotéines dans la pathogénicité ou l’interaction avec l’environnement reste très limitée. En outre, chez certaines bactéries, les enzymes nécessaires à la glycosylation des protéines sont partagées avec d’autres voies biosynthétiques polysaccharidiques, telles que les voies biosynthétiques des lipopolysaccharides et des capsules. L’importance fonctionnelle de la glycosylation a été élucidée chez plusieurs bactéries par mutation de gènes spécifiques que l’on pense être impliqués dans le processus de glycosylation et l’étude de son impact sur l’expression de la glycoprotéine cible et du glycane modificateur. Les Aeromonas mésophiles ont un flagelle polaire unique et O-glycosylé. Les glycanes flagellaires présentent une diversité dans la composition glucidique et la longueur de la chaîne entre les souches d’Aeromonas . Cependant, toutes les souches analysées à ce jour montrent un dérivé de l’acide pseudaminique comme sucre de liaison qui modifie les résidus de sérine ou de thréonine. Le dérivé de l’acide pseudaminique est nécessaire pour l’assemblage des flagelles polaires, et sa perte a un impact sur l’adhésion, la formation de biofilm et la colonisation. Le protocole détaillé dans cet article décrit comment la construction de mutants nuls peut être utilisée pour comprendre l’implication de gènes ou de régions du génome contenant des glycosyltransférases putatives dans la biosynthèse d’un glycane flagellaire. Cela inclut le potentiel de comprendre la fonction des glycosyltransférases impliquées et le rôle du glycane. Ceci sera réalisé en comparant le mutant déficient en glycane à la souche de type sauvage.

Introduction

La glycosylation des protéines a été décrite chez les bactéries Gram positif et Gram négatif et consiste en la fixation covalente d’un glycane à une chaîne latérale d’acide aminé 1,2. Chez les procaryotes, ce processus se produit généralement via deux mécanismes enzymatiques majeurs: O- et N-glycosylation 3. Dans l’O-glycosylation, le glycane est attaché au groupe hydroxyle d’un résidu de sérine (Ser) ou de thréonine (Thr). Dans la N-glycosylation, le glycane est attaché à l’azote amide de la chaîne latérale d’un résidu d’asparagine (Asn) dans les séquences tripeptides Asn-X-Ser/Thr, où X pourrait être n’importe quel acide aminé à l’exception de la proline.

Les glycanes peuvent adopter des structures linéaires ou ramifiées et sont composés de monosaccharides ou de polysaccharides liés de manière covalente par des liaisons glycosidiques. Chez les procaryotes, les glycanes présentent généralement une diversité dans la composition et la structure du sucre par rapport aux glycanes eucaryotes4. En outre, deux voies de glycosylation bactériennes différentes qui diffèrent dans la façon dont le glycane est assemblé et transféré à la protéine acceptrice ont été décrites: glycosylation séquentielle et en bloc 5,6. Pour la glycosylation séquentielle, le glycane complexe est construit directement sur la protéine par addition successive de monosaccharides. Dans la glycosylation en bloc, un glycane pré-assemblé est transféré à la protéine à partir d’un oligosaccharide lié aux lipides par une oligosaccharyltransférase spécialisée (OTase). Il a été démontré que les deux voies sont impliquées dans les processus de glycosylation N et O 7.

La glycosylation des protéines joue un rôle dans la modulation des propriétés physico-chimiques et biologiques des protéines. La présence d’un glycane peut influencer la façon dont la protéine interagit avec son ligand, ce qui affecte l’activité biologique de la protéine, mais peut également affecter la stabilité des protéines, la solubilité, la susceptibilité à la protéolyse, l’immunogénicité et les interactions microbe-hôte 8,9. Cependant, plusieurs paramètres de glycosylation, tels que le nombre de glycanes, la composition du glycane, la position et le mécanisme d’attachement, pourraient également affecter la fonction et la structure des protéines.

Les glycosyltransférases (GT) sont les enzymes clés dans la biosynthèse des glycanes complexes et des glycoconjugués. Ces enzymes catalysent la formation de liaison glycosidique entre une fraction de sucre d’une molécule donneuse activée et un accepteur de substrat spécifique. Les GT peuvent utiliser à la fois des nucléotides et des non-nucléotides comme molécules donneuses et cibler différents accepteurs de substrat, tels que des protéines, des saccharides, des acides nucléiques et des lipides10. Par conséquent, la compréhension des GT au niveau moléculaire est importante pour identifier leurs mécanismes d’action et leur spécificité, et permet également de comprendre comment la composition en sucre des glycanes qui modifient les molécules pertinentes est liée à la pathogénicité. La base de données sur les enzymes glucidiques actives (CAZy)11 classe les GT en fonction de leur homologie de séquence, ce qui fournit un outil prédictif puisque, dans la plupart des familles GT, le pli structurel et les mécanismes d’action sont invariants. Cependant, quatre raisons rendent difficile la prédiction de la spécificité du substrat de nombreux GT : 1) aucun motif de séquence clair déterminant la spécificité du substrat n’a été déterminé chez les procaryotes12, 2) de nombreux GT et OTases montrent la promiscuité du substrat13,14, 3) les GT fonctionnels sont difficiles à produire à haut rendement sous forme recombinante et 4) l’identification des substrats donneurs et accepteurs est complexe. Malgré cela, des études récentes sur la mutagénèse ont permis d’obtenir des avancées significatives dans la compréhension des mécanismes catalytiques et de soustraire la liaison des GT.

Chez les bactéries, l’O-glycosylation semble être plus répandue que la N-glycosylation. Les sites d’O-glycosylation ne montrent pas de séquence consensuelle, et de nombreuses protéines O-glycosylées sont sécrétées ou des protéines de surface cellulaire, telles que les flagellines, les pili ou les autotransporteurs1. La glycosylation de la flagelle montre une variabilité dans le nombre de sites accepteurs, la composition du glycane et la structure. Par exemple, les flagellines de Burkholderia spp n’ont qu’un seul site d’acceptation, tandis que chez Campylobacter jejuni, les flagellènes ont jusqu’à 19 sites d’acceptation15,16. De plus, pour certaines bactéries, le glycane est un monosaccharide unique, tandis que d’autres bactéries possèdent des glycanes hétérogènes compromis de différents monosaccharides pour former des oligosaccharides. Cette hétérogénicité se produit même parmi les souches de la même espèce. Les flagellines Helicobacter ne sont modifiées que par l’acide pseudaminique (PseAc)17, et les flagellines campylobacter peuvent être modifiées par PseAc, la forme acétamidino de l’acide pseudaminique (PseAm) ou de l’acide légionaminique (LegAm), et les glycanes dérivés de ces sucres avec de l’acétyle, de la N-acétylglucosamine ou des substitutions propioniques 18,19. Chez Aeromonas, les flagellènes sont modifiées par des glycanes dont la composition va d’un seul dérivé de l’acide PseAc à un hétéropolysaccharide20, et la fixation des glycanes aux monomères de flagelline se fait toujours via un dérivé PseAc.

En général, la glycosylation des flagellènes est essentielle pour l’assemblage du filament flagellaire, la motilité, la virulence et la spécificité de l’hôte. Cependant, alors que les flagellènes de C. jejuni16, H. pylori17 et Aeromonas sp. 21 ne peut s’assembler en filament que si les monomères de protéines sont glycosylés, Pseudomonas spp. et Burkholderia spp. 15 ne nécessitent pas de glycosylation pour l’assemblage des flagelles. De plus, chez certaines souches de C. jejuni, les changements dans la composition en sucre du flagelle glycane affectent l’interaction bactérie-hôte et peuvent jouer un rôle dans l’évasion de certaines réponses immunitaires16. L’autoagglutination est une autre caractéristique phénotypique affectée par les modifications de la composition des glycanes associées aux flagellines. Une autoagglutination plus faible entraîne une réduction de la capacité à former des microcolonies et du biofilm22. Chez certaines bactéries, la capacité des flagelles à déclencher une réponse pro-inflammatoire était liée à la glycosylation de la flagelline. Ainsi, chez P. aeruginosa, la flagelline glycosylée induit une réponse pro-inflammatoire plus élevée que le23 non glycolycosylé.

Les Aeromonas sont des bactéries à Gram négatif omniprésentes dans l’environnement, ce qui leur permet d’être à l’interface de tous les composants one health 24. Les Aeromonas mésophiles ont un seul flagelle polaire, qui est produit de manière constitutive. Plus de la moitié des isolats cliniques expriment également la flagelline latérale, inductible dans des milieux ou des plaques à haute viscosité. Différentes études ont lié les deux types de flagelles aux premiers stades de la pathogenèse bactérienne25. Alors que les flagellules polaires rapportées à ce jour sont O-glycosylées à 5-8 résidus Ser ou Thr de ses domaines immunogènes centraux, les flagellines latérales ne sont pas O-glycosylées dans toutes les souches. Bien que les glycanes flagelles polaires de différentes souches présentent une diversité dans leur composition glucidique et leur longueur de chaîne20, il a été démontré que le sucre de liaison est un dérivé de l’acide pseudaminique.

Le but de ce manuscrit est de décrire une méthode permettant d’obtenir des mutants nuls dans des GT spécifiques ou des régions chromosomiques contenant des GT afin d’analyser leur implication dans la biosynthèse des polysaccharides pertinents et dans la pathogénicité bactérienne, ainsi que le rôle du glycane lui-même. À titre d’exemple, nous identifions et supprimons une région chromosomique contenant des GT d’Aeromonas pour établir son implication dans la glycosylation de la flagelline polaire et analyser le rôle du glycane de flagelline. Nous montrons comment supprimer un GT spécifique pour établir sa fonction dans la biosynthèse de ce glycane et le rôle du glycane modifié. Bien qu’en utilisant Aeromonas comme exemple, le principe peut être utilisé pour identifier et étudier les îlots de glycosylation flagelle d’autres bactéries à Gram négatif et analyser la fonction des GT impliqués dans la biosynthèse d’autres glycanes tels que le lipopolysaccharide O-antigène.

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Protocol

La représentation schématique de la procédure est illustrée à la figure 1.

1. Identification bioinformatique de l’îlot de glycosylation flagelle (IFFI) à Aeromonas

  1. Pour identifier les grappes de biosynthétiques PseAc dans les génomes d’Aeromonas , utilisez l’outil tblastn de la base de données NCBI26. Tout d’abord, récupérez les protéines orthologues en PseC et PseI d’A. piscicola AH-3 (les codes d’identification sont OCA61126.1 et OCA61113.1) à partir de bases de données de souches séquencées d’Aeromonas , puis utilisez l’outil tblastn pour rechercher leurs séquences de nucléotides traduites.
    REMARQUE: Les gènes pse flanquent les FFI Aeromonas , avec pseB et pseC situés à une extrémité de l’amas et pseI à l’autre extrémité. L’emplacement du reste des gènes pse peut être différent d’un groupe FGI à l’autre.
  2. Étant donné que ces gènes de flagelline polaire de nombreuses souches sont adjacents aux FFI, utilisez le tblastn de la base de données NCBI pour trouver des protéines orthologues aux flagellines polaires FlaA et FlaB de A. piscicola AH-3 (les codes d’identification sont OCA61104.1 et OCA61105.1) et les gènes qui les codent.
  3. De plus, les FFI d’Aeromonas impliqués dans la biosynthèse des glycanes hétéropolysaccharidiques (groupe II)27 contiennent plusieurs gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse des acides gras, tels que luxC et luxE. Utilisez le tblastn de la base de données NCBI pour trouver des protéines orthologues à LuxC de A. piscicola AH-3 (le code d’identification est OCA61121.1) et le gène qui le code.

2. Génération de mutants nuls dans les gènes insulaires de glycosylation des flagelles

REMARQUE: Cette méthode de mutagénèse est basée sur l’échange allélique de produits de délétion dans le cadre de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en utilisant le vecteur suicide pDM428 (GenBank: KC795686.1). La réplication du vecteur pDM4 dépend du lambda pir , et l’échange allélique complet est contraint en utilisant le gène sacB situé sur le vecteur.

  1. Construction de produits de suppression dans le cadre de la PCR.
    1. Concevoir deux paires d’amorces qui amplifient les régions d’ADN en amont (amorces A et B) et en aval (amorces C et D) du gène ou de la région sélectionnés à supprimer (Figure 2B).
    2. Assurez-vous que les amorces A et D ont plus de 600 pb en amont du début et en aval de l’arrêt, respectivement, du ou des gènes à supprimer. Ces deux amorces doivent inclure à l’extrémité 5' un site de restriction pour une endonucléase qui permet le clonage dans pDM4.
      REMARQUE: Le site de restriction inclus à l’extrémité 5' des amorces A et D ne doit pas être le même que les sites dans les amplicons AB ou CD.
    3. Assurez-vous que les amorces B et C se trouvent dans le gène à supprimer ou à l’intérieur du premier et du dernier gène, respectivement, de la région à supprimer. Assurez-vous que les deux amorces (B et C) sont dans le cadre et situées entre 5 et 6 codons à l’intérieur du gène. De plus, assurez-vous que les deux amorces comprennent à l’extrémité 5' une séquence complémentaire de 21 pb (tableau 1) qui permet de joindre les amplicons d’ADN AB et CD.
    4. Cultiver la souche Aeromonas sélectionnée dans 5 mL de bouillon de soja tryptique (BST) pendant la nuit (O/N) à 30 °C. Utilisez une trousse disponible dans le commerce pour la purification de l’ADN génomique et suivez les instructions du fabricant (Table des matériaux). Quantifier 2 μL de l’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE: Utilisez de l’eau distillée double comme ébauche, l’instrument étant réglé pour enregistrer l’absorbance à 260 nm. Enregistrez l’absorbance avec 2 μL d’ADN purifié 3 à 5 fois et calculez une lecture d’absorbance moyenne. Utilisez la loi de Beer-Lambert pour calculer la concentration d’ADN, où A = Ɛ.c.l. dans lequel « A » est l’absorbance, « Ɛ » est le coefficient d’extinction molaire moyen pour l’ADN, « c » est la concentration d’ADN et « l » est la longueur du chemin (se référer à l’instruction du fabricant pour la longueur du chemin de chaque instrument).
    5. Utilisez 100 ng d’ADN chromosomique purifié comme modèle dans deux ensembles de PCR asymétriques avec des amorces A-B et C-D (Table des matériaux). Utilisez un rapport molaire de 10:1 de paires d’amorces A:B et D:C (matériau supplémentaire).
      REMARQUE: Les PCR asymétriques permettent l’amplification préférentielle d’un brin du modèle plus que de l’autre.
    6. Analyser les produits PCR par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1%. Utilisez TAE (40 mM de Tris-acétate, 1 mM d’EDTA) comme tampon de gel et un réglage de puissance de 8 V / cm. Pour visualiser l’ADN, ajoutez du bromure d’éthidium (0,5 μg/mL) au gel et visualisez les produits de PCR à l’aide d’une station de bio-imagerie (Table des matériaux).
    7. Excisez les amplicons du gel à l’aide d’un scalpel, purifiez-les en suivant le protocole du fabricant (Table des matériaux) et quantifiez-les.
    8. Joignez les amplicons AB et CD par leurs séquences de chevauchement de 21 pb dans la fin 3' des produits PCR (Figure 3). Mélanger 100 ng de chaque amplicon (AB et CD) dans un tube PCR avec des réactifs PCR (PCR pré-AD), mais sans amorces, et étendre à l’aide du programme thermocycleur (matériel supplémentaire). Ensuite, ajoutez 100 μM d’amorces A et D à la réaction (AD PCR) et amplifiez en un seul fragment (matériau supplémentaire).
    9. Analyser le produit PCR (amplicon AD) par électrophorèse dans un gel d’agarose à 1 % en utilisant les conditions décrites à l’étape 2.1.6, exciser l’amplicon du gel, purifier selon le protocole du fabricant et quantifier l’amplicon (Table des matériaux).
  2. Construction du plasmide recombinant pDM4 avec délétion dans le cadre.
    1. Cultiver une culture O/N d’Escherichia coli cc18λ pir contenant du pDM4 dans un bouillon Luria-Bertani (LB) Miller (10 mL) avec du chloramphénicol (25 μg/mL) à 30 °C.
    2. Faire tourner la culture à 5 000 x g à 4 °C et suspendre la pastille dans 600 μL d’eau distillée stérile. Effectuer l’extraction et la purification du plasmide pDM4 à l’aide d’un kit de purification du plasmide disponible dans le commerce, en suivant les instructions du fournisseur (Table des matériaux).
    3. Digérer 1 μg de pDM4 et 400 ng d’amplicon AD pendant 2 h avec une endonucléase capable de digérer les deux extrémités de l’amplicon AD et le site de clonage du pDM4 (Figure 3). Suivez le protocole du fabricant de l’enzyme pour les conditions de réaction (Table des matériaux).
    4. Nettoyez le plasmide et l’amplicon digérés à l’aide d’un kit de purification de l’ADN et quantifiez-les en suivant les instructions du fabricant (Table des matériaux).
    5. Pour éviter la réligation du pDM4 linéarisé, retirez le groupe phosphate des deux extrémités 5' en utilisant l’enzyme phosphatase alcaline en suivant les instructions du fabricant (Table des matériaux). Ensuite, nettoyez le plasmide traité et quantifiez-le à l’aide d’un spectrophotomètre comme décrit à l’étape 2.1.4 (Tableau des matériaux).
    6. Combiner 150 ng de pDM4 digéré et traité par phosphatase alcaline avec 95-100 ng d’amplicon AD digéré à un rapport vecteur molaire/insert de 1:4. Préparer la réaction de ligature dans un volume de 15 μL, en suivant les instructions du fabricant (tableau des matériaux).
    7. Incuber O/N à 20 °C ou le week-end à 4 °C. Après incubation, inactiver la ligase T4 à 70 °C pendant 20 min.
    8. Utilisez la ligature pour introduire le plasmide dans la soucheλpir d’Escherichia coli MC1061 par électroporation. Utilisez des bactéries électrocompétentes et des cuvettes d’électroporation de 2 mm d’intervalle.
  3. Préparation de l’électrocompétent E. coli et électroporation du plasmide recombinant pDM4
    1. Inoculer une seule colonie de la souche E. coli MC1061λpir dans le bouillon Luria-Bertani (LB) Miller et faire pousser O/N à 30 °C avec une agitation de 200 tr/min.
    2. Diluer 2 mL de la culture bactérienne dans 18 mL de bouillon LB et incuber à 30 °C en agitant (200 tr/min) jusqu’à ce qu’une densité optique (OD600) comprise entre 0,4 et 0,6 soit atteinte.
    3. Granulés de culture bactérienne par centrifugation à 5 000 x g et 4 °C pendant 15 min. Jeter le surnageant et suspendre la pastille dans 40 mL deH2Odistillé réfrigéré.
    4. Répétez cette étape de nettoyage deux fois de plus pour éliminer tous les sels de culture. Enfin, suspendre la pastille dans 4 mL deH2Odistillé réfrigéré et transférer 1 mL de la suspension dans chacun des quatre tubes coniques de 1,5 mL de microfuge.
    5. Granulés de culture bactérienne par centrifugation à 14 000 x g et 4 °C pendant 5 min. Retirer le surnageant sans perturber la pastille et suspendre chaque pastille dans 100 μL deH2Odistillé réfrigéré.
    6. Ajouter 3-3,5 μL du mélange de ligature à chaque tube et incuber sur de la glace pendant 5 min. Ensuite, transférez le contenu de chaque tube dans une cuvette d’électroporation réfrigérée de 2 mm d’espace et appliquez 2 kV, 129 Ω et une constante de temps d’environ 5 ms.
      REMARQUE: Pré-refroidir les cuvettes d’électroporation sur de la glace. Maintenez les bactéries sur la glace pendant toute la procédure.
    7. Après électroporation, ajouter 250 μL de milieu SOC à chacune des quatre cuvettes pour récupérer leur contenu, les transférer dans un tube de culture (environ 1 mL) et incuber pendant 1 h à 30 °C en agitant (200 tr/min).
    8. Plaquez les cellules transformées sur des plaques de gélose Luria-Bertani (LB) complétées par du chloramphénicol (25 μg / mL) pour s’assurer que toutes les colonies qui se développent dans la plaque ont l’épine dorsale plasmidique.
    9. Choisissez quelques colonies dans les plaques de gélose LB avec du chloramphénicol et incubez O/N à 30 °C. Lorsque les colonies se développent, vérifiez l’insertion de la construction de délétion dans pDM4 par PCR à l’aide d’amorces qui flanquent le côté clonage pDM4 : pDM4for et pDM4rev (Tableau 1), et les colonies lysées comme modèle (Matériel supplémentaire).
    10. Choisissez une colonie avec un cure-dent stérile et trempez-la dans un tube de 1,5 mL contenant 15 μL de Triton X-100 à 1 %, 20 mM de Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Incuber les tubes à 100 °C pendant 5 min, puis 1 min sur de la glace.
    11. Faire tourner les tubes dans un microfuge à 12 000 x g pendant 10 min pour granuler les bactéries et les débris. Utilisez 1 μL du surnageant comme modèle dans la réaction pcrurgique (Table des matériaux). La température de recuit de la paire d’apprêts est de 50 °C et la réaction pcr nécessite 10% de DMSO (matériau supplémentaire).
    12. Inoculer les colonies qui ont amplifié le produit d’intérêt dans 10 mL de bouillon LB avec du chloramphénicol (25 μg/mL) et faire croître O/N à 30 °C. Extraire le plasmide des cultures comme décrit aux étapes 2.2.1-2.2.2. Séquence à l’aide des amorces pDM4 en suivant les instructions du fabricant (Table des matériaux).
  4. Transfert de la suppression dans le cadre vers le Aeromonas filtrer
    REMARQUE: Le plasmide recombinant pDM4 doit être introduit dans le Aeromonas déformation par accouplement triparental (Graphique 4). Aeromonas La souche doit être résistante à la rifampicine pour être sélectionnée après l’accouplement triparental. Par conséquent, cultiver les souches sélectionnées O/N sur TSB à 30 °C, centrifuger 2 mL, 4 mL et 6 mL de cultures à 5 000 x g pendant 15 min, suspendre chaque pastille dans 100 μL de BST et plaquer dans la TSA avec de la rifampicine (100 μg/mL).
    1. Préparer des cultures O/N d’E. coli MC1061λpir avec le plasmide recombinant pDM4 sur gélose LB avec 25 μg/mL de chloramphénicol (souche donneuse), la souche Aeromonas résistante à la rifampicine sur TSA avec 100 μg/mL de rifampicine (souche réceptrice), et le plasmide E. coli HB101 avec le plasmide pRK2073 sur gélose LB avec 80 μg/mL de spectinomycine (souche auxiliaire) à 30 °C.
    2. Lorsque les colonies se sont développées, suspendez doucement le même nombre de colonies (10 à 15 colonies) des souches donneuses, receveuses et auxiliaires avec un cure-dent stérile dans trois tubes LB contenant 150 μL de LB.
    3. Ensuite, sur une plaque de gélose LB, sans antibiotiques, mélanger les trois suspensions bactériennes en deux gouttes chez un receveur: rapport aide: donneur de 5: 1: 1 (50 μL du receveur, 10 μL du donneur et 10 μL d’aide). Incuber la plaque face vers le haut O/N à 30 °C. Effectuer un contrôle négatif de la conjugaison en utilisant la souche donneuse sans plasmide recombinant.
      REMARQUE: La souche auxiliaire porte le plasmide conjugatif pRK2073 et facilite le transfert du pDM4 dans l’Aeromonas. N’utilisez pas de vortex pour suspendre les souches donneuses, receveuses et auxiliaires afin d’éviter de casser le pili.
    4. Récoltez les bactéries de la plaque de gélose LB en ajoutant 1 mL de bouillon LB et en l’étalant avec un épandeur de verre stérile pour obtenir une suspension bactérienne. Utilisez une pipette pour transférer vigoureusement la suspension bactérienne dans un tube de microfuge conique de 1,5 mL et un vortex.
    5. Pour sélectionner les colonies receveuses contenant le plasmide recombinant pDM4, plaque 100 μL de la suspension bactérienne récoltée sur des plaques de gélose LB avec de la rifampicine (100 μg/mL) et du chloramphénicol (25 μg/mL).
    6. Faire tourner 200 μL et 600 μL des échantillons dans une microfugie à 5 000 x g pendant 15 min, suspendre la pastille dans 100 μL de bouillon LB et plaquer sur gélose LB avec de la rifampicine (100 μg/mL) et du chloramphénicol (25 μg/mL). Incuber toutes les plaques pendant 24-48 h à 30 °C.
    7. Ramasser les colonies cultivées, transférer sur des plaques LB avec de la rifampicine (100 μg/mL) et du chloramphénicol (25 μg/mL), et les incuber O/N à 30 °C. Ensuite, confirmez que les colonies sont des Aeromonas par le test d’oxydase29 et que le plasmide recombinant pDM4 a été inséré (première recombinaison) dans la région chromosomique spécifique par PCR à l’aide des amorces E et F (Matériau supplémentaire), qui se lient à l’extérieur de la région amplifiée avec les amorces A et D (Table des matériaux). Comme décrit à l’étape 2.3.11, utilisez 1 μL de colonies lysées comme modèle.
    8. Pour compléter l’échange allélique pour la délétion dans le cadre, contraindre les colonies avec le plasmide suicidaire intégré à une deuxième recombinaison. Cultiver les colonies recombinantes dans 2 mL de LB avec 10% de saccharose et sans antibiotiques, O/N à 30 °C.
    9. Plaque 100 μL des cultures bactériennes de l’étape 2.4.8 sur plaque de gélose LB avec saccharose (10%). En outre, plaquer 100 μL de différentes dilutions de culture (10-2-10-4) et incuber O/N à 30 °C.
    10. Pour confirmer la perte de pDM4, ramasser les colonies, transférer sur des plaques LB avec et sans chloramphénicol (25 μg/mL), les incuber O/N à 30 °C, puis sélectionner les colonies sensibles au chloramphénicol.
    11. Analyser les colonies sensibles par PCR en utilisant la paire d’amorces E-F et 1 μL de colonies lysées comme modèle (Tableau des matériaux et matériaux supplémentaires). Sélectionnez les colonies dont le produit PCR est en corrélation avec la taille de la construction supprimée.

3. Essais de motilité

REMARQUE: Chez certaines espèces bactériennes avec des flagelles glycosylés, les modifications des niveaux de glycosylation ou de composition du glycane affectent l’assemblage des flagellènes, ce qui se traduit généralement par une réduction de la motilité ou une absence de motilité. Par conséquent, deux tests de motilité ont été effectués avec les mutants nuls.

  1. Essai de motilité en milieu liquide
    1. Culture Aeromonas filtre O/N dans 1 mL de BST à 25-30 °C. Pour coller une lame de couverture de microscope à une lame excavée, prenez une petite quantité de silicone avec la pointe d’un cure-dent et placez une petite goutte sur les quatre coins de la lame de couverture. Ensuite, déposez 1 μL de la culture Aeromonas au milieu de la lame de couverture et mélangez dans une goutte de milieu frais du BST (2 μL).
    2. Placez une glissière excavée sur la glissière de couverture. Faites correspondre l’excavation avec la goutte déposée, appuyez doucement et tournez la glissière à l’envers.
    3. Analysez la motilité de nage par microscopie optique à l’aide d’un microscope optique (Table des matériaux) avec un objectif 100x à l’aide d’huile d’immersion.
      REMARQUE: La souche de type sauvage d’Aeromonas doit être utilisée comme témoin positif. Comme témoin négatif, utilisez une bactérie non flagellée telle que Klebsiella.
  2. Essai de motilité dans des milieux semi-solides
    1. Culture Aeromonas souches O/N dans le BST (1 mL) à 25-30 °C. Ensuite, transférer 3 μL de la culture sur le centre d’une plaque de gélose molle (1% de tryptone, 0,5% de NaCl, 0,25% de bacto agar) et incuber la plaque face vers le haut O/N à 25-30 °C.
    2. À l’aide d’une règle, mesurez la migration bactérienne à travers la gélose du centre de la plaque vers la périphérie.

4. Purification des flagelles

  1. Isolement des flagelles ancrés à la surface bactérienne
    1. Culture Aeromonas souches O/N dans le BST (10 mL) à 25-30 °C. Ensuite, développez la culture dans une fiole avec du BST (900 mL) et laissez-la pousser O/N à 25-30 °C en agitant (200 tr/min).
    2. Centrifuger à 5 000 x g pendant 20 min à 4 °C. Suspendre la pastille dans 20 mL de tampon Tris-HCl de 100 mM (pH 7,8).
    3. Pour retirer les flagelles ancrés, cisaillez la suspension dans un vortex avec une barre de verre (2-3 mm de diamètre) pendant 3-4 min, puis passez de manière répétitive (au moins six fois) à travers une seringue de 21 G.
    4. Bactéries en granulés par deux centrifugations consécutives à 4 °C : d’abord, à 8 000 x g pendant 30 min. Retirer le surnageant et centrifuger à 18 000 x g pendant 20 min. Collectez le surnageant, qui contient des flagelles libres.
    5. Ultracentrifugez le surnageant à 100 000 x g pendant 1 h à 4 °C et suspendez la pastille dans 150 μL de 100 mM de Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM de tampon EDTA. La pastille contient des filaments de flagelles.
    6. Analysez 5 à 10 μL de la pastille remise en suspension de l’étape 4.1.5 par électrophorèse dans un gel SDS-Polyacrylamide à 12% et visualisez les protéines à l’aide de la coloration bleue de Coomassie.
      REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour l’électrophorèse des protéines et la coloration sur gel. Comme contrôle positif de la flagelline glycosylée, utilisez les flagelles purifiés de la souche de type sauvage. Purifier la fraction enrichie de flagelles dans un gradient de chlorure de césium (ClC).
  2. Gradient de chlorure de césium pour purifier les flagelles.
    1. Mélanger 12,1 g de CsCl avec 27 mL deH2Odistillé.
    2. Transférer la fraction enrichie de flagelles (150 μL) dans un tube ultra-clair à paroi mince (14 mm x 89 mm) (Table des matériaux) et le remplir de 12 mL de solution de CsCl.
    3. Ultracentrifugez le tube à 60 000 x g pendant 48 h à 4 °C dans un rotor à godet oscillant (Table des matériaux).
    4. Recueillir la bande flagelle dans le gradient CsCl avec une seringue et dialyze contre 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA. Ensuite, analysez les flagelles dialysés par électrophorèse dans un gel SDS-Polyacrylamide à 12% et coloration bleu Coomassie (étape 4.1.6) ou par spectrométrie de masse.

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Representative Results

Cette méthodologie fournit un système efficace pour générer des mutants nuls dans les gènes ou les régions chromosomiques d’Aeromonas qui peuvent affecter la glycosylation des flagelles et le rôle du filament de flagelle (Figure 1).

Le protocole commence par l’identification bioinformatique des FFI putatifs et des gènes codant pour les GT présents dans cette région. Chez Aeromonas, la localisation chromosomique des FFI est basée sur la détection de trois types de gènes : les gènes impliqués dans la biosynthèse de l’acide pseudaminique (pseI et pseC), les gènes de flagelline polaire et le luxC. Les souches dont les flagelles polaires sont glycosylés par un seul dérivé de l’acide pseudaminique, comme A. hydrophila AH-130, n’ont pas de gènes codant pour les GT entre les gènes pse situés dans le groupe I27 des FFI. La plupart des souches appartenant à ce groupe FGI présentent des gènes de flagelline polaire adjacents à cette région. En revanche, les souches dont les flagelles polaires sont glycosylés avec un glycane hétéropolysaccharide, comme A. piscicola AH-319, présentent différents gènes codant pour les GT en aval de luxC, localisés entre les gènes pse du groupe II27 des FFI, et ils ne sont pas toujours adjacents aux gènes de la flagelline polaire (Figure 2A).

La région impliquée dans la biosynthèse du flagelle hétéropolysaccharide glycane et la fonction des GT putatives qu’elle contient a été confirmée par la construction de mutants nuls. La génération de chaque mutant nécessite quatre amorces : A, B, C et D (tableau 1). L’amorce B recuit 5-6 codons en aval du début du gène (fgi-4) ou du premier gène de l’amas (fgi-1) à supprimer et l’amorce A recuit 600-800 bp en amont du début de ce gène (fgi-4 ou fgi-1). Recuits d’amorce C en amont des 5 à 6 derniers codons du gène (fgi-4) ou dernier gène de l’amas (fgi-12) à supprimer et recuits d’amorce D 600-800 bp en aval de l’arrêt de ce gène (fgi-4 ou fgi-12) (Figure 2B). Les amorces A et D pour la suppression de l’amas fgi et fgi-4 de A. piscicola AH-3 contiennent un site de restriction pour l’endonucléase BamHI à leurs extrémités 5' (tableau 1). Cette endonucléase n’a pas de cibles internes dans les fragments AB ni CD PCR. Une étape importante est la conception des apprêts B et C. Les deux doivent être dans le cadre pour ne pas casser le cadre de lecture ouvert du gène ou du fragment à supprimer. Les séquences complémentaires de 21 pb à l’extrémité 5' des amorces B et C permettent la génération d’amplicons AB et CD avec des séquences complémentaires à 3' extrémités, qui permettent la jonction et l’extension de ces amplicons. Le programme de PCR pour joindre et étendre les amplicons se compose d’une étape initiale de dénaturalisation et de cinq cycles avec une température de recuit de 54 °C (Matériau supplémentaire). Ensuite, l’ajout d’amorces A et D permet l’amplification du fragment étendu (Figure 3). L’action enzymatique de BamHI donne naissance à un amplicon aux extrémités collantes compatibles pour la ligature avec le vecteur suicide pDM4 digéré avec BglII.

Étant donné que le pDM4 est un plasmide dépendant de l’λpir, le produit de ligature a été électroporé dans la souche MC1061λpir d’E. coli (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) et sélectionné dans des plaques de chloramphénicol. pDM4 n’a pas de système direct pour sélectionner les clones recombinants, et les colonies ont été analysées par PCR avec une paire d’amorces pDM4 (pDM4for et pDM4rev) (Tableau 1 et Matériel supplémentaire) qui flanquent la région de clonage. La souche d’E. coli MC1061λpir sans pDM4 a été utilisée comme témoin négatif dans la réaction de PCR.

Pour effectuer l’échange allélique, le plasmide pDM4 recombinant a été transféré à la souche receveuse A. piscicola AH-3. Étant donné que de nombreux Aeromonas ne sont pas transformables par électroporation, le pDM4 recombinant a été transféré par conjugaison à l’aide d’un accouplement triparental (Figure 4). Pour sélectionner les colonies transconjugantes, nous utilisons une souche réceptrice résistante à la rifampicine, ce qui permet de sélectionner la souche Aeromonas à partir de l’accouplement de conjugaison. De plus, les colonies sélectionnées ont été soumises au test de l’oxydase parce que si Aeromonas est positif à l’oxydase, E. coli est négatif à l’oxydase. Les première et deuxième recombinaisons ont été confirmées par PCR avec des amorces externes (amorces E et F) de régions amplifiées (fragments AB et CD) (tableau 1, matériel supplémentaire et figure 5A).

Chez Aeromonas, la glycosylation des flagellines polaires est essentielle pour l’assemblage du filament flagellaire. La présence de flagelles polaires fonctionnels a été analysée à l’aide de tests de motilité des colonies bactériennes avec des gènes ou une région GT supprimés. Les tests de microscopie optique ont montré que la motilité de nage en milieu liquide était réduite chez les deux mutants par rapport à la souche de type sauvage. De plus, les deux ont montré une diminution de l’expansion radiale par rapport à la souche de type sauvage lorsque la motilité a été analysée sur une gélose molle (figure 5B). Étant donné que les deux mutants étaient capables de nager mais avec une motilité réduite par rapport à la souche de type sauvage, leurs flagelles polaires ont été purifiés et le poids moléculaire de la flagelline a été analysé dans un gel de polyacrylamide SDS à 12%. Cette analyse a montré que les deux mutants ont des flagellènes polaires de poids moléculaire inférieur à celui de la souche de type sauvage (Figure 5C), ce qui suggère des altérations du flagelle glycane. Les flagelles purifiés par des gradients CsCl (figure 5C) seront utilisés dans les essais de spectrométrie de masse pour identifier la composition du glycane et les mutants nuls utilisés dans le biofilm, l’adhérence ou d’autres essais pour identifier le rôle de la composition du glycane et du glycane.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble des étapes utilisées dans cette procédure. Schéma du processus décrit dans le protocole pour identifier l’île de glycosylation flagelle d’Aeromonas, et les GT impliqués dans la biosynthèse des glycanes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Détection bioinformatique des régions chromosomiques et conception de l’apprêt. (A) Schéma des régions chromosomiques identifiées chez A. hydrophila AH-1 et A. piscicola AH-3. A. hydrophile L’îlot de glycosylation des flagelles AH-1 est représentatif des souches dont le glycane flagellique n’a qu’un dérivé de l’acide pseudamine, et l’îlot de glycosylation du flagelle A. piscicola AH-3 est représentatif des souches dont le flagelle glycane est un hétéropolysaccharide. Les gènes notés en noir sont impliqués dans la biosynthèse de l’acide pseudaminique, et ceux notés jaunes sont des GT putatifs. (B) Schéma de l’emplacement chromosomique des paires d’amorces conçues pour les délétions dans le cadre de la PCR. Les boîtes bleues dans les amorces A et D contiennent le site de liaison de restriction pour une endonucléase. Les boîtes rouges dans les amorces B et C contiennent des séquences complémentaires de 21 pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma illustrant la méthode de construction des délétions et de la ligature dans le cadre de la PCR au plasmide suicidaire pDM4. MCS : site multiclonage, CmR : gènes résistants au chloramphénicol, sacB : code pour le Bacillus subtilis levansucrase, dont l’expression est induite par le saccharose et est mortelle pour les bactéries à Gram négatif, et mob : gènes de mobilisation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Conjugaison triparentale et procédure utilisée pour l’échange allélique. La première recombinaison se produit en raison de l’absence d’λpir dans les souches d’Aeromonas et donne lieu à l’intégration du plasmide recombinant dans le gène sélectionné. La deuxième recombinaison est induite par la croissance de la LB avec 10% de saccharose, ce qui conduit à l’expression du gène sacB, et le plasmide est excisé du chromosome. Après le croisement, le type sauvage ou le gène muté peut rester sur le chromosome bactérien. Les mutants nuls sont sélectionnés par PCR avec des amorces externes. RifR: résistant à la rifampicine; CmR: résistant au chloramphénicol; SpcR: résistant à la spectinomycine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Confirmation des mutants nuls et analyse phénotypique des flagelles polaires. (A) PCR avec des amorces externes fgi-4 (amorces EF) d’A. piscicola AH-3 pour confirmer l’échange allélique après deuxième recombinaison dans des colonies sensibles au chloramphénicol. Voie WT: A. piscicola AH-3; voies 1 à 8 : colonies sensibles au chloramphénicol de la deuxième recombinaison; St: HyperLadder 1 Kb marqueur. Les voies 1-3 et 5-8 montrent les colonies avec le gène fgi-4 de type sauvage comme voie WT. La voie 4 montre une colonie avec le gène fgi-4 supprimé. (B) Motilité sur la gélose molle d’A. piscicola AH-3 et les mutants nuls dans la région fgi (AH-3ΔFgi) et le gène fgi-4 (AH-3ΔFgi-4) à 25 °C. (C) Le flagelle polaire d’AH-3 (lane1) et les mutants nuls dans la région fgi (voie 2) et le gène fgi-4 (voie 3), isolés, purifiés dans des gradients CsCl, analysés dans 12% SDS-PAGE, et colorés à l’aide de coomassie bleu. Taille standard (St). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom de l’amorce Séquence dans le sens 5' à 3' Utilisé pour
A. piscicola AH-3
A-Flgi1 CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA Mutant fgi
B-Flgi1 CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA
C-Flgi12 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12 CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1 ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-Flgi12 TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-Fgi4 CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA Mutant fgi-4
B-Fgi4 CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT
C-Fgi4 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-Fgi4 CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-Fgi4 ATTTCCCTGCCAAATACG
F-Fgi4 CCTGCCAACAGGATGTAAG
Vecteur pDM4
pDM4pour AGTGATCTTCCGTCACAGG Insertions dans le vecteur pDM4
pDM4rev AAGGTTTAACGG TTGTGGA

Tableau 1 : Amorces utilisées pour la construction de mutants nuls. Les régions qui se chevauchent dans les amorces B et C sont soulignées. Bam Le site HI est en gras dans les amorces A et D.

Matériel supplémentaire. Réactifs et réactions utilisés dans les PCR asymétriques pour obtenir les amplicons AB et CD, PCR pré-AD et AD pour étendre et obtenir les amplicons AD, PCR pDM4 pour vérifier l’insertion de la construction supprimée dans le vecteur pDM4 et PCR EF pour vérifier la première et la deuxième recombinaison. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’étape précoce critique de cette méthode est l’identification des régions impliquées dans la glycosylation des flagelles et des GT putatifs, car ces enzymes présentent une homologie élevée et sont impliquées dans de nombreux processus. L’analyse bioinformatique des génomes d’Aeromonas dans les bases de données publiques montre que cette région est adjacente à la région polaire flagellelle 2, qui contient les gènes de flagelline dans de nombreuses souches et contient des gènes impliqués dans la biosynthèse de l’acide pseudaminique27. Cela a permis d’élaborer une ligne directrice pour la détection des îlots de glycosylation flagelliques dans Aeromonas qui pourrait être utilisée pour identifier cette région chez d’autres bactéries dont le glycane flagellaire contient des dérivés de l’acide pseudaminique. En outre, bien que cette méthode décrive comment analyser un groupe de gènes impliqués dans la glycosylation des flagelles, elle peut également être utilisée pour étudier les gènes codant pour des protéines qui pourraient être impliquées dans la formation, la rotation ou la régulation des flagelles chez différentes bactéries à Gram négatif.

La conception des amorces B et C est également importante dans la génération de délétions dans le cadre de la PCR. Ces amorces doivent être localisées 5 à 6 codons en aval du début (amorce B) et en amont de l’arrêt (amorce C) du gène ou de la région sélectionnée à supprimer et ne doivent pas casser le cadre de lecture ouvert. De plus, un facteur important à considérer est la longueur de la région d’homologie amplifiée pour générer les amplicons AB et CD. Ce protocole recommande que les deux amplicons contiennent une région homologue de 600 à 800 bp chacun. Les régions homologues plus courtes rendent la première recombinaison plus difficile.

Les souches d’Aeromonas ne portent pas le gène lambda pir , qui est nécessaire pour répliquer le plasmide suicidaire pDM4. Par conséquent, le plasmide recombinant pDM4 doit s’intégrer dans l’ADN chromosomique. Après l’accouplement triparental, il est important d’identifier les colonies bactériennes dans lesquelles la première recombinaison a eu lieu. Ces colonies contiennent le pDM4 recombinant inséré dans la région chromosomique homologue. L’identification des colonies recombinantes est réalisée à l’aide d’une réaction pcrifique avec des amorces (amorces E et F) externes à la région ciblée à supprimer. Si une ADN polymérase standard est utilisée, les amorces E-F ne conduiront qu’à la génération d’un produit PCR dans le type sauvage. Cette paire d’amorces ne produira aucun produit pcR dans les colonies bactériennes dans lesquelles le plasmide recombinant pDM4 a été inséré dans l’ADN chromosomique. L’absence de produit PCR est due à la distance entre les séquences de recuit des amorces E et F. Cette distance ne peut pas être amplifiée par des polymérases standard. Cependant, d’autres facteurs peuvent également empêcher la formation de produits PCR. Par conséquent, les premières colonies recombinantes peuvent être identifiées par des ADN polymérases pour l’amplification de longs fragments ou par des réactions de PCR à l’aide de paires d’amorces constituées d’un pDM4 et d’un apprêt externe. Lorsque de grands amas génétiques sont supprimés, l’amplification dans la souche de type sauvage nécessite l’utilisation d’ADN polymérases pour l’amplification de longs fragments. Les colonies bactériennes avec la première recombinaison peuvent être identifiées par PCR avec des paires d’amorces externes pDM4. Cependant, la première et la deuxième recombinaison sont généralement produites en même temps, laissant le pDM4 avec le type sauvage ou avec le gène supprimé après la recombinaison. Cela conduit à des colonies résistantes au chloramphénicol dont la PCR utilisant des amorces externes donne des amplicons de taille identique au gène de type sauvage ou à de petits amplicons, qui sont en corrélation avec le gène ou le fragment supprimé. Les colonies dont il a été démontré qu’elles avaient l’insert recombinant correct ont été incubées avec du saccharose pour éliminer le pDM4 non inséré. Le saccharose induit l’expression du gène sacB situé sur le pDM4, qui code une enzyme létale pour les bactéries à Gram négatif. Par conséquent, seules les colonies dépourvues du plasmide suicidaire se développeront en LB avec le saccharose. Pour soutenir l’identité des colonies contenant le gène supprimé, le fragment amplifié avec la paire d’amorces externes peut ensuite être séquencé.

La mise en œuvre de cette méthode de mutation dans le cadre dans Aeromonas permet la génération de mutants nuls plus stables sans modification des niveaux d’expression des gènes en aval. D’autres méthodes, telles que l’insertion d’une cassette antibiotique, assurent la transcription des gènes en aval, mais le niveau d’expression pourrait être modifié. En outre, cette méthode pourrait être extrapolée à d’autres gènes et régions cibles, y compris d’autres bactéries à Gram négatif 29,31,32,33.

Dans certaines souches bactériennes, la perte ou la modification du glycane lié aux flagellines peut entraîner l’incapacité d’assemblage des flagelles ou l’instabilité du filament des flagelles, ce qui entraîne une réduction de la motilité des flagelles polaires. Bien qu’il soit facile de distinguer un phénotype non mobile d’un phénotype mobile à l’aide de tests de motilité dans des milieux liquides, les différences dans le degré de motilité peuvent être difficiles à quantifier. Des tests de plaque de motilité sont nécessaires pour mesurer les différences dans le degré de motilité. Cependant, certaines espèces bactériennes, y compris de nombreuses souches mésophiles d’Aeromonas , expriment des flagelles latéraux inductibles lorsqu’elles poussent dans des milieux ou des plaques à haute viscosité, en plus des flagelles polaires constitutifs. Les deux types de flagelles contribuent à la motilité bactérienne dans les plaques semi-solides. Par conséquent, les modifications des flagelles polaires ou latéraux n’entraînent que des réductions des diamètres de migration. Ainsi, les mutants AH-3ΔFgi et AH-3ΔFgi-4 ne montrent qu’une motilité réduite par rapport à la souche de type sauvage. Pour améliorer l’évaluation de la motilité produite par la rotation des flagelles polaires, le diamètre d’expansion des mutants nuls doit être comparé non seulement à la souche de type sauvage, mais aussi à un mutant dépourvu du flagelle polaire. En outre, une réduction du nombre de résidus de glycane ou des changements dans la composition du glycane influencent la motilité électrophorétique des flagellines glycosylées. Par exemple, le poids moléculaire des flagellènes glycosylés observés à l’aide de gels SDS-PAGE est plus élevé que prévu à partir de la séquence d’acides aminés flagelline, et des perturbations du glycane sont observées sous forme de réductions de leur poids moléculaire. Dans certains cas, les changements dans la modification du glycane à la protéine flagelline peuvent ne pas être détectables à l’aide de SDS-PAGE. Dans ces cas, une analyse par spectrométrie de masse de protéines intactes ou de peptides de flagelline peut être nécessaire pour confirmer la présence et la masse de glycane.

La pathogénicité d’Aeromonas, ainsi que d’autres bactéries à Gram négatif, peut être affectée par l’absence de flagelle mais aussi par des changements dans la composition des flagelles glycanes. Ces changements peuvent affecter l’interaction bactérienne aux surfaces biotiques et abiotiques, l’autoagglutination, jouer un rôle dans l’évasion de la réponse immunitaire et / ou l’induction de la réponse pro-inflammatoire. Par conséquent, l’observance, la formation de biofilm et les tests de réponse pro-inflammatoire sont nécessaires pour évaluer la relation entre la glycosylation des flagelles et la pathogénicité d’Aeromonas .

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Conseil national de recherches du Canada, pour le Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Espagne) et pour la Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Applied Biosystems 4337455 Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity Invitrogen 12346-086 Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose Conda-Pronadise 8008 Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) Promega M1821 Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar Becton Dickinson 214010 Use for motility analysis
BamHI Promega R6021 Used for endonuclease restriction
BglII Promega R6081 Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System UVP Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase Bioline BIO-21040 Used for colony screening
Cesium chloride Applichem A1126,0100 Used for flagella purification
Chloramphenicol Applichem A1806,0025 Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit Cytivia 28-9034-71 Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA Applichem 131026.1211 Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap VWR 732-1133 Used for transformation
Ethidium bromide Applichem A1152,0025 Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker Bioline BIO-33053 DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit Invitrogen 10750204 Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar Condalab 996 Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth Condalab 1551 Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000 NanoDrop Techonologies Inc Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin Applichem A2220,0005 Used for triparental mating
SOC Medium Invitrogen 15544034 Used for electroporation recovery
Spectinomycin Applichem A3834,0005 Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman 331362 Used for flagella purification
T4 DNA ligase Invitrogen 15224017 Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar Condalab 1068 Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth Condalab 1224 Used for Aeromonas grown
Tryptone Condalab 1612 Use for motility analysis
Tris Applichem A2264,0500 Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100 Applichem A4975,0100 Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) Beckman 344059 Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler Applied Biosystems Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit Zymmo research D4020 Used for isolation of plasmid DNA

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Immunologie et infection numéro 181 O-glycosylation glycosyltransférases hétéroglycanes mutants dans le cadre aéromonas mésophiles flagelles purification des flagelles gradient CsCl
Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne
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Tomás, J. M., Fulton, K. M.,… More

Tomás, J. M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Merino, S. Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility. J. Vis. Exp. (181), e63231, doi:10.3791/63231 (2022).

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