Summary
ここでは、特定の糖転移酵素または糖転移酵素を含む領域における アエロモナ スのヌル変異体の構築、グリカンの生合成におけるそれらのコードされた酵素の関与および機能を確立するために行われる運動性アッセイ、および鞭毛精製、ならびに細菌病因におけるこのグリカンの役割について説明する。
Abstract
原核生物におけるグリコシル化の研究は急速に成長している分野です。細菌は、その表面に異なるグリコシル化構造を有し、そのグリカンは株特異的バーコードを構成する。関連するグリカンは、真核生物のグリカンよりも糖組成および構造において高い多様性を示し、細菌宿主認識プロセスおよび環境との相互作用において重要である。病原性細菌では、糖タンパク質は感染プロセスのさまざまな段階に関与しており、糖鎖修飾は糖タンパク質の特定の機能を妨げる可能性がある。しかしながら、糖鎖の組成、構造、および生合成経路の理解においてなされた進歩にもかかわらず、病原性または環境との相互作用における糖タンパク質の役割の理解は非常に限られている。さらに、いくつかの細菌では、タンパク質グリコシル化に必要な酵素は、リポ多糖およびカプセル生合成経路などの他の多糖生合成経路と共有される。グリコシル化の機能的重要性は、グリコシル化プロセスに関与すると考えられる特定の遺伝子の変異と、それが標的糖タンパク質および修飾グリカンの発現に及ぼす影響の研究を通じて、いくつかの細菌において解明されてきた。中温性 アエロモナスは 、単一および O-グリコシル化極性鞭毛を有する。べん毛グリカンは、 アエロモナ ス株間の炭水化物組成および鎖長の多様性を示す。しかしながら、現在までに分析された全ての株は、セリンまたはスレオニン残基を修飾する連結糖としてプセウダミン酸誘導体を示す。プセウダミン酸誘導体は極性鞭毛集合に必要であり、その喪失は接着、バイオフィルム形成、およびコロニー形成に影響を与える。この記事で詳述するプロトコルは、鞭毛グリカンの生合成における推定糖転移酵素を含む遺伝子またはゲノム領域の関与を理解するために、ヌル変異体の構築をどのように使用できるかを説明しています。これには、関与する糖転移酵素の機能および糖鎖の役割を理解する可能性が含まれる。これは、グリカン欠損変異体を野生型株と比較することによって達成されるであろう。
Introduction
タンパク質グリコシル化は、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方において記載されており、アミノ酸側鎖1,2へのグリカンの共有結合からなる。原核生物では、このプロセスは、通常、2つの主要な酵素機構を介して起こる:O−およびN−グリコシル化3。O-グリコシル化において、グリカンはセリン(Ser)またはスレオニン(Thr)残基のヒドロキシル基に結合している。N-グリコシル化において、グリカンはトリペプチド配列Asn-X-Ser/Thr内のアスパラギン(Asn)残基の側鎖アミド窒素に結合し、Xはプロリンを除く任意のアミノ酸であり得る。
グリカンは、直鎖状または分枝鎖状の構造を採用することができ、グリコシド結合によって共有結合で結合された単糖または多糖類から構成される。原核生物において、グリカンは通常、真核生物グリカン4と比較して糖組成および構造において多様性を示す。さらに、グリカンが組み立てられ、アクセプタータンパク質に移される方法において異なる2つの異なる細菌グリコシル化経路が記載されている:逐次的および 一括 グリコシル化5、6。逐次グリコシル化の場合、複合糖鎖は、単糖の連続的な付加によってタンパク質上に直接構築される。 エンブロック グリコシル化では、予め組み立てられたグリカンが、特殊なオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTase)によって脂質結合オリゴ糖からタンパク質に転移される。両方の経路が 、N− および O−グリコシル化プロセスに関与することが示されている7。
タンパク質のグリコシル化は、タンパク質の物理化学的および生物学的特性を調節する役割を有する。グリカンの存在は、タンパク質がそのリガンドとどのように相互作用するかに影響を与える可能性があり、これはタンパク質の生物学的活性に影響を与えるが、タンパク質の安定性、溶解性、タンパク質分解に対する感受性、免疫原性、および微生物と宿主の相互作用にも影響し得る8,9。しかし、グリカンの数、グリカン組成、位置、および結合機構などのいくつかのグリコシル化パラメータも、タンパク質の機能および構造に影響を及ぼす可能性がある。
糖転移酵素(GT)は、複合グリカンおよび複合糖質の生合成における重要な酵素である。これらの酵素は、活性化されたドナー分子からの糖部分と特定の基質アクセプターとの間のグリコシド結合形成を触媒する。GTsは、ドナー分子としてヌクレオチドおよび非ヌクレオチドの両方を使用し、タンパク質、糖類、核酸、および脂質などの異なる基質アクセプターを標的とすることができる10。したがって、GTを分子レベルで理解することは、その作用機序や特異性を解明するために重要であり、また、関連する分子を修飾する糖鎖の糖組成が病原性にどのように関連しているかを理解することを可能にする。炭水化物活性酵素データベース(CAZy)11は、GTを配列相同性に従って分類し、ほとんどのGTファミリーにおいて構造的フォールドおよび作用機序が不変であるため、予測ツールを提供する。しかしながら、多くのGTの基質特異性を予測することが困難な理由は、1)原核生物において基質特異性を決定する明確な配列モチーフが決定されていない、12)多くのGTおよびOTaseが基質混交性を示す13、14、3)機能的GTsが組換え形態で高収率で生産することが困難である、および4)ドナーおよびアクセプター基質の両方の同定が複雑である。それにもかかわらず、最近の突然変異誘発研究は、触媒機構の理解において著しい進歩を得て、GTの結合を差し引くことを可能にした。
細菌では、O-グリコシル化はN-グリコシル化よりも一般的であるようである。O-グリコシル化部位はコンセンサス配列を示さず、O-グリコシル化タンパク質の多くは、フラジェリン、ピリ、または自己輸送体などの分泌タンパク質または細胞表面タンパク質1である。クラジェリングリコシル化は、アクセプター部位の数、グリカン組成、および構造に変動性を示す。例えば、バークホルデリア属の鞭毛虫は1つのアクセプター部位しか持たないが、カンピロバクター・ジェジュニでは、鞭毛虫は19のアクセプター部位15,16個しか持たない。さらに、いくつかの細菌にとって、グリカンは単一の単糖であり、他の細菌はオリゴ糖を形成するために異なる単糖の妥協した不均一なグリカンを有する。この異原性は、同じ種の株間でも生じる。ヘリコバクター鞭毛虫はプセウダミン酸(PseAc)17によってのみ修飾され、カンピロバクター鞭毛虫はPseAc、プセウダミン酸(PseAm)またはレジオナミン酸(LegAm)のアセトアミジノ型、およびアセチル、N-アセチルグルコサミン、またはプロピオン置換18,19を有するこれらの糖に由来するグリカンによって修飾することができる。アエロモナスでは、鞭毛虫は、その組成が単一のPseAc酸誘導体からヘテロ多糖20までの範囲のグリカンによって修飾され、フラジェリンモノマーへのグリカンの結合は常にPseAc誘導体を介して行われる。
一般に、鞭毛虫のグリコシル化は、鞭毛フィラメントアセンブリ、運動性、ビルレンス、および宿主特異性に不可欠である。しかし、 C. jejuni16、 H. pylori17、 および Aeromonas sp.21は 、タンパク質モノマーがグリコシル化されない限り、フィラメントに組み立てることができない、 シュードモナス 属および バークホルデリア属。15は 鞭毛集合のためにグリコシル化を必要としない。さらに、いくつかの C. jejuni 株では、鞭毛グリカンの糖組成の変化が細菌−宿主相互作用に影響を及ぼし、特定の免疫応答を回避する上で役割を果たし得る16。自己凝集は、フラジェリンに関連するグリカンの組成における修飾によって影響を受ける別の表現型特性である。より低い自己凝集は、マイクロコロニーおよびバイオフィルム22を形成する能力の低下をもたらす。いくつかの細菌において、炎症促進反応を誘発する鞭毛の能力は、鞭毛グリコシル化と関連していた。したがって、 緑膿菌において、グリコシル化フラジェリンは、非グリコシル化23よりも高い炎症誘発性応答を誘導する。
アエロモナは、環境中に遍在するグラム陰性菌であり、これにより、それらがすべてのOne Health成分24の界面に存在することを可能にする。中温性アエロモナスは、恒常的に産生される単一の極性鞭毛を有する。臨床分離株の半分以上はまた、高粘度媒体またはプレート中で誘導可能な側方鞭毛を発現する。異なる研究は、両方の鞭毛タイプを細菌病因の初期段階と関連付けている25。現在までに報告された極性鞭毛は、その中心免疫原性ドメインの5〜8 SerまたはThr残基でO-グリコシル化されているが、側方鞭毛はすべての株においてO-グリコシル化されていない。異なる株由来の極性鞭毛グリカンはそれらの糖鎖組成および鎖長20において多様性を示すが、連結糖はプセウダミン酸誘導体であることが示された。
この原稿の目的は、GTを含む特定のGTまたは染色体領域におけるヌル変異体を取得し、関連する多糖類の生合成および細菌病原性におけるそれらの関与、ならびにグリカン自体の役割を分析する方法を説明することである。一例として、 アエロモナスの GTを含む染色体領域を同定・除去し、極性フラジェリングリコシル化への関与を確立し、フラジェリングリカンの役割を解析します。我々は、このグリカンの生合成におけるその機能を確立するために特定のGTを削除する方法と修飾グリカンの役割を示す。 アエロモナス を例にとりますが、この原理は、他のグラム陰性菌の鞭毛グリコシル化島を同定して研究し、O抗原リポ多糖などの他のグリカンの生合成に関与するGTの機能を分析するために使用できます。
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Protocol
手順の概略図を 図1に示します。
1. アエロモナスにおける鞭毛グリコシル化島(FGI)のバイオインフォマティクス同定
- アエロモナスゲノム中のPseAc生合成クラスターを同定するには、NCBIデータベース26のtblastnツールを使用する。まず、配列決定されたアエロモナス株のデータベースから、A. piscicola AH-3のPseCおよびPseI(識別コードはOCA61126.1およびOCA61113.1)に対するオルソログタンパク質を取得し、次にtblastnツールを使用してそれらの翻訳ヌクレオチド配列を検索する。
注: pse 遺伝子はアエロモナス FGI に隣接しており、pseB と pseC はクラスターの一端に位置し、pseI はもう一方の端にあります。 残りのPSE遺伝子の位置は、FGI群ごとに異なる可能性がある。 - 多くの株のこれらの極性フラジェリン遺伝子がFGIに隣接していることを考えると、NCBIデータベースからの tblastn を使用して、 A. piscicola AH-3の極性鞭毛FlaAおよびFlaB(識別コードはOCA61104.1およびOCA61105.1)およびそれらをコードする遺伝子に対するオルソログタンパク質を見つける。
- さらに、ヘテロ多糖化グリカン(グループII)27の生合成に関与するアエロモナスFGIは、luxCおよびluxEなどの脂肪酸合成に関与する酵素をコードするいくつかの遺伝子を含む。NCBIデータベースからのtblastnを使用して、A. piscicola AH-3(識別コードはOCA61121.1)のLuxCおよびそれをコードする遺伝子に対するオルソログタンパク質を見つける。
2. 鞭毛糖鎖付加島遺伝子におけるヌル変異体の生成
注:この突然変異誘発方法は、自殺ベクターpDM428 (GenBank:KC795686.1)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)インフレーム欠失産物の対立遺伝子交換に基づいている。pDM4ベクターの複製は λpir 依存性であり、ベクター上に位置する sacB 遺伝子を利用して完全な対立遺伝子交換が強制される。
- PCRインフレーム欠失産物の構築。
- 選択した遺伝子または欠失する領域の上流(AおよびBプライマー)および下流(CおよびDプライマー)を増幅する2組のプライマーを設計します(図2B)。
- プライマーAおよびDが、欠失する遺伝子の始点から上流に600 bp以上、停止から下流にそれぞれ600 bp以上あることを確認します。これら2つのプライマーは、pDM4でのクローニングを可能にするエンドヌクレアーゼの制限部位を5'末端に含む必要がある。
注:AおよびDプライマーの5'末端に含まれる制限部位は、ABまたはCDアンプリコン内の部位と同じであってはならない。 - プライマーBとCが、それぞれ削除対象の遺伝子内、または削除対象領域の最初と最後の遺伝子の内側にあることを確認します。両方のプライマー(BとC)がインフレームで、遺伝子内の5〜6コドンの間に位置することを確認します。さらに、両方のプライマーが、DNAアンプリコンABおよびCDを結合することを可能にする21bp相補配列(表1)を5'末端に含むことを確認する。
- 選択した アエロモナ ス株を5 mLのトリプシン大豆ブロス(TSB)中で30°Cで一晩(O/N)増殖させます。 ゲノムDNA精製には市販のキットを使用し、製造元の指示に従ってください(材料表)。精製したDNAの2 μLを分光光度計を用いて定量する。
注:二重蒸留水をブランクとして使用し、機器は260nmの吸光度を記録するように設定してください。2 μLの精製DNAで吸光度を3〜5回記録し、平均吸光度読み取り値を計算します。ここで、A = Ɛ.c.l. ここで、A = Ɛ.c.l. ここで、"A" は吸光度、"Ɛ" は DNA のモル平均吸光係数、"c" は DNA 濃度、"l" はパス長です (各機器のパス長については、メーカーの指示を参照)。 - A-BおよびC-Dプライマーを用いた2組の不斉PCRにおいて、100ngの精製染色体DNAを鋳型として使用する(材料表)。A:BおよびD:Cプライマー対の10:1モル比を使用する(補足材料)。
注: 非対称 PCR では、テンプレートの一方の鎖を他方の鎖よりも優先的に増幅できます。 - PCR産物を1%アガロースゲル中で電気泳動により分析する。TAE(40 mM トリスアセテート、1 mM EDTA)をゲルランニングバッファーとして使用し、8 V/cmの電力設定を行います。DNAを可視化するには、エチジウムブロマイド(0.5 μg/mL)をゲルに加え、バイオイメージングステーション(材料表)を使用してPCR産物を可視化します。
- メスを使用してゲルからアンプリコンを取り出し、製造業者のプロトコール(材料表)に従って精製し、それらを定量化する。
- ABおよびCDアンプリコンを、PCR産物の3'末端の21 bpのオーバーラップ配列で結合します(図3)。PCRチューブ内の各アンプリコン(ABおよびCD)の100 ngをPCR試薬(プレADのPCR)と混合するが、プライマーは含まず、サーモサイクラープログラム(補足資料)を使用して延長する。次に、100 μM の A プライマーと D プライマーを反応 (AD PCR) に追加し、単一のフラグメントとして増幅します (補足資料)。
- ステップ2.1.6に記載した条件を用いて1%アガロースゲル中の電気泳動によりPCR産物(ADアンプリコン)を分析し、ゲルからアンプリコンを切除し、製造業者のプロトコールに従って精製し、アンプリコンを定量する(材料表)。
- インフレーム欠失を有するpDM4組換えプラスミドの構築。
- pDM4を含む エシェリヒア・コリ cc18λ pir のO/N培養物を、クロラムフェニコール(25 μg/mL)とともにルリア・ベルタニ(LB)ミラーブロス(10 mL)中で30°Cで生育させる。
- 4°Cで5,000 x g で培養物をスピンダウンし、ペレットを600 μLの滅菌蒸留水に懸濁する。市販のプラスミド精製キットを用いてプラスミドpDM4の抽出および精製を行い、提供者の指示(材料表)に従う。
- 1 μgのpDM4と400 ngのADアンプリコンを、ADアンプリコンの両端とpDM4のクローニングサイトを消化できるエンドヌクレアーゼで2時間消化します(図3)。反応条件については酵素メーカーのプロトコール(材料表)に従ってください。
- DNA精製キットを使用して消化プラスミドとアンプリコンをクリーンアップし、製造元の指示に従って定量します(材料表)。
- 直鎖状pDM4の連結を防止するために、製造業者の指示に従ってアルカリホスファターゼ酵素を用いて両5'末端からリン酸基を除去する(材料表)。次に、処理したプラスミドをクリーンアップし、ステップ2.1.4(材料表)に記載されているように分光光度計を使用して定量します。
- 150 ngの消化およびホスファターゼアルカリ処理pDM4を、95〜100 ngの消化ADアンプリコンと1:4のモルベクター:インサート比で組み合わせます。ライゲーション反応を15μLの容量で調製し、製造元の指示に従ってください(材料表)。
- O/N を 20 °C で、または週末に 4 °C でインキュベートします。 インキュベーション後、T4リガーゼを70°Cで20分間不活化する。
- ライゲーションを使用して、エレクトロポレーションにより プラスミドをエシェリヒア・コリ MC1061λpir 株に導入した。電気担当細菌と2mmギャップのエレクトロポレーションキュベットを使用してください。
- エレクトロコンピテント 大腸菌 の作製とpDM4組換えプラスミドのエレクトロポレーション
- 大腸菌MC1061λpir株の単一コロニーをルリア・ベルタニ(LB)ミラーブロスに接種し、200rpm振とうしながら30°CでO/Nを増殖させる。
- 2 mLの細菌培養物を18 mLのLBブロスで希釈し、0.4〜0.6の間の光学密度(OD 600)が達成されるまで、振とう(200rpm)しながら30°Cでインキュベートする。
- 細菌培養物をペレット化し、5,000 x g および4°Cで15分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを40mLのチルド蒸留H2Oに懸濁する。
- この洗浄工程をさらに2回繰り返して、すべての培養塩を除去した。最後に、ペレットを4 mLのチルド蒸留H2Oに懸濁させ、1 mLの懸濁液を4本の円錐形1.5 mLマイクロフュージチューブのそれぞれに移す。
- ペレットは、細菌培養物を14,000 x g および4°Cで5分間遠心分離することにより行う。ペレットを乱すことなく上清を除去し、各ペレットを100μLのチルド蒸留H2Oに懸濁する。
- 3〜3.5 μLのライゲーション混合物を各チューブに加え、氷上で5分間インキュベートする。次いで、各チューブの内容物をチルド2mmギャップエレクトロポレーションキュベットに移し、2kV、129 Ω、および5ms付近の時定数を塗布する。
メモ:エレクトロポレーションキュベットを氷上で予冷してください。手順全体を通して氷上の細菌を維持します. - エレクトロポレーション後、4つのキュベットのそれぞれにSOC培地250 μLを加えて内容物を回収し、培養チューブ(約1 mL)に移し、振とう(200 rpm)しながら30°Cで1時間インキュベートする。
- 形質転換細胞をクロラムフェニコール(25 μg/mL)を添加したLuria-Bertani(LB)寒天プレートにプレートし、プレート内で増殖するすべてのコロニーがプラスミド骨格を有することを確認します。
- LB寒天プレートからクロラムフェニコールを含むいくつかのコロニーを選び、30°CでO / Nをインキュベートする。 コロニーが増殖したら、pDM4クローニング側に隣接するプライマー(pDM4forおよびpDM4rev)を用いたPCRによりpDM4への欠失構築物の挿入を確認し(表1)、コロニーを鋳型として溶解した(補足資料)。
- 滅菌爪楊枝でコロニーを1つ選び、15 μLの1% Triton X-100、20 mM Tris-HCl pH 8.0、2 mM EDTA pH 8.0を含む1.5 mLチューブに浸します。チューブを100°Cで5分間インキュベートし、次いで氷上で1分間インキュベートする。
- チューブをマイクロフュージで12,000 x g で10分間回転させ、細菌や破片をペレット化します。PCR反応の鋳型として上清1 μLを使用する(材料表)。プライマー対のアニーリング温度は50°Cであり、PCR反応には10%DMSO(補足材料)が必要である。
- 目的の生成物を増幅したコロニーを10mLのLBブロスにクロラムフェニコール(25μg/mL)を接種し、30°CでO/Nを増殖させる。 培養物からプラスミドを抽出し、ステップ2.2.1~2.2.2に記載した。配列は製造者の指示に従いpDM4プライマーを用いた(材料表)。
- フレーム内削除の転送 Aeromonas 濾す
注:pDM4組換えプラスミドは、選択されたプラスミドに導入されなければならない Aeromonas 三親交配によるひずみ(図4). Aeromonas 株は、三親交配後に選択されるリファンピシン耐性でなければならない。したがって、選択した菌株を TSB 上で 30 °C、遠心分離機 2 mL、4 mL、および 6 mL の培養物を 5,000 x で増殖させます。 g 15分間、各ペレットを100 μLのTSBに懸濁し、リファンピシン(100 μg/mL)でTSAにプレートする。- 大 腸菌 MC1061λpirのO/N培養物を、25μg/mLクロラムフェニコール(ドナー株)を含むLB寒天上のpDM4組換えプラスミド、TSA上のア エロモナ ス株リファンピシン耐性を100μg/mLリファンピシン(レシピエント株)と共に、大 腸菌 HB101をLB寒天上のpRK2073プラスミドと共に、30°Cで80μg/mLスペクチノマイシン(ヘルパー株)を用いて調製する。
- コロニーが成長したら、ドナー、レシピエント、およびヘルパー株の同数のコロニー(10〜15コロニー)を、150μLのLBを含む3本のLBチューブに滅菌爪楊枝で穏やかに懸濁する。
- 次いで、LB寒天プレート上で、抗生物質なしで、3つの細菌懸濁液をレシピエント:ヘルパー:ドナー比5:1:1(レシピエント50μL、ドナー10μL、およびヘルパー10μL)で2滴に混合する。プレートを30°CでO/Nを上にしてインキュベートします。 組換えプラスミドを含まないドナー株を用いてコンジュゲーションのネガティブコントロールを行う。
注:ヘルパー株は、結合プラスミドpRK2073を運び、ア エロモナスへのpDM4の転写を補助する。渦を使用してドナー、レシピエント、およびヘルパー株を中断させ、ピリを壊さないようにしないでください。 - LB寒天プレートから菌を採取するには、LBブロス1mLを加え、滅菌ガラススプレッダーで広げ、菌液を得た。ピペットを使用して、細菌懸濁液を円錐形の1.5mLマイクロフュージチューブに移し、激しく渦巻きます。
- pDM4組換えプラスミドを含むレシピエントコロニーを選択するために、リファンピシン(100μg/mL)およびクロラムフェニコール(25μg/mL)を含むLB寒天プレート上の回収細菌懸濁液のプレート100μLをプレートした。
- マイクロフュージ中のサンプル200 μLおよび600 μLを5,000 x g で15分間スピンダウンし、ペレットを100 μLのLBブロスに懸濁し、リファンピシン(100 μg/mL)およびクロラムフェニコール(25 μg/mL)を含むLB寒天上にプレートする。すべてのプレートを30°Cで24〜48時間インキュベートする。
- 成長したコロニーを拾い上げ、リファンピシン(100 μg/mL)およびクロラムフェニコール(25 μg/mL)と共にLBプレートに移し、30°CでO/Nインキュベートする。 次いで、オキシダーゼ試験29によりコロニーがアエロモナスであることを確認し、E及びFプライマーを用いたPCRによりpDM4組換えプラスミドを特異的染色体領域に挿入(第1組換え)し(第1の組換え)、A及びDプライマーで増幅した領域外側に結合する(材料表)。ステップ 2.3.11 で説明したように、1 μL の溶解コロニーをテンプレートとして使用します。
- インフレーム欠失のための対立遺伝子交換を完了するために、組み込み自殺プラスミドを有するコロニーを第2の組換えに強制する。組換えコロニーを2mLのLB中で、10%スクロースを含み、抗生物質を含まないO/Nで30°Cで増殖させる。
- ステップ2.4.8からの細菌培養物のプレート100 μLをスクロース(10%)を含むLB寒天プレート上に配置した。また、100μLの異培養希釈液(10-2-10-4)をプレートし、30°CでO/Nをインキュベートする。
- pDM4の損失を確認するために、コロニーを拾い上げ、クロラムフェニコール(25μg/mL)の有無にかかわらずLBプレートに移し、それらを30°CでO/Nインキュベートし、次いでクロラムフェニコール感受性コロニーを選択する。
- E-Fプライマー対と1 μLの溶解コロニーを鋳型として用いたPCRにより、感受性コロニーを解析する(材料表 および 補足資料)。PCR産物が削除された構築物のサイズと相関したコロニーを選択する。
3. 運動性アッセイ
注:グリコシル化鞭毛を有するいくつかの細菌種では、グリコシル化またはグリカン組成のレベルの変化がフラジェリンの集合に影響を及ぼし、これは通常、運動性の低下または運動性の不在として反映される。したがって、2つの運動性アッセイをヌル変異体を用いて実施した。
- 液体培地中の運動性アッセイ
- アエロモナス株O/Nを1mLのTSB中で25~30°Cで培養する。 顕微鏡カバースライドを発掘したスライドに接着させるには、つまようじの先端で少量のシリコーンを拾い上げ、カバースライドの四隅に小さな滴を塗ります。次に、カバースライドの中央にアエロモナス培養液1 μLを堆積させ、新鮮なTSB培地(2 μL)の滴で混合する。
- 発掘したスライドをカバースライドの上に置きます。掘削物を堆積した落下物と一致させ、静かに押して、スライドを逆さまにします。
- 浸漬油を用いた100倍の対物レンズを有する光学顕微鏡(材料表)を用いた光学顕微鏡による水泳運動性を分析する。
注:アエロモナスの野生型株を陽性対照として使用する必要があります。ネガティブコントロールとして、クレブシエラ菌などの非鞭毛虫細菌を用いる。
- 半固体培地における運動性アッセイ
- アエロモナス株O/NをTSB(1mL)中、25~30°Cで培養する。 次いで、培養液3 μLを軟寒天プレート(1%トリプトン、0.5%NaCl、0.25%バクト寒天)の中心に移し、プレートを25-30°CでO/Nに面してインキュベートする。
- 定規を使用して、プレートの中心から周辺に向かって寒天を通る細菌の移動を測定します。
4. べん毛浄化
- 細菌表面に固定された鞭毛の単離
- アエロモナス株O/NをTSB(10mL)中、25~30°Cで培養する。 次いで、培養物をTSB(900mL)の入ったフラスコに展開し、振とう(200rpm)しながら25-30°CでO/Nを増殖させる。
- 5,000 x g で4°Cで20分間遠心分離機。 ペレットを20mLの100mMトリス塩酸緩衝液(pH7.8)に懸濁する。
- 固定鞭毛を除去するには、ガラスバー(直径2〜3mm)で渦の中で懸濁液を3〜4分間剪断し、次いで21Gシリンジに繰り返し(最低6回)通過させる。
- ペレット細菌は、4°Cで2回連続遠心分離:まず、8,000 x g で30分間。上清を除去し、18,000 x g で20分間遠心分離機で遠心分離した。遊離鞭毛を含む上清を集める。
- 上清を100,000 x g で4°Cで1時間超遠心分離し、ペレットを150 μLの100 mM Tris-HCl(pH 7.8)プラス2 mM EDTAバッファーに懸濁します。ペレットは鞭毛フィラメントを含む。
- ステップ4.1.5から再懸濁したペレット5~10 μLを12%SDS-ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動で分析し、クマシーブルー染色を用いてタンパク質を可視化します。
注: タンパク質電気泳動およびゲル染色については、製造元の指示に従ってください。糖鎖付加フラジェリンのポジティブコントロールとして、野生型株の精製鞭毛を使用する。鞭毛の濃縮画分を塩化セシウム(ClCs)勾配で精製する。
- 鞭毛を精製するための塩化セシウム勾配。
- 12.1gのCsClを27mLの蒸留H2Oと混合する。
- 鞭毛の濃縮画分(150 μL)を薄肉の超透明チューブ(14 mm x 89 mm)に移し(材料表)、12 mLのCsCl溶液で満たします。
- チューブを60,000 x g で超遠心し、スイングバケットローターで4°Cで48時間(材料表)。
- シリンジで鞭毛バンドをCsCl勾配に集め、100 mM Tris-HCl(pH 7.8)と2 mM EDTAに対して透析します。次いで、透析した鞭毛を、12%SDS−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動およびクマシーブルー染色(ステップ4.1.6)または質量分析によって分析する。
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Representative Results
この方法論は、鞭毛グリコシル化および鞭毛フィラメントの役割に影響を及ぼす可能性のある アエロモナ スの遺伝子または染色体領域においてヌル変異体を生成するための効果的なシステムを提供する(図1)。
このプロトコルは、推定FGIのバイオインフォマティクス同定から始まり、GTをコードする遺伝子がこの領域に存在する。アエロモナスでは、FGIの染色体位置は、プセウダミン酸の生合成に関与する遺伝子(pseIおよびpseC)、極性フラジェリン遺伝子、およびluxCの3種類の遺伝子の検出に基づいている。A. hydrophila AH-130などの極性鞭毛が単一のプセウダミン酸誘導体によってグリコシル化されている株は、FGIs群I27に位置するPSE遺伝子間にGTsをコードする遺伝子を有していない。このFGI群に属する菌株のほとんどは、この領域に隣接する極性フラジェリン遺伝子を示す。対照的に、A. piscicola AH-319のようなヘテロ多糖グリカンで極性鞭毛がグリコシル化された株は、luxCの下流にGTsをコードする異なる遺伝子を示し、FGI群IIのPSE遺伝子間に局在する27、およびそれらは必ずしも極性フラジェリン遺伝子に隣接しているわけではない(図2A)。
そこに含まれるべん毛ヘテロ多糖糖鎖の生合成に関与する領域と推定GTsの機能がnull変異体の構築により確認された。各変異体の生成には、A、B、C、Dの4つのプライマーが必要です(表1)。プライマーBは、遺伝子(fgi-4)またはクラスター(fgi-1)の開始から5~6コドン下流のアニール、およびプライマーAは、この遺伝子(fgi-4またはfgi-1)の開始から600~800bp上流にアニールする。プライマーCは、欠失する遺伝子(fgi−4)または最後の遺伝子(fgi−12)の最後の5〜6コドンの上流のアニール、およびプライマーDは、この遺伝子(fgi−4またはfgi−12)の停止から600〜800bp下流のアニールである(図2B)。A. piscicola AH-3のfgiクラスターおよびfgi-4の欠失のためのプライマーAおよびDは、それらの5'末端にエンドヌクレアーゼBamHIに対する制限部位を含有する(表1)。このエンドヌクレアーゼは、ABまたはCD PCR断片に内部標的を有さない。重要なステップの1つは、BおよびCプライマーの設計です。削除される遺伝子または断片の開いた読み取りフレームを壊さないように、両方ともインフレームでなければならない。BおよびCプライマーの5'末端にある21 bpの相補配列は、3'末端相補配列を有するABおよびCDアンプリコンの生成を可能にし、これらのアンプリコンの結合および拡張を可能にする。アンプリコンを結合および延長するPCRプログラムは、初期変性ステップと、アニーリング温度54°Cの5サイクル(補足材料)で構成されています。次いで、AおよびDプライマーの添加は、拡張断片の増幅を可能にする(図3)。BamHIの酵素作用は、BglIIで消化された自殺ベクターpDM4との結紮に適合する粘着性末端を有するアンプリコンを生じる。
pDM4がλpir依存性プラスミドであることを考慮して、ライゲーション産物を大腸菌株MC1061λpir(thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir)にエレクトロポレーションし、クロラムフェニコールプレートで選択した。pDM4は組換えクローンを選択する直接系を有さず、クローニング領域に隣接するpDM4プライマー対(pDM4forおよびpDM4rev)(表1および補足資料)を用いてコロニーをPCRにより分析した。pDM4を含まない大腸菌株MC1061λpirをPCR反応における陰性対照として用いた。
対立遺伝子交換を行うために、組換えpDM4プラスミドをレシピエント株 A.ピシコーラ AH-3に移した。多くの アエロモナ がエレクトロポレーションによって形質転換できないことを考えると、組換えpDM4は、三親交配を用いたコンジュゲーションによって転写された(図4)。トランスコンジュガントコロニーを選択するために、我々は、コンジュゲーション交配から アエロモナ ス株を選択することを可能にするリファンピシン耐性レシピエント株を使用する。さらに、選択されたコロニーは、 アエロモナスが オキシダーゼ陽性であるのに対し、 大腸菌 はオキシダーゼ陰性であるため、オキシダーゼ試験に提出された。第1および第2の組換えは、増幅領域(ABおよびCD断片)の外部プライマー(EおよびFプライマー)を用いたPCRによって確認した(表1、 補足資料、および 図5A)。
アエロモナスでは、極性鞭毛のグリコシル化は鞭毛フィラメントの組み立てに不可欠である。機能的極性鞭毛の存在を、GTs遺伝子または領域を欠失させた細菌コロニーの運動性アッセイを用いて分析した。光学顕微鏡アッセイは、液体培地中での遊泳運動性が野生型株と比較して両方の変異体において低下したことを示した。さらに、いずれも軟寒天上で運動性を解析したところ野生型株との関係で径方向拡大の減少を示した(図5B)。両方の変異体が泳ぐことができたが、野生型株に関連して運動性が低下していたことを考慮して、それらの極性鞭毛を精製し、フラジェリン分子量を12%SDSポリアクリルアミドゲルで分析した。この解析は、両方の変異体が野生型株よりも分子量の低い極性鞭毛を有することを示し(図5C)、これは鞭毛糖鎖の変化を示唆している。CsCl勾配によって精製された鞭毛(図5C)は、グリカン組成物を同定するための質量分析アッセイおよびバイオフィルム、接着、またはグリカンおよびグリカン組成物の役割を同定するための他のアッセイに使用されるヌル変異体において使用される。
図 1: この手順で使用されるステップの概要。 プロトコールに記載されたプロセスのスキームは、 アエロモナスの 鞭毛グリコシル化島、およびグリカン生合成に関与するGTsを同定する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:染色体領域のバイオインフォマティクス検出とプライマー設計 (a)A.ヒドロフィラAH-1およびA.ピシコーラAH-3で同定された染色体領域のスキーム。A. 親水性 AH-1べん毛糖鎖付加島は、鞭毛糖鎖がプセウダミン酸誘導体のみを有する菌株の代表であり、A. piscicola AH-3鞭毛糖鎖付加島は、鞭毛糖鎖がヘテロ多糖である菌株の代表である。黒色で表記された遺伝子はプセウダミン酸の生合成に関与しており、黄色と表記された遺伝子は推定GTsである。AおよびDプライマー中の青色のボックスは、エンドヌクレアーゼに対する制限結合部位を含む。BおよびCプライマー中の赤いボックスは、21bpの相補配列を含む。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:自殺プラスミドpDM4へのPCRインフレーム欠失およびライゲーションを構築する方法を示すスキーム。 MCS:マルチクローニングサイト、CmR:クロラムフェニコール耐性遺伝子、 sacB:スクロースによって誘導されグラム陰性菌に対して致死 的である枯草菌 レバンスクラーゼ、および mob: 動員遺伝子をコードする。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:対立遺伝子交換に用いた三親コンジュゲーションおよび手順。 最初の組換えは、アエロモナス株へのλpirの不在のために起こり、選択された遺伝子への組換えプラスミドの組み込みを引き起こす。第2の組換えは、10%スクロースによるLBの成長によって誘導され、これはsacB遺伝子の発現をもたらし、プラスミドは染色体から切り出される。交配後、野生型または変異遺伝子は細菌染色体上に残ることができる。ヌル変異体は、外部プライマーを用いたPCRにより選択される。リフR:リファンピシン耐性;CmR:クロラムフェニコール耐性;SpcR:スペクチノマイシン耐性。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ヌル変異体の確認と極性鞭毛の表現型解析。 (a)ピシコーラA.ピシコーラAH-3のfgi-4外部プライマー(EFプライマー)を用いたPCRを行い、クロラムフェニコール感受性コロニーにおける2回目の組換え後の対立遺伝子交換を確認した。レーンWT: A. ピシコーラ AH-3;レーン1〜8:第2の組換えのクロラムフェニコール感受性コロニー;セント:ハイパーラダー1 Kbマーカー。レーン1~3及び5~8はレーンWTとして野生型fgi-4遺伝子を有するコロニーを示し、レーン4は欠失したfgi-4遺伝子を有するコロニーを示す。 (B)25°Cにおけるfgi領域のA. piscicola AH-3およびfgi-4遺伝子(AH-3ΔFgi-4)のヌル変異体およびfgi領域のヌル変異体(AH-3ΔFgi-4)の軟寒天上の運動性(C)の極鞭毛を、AH-3(lane1)およびfgi領域のヌル変異体(レーン2)およびfgi-4遺伝子(レーン3)から単離し、CsCl勾配で精製し、12%SDS−PAGEで分析し、クーマシーブルーを用いて染色した。 サイズ標準(St)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| プライマー名 | 5' から 3' 方向のシーケンス | 使用対象 | ||
| A. ピシコーラ ああ-3 | ||||
| A-Flgi1 | CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA | fgi変異 体 | ||
| B-Flgi1 | CCCATCCACTAAACTTAAACAGATCACCTCGAACTCGAAA | |||
| C-Flgi12 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGGAACCTTAAATGCCATGA | |||
| D-Flgi12 | CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC | |||
| E-Flgi1 | ACCCGCTTCATTCGCTAT | |||
| エフ-フルギ12 | TCCGATTTTCTGACTCAGGG | |||
| A-Fgi4 | CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATGAA | fgi-4ミュータント | ||
| B-Fgi4 | CCCATCCACTAAACTTAAACACATATTATCTTGCCCCTGAT | |||
| C-Fgi4 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGATGGAGCTAATCACTCGTTT | |||
| D-Fgi4 | CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC | |||
| E-Fgi4 | ATTTCCCTGCCAAATACG | |||
| エフエフギ4 | CCTGCCAACAGGATGTAAG | |||
| pDM4 ベクトル | ||||
| pDM4フォー | AGTGATCTTCCGTCAGG | pDM4ベクトルへの挿入 | ||
| pDM4rev | AAGGTTTAACGG TTGTGGA | |||
表1:ヌル変異体の構築に用いたプライマー。 プライマーBおよびCにおける重複領域には下線が引かれている。 バムHIサイトはプライマーAおよびDにおいて太字で示されている。
補足資料。 ABおよびCDアンプリコンを得るための不斉PCRで使用される試薬および反応、ADアンプリコンを拡張および取得するためのPre-ADおよびADPCR、pDM4ベクターにおける欠失した構築物の挿入を検証するためのpDM4 PCR、および第1および第2の組換えを検証するためのEF PCRs。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法の重要な初期段階のステップは、鞭毛および推定GTのグリコシル化に関与する領域の同定であり、これらの酵素は高い相同性を示し、多くのプロセスに関与している。公開データベースにおける アエロモナ スゲノムのバイオインフォマティクス解析は、この領域が、多くの株のフラジェリン遺伝子を含み、プセウダミン酸の生合成に関与する遺伝子を含む極性鞭毛領域2に隣接していることを示している27。これにより、 アエロモナ スの鞭毛グリコシル化島を検出するためのガイドラインを開発し、鞭毛糖鎖がプセウダミン酸誘導体を含む他の細菌においてこの領域を同定することが可能となった。さらに、この方法は、鞭毛グリコシル化に関与する遺伝子クラスターを分析する方法を記載しているが、異なるグラム陰性細菌における鞭毛形成、回転、または調節に関与する可能性のあるタンパク質をコードする遺伝子を研究するためにも使用することができる。
PCRインフレーム欠失の生成において重要なのは、BおよびCプライマーの設計である。これらのプライマーは、欠失する選択された遺伝子または領域の開始(Bプライマー)および停止の上流(Cプライマー)の下流に5〜6コドンに局在するべきであり、オープンリーディングフレームを壊さないようにすべきである。さらに、考慮すべき重要な要素は、ABおよびCDアンプリコンを生成するために増幅された相同性領域の長さである。このプロトコルは、両方のアンプリコンがそれぞれ600〜800 bpのホモログ領域を含むことを推奨する。ホモログ領域が短いと、最初の組換えがより困難になる。
アエロモナ ス株は、pDM4自殺プラスミドを複製するために必要なラムダ ピル 遺伝子を保有していない。したがって、pDM4組換えプラスミドは染色体DNAに組み込まれなければならない。 三親交配後、最初の組換えが起こった細菌コロニーを特定することが重要です。これらのコロニーは、相同染色体領域に挿入された組換えpDM4を含有する。組換えコロニーの同定は、欠失させる領域を標的とする外部のプライマー(EおよびFプライマー)とのPCR反応を用いて行われる。標準的なDNAポリメラーゼを使用する場合、E-Fプライマーは野生型でのPCR産物の生成にのみつながります。このプライマー対は、pDM4組換えプラスミドが染色体DNAに挿入された細菌コロニーにおいて、いかなるPCR産物も産生しない。PCR産物の欠如は、EプライマーとFプライマーのアニーリング配列間の距離によるものである。この距離は、標準的なポリメラーゼでは増幅できません。しかし、他の因子もPCR産物の形成を妨げる可能性がある。したがって、第1の組換えコロニーは、長い断片増幅のためのDNAポリメラーゼによって、またはpDM4と外部プライマーからなるプライマーの対を用いたPCR反応によって同定することができる。大きな遺伝子クラスターが欠失すると、野生型株での増幅には、長い断片増幅のためにDNAポリメラーゼの使用が必要です。最初の組換えを有する細菌コロニーは、pDM4-外部プライマーのペアを用いたPCRによって同定することができる。しかし、第1および第2の組換えは、通常、同時に産生され、組換え後にpDM4を野生型または欠失遺伝子と共に残す。これにより、クロラムフェニコール耐性コロニーが得られ、その外部プライマーを用いたPCRは、欠失した遺伝子または断片と相関する野生型遺伝子の同一サイズのアンプリコンまたは小さなアンプリコンを与える。正しい組換えインサートを有することが示されたコロニーをスクロースと共にインキュベートし、非挿入pDM4を除去した。スクロースは、グラム陰性菌の致死酵素をコードするpDM4に位置する sacB 遺伝子の発現を誘導する。したがって、自殺プラスミドを欠くコロニーのみがスクロースを有するLBで増殖することになる。欠失した遺伝子を含むコロニーの同一性を支持するために、次いで、外部プライマー対で増幅された断片を配列決定することができる。
このインフレーム変異法をアエロモナスに実装することで、下流の遺伝子の発現レベルを変更することなく、より安定したヌル変異体を生成することができます。抗生物質カセットを挿入するなどの他の方法は、下流の遺伝子の転写を保証するが、発現レベルは変更することができる。さらに、この方法は、他のグラム陰性菌29、31、32、33を含む他の標的遺伝子および領域に外挿することができた。
いくつかの細菌株では、鞭毛に結合したグリカンの損失または修飾は、鞭毛アセンブリの不能または鞭毛フィラメントの不安定性をもたらし、極性鞭毛運動性の低下をもたらし得る。液体媒体中の運動性アッセイを使用して、非運動性表現型と運動性表現型を区別することは容易であるが、運動性の程度の違いを定量化することは困難であり得る。運動性プレートアッセイは、運動性の程度の違いを測定するために必要とされる。しかし、多くの中温性 アエロモナ ス株を含むいくつかの細菌種は、構成的な極性鞭毛に加えて、高粘性媒体またはプレート中で増殖すると誘導性側鞭毛を発現する。両方の鞭毛タイプは、半固体プレートにおける細菌運動性に寄与する。したがって、極性または側方鞭毛の改変は、遊走直径の減少をもたらすだけである。したがって、AH−3ΔFgiおよびAH−3ΔFgi−4変異体は、野生型株に関して減少した運動性のみを示す。極鞭毛の回転によって生じる運動性の評価を改善するためには、ヌル変異体の膨張径を野生型株だけでなく、極鞭毛を欠く変異株との関係で比較すべきである。さらに、グリカン残基の数の減少またはグリカン組成の変化は、グリコシル化フラジェリンの電気泳動運動性に影響を及ぼす。例えば、SDS-PAGEゲルを用いて観察される糖鎖付加鞭毛虫の分子量は、フラジェリンアミノ酸配列から予測されるよりも高く、その分子量の減少として糖鎖への破壊が観察される。場合によっては、フラジェリンタンパク質に対するグリカン修飾の変化は、SDS−PAGEを使用して検出できない場合がある。これらの場合、グリカンの存在および質量を確認するために、インタクトなタンパク質またはフラジェリンペプチドのいずれかの質量分析分析が必要であり得る。
アエロモナスおよび他のグラム陰性菌の病原性は、鞭毛の不在だけでなく、鞭毛グリカンの組成の変化によっても影響を受ける可能性がある。これらの変化は、生物的および非生物的表面への細菌相互作用、自己凝集、免疫応答の回避および/または炎症促進応答の誘導において役割を果たすことができる。したがって、鞭毛グリコシル化とアエロモナス病原性との関係を評価するためには、アドヒアランス、バイオフィルム形成、および炎症促進応答アッセイが必要である。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、カナダ国立研究評議会、プラン・ナシオナル・デ・イ・イ・コンペティティビダッド(スペイン、エコノミア・イ・コンペティビダド大臣)とカタルーニャ総局(Center de Referència en Biotecnologia)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
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