Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Генерация нулевых мутантов для выяснения роли бактериальных гликозилтрансфераз в бактериальной подвижности

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63231
Automatic Translation
1, 2,3, 2,4, 1
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

Summary

Здесь мы опишем построение нулевых мутантов Aeromonas в специфических гликозилтрансферазах или областях, содержащих гликозилтрансферазы, анализы подвижности и очистку жгутиков, выполненные для установления участия и функции их кодируемых ферментов в биосинтезе гликана, а также роль этого гликана в бактериальном патогенезе.

Abstract

Изучение гликозилирования у прокариот является быстро растущей областью. Бактерии содержат различные гликозилированные структуры на своей поверхности, гликаны которых составляют специфический для штамма штрих-код. Ассоциированные гликаны демонстрируют более высокое разнообразие в составе и структуре сахара, чем у эукариот, и играют важную роль в процессах распознавания бактерий-хозяев и взаимодействия с окружающей средой. У патогенных бактерий гликопротеины были вовлечены в разные стадии инфекционного процесса, а модификации гликана могут мешать специфическим функциям гликопротеинов. Однако, несмотря на успехи, достигнутые в понимании состава гликана, структуры и путей биосинтеза, понимание роли гликопротеинов в патогенности или взаимодействии с окружающей средой остается очень ограниченным. Кроме того, у некоторых бактерий ферменты, необходимые для гликозилирования белка, совместно используются с другими полисахаридными биосинтетическими путями, такими как липополисахаридные и капсульные биосинтетические пути. Функциональная важность гликозилирования была выяснена у нескольких бактерий путем мутации специфических генов, которые, как считается, участвуют в процессе гликозилирования, и изучения его влияния на экспрессию целевого гликопротеина и модифицирующего гликана. Мезофильные аэромоны имеют одно- и О-гликозилированный полярный жгутик. Жгутиковые гликаны показывают разнообразие в углеводном составе и длине цепи между штаммами Aeromonas. Тем не менее, все штаммы, проанализированные на сегодняшний день, показывают производное псеудаминовой кислоты в качестве связующего сахара, который модифицирует остатки серина или треонина. Производное псеудаминовой кислоты требуется для сборки полярных жгутиков, и его потеря влияет на адгезию, образование биопленки и колонизацию. Протокол, подробно описанный в этой статье, описывает, как конструкция нулевых мутантов может быть использована для понимания участия генов или областей генома, содержащих предполагаемые гликозилтрансферазы, в биосинтезе жгутикового гликана. Это включает в себя потенциал для понимания функции вовлеченных гликозилтрансфераз и роли гликана. Это будет достигнуто путем сравнения гликан-дефицитного мутанта со штаммом дикого типа.

Introduction

Гликозилирование белка было описано как у грамположительных, так и у грамотрицательных бактерий и состоит из ковалентного прикрепления гликана к аминокислотной боковойцепи 1,2. У прокариот этот процесс обычно происходит через два основных ферментативных механизма: O- и N-гликозилирование 3. При О-гликозилировании гликан присоединяется к гидроксильной группе остатка серина (Ser) или треонина (Thr). При N-гликозилировании гликан присоединяется к боковой цепи амидного азота остатка аспарагина (Asn) в трипептидных последовательностях Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, кроме пролина.

Гликаны могут принимать линейные или разветвленные структуры и состоят из моносахаридов или полисахаридов, ковалентно связанных гликозидными связями. У прокариот гликаны обычно демонстрируют разнообразие в составе и структуре сахара по сравнению с эукариотическими гликанами4. Кроме того, были описаны два различных пути бактериального гликозилирования, которые отличаются тем, как гликан собирается и переносится в акцепторный белок: последовательное и блоковое гликозилирование 5,6. Для последовательного гликозилирования сложный гликан накапливается непосредственно на белке путем последовательного добавления моносахаридов. При гликозилировании в блоке предварительно собранный гликан переносится в белок из липидно-связанного олигосахарида специализированной олигосахарилтрансферазой (OTase). Было показано, что оба пути участвуют в процессах N- и O-гликозилирования 7.

Гликозилирование белка играет роль в модуляции физико-химических и биологических свойств белков. Присутствие гликана может влиять на то, как белок взаимодействует со своим лигандом, что влияет на биологическую активность белка, но также может влиять на стабильность белка, растворимость, восприимчивость к протеолизу, иммуногенность и взаимодействия микроб-хозяин 8,9. Однако некоторые параметры гликозилирования, такие как количество гликанов, состав гликана, положение и механизм присоединения, также могут влиять на функцию и структуру белка.

Гликозилтрансферазы (ГТ) являются ключевыми ферментами в биосинтезе сложных гликанов и гликоконъюгатов. Эти ферменты катализируют образование гликозидной связи между фрагментом сахара из активированной донорской молекулы и специфическим акцептором субстрата. ГТ могут использовать как нуклеотиды, так и ненуклеотиды в качестве донорских молекул и нацеливаться на различные акцепторы субстрата, такие как белки, сахариды, нуклеиновые кислоты и липиды10. Поэтому понимание ГТ на молекулярном уровне важно для выявления их механизмов действия и специфичности, а также позволяет понять, как сахарный состав гликанов, которые модифицируют соответствующие молекулы, связаны с патогенностью. База данных активных ферментов углеводов (CAZy)11 классифицирует GT в соответствии с их гомологией последовательностей, что обеспечивает прогностический инструмент, поскольку в большинстве семейств GT структурная складка и механизмы действия инвариантны. Однако четыре причины затрудняют прогнозирование субстратной специфичности многих ГТ: 1) у прокариот не определен четкий мотив последовательности, определяющий специфичность субстрата12, 2) многие ГТ и ОТА показывают распущенность субстрата 13,14, 3) функциональные ГТ трудно получить при высоком выходе в рекомбинантной форме и 4) идентификация как донорских, так и акцепторных субстратов сложна. Несмотря на это, недавние исследования мутагенеза позволили получить значительные успехи в понимании каталитических механизмов и вычитании связывания ГТ.

У бактерий O-гликозилирование, по-видимому, более распространено, чем N-гликозилирование. Участки O-гликозилирования не показывают консенсусной последовательности, и многие из O-гликозилированных белков секретируются или белки клеточной поверхности, такие как жгутики, пили или аутотранспортеры1. Гликозилирование флагеллина показывает изменчивость в количестве акцепторных участков, составе гликана и структуре. Например, флагеллины Burkholderia spp имеют только один акцепторный участок, в то время как в Campylobacter jejuni жгутики имеют целых 19 акцепторных сайтов15,16. Кроме того, для некоторых бактерий гликан представляет собой один моносахарид, в то время как другие бактерии обладают гетерогенными гликанами, скомпрометированными различными моносахаридами с образованием олигосахаридов. Такая гетерогенность встречается даже среди штаммов одного вида. Хеликобактерные флагеллины модифицируются только псевдоминовой кислотой (PseAc)17, а флагеллины Campylobacter могут быть модифицированы PseAc, ацетамидиновой формой псеудаминовой кислоты (PseAm) или легионаминовой кислоты (LegAm), и гликанами, полученными из этих сахаров с ацетилом, N-ацетилглюкозамином или пропионными заменителями 18,19. В Aeromonas жгутики модифицируются гликанами, состав которых варьируется от одного производного кислоты PseAc до гетерополисахарида20, а присоединение гликанов к мономерам флагеллина всегда происходит через производное PseAc.

В целом, гликозилирование жгутиков имеет важное значение для сборки жгутиковой нити, подвижности, вирулентности и специфичности хозяина. Однако, в то время как флагеллины C. jejuni16, H. pylori17 и Aeromonas sp. 21 не может собираться в нить, если белковые мономеры не являются гликозилированными, Pseudomonas spp. и Burkholderia spp. 15 не требуют гликозилирования для сборки жгутиков. Кроме того, в некоторых штаммах C. jejuni изменения в сахарном составе жгутикового гликана влияют на взаимодействие бактерий с хозяином и могут играть роль в уклонении от определенных иммунных реакций16. Аутоагглютинация является еще одной фенотипической характеристикой, на которую влияют изменения в составе гликанов, связанных с жгутиками. Более низкая аутоагглютинация приводит к снижению способности образовывать микроколонии и биопленку22. У некоторых бактерий способность жгутиков вызывать провоспалительную реакцию была связана с жгутиковым гликозилированием. Таким образом, у P. aeruginosa гликозилированный жгутикеллин вызывает более высокую провоспалительную реакцию, чем у негликозилированный23.

Аэромоны являются грамотрицательными бактериями, повсеместно распространенными в окружающей среде, что позволяет им находиться на стыке всех компонентов One Health 24. Мезофильные аэромоны имеют один полярный жгутик, который конститутивно образуется. Более половины клинических изолятов также экспрессируют боковой флагеллин, индуцируемый в высоковязких средах или пластинах. Различные исследования связывают оба типа жгутиков с ранними стадиями бактериального патогенеза25. В то время как полярные жгутики, о которых сообщалось на сегодняшний день, являются O-гликозилированными при 5-8 Остатках Ser или Thr его центральных иммуногенных доменов, боковые жгутики не являются O-гликозилированными во всех штаммах. Хотя гликаны полярных жгутиков из разных штаммов демонстрируют разнообразие в своем углеводном составе и длине цепи20, было показано, что связывающий сахар является производным псеудаминовой кислоты.

Целью данной рукописи является описание способа получения нулевых мутантов в конкретных ГТ или хромосомных областях, содержащих ГТ, для анализа их участия в биосинтезе соответствующих полисахаридов и в бактериальной патогенности, а также роли самого гликана. В качестве примера мы идентифицируем и удаляем хромосомную область, содержащую GT Aeromonas , чтобы установить ее участие в гликозилировании полярного флагеллина и проанализировать роль гликана флагеллина. Показано, как удалить конкретный ГТ, чтобы установить его функцию в биосинтезе этого гликана и роль модифицированного гликана. Хотя используя Aeromonas в качестве примера, этот принцип может быть использован для идентификации и изучения островов гликозилирования жгутиков других грамотрицательных бактерий и анализа функции GT, участвующих в биосинтезе других гликанов, таких как липополисахарид O-антигена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Схематическое представление процедуры показано на рисунке 1.

1. Биоинформационная идентификация острова гликозилирования жгутиков (FGI) в Aeromonas

  1. Чтобы идентифицировать биосинтетические кластеры PseAc в геномах Aeromonas , используйте инструмент tblastn из базы данных NCBI26. Сначала извлеките ортологичные белки в PseC и PseI A. piscicola AH-3 (идентификационные коды OCA61126.1 и OCA61113.1) из баз данных секвенированных штаммов Aeromonas , а затем используйте инструмент tblastn для поиска их переведенных последовательностей нуклеотидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гены pse обрамляют FGI Aeromonas , с pseB и pseC , расположенными на одном конце кластера, и pseI на другом конце. Расположение остальных генов pse может отличаться от одной группы FGI к другой.
  2. Учитывая, что эти полярные гены флагеллина многих штаммов примыкают к FGI, используйте tblastn из базы данных NCBI, чтобы найти ортологичные белки к полярным жгутикам FlaA и FlaB A. piscicola AH-3 (идентификационные коды OCA61104.1 и OCA61105.1) и генам, которые их кодируют.
  3. Кроме того, ФГИ Aeromonas , участвующие в биосинтезе гетерополисахаридных гликанов (группа II)27 , содержат несколько генов, кодирующих ферменты, участвующие в синтезе жирных кислот, такие как luxC и luxE. Используйте tblastn из базы данных NCBI, чтобы найти ортологичные белки для LuxC A. piscicola AH-3 (идентификационный код OCA61121.1) и гена, который его кодирует.

2. Генерация нулевых мутантов в генах острова гликозилирования жгутиков

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод мутагенеза основан на аллельном обмене продуктов делеции полимеразной цепной реакции (ПЦР) в кадре с использованием вектора самоубийства pDM428 (GenBank: KC795686.1). Репликация вектора pDM4 лямбда-пир-зависима , а полный аллельный обмен принуждается с помощью гена sacB , расположенного на векторе.

  1. Построение продуктов для удаления ПЦР в рамке.
    1. Спроектируйте две пары праймеров, которые усиливают участки ДНК вверх по течению (праймеры A и B) и вниз по течению (праймеры C и D) выбранного гена или области, подлежащей удалению (рисунок 2B).
    2. Убедитесь, что праймеры A и D имеют более 600 bp вверх по течению от начала и вниз по течению от остановки, соответственно, гена или генов, подлежащих удалению. Эти два праймера должны включать в конце 5' участок ограничения для эндонуклеазы, который позволяет клонировать в pDM4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Участок ограничения, включенный в 5-футовый конец букварей A и D, не должен совпадать с участками в ампликонах AB или CD.
    3. Убедитесь, что праймеры B и C находятся внутри гена, подлежащего удалению, или внутри первого и последнего гена, соответственно, области, подлежащей удалению. Убедитесь, что оба праймера (B и C) находятся в кадре и расположены между 5-6 кодонами внутри гена. Кроме того, убедитесь, что оба праймера включают на 5' конце комплементарную последовательность 21 bp (таблица 1), которая позволяет объединить ампликоны ДНК AB и CD.
    4. Вырастите выбранный штамм Aeromonas в 5 мл триптического соевого бульона (TSB) в течение ночи (O/N) при 30 °C. Используйте коммерчески доступный комплект для геномной очистки ДНК и следуйте инструкциям производителя (Таблица материалов). Количественно оцените 2 мкл очищенной ДНК с помощью спектрофотометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте двойную дистиллированную воду в качестве заготовки, с прибором, установленным для регистрации поглощения при 260 нм. Запишите абсорбцию с 2 мкл очищенной ДНК в 3-5 раз и рассчитайте среднее показание абсорбции. Используйте закон Бира-Ламберта для расчета концентрации ДНК, где A = Ɛ.c.l., где «A» — поглощение, «Ɛ» — молярный средний коэффициент вымирания для ДНК, «c» — концентрация ДНК, а «l» — длина пути (см. инструкцию производителя для длины пути каждого инструмента).
    5. Используйте 100 нг очищенной хромосомной ДНК в качестве шаблона в двух наборах асимметричных ПЦР с праймерами A-B и C-D (Таблица материалов). Используйте молярное соотношение 10:1 пар праймеров A:B и D:C (дополнительный материал).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Асимметричные ПЦР позволяют предпочтительно амплодировать одну нить шаблона больше, чем другую.
    6. Анализ продуктов ПЦР методом электрофореза в 1% агарозном геле. Используйте TAE (40 мМ трис-ацетата, 1 мМ ЭДТА) в качестве гелевого рабочего буфера и с настройкой мощности 8 В/см. Чтобы визуализировать ДНК, добавьте бромид этидия (0,5 мкг/мл) в гель и визуализируйте продукты ПЦР с помощью станции биовизуализации (Таблица материалов).
    7. Иссечение ампликонов из геля с помощью скальпеля, очистка по протоколу производителя (Таблица материалов) и их количественная оценка.
    8. Соедините ампликоны AB и CD с помощью их перекрывающихся последовательностей 21 bp в 3'-конце продуктов ПЦР (рисунок 3). Смешайте 100 нг каждого ампликона (AB и CD) в ПЦР-трубке с реагентами ПЦР (pre-AD PCR), но без праймеров, и расширьте с помощью термоциклерной программы (Дополнительный материал). Затем добавляют 100 мкМ праймеров А и D к реакции (AD PCR) и усиливают в виде одного фрагмента (дополнительного материала).
    9. Проанализируйте продукт ПЦР (ампликон АД) методом электрофореза в 1% агарозном геле с использованием условий, описанных на этапе 2.1.6, исключите ампликон из геля, очистите в соответствии с протоколом производителя и количественно оцените ампликон (Таблица материалов).
  2. Построение рекомбинантной плазмиды pDM4 с внутрирамочной делецией.
    1. Вырастите культуру O/N Escherichia coli cc18λ pir , содержащую pDM4, в бульоне Миллера Luria-Bertani (LB) (10 мл) с хлорамфениколом (25 мкг/мл) при 30 °C.
    2. Открутите культуру при 5000 х г при 4 °C и суспендируйте гранулу в 600 мкл стерильной дистиллированной воды. Выполните экстракцию и очистку плазмиды pDM4 с использованием коммерчески доступного комплекта для очистки плазмид в соответствии с инструкциями поставщика (Таблица материалов).
    3. Переваривает 1 мкг pDM4 и 400 нг ампликона AD в течение 2 ч с эндонуклеазой, способной переваривать оба конца ампликона AD и место клонирования pDM4 (рисунок 3). Следуйте протоколу производителя фермента для условий реакции (Таблица материалов).
    4. Очистите переваренную плазмиду и ампликон с помощью набора для очистки ДНК и количественно оцените их в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов).
    5. Чтобы предотвратить религирование линеаризированного pDM4, удалите фосфатную группу с обоих 5' концов с помощью фермента щелочной фосфатазы в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов). Затем очистите обработанную плазмиду и количественно оцените ее с помощью спектрофотометра, как описано на этапе 2.1.4 (Таблица материалов).
    6. Смешайте 150 нг переваренного и фосфатазно-щелочного обработанного pDM4 с 95-100 нг переваренного ампликона AD при молярном соотношении вектор:вставка 1:4. Готовят реакцию лигирования в объеме 15 мкл, следуя инструкциям производителя (Таблица материалов).
    7. Инкубируйте O/N при 20 °C или в выходные дни при 4 °C. После инкубации инактивируют Т4-лигазу при 70°С в течение 20 мин.
    8. Используют лигирование для введения плазмиды в штамм Escherichia coli MC1061λpir методом электропорации. Используйте электрокомпетентные бактерии и 2-миллиметровые электропорационные кюветы.
  3. Получение электрокомпетентной кишечной палочки и электропорация рекомбинантной плазмиды pDM4
    1. Инокулируют одну колонию штамма E. coli MC1061λpir в бульон Миллера Luria-Bertani (LB) и выращивают O/N при 30 °C с встряхиванием 200 об/мин.
    2. Развести 2 мл бактериальной культуры в 18 мл бульона LB и инкубировать при 30 °C с встряхиванием (200 об/мин) до достижения оптической плотности (OD600) между 0,4-0,6.
    3. Гранулирование бактериальной культуры центрифугированием при 5,000 х г и 4 °C в течение 15 мин. Выбрасываем супернатант и суспендируем гранулу в 40 мл охлажденного дистиллированногоH2O.
    4. Повторите этот этап очистки еще два раза, чтобы удалить все соли культуры. Наконец, суспендировать гранулу в 4 мл охлажденного дистиллированногоH2Oи перенести 1 мл суспензии в каждую из четырех конических микрофьюжных трубок по 1,5 мл.
    5. Гранулирование бактериальной культуры центрифугированием при 14 000 х г и 4 °C в течение 5 мин. Удалите супернатант, не нарушая гранулу, и суспендируйте каждую гранулу в 100 мкл охлажденного дистиллированногоH2O.
    6. Добавить в каждую пробирку 3-3,5 мкл лигативной смеси и инкубировать на льду в течение 5 мин. Затем перенесите содержимое каждой трубки в охлажденную электропорационную кювету с зазором 2 мм и нанесите 2 кВ, 129 Ω и постоянную времени около 5 мс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно охладите электропорационные кюветы на льду. Поддерживайте бактерии на льду в течение всей процедуры.
    7. После электропорации добавляют 250 мкл среды SOC к каждой из четырех кювет для извлечения их содержимого, переносят их в культуральную трубку (около 1 мл) и инкубируют в течение 1 ч при 30 °C с встряхиванием (200 об/мин).
    8. Пластинчатые трансформированные клетки на агаровых пластинах Лурии-Бертани (LB), дополненных хлорамфениколом (25 мкг / мл), чтобы гарантировать, что все колонии, растущие в пластине, имеют плазмидную основу.
    9. Выберите несколько колоний из пластин агара LB с хлорамфениколом и инкубата O/N при 30 °C. Когда колонии растут, проверьте вставку конструкции делеции в pDM4 с помощью ПЦР, используя праймеры, которые обрамляют сторону клонирования pDM4: pDM4for и pDM4rev (таблица 1), и лизированные колонии в качестве шаблона (Дополнительный материал).
    10. Выберите одну колонию стерильной зубочисткой и окуните ее в трубку объемом 1,5 мл, содержащую 15 мкл 1% Triton X-100, 20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 2 мМ ЭДТА рН 8,0. Инкубировать пробирки при 100 °C в течение 5 мин, а затем 1 мин на льду.
    11. Раскрутите трубки в микрофуге по 12 000 х г в течение 10 мин до гранул бактерий и мусора. Используйте 1 мкл супернатанта в качестве шаблона в реакции ПЦР (Таблица материалов). Температура отжига пары праймеров составляет 50 °C, а реакция ПЦР требует 10% DMSO (дополнительного материала).
    12. Инокулируют колонии, которые усиливали интересующий продукт в 10 мл бульона LB, хлорамфениколом (25 мкг/мл) и выращивают O/N при 30 °C. Извлеките плазмиду из культур, как описано в шагах 2.2.1-2.2.2. Последовательность использования грунтовок pDM4 в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов).
  4. Перенос внутрифреймового удаления в Aeromonas напряжение
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантная плазмида pDM4 должна быть введена в выбранную Aeromonas штамм путем спаривания с тремя родителями (Рисунок 4). Aeromonas штамм должен быть устойчивым к рифампицину, чтобы быть выбранным после трехродительского спаривания. Поэтому выращивайте выбранные штаммы O/N на TSB при 30 °C, центрифугах 2 мл, 4 мл и 6 мл культур при 5000 x g в течение 15 мин суспендировать каждую гранулу в 100 мкл TSB, а пластину в TSA с рифампицином (100 мкг/мл).
    1. Готовят O/N культуры E. coli MC1061λpir с рекомбинантной плазмидой pDM4 на агаре LB с хлорамфениколом 25 мкг/мл (донорский штамм), штамма Aeromonas , резистентного к рифампицину на TSA со 100 мкг/мл рифампицина (штамм реципиента), и E. coli HB101 с плазмидой pRK2073 на агаре LB со 80 мкг/мл спектиномицина (вспомогательный штамм) при 30 °C.
    2. Когда колонии вырастут, приостановите такое же количество колоний (10-15 колоний) донора, реципиента и вспомогательного штаммов осторожно стерильной зубочисткой в трех трубочках LB со 150 мкл LB.
    3. Затем, на агаровой пластине LB, без антибиотиков, смешайте три бактериальные суспензии в двух каплях у реципиента: соотношение помощник: донор 5: 1: 1 (50 мкл реципиента, 10 мкл донора и 10 мкл помощника). Инкубируйте пластину лицевой стороной вверх O/N при 30 °C. Осуществляют отрицательный контроль конъюгации с помощью донорского штамма без рекомбинантной плазмиды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вспомогательный штамм несет конъюгативную плазмиду pRK2073 и способствует переносу pDM4 в Aeromonas. Не используйте вихрь, чтобы приостановить донорские, реципиентные и вспомогательные штаммы, чтобы избежать разрушения пили.
    4. Соберите бактерии с агаровой пластины LB, добавив 1 мл бульона LB и распространив его стерильным стеклянным разбрасывателем для получения бактериальной суспензии. Используйте пипетку, чтобы перенести бактериальную суспензию в коническую микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл и энергично вихрь.
    5. Для отбора колоний-реципиентов, содержащих рекомбинантную плазмиду pDM4, пластину 100 мкл собранной бактериальной суспензии на пластинах агара LB с рифампицином (100 мкг/мл) и левомицетином (25 мкг/мл).
    6. Раскрутите 200 мкл и 600 мкл образцов в микрофуге при 5000 х г в течение 15 мин, суспендируйте гранулу в 100 мкл бульона LB и пластине на агаре LB с рифампицином (100 мкг/мл) и хлорамфениколом (25 мкг/мл). Инкубировать все пластины в течение 24-48 ч при 30 °C.
    7. Подберите выращенные колонии, переложите на пластины LB с рифампицином (100 мкг/мл) и хлорамфениколом (25 мкг/мл) и инкубируйте их O/N при 30 °C. Затем подтвердите, что колонии являются Aeromonas с помощью теста оксидазы29 и что рекомбинантная плазмида pDM4 была вставлена (первая рекомбинация) в конкретную хромосомную область с помощью ПЦР с использованием праймеров E и F (дополнительный материал), которые связываются за пределами области, усиленной праймерами A и D (Таблица материалов). Как описано на этапе 2.3.11, используйте в качестве шаблона 1 мкл лизированных колоний.
    8. Чтобы завершить аллельный обмен на внутрирамочную делецию, принудить колонии с интегрированной плазмидой самоубийства ко второй рекомбинации. Выращивать рекомбинантные колонии в 2 мл LB с 10% сахарозой и без антибиотиков, O/N при 30 °C.
    9. Пластина 100 мкл бактериальных культур со стадии 2.4.8 на пластине агара LB с сахарозой (10%). Кроме того, пластина 100 мкл различных культуральных разведений (10-2-10-4) и инкубация O/N при 30 °C.
    10. Чтобы подтвердить потерю pDM4, подберите колонии, перенесите на пластины LB с хлорамфениколом и без него (25 мкг/мл), инкубируйте их O/N при 30 °C, а затем выберите чувствительные к хлорамфениколу колонии.
    11. Анализ чувствительных колоний методом ПЦР с использованием пары праймеров E-F и 1 мкл лизированных колоний в качестве шаблона (Таблица материалов и дополнительного материала). Выберите колонии, продукт ПЦР которых коррелирует с размером удаленной конструкции.

3. Анализы подвижности

ПРИМЕЧАНИЕ: У некоторых видов бактерий с гликозилированными жгутиками модификации уровней гликозилирования или состава гликана влияют на сборку жгутиков, что обычно отражается как снижение подвижности или отсутствие подвижности. Поэтому с нулевыми мутантами были проведены два анализа подвижности.

  1. Анализ подвижности в жидких средах
    1. Культивирование штаммов Aeromonas O/N в 1 мл TSB при 25-30 °C. Чтобы приклеить горку крышки микроскопа к выкопанной горке, подберите небольшое количество силикона кончиком зубочистки и нанесите небольшую каплю на четыре угла затвора крышки. Затем нанесите 1 мкл культуры Aeromonas в середину слайда крышки и смешайте с каплей свежей среды TSB (2 мкл).
    2. Поместите выкопанную горку на горку крышки. Сопоставьте выемку с отложенной каплей, осторожно нажмите и переверните горку вверх дном.
    3. Анализ подвижности плавания с помощью световой микроскопии с помощью оптического микроскопа (Таблица материалов) со 100-кратным объективом с использованием погружного масла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм Aeromonas дикого типа должен использоваться в качестве положительного контроля. В качестве отрицательного контроля используйте небигепеллированную бактерию, такую как Клебсиелла.
  2. Анализ подвижности в полутвердых средах
    1. Культура штаммов Aeromonas O/N в TSB (1 мл) при 25-30 °C. Затем переложить 3 мкл культуры на центр мягкой агаровой пластины (1% триптона, 0,5% NaCl, 0,25% бактоагара) и инкубировать пластину лицевой стороной вверх O/N при 25-30 °C.
    2. Используя линейку, измерьте бактериальную миграцию через агар от центра пластины к периферии.

4. Очистка жгутиков

  1. Выделение жгутиков, закрепленных на бактериальной поверхности
    1. Культивирование штаммов Aeromonas O/N в TSB (10 мл) при 25-30 °C. Затем разверните культуру в колбу с TSB (900 мл) и дайте ей вырасти O/N при 25-30 °C с встряхиванием (200 об/мин).
    2. Центрифуга при 5 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Суспендировать гранулы в 20 мл буфера Tris-HCl 100 мМ (рН 7,8).
    3. Чтобы удалить закрепленные жгутики, срежьте суспензию в вихре со стеклянной планкой (диаметром 2-3 мм) в течение 3-4 мин, а затем пройдите повторно (минимум шесть раз) через шприц 21-G.
    4. Пеллетные бактерии двумя последовательными центрифугированием при 4 °C: сначала при 8000 х г в течение 30 мин. Удалите супернатант и центрифугу при 18 000 х г в течение 20 мин. Соберите супернатант, который содержит свободные жгутики.
    5. Ультрацентрифугируют супернатант при 100 000 х г в течение 1 ч при 4 °C и суспендируют гранулу в 150 мкл 100 мМ Tris-HCl (рН 7,8) плюс 2 мМ буфера ЭДТА. Гранула содержит жгутиковые нити.
    6. Анализируют 5-10 мкл ресуспендированной гранулы со стадии 4.1.5 методом электрофореза в 12% SDS-полиакриламидном геле и визуализируют белки с помощью синего окрашивания Coomassie.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям производителя по электрофорезу белка и окрашиванию гелем. В качестве положительного контроля гликозилированного жгутика используют очищенные жгутики штамма дикого типа. Очищают обогащенную фракцию жгутиков в градиенте хлорида цезия (ClCs).
  2. Градиент хлорида цезия для очищения жгутиков.
    1. Смешайте 12,1 г CsCl с 27 мл дистиллированногоH2O.
    2. Переложить обогащенную фракцию жгутиков (150 мкл) в тонкостенную сверхпрозрачную трубку (14 мм х 89 мм) (Таблица материалов) и заполнить ее 12 мл раствора CsCl.
    3. Ультрацентрифугирование трубы при 60 000 х г в течение 48 ч при 4 °C в качающемся роторе ковша (Таблица материалов).
    4. Соберите жгутиковую полосу в градиент CsCl с помощью шприца и диализуйте против 100 мМ Tris-HCl (рН 7,8) плюс 2 мМ ЭДТА. Затем анализируют диализованные жгутики электрофорезом в 12% SDS-полиакриламидном геле и синим окрашиванием Кумасси (этап 4.1.6) или масс-спектрометрией.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эта методология обеспечивает эффективную систему для генерации нулевых мутантов в генах или хромосомных областях Aeromonas , которые могут влиять на гликозилирование жгутиков и роль нитей жгутиков (рисунок 1).

Протокол начинается с биоинформатической идентификации предполагаемых FGI и генов, кодирующих GT, присутствующих в этом регионе. В Aeromonas хромосомное расположение FGI основано на обнаружении трех типов генов: генов, участвующих в биосинтезе псеудаминовой кислоты (pseI и pseC), генов полярного жгутика и luxC. Штаммы, чьи полярные жгутики гликозилируются одним производным псевдоминовой кислоты, таким как A. hydrophila AH-130, не имеют генов, кодирующих GT между генами pse , расположенными в FGI группы I27. Большинство штаммов, принадлежащих к этой группе FGI, показывают гены полярных флагеллинов, прилегающих к этой области. Напротив, штаммы, чьи полярные жгутики гликозилированы гетерополисахаридным гликаном, такие как A. piscicola AH-319, показывают различные гены, кодирующие GT ниже по течению от luxC, локализованные между генами PSE группы FGI II27, и они не всегда примыкают к генам полярного жгутика (рисунок 2A).

Область, участвующая в биосинтезе жгутиков гетерополисахарида гликана, и содержащаяся там функция предполагаемых ГТ была подтверждена построением нулевых мутантов. Для генерации каждого мутанта требуется четыре праймера: A, B, C и D (таблица 1). Праймер B отжигает 5-6 кодонов ниже по течению от начала гена (fgi-4) или первого гена кластера (fgi-1), подлежащего удалению, а праймер A отжигает 600-800 bp вверх по течению от начала этого гена (fgi-4 или fgi-1). Праймер C отжигает вверх по течению от последних 5-6 кодонов гена (fgi-4) или последнего гена кластера (fgi-12), подлежащих удалению, а праймер D отжигает 600-800 bp вниз по течению от остановки этого гена (fgi-4 или fgi-12) (рисунок 2B). Праймеры A и D для удаления кластера fgi и fgi-4 A. piscicola AH-3 содержат участок рестрикции для эндонуклеазы BamHI на их 5' концах (таблица 1). Эта эндонуклеаза не имеет внутренних мишеней в фрагментах AB или CD PCR. Одним из важных шагов является проектирование грунтовок B и C. Оба должны быть в кадре, чтобы не нарушать открытую рамку чтения гена или фрагмента, подлежащего удалению. Комплементарные последовательности 21 bp на 5' конце праймеров B и C позволяют генерировать ампликоны AB и CD с 3' концевыми комплементарными последовательностями, которые позволяют соединять и расширять эти ампликоны. Программа ПЦР для соединения и расширения ампликонов состоит из начальной стадии денатурализации и пяти циклов с температурой отжига 54 °C (дополнительный материал). Затем добавление праймеров A и D позволяет усилить расширенный фрагмент (рисунок 3). Ферментативное действие BamHI дает начало ампликону с липкими концами, совместимому для лигирования с вектором самоубийства pDM4, переваренным BglII.

Учитывая, что pDM4 является λpir-зависимой плазмидой, продукт лигирования был электропорирован в штамм E. coli MC1061λpir (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) и выбран в пластинах хлорамфеникола. pDM4 не имеет прямой системы для отбора рекомбинантных клонов, и колонии были проанализированы методом ПЦР с парой праймеров pDM4 (pDM4for и pDM4rev) (таблица 1 и дополнительный материал), которые обрамляют область клонирования. Штамм E. coli MC1061λpir без pDM4 использовался в качестве отрицательного контроля в реакции ПЦР.

Для выполнения аллельного обмена рекомбинантную плазмиду pDM4 перенесли к штамму-реципиенту A. piscicola AH-3. Учитывая, что многие аэромоны не трансформируются электропорацией, рекомбинантный pDM4 переносился путем сопряжения с использованием трехродительского спаривания (рисунок 4). Для отбора трансконъюгантных колоний мы используем устойчивый к рифампицину штамм-реципиент, который позволяет выбрать штамм Aeromonas из конъюгационного спаривания. Кроме того, отобранные колонии были подвергнуты тесту на оксидазу, потому что, в то время как Aeromonas является оксидазно-положительным, E. coli является оксидазой отрицательным. Первая и вторая рекомбинации были подтверждены ПЦР с внешними праймерами (E и F праймерами) амплифицированных областей (фрагменты AB и CD) (таблица 1, дополнительный материал, и рисунок 5А).

В Aeromonas гликозилирование полярных жгутиков имеет важное значение для сборки жгутиковой нити. Наличие функциональных полярных жгутиков было проанализировано с использованием анализов подвижности бактериальных колоний с удаленными генами или областью ГТ. Анализы световой микроскопии показали, что подвижность плавания в жидкой среде была снижена у обоих мутантов по сравнению со штаммом дикого типа. Кроме того, оба показали снижение радиального расширения по отношению к деформации дикого типа при анализе подвижности на мягком агаре (рисунок 5B). Учитывая, что оба мутанта были способны плавать, но с уменьшенной подвижностью по отношению к штамму дикого типа, их полярные жгутики были очищены, а молекулярная масса жгутика была проанализирована в 12% SDS-полиакриламидном геле. Этот анализ показал, что оба мутанта имеют полярные жгутики с более низкой молекулярной массой, чем штамм дикого типа (рисунок 5C), что предполагает изменения в гликанах жгутиков. Жгутики, очищенные градиентами CsCl (рисунок 5C), будут использоваться в масс-спектрометрических анализах для идентификации гликанная композиция и нулевых мутантов, используемых в биопленке, адгезии или других анализах для определения роли гликана и гликанная композиция.

Figure 1
Рисунок 1: Обзор шагов, используемых в этой процедуре. Схема процесса описана в протоколе идентификации жгутикового гликозилирования острова Aeromonas и ГТ, участвующих в биосинтезе гликанов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Биоинформационное обнаружение хромосомных областей и конструкция грунтовки. (A) Схема хромосомных областей, идентифицированных у A. hydrophila AH-1 и A. piscicola AH-3. А. гидрофила Остров гликозилирования жгутиков AH-1 является представителем штаммов, чей жгутик гликан имеет только производное псевдодинамиковой кислоты, а A. piscicola AH-3 flagella glycosylation island является представителем штаммов, чей жгутик гликан является гетерополисахаридом. Гены, обозначаемые черным цветом, участвуют в биосинтезе псевдодинамической кислоты, а те, которые обозначаются желтым цветом, являются предполагаемыми ГТ. (В) Схема хромосомного расположения пар праймеров, предназначенных для делеций ПЦР в кадре. Синие коробочки в праймерах A и D содержат сайт связывания ограничений для эндонуклеазы. Красные коробки в праймерах B и C содержат 21 bp комплементарных последовательностей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Схема, изображающая метод построения ПЦР в кадре делеций и лигации к суицидальной плазмиде pDM4. MCS: сайт мультиклонирования, CmR: гены, устойчивые к хлорамфениколу, sacB: кодирует Bacillus subtilis levansucrase, экспрессия которой индуцируется сахарозой и смертельна для грамотрицательных бактерий, и mob: мобилизационные гены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Триродительское спряжение и процедура, используемая для аллельного обмена. Первая рекомбинация происходит из-за отсутствия λpir в штаммах Aeromonas и приводит к интеграции рекомбинантной плазмиды в выбранный ген. Вторая рекомбинация индуцируется ростом LB с 10% сахарозой, что приводит к экспрессии гена sacB , и плазмида иссекается из хромосомы. После кроссовера дикий тип или мутировавший ген может остаться на бактериальной хромосоме. Нулевые мутанты отбираются методом ПЦР с внешними праймерами. RifR: устойчивый к рифампицину; CmR: устойчивый к хлорамфениколу; SpcR: резистентный к спектиномицину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Подтверждение нулевых мутантов и фенотипический анализ полярных жгутиков. (A) ПЦР с внешними праймерами fgi-4 (праймерами EF) A. piscicola AH-3 для подтверждения аллельного обмена после второй рекомбинации в чувствительных к хлорамфениколу колониях. Переулок WT: A. piscicola AH-3; полосы 1-8: чувствительные к хлорамфениколу колонии второй рекомбинации; St: Маркер HyperLadder 1 Кб. Полосы 1-3 и 5-8 показывают колонии с геном fgi-4 дикого типа как полосу WT. Полоса 4 показывает колонию с удаленным геном fgi-4 . (B) Подвижность на мягком агаре A. piscicola AH-3 и нулевых мутантах в области fgi (AH-3ΔFgi) и гене fgi-4 (AH-3ΔFgi-4) при 25 °C. (C) Полярный жгутик из AH-3 (lane1) и нулевые мутанты в области fgi (полоса 2) и ген fgi-4 (полоса 3), выделенные, очищенные в градиентах CsCl, проанализированные в 12% SDS-PAGE и окрашенные с использованием синего Coomassie. Размер стандартный (Ст). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Название грунтовки Последовательность в направлении от 5' до 3' Используется для
А. писцикола -3
А-Флги1 CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA Мутант fgi
Б-Флги1 CCCATCCACTAAACTTAAACA ГАТКАККТКГААКТЦГАААА
С-Флги12 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA
Д-Флги12 CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
Э-Флги1 ACCCGCTTCATTCGCTAT
Ф-Флги12 TCCGATTTTCTGACTCAGGG
А-Фги4 CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA Мутант fgi-4
Б-Фги4 CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT
С-Фги4 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT
Д-Фги4 CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
Е-Фги4 ATTTCCCTGCCAAATACG
Ф-Фги4 CCTGCCAACAGGATGTAAG
вектор pDM4
pDM4for AGTGATCTTCCGTCACAGG Вставки в вектор pDM4
pDM4rev AAGGTTTAACGG TTGTGGA

Таблица 1: Праймеры, используемые для построения нулевых мутантов. Перекрывающиеся области в грунтовках B и C подчеркнуты. Бам Сайт HI выделен жирным шрифтом в букварях A и D.

Дополнительные материалы. Реагенты и реакции, используемые в асимметричных ПЦР для получения ампликонов AB и CD, ПЦР Pre-AD и AD для расширения и получения ампликонов AD, pDM4 PCR для проверки вставки удаленной конструкции в вектор pDM4 и EF PCR для проверки первой и второй рекомбинации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Критическим ранним этапом этого метода является идентификация областей, участвующих в гликозилировании жгутиков и предполагаемых ГТ, поскольку эти ферменты показывают высокую гомологию и участвуют во многих процессах. Биоинформационный анализ геномов Aeromonas в общедоступных базах данных показывает, что эта область примыкает к области полярных жгутиков 2, которая содержит гены жгутика во многих штаммах и содержит гены, участвующие в биосинтезе псевдомининовой кислоты27. Это позволило разработать руководство по обнаружению островов гликозилирования жгутиков в Aeromonas , которое может быть использовано для идентификации этого региона у других бактерий, жгутиковый гликан которых содержит производные псевдоаминовой кислоты. Кроме того, хотя этот метод описывает, как анализировать кластер генов, участвующий в гликозилировании жгутиков, он также может быть использован для изучения генов, кодирующих белки, которые могут быть вовлечены в образование, вращение или регуляцию жгутиков у различных грамотрицательных бактерий.

Также важным в генерации ПЦР-удалений в кадре является конструкция праймеров B и C. Эти праймеры должны быть локализованы на 5-6 кодонов ниже по течению от начала (букварь B) и вверх по течению от остановки (C-праймер) выбранного гена или области, подлежащей удалению, и не должны нарушать открытую рамку чтения. Кроме того, важным фактором, который следует учитывать, является длина области гомологии, усиленной для генерации ампликонов AB и CD. Этот протокол рекомендует, чтобы оба ампликона содержали гомологическую область 600-800 bp каждый. Более короткие области гомолога делают первую рекомбинацию более сложной.

Штаммы Aeromonas не несут лямбда-пир-ген, который необходим для репликации плазмиды самоубийства pDM4. Поэтому рекомбинантная плазмида pDM4 должна интегрироваться в хромосомную ДНК. После трехродительского спаривания важно выявить бактериальные колонии, в которых произошла первая рекомбинация. Эти колонии содержат рекомбинантный pDM4, вставленный в гомологичную хромосомную область. Идентификацию рекомбинантных колоний проводят с помощью реакции ПЦР с праймерами (праймерами E и F), внешними по отношению к области, подлежащей удалению. Если используется стандартная ДНК-полимераза, праймеры E-F приведут только к генерации продукта ПЦР в диком типе. Эта пара праймеров не будет производить какой-либо продукт ПЦР в бактериальных колониях, в которых рекомбинантная плазмида pDM4 была вставлена в хромосомную ДНК. Отсутствие продукта ПЦР связано с расстоянием между последовательностями отжига E и F праймеров. Это расстояние не может быть усилено стандартными полимеразами. Однако другие факторы также могут препятствовать образованию продуктов ПЦР. Поэтому первые рекомбинантные колонии могут быть идентифицированы ДНК-полимеразами для амплификации длинных фрагментов или ПЦР-реакциями с использованием пар праймеров, состоящих из pDM4 и внешнего праймера. Когда большие генетические кластеры удаляются, амплификация в штамме дикого типа требует использования ДНК-полимераз для амплификации длинных фрагментов. Колонии бактерий с первой рекомбинацией могут быть идентифицированы методом ПЦР с pDM4-внешними парами праймеров. Однако первая и вторая рекомбинации обычно производятся одновременно, оставляя pDM4 с диким типом или с удаленным геном после рекомбинации. Это приводит к образованию резистентных к хлорамфениколу колоний, ПЦР которых с помощью внешних праймеров дают ампликоны с одинаковым размером гена дикого типа или небольшие ампликоны, которые коррелируют с удаленным геном или фрагментом. Колонии, которые, как было показано, имеют правильную рекомбинантную вставку, инкубировали с сахарозой для удаления невставленного pDM4. Сахароза индуцирует экспрессию гена sacB, расположенного на pDM4, который кодирует смертельный фермент для грамотрицательных бактерий. Поэтому только колонии, в которых отсутствует плазмида самоубийства, будут расти в LB с сахарозой. Чтобы поддержать идентичность колоний, содержащих удаленный ген, фрагмент, амплифицированный с помощью пары внешних праймеров, затем может быть секвенирован.

Реализация этого метода мутации в кадре в Aeromonas позволяет генерировать более стабильные нулевые мутанты без изменений в уровнях экспрессии последующих генов. Другие методы, такие как вставка антибиотической кассеты, обеспечивают транскрипцию последующих генов, но уровень экспрессии может быть изменен. Кроме того, этот метод может быть экстраполирован на другие целевые гены и области, включая другие грамотрицательные бактерии 29,31,32,33.

У некоторых бактериальных штаммов потеря или модификация гликана, связанного с жгутиками, может привести к невозможности сборки жгутиков или нестабильности нитей жгутиков, что приводит к снижению подвижности полярных жгутиков. Хотя легко отличить неподвижный фенотип от подвижного с помощью анализов подвижности в жидких средах, различия в степени подвижности могут быть трудно количественно оценить. Анализы пластин подвижности необходимы для измерения различий в степени подвижности. Однако некоторые виды бактерий, в том числе многие мезофильные штаммы Aeromonas , экспрессируют индуцируемые боковые жгутики при выращивании в высоковязких средах или пластинах, в дополнение к конститутивным полярным жгутикам. Оба типа жгутиков способствуют бактериальной подвижности в полутвердых пластинах. Поэтому модификации полярных или боковых жгутиков приводят только к уменьшению миграционных диаметров. Таким образом, мутанты AH-3ΔFgi и AH-3ΔFgi-4 демонстрируют лишь пониженную подвижность по отношению к штамму дикого типа. Чтобы улучшить оценку подвижности, создаваемой вращением полярных жгутиков, диаметр расширения нулевых мутантов следует сравнивать по отношению не только к штамму дикого типа, но и к мутанту, не имеющему полярного жгутика. Кроме того, уменьшение количества остатков гликана или изменение состава гликана влияет на электрофоретическую подвижность гликозилированных жгутиков. Например, молекулярная масса гликозилированных жгутиков, наблюдаемых с помощью гелей SDS-PAGE, выше, чем прогнозировалось по последовательности аминокислот флагеллина, а нарушения гликана наблюдаются по мере снижения их молекулярной массы. В некоторых случаях изменения в модификации гликана в белке флагеллина могут быть не обнаружены с помощью SDS-PAGE. В этих случаях для подтверждения наличия и массы гликана может потребоваться масс-спектрометрический анализ интактных белковых или флагеллиновых пептидов.

На патогенность Aeromonas, как и других грамотрицательных бактерий, может влиять отсутствие жгутика, а также изменения в составе жгутиков. Эти изменения могут влиять на бактериальное взаимодействие с биотическими и абиотическими поверхностями, аутоагглютинацию, играть роль в уклонении от иммунного ответа и / или индукции провоспалительного ответа. Поэтому для оценки взаимосвязи между гликозилированием жгутиков и патогенностью Aeromonas необходимы анализы адгезии, образования биопленки и провоспалительной реакции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным исследовательским советом Канады, Национальным планом I+D (Ministerio de Economía y Competitividad, Испания) и Женералитатом Каталонии (Centre de Referència en Biotecnologia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Applied Biosystems 4337455 Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity Invitrogen 12346-086 Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose Conda-Pronadise 8008 Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) Promega M1821 Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar Becton Dickinson 214010 Use for motility analysis
BamHI Promega R6021 Used for endonuclease restriction
BglII Promega R6081 Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System UVP Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase Bioline BIO-21040 Used for colony screening
Cesium chloride Applichem A1126,0100 Used for flagella purification
Chloramphenicol Applichem A1806,0025 Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit Cytivia 28-9034-71 Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA Applichem 131026.1211 Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap VWR 732-1133 Used for transformation
Ethidium bromide Applichem A1152,0025 Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker Bioline BIO-33053 DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit Invitrogen 10750204 Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar Condalab 996 Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth Condalab 1551 Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000 NanoDrop Techonologies Inc Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin Applichem A2220,0005 Used for triparental mating
SOC Medium Invitrogen 15544034 Used for electroporation recovery
Spectinomycin Applichem A3834,0005 Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman 331362 Used for flagella purification
T4 DNA ligase Invitrogen 15224017 Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar Condalab 1068 Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth Condalab 1224 Used for Aeromonas grown
Tryptone Condalab 1612 Use for motility analysis
Tris Applichem A2264,0500 Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100 Applichem A4975,0100 Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) Beckman 344059 Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler Applied Biosystems Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit Zymmo research D4020 Used for isolation of plasmid DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Tags

Иммунология и инфекция выпуск 181 О-гликозилирование гликозилтрансферазы гетерогликан мутанты в кадре мезофильные аэромоны жгутики очистка жгутиков градиент CsCl
Генерация нулевых мутантов для выяснения роли бактериальных гликозилтрансфераз в бактериальной подвижности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomás, J. M., Fulton, K. M.,… More

Tomás, J. M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Merino, S. Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility. J. Vis. Exp. (181), e63231, doi:10.3791/63231 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter