Summary
Her beskriver vi byggingen av nullmutanter av Aeromonas i spesifikke glykosyltransferaser eller regioner som inneholder glykosyltransferaser, motilitetsanalysene og flagellarensing utført for å etablere involvering og funksjon av deres kodede enzymer i biosyntesen til en glykan, samt rollen til denne glykanen i bakteriell patogenese.
Abstract
Studien av glykosylering i prokaryoter er et raskt voksende område. Bakterier har forskjellige glykosylerte strukturer på overflaten hvis glykaner utgjør en belastningsspesifikk strekkode. De tilhørende glykanene viser høyere mangfold i sukkersammensetning og struktur enn for eukaryoter og er viktige i bakteriell-vert anerkjennelsesprosesser og interaksjon med miljøet. I patogene bakterier har glykoproteiner vært involvert i ulike stadier av den smittsomme prosessen, og glykanmodifikasjoner kan forstyrre spesifikke funksjoner av glykoproteiner. Til tross for fremskrittene i forståelsen av glykansk sammensetning, struktur og biosynteseveier, forblir forståelsen av glykoproteinenes rolle i patogenisitet eller interaksjon med miljøet svært begrenset. Videre, i noen bakterier, deles enzymene som kreves for proteinglykosylering med andre polysakkaridbiosyntetiske veier, som lipopolysakkarid og kapselbiosyntetiske veier. Den funksjonelle betydningen av glykosylering har blitt belyst i flere bakterier gjennom mutasjon av spesifikke gener som antas å være involvert i glykosyleringsprosessen og studien av dens innvirkning på uttrykket av målglykoproteinet og modifiserende glykan. Mesofile Aeromonas har en enkelt og O-glykosylert polar flagellum. Flagellar glykaner viser mangfold i karbohydratsammensetning og kjedelengde mellom Aeromonas stammer. Imidlertid viser alle stammer analysert til dags dato et pseudaminsyrederivat som koblingssukkeret som endrer serin- eller treoninrester. Pseudaminsyrederivatet er nødvendig for polar flagellamontering, og tapet har innvirkning på vedheft, biofilmdannelse og kolonisering. Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen beskriver hvordan bygging av nullmutanter kan brukes til å forstå involvering av gener eller genomregioner som inneholder putative glykosyltransferaser i biosyntesen til en flagellar glykan. Dette inkluderer potensialet til å forstå funksjonen til glykosyltransferaser involvert og glykanens rolle. Dette oppnås ved å sammenligne glykanmangelmutanten med villtypestammen.
Introduction
Proteinglykosylering er beskrevet i både Gram-positive og Gram-negative bakterier og består av kovalent vedlegg av en glykan til en aminosyre sidekjede 1,2. I prokaryoter skjer denne prosessen vanligvis via to store enzymatiske mekanismer: O- og N-glykosylering3. Ved O-glykosylering er glykanen festet til hydroksylgruppen av en serin (Ser) eller treonin (Thr) rester. Ved N-glykosylering er glykanen festet til sidekjeden midt i nitrogenet til en asparagin (Asn) rester i tripeptidsekvensene Asn-X-Ser/Thr, hvor X kan være en hvilken som helst aminosyre unntatt prolin.
Glykaner kan vedta lineære eller forgrenede strukturer og består av monosakkarider eller polysakkarider som er kovalent forbundet med glykosidiske bindinger. I prokaryoter viser glykaner vanligvis mangfold i sukkersammensetning og struktur i forhold til eukaryote glykaner4. Videre er to forskjellige bakterielle glykosyleringsveier som varierer i hvordan glykanen monteres og overføres til akseptorproteinet blitt beskrevet: sekvensiell og en blokkglykosylering 5,6. For sekvensiell glykosylering er den komplekse glykanen bygget opp direkte på proteinet ved etterfølgende tilsetning av monosakkarider. I en blokk glykosylering overføres en forhåndsmontert glykan til proteinet fra en lipidbundet oligosakkarid av en spesialisert oligosakkaryltransferase (OTase). Begge veiene har vist seg å være involvert i N- og O-glykosyleringsprosesser7.
Proteinglykosylering har en rolle i modulering av proteinens fysisk-kjemiske og biologiske egenskaper. Tilstedeværelsen av en glykan kan påvirke hvordan proteinet samhandler med sin ligand, noe som påvirker proteinets biologiske aktivitet, men kan også påvirke proteinstabilitet, løselighet, følsomhet for proteolyse, immunogenisitet og mikrobevertinteraksjoner 8,9. Imidlertid kan flere glykosyleringsparametere, for eksempel antall glykaner, glykansammensetning, posisjon og festemekanisme, også påvirke proteinfunksjon og struktur.
Glykosyltransferaser (GTs) er de viktigste enzymene i biosyntesen av komplekse glykaner og glykokonjugater. Disse enzymene katalyserer den glykosidiske bindingsdannelsen mellom en sukkermoiety fra et aktivert donormolekyl og en bestemt substrat akseptor. GTer kan bruke både nukleotider og ikke-nukleotider som donormolekyler og målrette mot forskjellige substrat akseptorer, som proteiner, sakkarider, nukleinsyrer og lipider10. Derfor er det viktig å forstå GTs på molekylært nivå for å identifisere deres virknings- og spesifisitetsmekanismer, og muliggjør også å forstå hvordan sukkersammensetning av glykaner som endrer relevante molekyler er relatert til patogenisitet. Den karbohydrataktive enzymdatabasen (CAZy)11 klassifiserer GT-er i henhold til deres sekvens homologi, som gir et prediktivt verktøy siden, i de fleste av GT-familiene, er den strukturelle folden og virkningsmekanismene konstante. Imidlertid gjør fire grunner det vanskelig å forutsi substratspesifisitet av mange GTs: 1) ikke noe klart sekvensmotiv som bestemmer substratspesifisitet er bestemt i prokaryoter12, 2) mange GTs og OTases viser substrat promiscuity13,14, 3) funksjonelle GTs er vanskelig å produsere i høy avkastning i rekombinant form og 4) identifisering av både donor og akseptor substrater er kompleks. Til tross for dette har nyere mutagenesestudier gjort det mulig å oppnå betydelige fremskritt i forståelsen av katalytiske mekanismer og trekke fra binding av GTs.
I bakterier synes O-glykosylering å være mer utbredt enn N-glykosylering. O-glykosyleringsstedene viser ikke en konsensussekvens, og mange av O-glykosylerte proteiner utskilles eller celleoverflateproteiner, for eksempel flagelliner, pili eller autotransportører1. Flagellin glykosylering viser variasjon i antall akseptorområder, glykansk sammensetning og struktur. For eksempel har Burkholderia spp flagellins bare ett akseptorsted, mens i Campylobacter jejuni har flagellins så mange som 19 akseptorsteder15,16. Videre, for noen bakterier, er glykanen et enkelt monosakkarid, mens andre bakterier har heterogene glykaner kompromittert av forskjellige monosakkarider for å danne oligosakkarider. Denne heterogeniteten oppstår selv blant stammer av samme art. Helicobacter flagellins er bare modifisert av pseudaminsyre (PseAc)17, og Campylobacter flagellins kan endres av PseAc, acetamidinoformen av pseudaminsyren (PseAm) eller legionaminsyre (LegAm), og glykaner avledet fra disse sukkerene med acetyl, N-acetylglucosamin eller propioniske substitusjoner 18,19. I Aeromonas er flagelliner modifisert av glykaner hvis sammensetning spenner fra et enkelt PseAc syrederivat til et heteropolysakkarid20, og vedlegg av glykaner til flagellinmonomerer er alltid via et PseAc-derivat.
Generelt er glykosylering av flagellins avgjørende for flagellarfilamentmontering, motilitet, virulens og vertsspesifikkitet. Men mens flagellins av C. jejuni16, H. pylori17, og Aeromonas sp. 21 kan ikke samles i filament med mindre proteinmonomerene er glykosylerte, Pseudomonas spp. og Burkholderia spp. 15 krever ikke glykosylering for flagellamontering. Videre, i noen C. jejuni stammer, endringer i sukkersammensetningen av flagella glykan påvirke bakteriell-vert interaksjon og kan spille en rolle i å unngå visse immunresponser16. Autoagglutination er en annen fenotypisk egenskap påvirket av modifikasjoner i sammensetningen av glykaner forbundet med flagellins. En lavere autoagglutinasjon fører til en reduksjon i evnen til å danne mikrokolonier og biofilm22. I noen bakterier var flagellaens evne til å utløse en proinflammatorisk respons knyttet til flagellin glykosylering. Således, i P. aeruginosa, glykosylert flagellin induserer en høyere pro-inflammatorisk respons enn unglykosylert23.
Aeromonas er Gram-negative bakterier allestedsnærværende i miljøet, noe som gjør at de kan være i grensesnittet til alle One Health-komponenter 24. Mesofile Aeromonas har et enkelt polart flagellum, som er konstituativt produsert. Mer enn halvparten av kliniske isolasjoner uttrykker også lateral flagellin, inducible i medier eller plater med høy viskositet. Ulike studier har relatert begge flagellatyper med de tidlige stadiene av bakteriell patogenese25. Mens polar flagellins rapportert til dags dato er O-glykosylert på 5-8 Ser eller Thr rester av sine sentrale immunogene domener, laterale flagellins er ikke O-glykosylert i alle stammer. Selv om polar flagella glykaner fra forskjellige stammer viser mangfold i karbohydratsammensetningen og kjedelengden20, har koblingssukker vist seg å være et pseudaminsyrederivat.
Målet med dette manuskriptet er å beskrive en metode for å oppnå nullmutanter i spesifikke GTs eller kromosomale regioner som inneholder GTs for å analysere deres engasjement i biosyntesen av relevante polysakkarider og i bakteriell patogenisitet, samt glykanens rolle selv. Som et eksempel identifiserer og sletter vi en kromosomregion som inneholder GTer av Aeromonas for å etablere sitt engasjement i polar flagellin glykosylering og analysere rollen til flagellin glykan. Vi viser hvordan du sletter en bestemt GT for å etablere sin funksjon i biosyntesen til denne glykanen og rollen som modifisert glykan. Selv om du bruker Aeromonas som eksempel, kan prinsippet brukes til å identifisere og studere flagella glykosyleringsøyer av andre Gram-negative bakterier og analysere funksjonen til GTs involvert i biosyntesen til andre glykaner som O-antigen lipopolysakkarid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den skjematiske representasjonen av prosedyren vises i figur 1.
1. Bioinformatisk identifikasjon av flagella glykosyleringsøy (FGIer) i Aeromonas
- For å identifisere PseAc biosyntetiske klynger i Aeromonas genomer, bruk tblastnverktøyet fra NCBI database26. Først henter du ortopediske proteiner til PseC og PseI fra A. piscicola AH-3 (identifikasjonskodene er OCA61126.1 og OCA61113.1) fra databaser med sekvenserte Aeromonas-stammer , og bruk deretter tblastnverktøyet til å søke i de oversatte nukleotidsekvensene.
MERK: Pse-genene flankerer Aeromonas FGIer, med pseB og pseC plassert i den ene enden av klyngen og pseI i den andre enden. Plasseringen av resten av psegenene kan være forskjellig fra en FGI-gruppe til en annen. - Gitt at de polare flagellinske genene av mange stammer ligger ved siden av FGIene, bruk tblasten fra NCBI-databasen for å finne ortopediske proteiner til polarflaggellinene FlaA og FlaB av A. piscicola AH-3 (identifikasjonskodene er OCA61104.1 og OCA61105.1) og genene som koder dem.
- I tillegg inneholder Aeromonas FGIer involvert i biosyntesen av heteropolysakkaridiske glykaner (gruppe II)27 flere gener som koder enzymer involvert i fettsyresyntesen, som luxC og luxE. Bruk tblastn fra NCBI-databasen til å finne ortopediske proteiner til LuxC av A. piscicola AH-3 (identifikasjonskode er OCA61121.1) og genet som koder det.
2. Generering av null mutanter i flagella glykosyleringsøygener
MERK: Denne metoden for mutagenese er basert på allelisk utveksling av polymerasekjedereaksjon (PCR) in-frame slettingsprodukter ved hjelp av selvmordsvektoren pDM428 (GenBank: KC795686.1). Replikering av pDM4 vektor er lambda pir avhengig, og den komplette allelic utvekslingen er tvunget ved å bruke sakB genet ligger på vektoren.
- Bygging av PCR innramme sletting produkter.
- Design to par primere som forsterker DNA-regioner oppstrøms (A- og B-primere) og nedstrøms (C- og D-primere) av det valgte genet eller området som skal slettes (figur 2B).
- Sørg for at Primers A og D har mer enn 600 bp oppstrøms fra henholdsvis start og nedstrøms fra stoppet av genet eller genene som skal slettes. Disse to primerne må på slutten inkludere et begrensningssted for en endonuklease som tillater kloning i pDM4.
MERK: Begrensningsstedet som er inkludert i 5' enden av A- og D-primere, bør ikke være det samme som steder i AB- eller CD-amfiloner. - Sørg for at Primers B og C er innenfor genet som skal slettes eller inne i henholdsvis første og siste gen i regionen som skal slettes. Sørg for at begge primerne (B og C) er in-frame og plassert mellom 5-6 codons inne i genet. Videre må du sørge for at begge primerne ved 5' enden inkluderer en 21 bp komplementær sekvens (tabell 1) som gjør det mulig å bli med i DNA-amlikonene AB og CD.
- Øk den valgte Aeromonas-stammen i 5 ml tryptisk soyabuljong (TSB) over natten (O/N) ved 30 °C. Bruk et kommersielt tilgjengelig sett for genomisk DNA-rensing og følg produsentens instruksjoner (Materialfortegnelse). Kvantifisere 2 μL av det rensede DNA-et ved hjelp av et spektrofotometer.
MERK: Bruk dobbelt destillert vann som blankt, med instrumentet satt til å registrere absorbans ved 260 nm. Registrer absorbans med 2 μL renset DNA 3-5 ganger og beregn en gjennomsnittlig absorbansavlesning. Bruk Beer-Lambert-loven til å beregne DNA-konsentrasjonen, der A = Ɛ.c.l. der "A" er absorbans, "Ɛ" er molar gjennomsnittlig utryddelseskoeffisient for DNA, "c" er DNA-konsentrasjon, og "l" er banelengden (se produsentens instruksjon for banelengden til hvert instrument). - Bruk 100 ng renset kromosomalt DNA som mal i to sett med asymmetriske PCR-er med A-B- og CD-primere (Materialfortegnende tabell). Bruk et 10:1 molarforhold mellom A:B- og D:C-primerpar (tilleggsmateriale).
MERK: Asymmetriske PCR-er tillater fortrinnsforsterkning av den ene tråden i malen mer enn den andre. - Analyser PCR-produktene ved elektroforese i en 1% agarose gel. Bruk TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) som gelløpsbuffer og en effektinnstilling på 8 V/cm. For å visualisere DNA, tilsett ethidiumbromid (0,5 μg/ml) i gelen og visualiser PCR-produktene ved hjelp av en bioavbildningsstasjon (Materialtabell).
- Excise amplikonene fra gelen ved hjelp av en skalpell, rens etter produsentens protokoll (Materialtabell) og kvantifisere dem.
- Bli med AB- og CD-amlikoner med deres 21 bp overlappende sekvenser i 3' enden av PCR-produkter (figur 3). Bland 100 ng av hver amplikon (AB og CD) i et PCR-rør med PCR-reagenser (pre-AD PCR), men uten primere, og utvid ved hjelp av termocycler-programmet (Tilleggsmateriale). Tilsett deretter 100 μM A- og D-primere til reaksjonen (AD PCR) og forsterk som et enkelt fragment (tilleggsmateriale).
- Analyser PCR-produktet (AD-amplikon) ved elektroforese i en 1% agarose gel ved hjelp av forholdene beskrevet i trinn 2.1.6, sluk ampullen fra gelen, rens etter produsentens protokoll og kvantifisere amplicon (Tabell over materialer).
- Konstruksjon av pDM4 rekombinant plasmid med sletting i rammen.
- Voks en O/N-kultur av Escherichia coli cc18λ pir som inneholder pDM4 i Luria-Bertani (LB) Miller buljong (10 ml) med kloramfenikol (25 μg/ml) ved 30 °C.
- Spinn ned kulturen ved 5000 x g ved 4 °C og heng pelletsen i 600 μL sterilt destillert vann. Utfør ekstraksjon og rensing av plasmid pDM4 ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig plasmidrensesett, i følge leverandørens instruksjoner (Materialfortegnelse).
- Fordøye 1 μg pDM4 og 400 ng AD-amplikon i 2 timer med en endonuklease som kan fordøye begge ender av AD-amfinen og kloningsstedet til pDM4 (figur 3). Følg enzymprodusentens protokoll for reaksjonsforhold (Materialliste).
- Rydd opp i den fordøyde plasmiden og forsterkningen ved hjelp av et DNA-rensesett og kvantifisere dem i henhold til produsentens instruksjoner (Materialfortegnelse).
- For å forhindre religasjon av den lineariserte pDM4, fjern fosfatgruppen fra begge 5' endene ved hjelp av det alkaliske fosfatenzymet etter produsentens instruksjoner (Materialfortegnelse). Rydd deretter opp den behandlede plasmiden og kvantifisere den ved hjelp av et spektrofotometer som beskrevet i trinn 2.1.4 (Materialtabell).
- Kombiner 150 ng av den fordøyde og fosfatase alkaliske behandlet pDM4 med 95-100 ng fordøyd AD-amplikon ved en molar vektor: innsatsforhold på 1:4. Forbered ligasjonsreaksjonen i et volum på 15 μL, i henhold til produsentens instruksjoner (Materialliste).
- Inkuber O/N ved 20 °C eller i løpet av helgen ved 4 °C. Etter inkubasjon inaktiverer du T4-ligaene ved 70 °C i 20 minutter.
- Bruk ligasjon til å introdusere plasmid i Escherichia coli MC1061λpir belastning ved elektroporasjon. Bruk elektrokompetente bakterier og 2 mm-gap elektroporasjonspovetter.
- Fremstilling av elektrokompetent E. coli og elektroporasjon av pDM4 rekombinant plasmid
- Inokuler en enkelt koloni av E. coli MC1061λpir belastning i Luria-Bertani (LB) Miller buljong og vokse O / N ved 30 ° C med 200 rpm risting.
- Fortynn 2 ml av bakteriekulturen i 18 ml LB buljong og inkuber ved 30 °C med risting (200 o/min) til en optisk tetthet (OD600) mellom 0,4-0,6 oppnås.
- Pellet bakteriekulturen ved sentrifugering ved 5000 x g og 4 °C i 15 minutter. Kast supernatanten og heng pelletsen i 40 ml kjølt destillert H2O.
- Gjenta dette rengjøringstrinnet to ganger til for å fjerne alle kultursalter. Til slutt, suspendere pellet i 4 ml kjølt destillert H2O og overfør 1 ml av suspensjonen til hver av fire koniske 1,5 ml mikrofugerør.
- Pellet bakteriekulturen ved sentrifugering ved 14.000 x g og 4 °C i 5 min. Fjern supernatanten uten å forstyrre pelletsen og suspendere hver pellets i 100 μL kjølt destillert H2O.
- Tilsett 3-3,5 μL av ligasjonsblandingen til hvert rør og inkuber på is i 5 min. Overfør deretter innholdet i hvert rør til en kjølt 2 mm-gap elektroporerings-cuvette og påfør 2 kV, 129 Ω og tid konstant rundt 5 ms.
MERK: Forkjøl elektroporasjonsgnynttene på isen. Oppretthold bakteriene på is under hele prosedyren. - Etter elektroporasjon, tilsett 250 μL SOC medium til hver av de fire cuvettene for å gjenopprette innholdet, overfør dem til et kulturrør (ca. 1 ml), og inkuber i 1 time ved 30 °C med risting (200 o/min).
- Plate de transformerte cellene på Luria-Bertani (LB) agarplater supplert med kloramfenikol (25 μg / ml) for å sikre at alle kolonier som vokser i platen har den plasmide ryggraden.
- Velg noen kolonier fra LB agar plater med kloramfenikol og inkuber O / N ved 30 °C. Når koloniene vokser, må du kontrollere innsettingen av slettingskonstruksjonen i pDM4 av PCR ved hjelp av primere som flankerer pDM4-kloningssiden: pDM4for og pDM4rev (tabell 1) og lysede kolonier som mal (tilleggsmateriale).
- Velg en koloni med en steril tannpirker og dypp den i et 1,5 ml rør som inneholder 15 μL 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Inkuber rørene ved 100 °C i 5 minutter, og deretter 1 min på is.
- Snurr rørene i en mikrofunksjon på 12.000 x g i 10 min til pelletsbakterier og rusk. Bruk 1 μL av supernatanten som mal i PCR-reaksjonen (Materialfortegnelser). Glødetemperaturen til primerparet er 50 °C, og PCR-reaksjonen krever 10 % DMSO (tilleggsmateriale).
- Inokuler koloniene som forsterket produktet av interesse i 10 ml LB buljong med kloramfenikol (25 μg/ml) og vokse O/N ved 30 °C. Trekk ut plasmidet fra kulturer som beskrevet i trinn 2.2.1-2.2.2. Sekvens ved hjelp av pDM4-primerne i henhold til produsentens instruksjoner (Materialliste).
- Overføring av sletting i rammer til Aeromonas belastning
MERK: pDM4-rekombinant plasmid må innføres i den valgte Aeromonas belastning ved triparental parring (Figur 4). Aeromonas belastning må være rifampicinresistent for å bli valgt etter triparental parring. Derfor, vokse de valgte stammene O / N på TSB ved 30 °C, sentrifuge 2 ml, 4 ml og 6 ml kulturer ved 5000 x g i 15 min, suspendere hver pellets i 100 μL TSB, og plate i TSA med rifampicin (100 μg / ml).- Forbered O/N-kulturer av E. coli MC1061λpir med pDM4 rekombinant plasmid på LB agar med 25 μg/ml kloramfenikol (donorstamme), Aeromonas-stammen rifampicinresistent på TSA med 100 μg/ml rifampicin (mottakerstamme) og E. coli HB101 med pRK2073 plasmid på LB agar med 80 μg/ml spectinomycin (hjelperstamme) ved 30 °C.
- Når koloniene har vokst, suspendere samme antall kolonier (10-15 kolonier) av donor, mottaker og hjelper stammer forsiktig med en steril tannpirker i tre LB rør med 150 μL LB.
- Deretter, på en LB agar plate, uten antibiotika, bland de tre bakterielle suspensjonene i to dråper hos en mottaker: hjelper: donorforhold på 5: 1: 1 (50 μL mottaker, 10 μL av donoren og 10 μL hjelper). Inkuber platen med forsiden opp O/N ved 30 °C. Utfør negativ kontroll av konjugering ved hjelp av donorstammen uten rekombinant plasmid.
MERK: Hjelperstammen bærer den konjugative plasmid pRK2073 og hjelper overføringen av pDM4 til Aeromonas. Ikke bruk virvel til å suspendere donor-, mottaker- og hjelperstammene for å unngå å bryte piliene. - Høst bakterier fra LB agarplaten ved å tilsette 1 ml LB buljong og spre den med en steril glassspreder for å oppnå en bakteriell suspensjon. Bruk en pipette til å overføre bakteriell suspensjon til et konisk 1,5 ml mikrofugerør og virvel kraftig.
- For å velge mottakerkoloniene som inneholder pDM4-rekombinant plasmid, plate 100 μL av den høstede bakterielle suspensjonen på LB agarplater med rifampicin (100 μg/ml) og kloramfenikol (25 μg/ml).
- Spinn ned 200 μL og 600 μL av prøvene i en mikrofunksjon ved 5000 x g i 15 minutter, heng pelletsen i 100 μL LB buljong og tallerken på LB agar med rifampicin (100 μg/ml) og kloramfenikol (25 μg/ml). Inkuber alle plater i 24-48 timer ved 30 °C.
- Plukk opp de voksne koloniene, overfør til LB-plater med rifampicin (100 μg/ml) og kloramfenikol (25 μg/ml), og inkuber dem O/N ved 30 °C. Bekreft deretter at koloniene er Aeromonas ved oksidasetest29 og at pDM4 rekombinant plasmid ble satt inn (første rekombinasjon) i den spesifikke kromosomale regionen av PCR ved hjelp av E- og F-primerne (Tilleggsmateriale), som binder seg utenfor regionen forsterket med A- og D-primerne (Materialfortegnelse). Som beskrevet i trinn 2.3.11, bruk 1 μL lysed kolonier som mal.
- For å fullføre den alleliske utvekslingen for sletting i rammen, tvinge koloniene med den integrerte selvmordsplasmiden til en ny rekombinasjon. Dyrk de rekombinante koloniene i 2 ml LB med 10 % sukrose og uten antibiotika, O/N ved 30 °C.
- Plate 100 μL av bakteriekulturene fra trinn 2.4.8 på LB agar plate med sukrose (10%). Også plate 100 μL av forskjellige kulturfortynninger (10-2-10-4) og inkuber o / n ved 30 °C.
- For å bekrefte tapet av pDM4, plukk opp koloniene, overfør til LB-plater med og uten kloramfenikol (25 μg / ml), inkuber dem O / N ved 30 °C, og velg deretter kloramfenikolfølsomme kolonier.
- Analyser de følsomme koloniene av PCR ved hjelp av E-F primerparet og 1 μL lyskolonier som mal (Tabell over materialer og tilleggsmateriale). Velg koloniene der PCR-produktet er korrelert med størrelsen på den slettede konstruksjonen.
3. Motilitetsanalyser
MERK: I noen bakteriearter med glykosylert flagella påvirker modifikasjoner i nivåene av glykosylering eller glykansammensetning montering av flagelliner, som vanligvis gjenspeiles som en motilitetsreduksjon eller fravær av motilitet. Derfor ble to motilitetsanalyser utført med nullmutantene.
- Motilitetsanalyse i flytende medier
- Kultur Aeromonas stammer O/N i 1 ml TSB ved 25-30 °C. For å feste et mikroskopdeksel til en utgravd lysbilde, plukk opp en liten mengde silikon med spissen av en tannpirker og legg en liten dråpe på de fire hjørnene av dekselsklie. Deretter deponerer du 1 μL av Aeromonas-kulturen midt i dekselsklie og blander i en dråpe ferske TSB-medier (2 μL).
- Plasser en utgravd sklie på dekselsklie. Match utgravningen med avsatt dråpe, trykk forsiktig og snu lysbildet opp ned.
- Analyser svømmemotilitet ved lett mikroskop ved hjelp av et optisk mikroskop (Materialbord) med et 100x mål ved hjelp av nedsenkningsolje.
MERK: Den ville stammen av Aeromonas må brukes som positiv kontroll. Som en negativ kontroll, bruk en ikke-flagellated bakterie som Klebsiella.
- Motilitetsanalyse i halvfaste medier
- Kultur Aeromonas stammer O/N i TSB (1 ml) ved 25-30 °C. Deretter overfører du 3 μL av kulturen til midten av en myk agarplate (1% trypton, 0,5% NaCl, 0,25% bacto agar) og inkuberer platen med forsiden opp O / N ved 25-30 °C.
- Bruk en linjal til å måle bakterievandringen gjennom agaren fra platens senter mot periferien.
4. Flagella rensing
- Isolering av flagella forankret til bakterieoverflaten
- Kultur Aeromonas stammer O/N i TSB (10 ml) ved 25-30 °C. Utvid deretter kulturen til en kolbe med TSB (900 ml) og la den vokse O / N ved 25-30 °C med risting (200 o/min).
- Sentrifuge ved 5000 x g i 20 min ved 4 °C. Heng pelletsen i 20 ml 100 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,8).
- For å fjerne den forankrede flagellaen, skjær suspensjonen i en virvel med en glassstang (2-3 mm diameter) i 3-4 min, og pass deretter repeterende (minimum seks ganger) gjennom en 21-G sprøyte.
- Pelletsbakterier med to påfølgende sentrifuger ved 4 °C: først ved 8000 x g i 30 minutter. Fjern supernatanten og sentrifugen ved 18 000 x g i 20 minutter. Samle supernatanten, som inneholder gratis flagella.
- Ultracentrifuge supernatanten ved 100 000 x g i 1 t ved 4 °C og suspendere pelletsen i 150 μL 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) pluss 2 mM EDTA-buffer. Pellet inneholder flagellafilamenter.
- Analyser 5-10 μL av den resuspenderte pellet fra trinn 4.1.5 ved elektroforese i en 12% SDS-Polyacrylamide gel og visualiser proteinene ved hjelp av Coomassie blå farging.
MERK: Følg produsentens anvisninger for proteinelektroforese og gelfarging. Som en positiv kontroll av glykosylert flagellin, bruk renset flagella av villtypestammen. Rens den berikede brøkdelen av flagella i en cesiumklorid (CLCs) gradient.
- Cesium klorid gradient for å rense flagella.
- Bland 12,1 g CsCl med 27 ml destillert H2O.
- Overfør den berikede brøkdelen av flagella (150 μL) til et tynnvegget ultraklart rør (14 mm x 89 mm) (Materialbord) og fyll det med 12 ml CsCl-løsning.
- Ultracentrifuge røret på 60.000 x g i 48 timer ved 4 °C i en svingende bøtterotor (Materialbord).
- Samle flagellabåndet i CsCl-gradienten med en sprøyte og dialyze mot 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) pluss 2 mM EDTA. Deretter analyserer du dialyzed flagella ved elektroforese i en 12% SDS-Polyacrylamide gel og Coomassie blå farging (trinn 4.1.6) eller ved massespektrometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metodikken gir et effektivt system for å generere nullmutanter i gener eller kromosomale regioner i Aeromonas som kan påvirke flagellaglykosylering og rollen som flagellafilament (figur 1).
Protokollen starter med bioinformatisk identifisering av putative FGIer og genene som koder GTs presenterer i denne regionen. I Aeromonas er den kromosomale plasseringen av FGIer basert på påvisning av tre typer gener: gener involvert i biosyntesen av pseudaminsyren (pseI og pseC), polare flagellingener og luxC. Stammer hvis polare flagella er glykosylert av et enkelt pseudaminsyrederivat, som A. hydrophila AH-130, har ikke gener som koder GTs mellom psegenene som ligger i FGIs gruppe I27. De fleste stammene som tilhører denne FGI-gruppen viser polare flagellingener ved siden av denne regionen. Derimot viser stammer hvis polar flagella er glykosylert med en heteropolysakkaridglykan, som A. piscicola AH-319, forskjellige gener som koder GTs nedstrøms luxC, lokalisert mellom pse gener i FGIs gruppe II27, og de er ikke alltid tilstøtende til polare flagellingener (figur 2A).
Regionen som er involvert i biosyntesen av flagella heteropolysakkarid glykan og funksjonen til putative GTs inneholdt der ble bekreftet ved bygging av null mutanter. Genereringen av hver mutant krever fire primere: A, B, C og D (tabell 1). Primer B anneals 5-6 codons nedstrøms av starten av genet (fgi-4) eller første gen av klyngen (fgi-1) som skal slettes og primer A anneals 600-800 bp oppstrøms fra starten av dette genet (fgi-4 eller fgi-1). Primer C anneals oppstrøms for de siste 5-6 kodonene i genet (fgi-4) eller siste gen av klyngen (fgi-12) som skal slettes og primer D anneals 600-800 bp nedstrøms fra stoppet av dette genet (fgi-4 eller fgi-12) (Figur 2B). Primere A og D for sletting av fgi-klynge og fgi-4 av A. piscicola AH-3 inneholder et begrensningssted for endonuklease BamHI i deres 5' ender (tabell 1). Denne endonuclease har ingen interne mål i AB eller CD PCR fragmenter. Et viktig skritt er utformingen av B- og C-primere. Begge må være i rammen for ikke å bryte den åpne leserammen til gen eller fragment som skal slettes. De 21 bp komplementære sekvensene i 5' enden av B- og C-primerne tillater generering av AB- og CD-amplikoner med 3' end komplementære sekvenser, som tillater sammenføyning og utvidelse av disse amlikonene. PCR-programmet for å bli med og utvide amlikonene består av et innledende denaturaliseringstrinn og fem sykluser med en glødetemperatur på 54 °C (tilleggsmateriale). Deretter tillater tilsetningen av A- og D-primere forsterkning av det utvidede fragmentet (figur 3). Den enzymatiske virkningen av BamHI gir opphav til en amplikon med klissete ender som er kompatible for ligasjon med selvmordsvektoren pDM4 fordøyd med BglII.
Gitt at pDM4 er en λpir avhengig plasmid, ble ligationproduktet elektroporated inn i E. coli-stammen MC1061λpir (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) og valgt i kloramfenikolplater. pDM4 har ikke et direkte system for å velge rekombinante kloner, og kolonier ble analysert av PCR med et pDM4 primerpar (pDM4for og pDM4rev) (tabell 1 og tilleggsmateriale) som flankerer kloningsområdet. E. coli-stammen MC1061λpir uten pDM4 ble brukt som negativ kontroll i PCR-reaksjonen.
For å utføre den allelikiske utvekslingen ble den rekombinante pDM4-plasmiden overført til mottakerstammen A. piscicola AH-3. Gitt at mange Aeromonas ikke kan transformeres ved elektroporasjon, ble den rekombinante pDM4 overført ved konjugering ved hjelp av triparental parring (figur 4). For å velge de transkonjugante koloniene bruker vi en rifampicinresistent mottakerstamme, som gjør det mulig å velge Aeromonas-stammen fra konjugeringsparingen. Videre ble de valgte koloniene sendt til oksidasetesten fordi mens Aeromonas er oksidasepositiv, er E. coli oksidase negativ. Den første og andre rekombinasjonen ble bekreftet av PCR med eksterne primere (E- og F-primere) av forsterkede regioner (AB- og CD-fragmenter) (tabell 1, tilleggsmateriale og figur 5A).
I Aeromonas er glykosylering av polar flagellins avgjørende for montering av flagellarfilamentet. Tilstedeværelsen av funksjonell polar flagella ble analysert ved hjelp av motilitetsanalyser av bakteriekoloniene med slettede GTs gener eller region. Lette mikroskopianalyser viste at svømmemotiliteten i flytende medium ble redusert hos begge mutantene sammenlignet med den ville stammen. Videre viste begge en redusert radial ekspansjon i forhold til villtypestammen når motilitet ble analysert på myk agar (figur 5B). Gitt at begge mutantene var i stand til å svømme, men med redusert bevegelighet i forhold til den ville stammen, ble deres polare flagella renset, og flagellinmolekylærvekten ble analysert i en 12% SDS-polyakrylamidgel. Denne analysen viste at begge mutantene har polare flagelliner med lavere molekylvekt enn den ville stammen (figur 5C), noe som antyder endringer i flagella glykan. Flagella renset av CsCl-gradienter (figur 5C) vil bli brukt i massespektrometrianalyser for å identifisere glykansammensetning og nullmutanter som brukes i biofilm, vedheft eller andre analyser for å identifisere rollen til glykan- og glykansammensetningen.
Figur 1: Oversikt over trinnene som brukes i denne prosedyren. Ordningen av prosessen beskrevet i protokollen for å identifisere flagella glykosyleringsøya Aeromonas, og GTs involvert i glykan biosyntese. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bioinformatisk deteksjon av kromosomale regioner og primerdesign. (A) Ordning av kromosomale regioner identifisert i A. hydrofila AH-1 og A. piscicola AH-3. A. hydrofila AH-1 flagella glykosyleringsøy er representativ for stammer hvis flagella glykan bare har et pseudaminsyrederivat, og A. piscicola AH-3 flagella glykosyleringsøy er representativ for stammer hvis flagella glykan er et heteropolysakkarid. Gener betegnet i svart er involvert i biosyntesen av pseudaminsyre, og de betegnet gule er putative GTs. (B) Scheme of the chromosomal location of primer pairs designet for PCR in-frame slettinger. Blå bokser i A- og D-primere inneholder begrensningsbindingsstedet for en endonuclease. Røde bokser i B- og C-primere inneholder 21 bp komplementære sekvenser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Skjema som viser metoden for å konstruere PCR-slettinger og ligasjon i rammen til selvmordsplasmid pDM4. MCS: multi kloning sted, CmR: kloramfenikol resistente gener, sakB: koder Bacillus subtilis levansucrase, hvis uttrykk er indusert av sukrose og er dødelig for Gram-negative bakterier, og mob: mobilisering gener. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Triparental konjugering og prosedyre som brukes til allelikisk utveksling. Første rekombinasjon oppstår på grunn av fravær av λpir i Aeromonas-stammene og gir opphav til integreringen av den rekombinante plasmiden i det valgte genet. Andre rekombinasjon induseres av vekst i LB med 10% sukrose, noe som fører til uttrykk for sakB-gen , og plasmidet utskilles fra kromosomet. Etter cross-over kan den ville typen eller det muterte genet forbli på bakteriell kromosom. Nullmutanter velges av PCR med eksterne primere. RifR: rifampicin-resistent; CmR: kloramfenikolresistent; SpcR: spektrinomycinresistent. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bekreftelse av nullmutanter og fenotypisk analyse av polar flagella. (A) PCR med fgi-4 eksterne primere (EF primere) av A. piscicola AH-3 for å bekrefte allelutvekslingen etter andre rekombinasjon i kloramfenikolfølsomme kolonier. Lane WT: A. piscicola AH-3; baner 1-8: kloramfenikolfølsomme kolonier av den andre rekombinasjonen; St: HyperLadder 1 Kb-markør. Lanes 1-3 og 5-8 viser koloniene med wild-type fgi-4 gen som lane WT. Lane 4 viser en koloni med det slettede fgi-4 genet. (B) Motilitet på myk agar av A. piscicola AH-3 og null mutanter i fgi-regionen (AH-3ΔFgi) og fgi-4 gen (AH-3ΔFgi-4) ved 25 °C. (C) Polar flagellum fra AH-3 (lane1) og null mutanter i fgi-regionen (lane 2) og fgi-4 gen (lane 3), isolert, renset i CsCl gradienter, analysert i 12% SDS-PAGE, og farget ved hjelp av Coomassie blå. Størrelse standard (St). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primer-navn | Sekvens i retning 5 til 3 | Brukes til | ||
| A. piscicola AH-3 | ||||
| A-Flgi1 | CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA | fgi mutant | ||
| B-Flgi1 | CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA | |||
| C-Flgi12 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA | |||
| D-Flgi12 | CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC | |||
| E-Flgi1 | ACCCGCTTCATTCGCTAT | |||
| F-Flgi12 | TCCGATTTTCTGACTCAGGG | |||
| A-Fgi4 | CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA | fgi-4 mutant | ||
| B-Fgi4 | CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT | |||
| C-Fgi4 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT | |||
| D-Fgi4 | CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC | |||
| E-Fgi4 | ATTTCCCTGCCAAATACG | |||
| F-Fgi4 | CCTGCCAACAGGATGTAAG | |||
| pDM4 vektor | ||||
| pDM4for | AGTGATCTTCCGTCACAGG | Innsettinger i pDM4-vektoren | ||
| pDM4rev | AAGGTTTAACGG TTGTGGA | |||
Tabell 1: Primere som brukes til bygging av nullmutanter. Overlappende områder i primere B og C er understreket. Bam HI-nettstedet er fet i primere A og D.
Tilleggsmateriale. Reagenser og reaksjoner som brukes i asymmetriske PCR-er for å få AB- og CD-amfilon, pre-AD og AD PCRs for å utvide og oppnå AD-amfilon, pDM4 PCR-er for å verifisere innsetting av slettet konstruksjon i pDM4-vektor, og EF PCR-er for å verifisere den første og andre rekombinasjonen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det kritiske tidlige trinnet i denne metoden er identifisering av regioner som er involvert i glykosylering av flagella og putative GTs fordi disse enzymene viser høy homologi og er involvert i mange prosesser. Bioinformatisk analyse av Aeromonas-genomer i offentlige databaser viser at denne regionen ligger ved siden av polar flagella-regionen 2, som inneholder flagellingenene i mange stammer og inneholder gener involvert i biosyntesen av pseudaminsyre27. Dette har gjort det mulig å utvikle en retningslinje for å oppdage flagella glykosyleringsøyer i Aeromonas som kan brukes til å identifisere denne regionen i andre bakterier hvis flagellar glykan inneholder pseudaminsyrederivater. I tillegg, selv om denne metoden beskriver hvordan man analyserer en genklykosylering, kan den også brukes til å studere gener som koder proteiner som kan være involvert i flagelladannelse, rotasjon eller regulering i forskjellige Gram-negative bakterier.
Også viktig i genereringen av PCR-slettinger i rammen er utformingen av B- og C-primere. Disse primerne bør lokaliseres 5-6 codons nedstrøms start (B primer) og oppstrøms stopp (C primer) av det valgte genet eller regionen som skal slettes og bør ikke bryte den åpne leserammen. Videre er en viktig faktor å vurdere lengden på homologiregionen forsterket for å generere AB- og CD-amfilonene. Denne protokollen anbefaler at begge amlikonene inneholder en homologregion på 600-800 bp hver. Kortere homologregioner gjør den første rekombinasjonen mer utfordrende.
Aeromonas stammer bærer ikke lambda pir genet, som er nødvendig for å gjenskape pDM4 selvmord plasmid. Derfor må pDM4 rekombinant plasmid integreres i kromosomalt DNA. Etter triparental parring er det viktig å identifisere bakteriekoloniene der den første rekombinasjonen har skjedd. Disse koloniene inneholder den rekombinante pDM4 satt inn i den homologe kromosomale regionen. Identifisering av rekombinante kolonier utføres ved hjelp av en PCR-reaksjon med primere (E og F primere) utenfor regionen som er målrettet for å bli slettet. Hvis en standard DNA-polymerase brukes, vil E-F-primerne bare føre til generering av et PCR-produkt i villtypen. Dette primerparet vil ikke produsere noe PCR-produkt i bakteriekolonier der pDM4 rekombinant plasmid er satt inn i kromosomalt DNA. Mangelen på PCR-produkt skyldes avstanden mellom glødesekvensene til E- og F-primere. Denne avstanden kan ikke forsterkes av standard polymeraser. Imidlertid kan andre faktorer også forhindre dannelse av PCR-produkter. Derfor kan første rekombinante kolonier identifiseres av DNA-polymeraser for lang fragmentforsterkning eller ved PCR-reaksjoner ved hjelp av par primere som består av en pDM4 og en ekstern primer. Når store genetiske klynger slettes, krever forsterkning i villtypestammen bruk av DNA-polymeraser for lang fragmentforsterkning. Bakteriekolonier med den første rekombinasjonen kan identifiseres av PCR med pDM4-eksterne par primere. Imidlertid produseres første og andre rekombinasjoner vanligvis samtidig, og etterlater pDM4 med wild-type eller med det slettede genet etter rekombinasjon. Dette fører til kloramfenikolresistente kolonier hvis PCR ved hjelp av eksterne primere gir amlikoner med en identisk størrelse på villtypegenet eller små amlikoner, som korrelerer med det slettede genet eller fragmentet. Kolonier som viste seg å ha riktig rekombinant innsats ble inkubert med sukrose for å fjerne den ikke-innsatte pDM4. Sukrose induserer uttrykket av sakB-genet som ligger på pDM4, som koder et dødelig enzym for gram-negative bakterier. Derfor vil bare kolonier som mangler selvmordsplasmid vokse i LB med sukrose. For å støtte identiteten til kolonier som inneholder det slettede genet, kan fragmentet forsterket med det eksterne primerparet deretter sekvenseres.
Implementering av denne in-frame mutasjonsmetoden i Aeromonas tillater generering av mer stabile nullmutanter uten modifikasjoner i uttrykksnivåene til nedstrømsgener. Andre metoder, som å sette inn en antibiotikakassett, sikrer transkripsjon av nedstrømsgener, men uttrykksnivået kan endres. Videre kan denne metoden ekstrapoleres til andre målgener og -regioner, inkludert andre Gram-negative bakterier 29,31,32,33.
I noen bakteriestammer kan tap eller modifikasjon av glykan knyttet til flagelliner føre til manglende evne til flagellamontering eller ustabiliteten til flagellafilament, noe som fører til en reduksjon av polar flagellamotilitet. Selv om det er lett å skille en ikke-motil fenotype fra en motil ved hjelp av motilitetsanalyser i flytende medier, kan forskjeller i graden av motilitet være vanskelig å kvantifisere. Motility plateanalyser er nødvendig for å måle forskjeller i graden av motilitet. Imidlertid uttrykker noen bakterielle arter, inkludert mange mesofile Aeromonas-stammer , inducible lateral flagella når de vokser i høye viskøse medier eller plater, i tillegg til den konstitutive polar flagellaen. Begge flagellatyper bidrar til bakteriell bevegelighet i halvfaste plater. Derfor fører modifikasjoner av polar eller lateral flagella bare til reduksjoner i migrasjonsdiametrene. Dermed viser AH-3ΔFgi og AH-3ΔFgi-4 mutanter bare redusert bevegelighet i forhold til den ville typen belastning. For å forbedre evalueringen av motilitet produsert av rotasjonen av polar flagella, bør ekspansjonsdiameteren til nullmutanter sammenlignes i forhold til ikke bare den ville stammen, men også en mutant som mangler polar flagellum. Videre påvirker en reduksjon i antall glykanrester eller endringer i glykansammensetningen den elektroforetiske motiliteten til glykosylerte flagelliner. For eksempel er molekylvekten til glykosylerte flagelliner observert ved hjelp av SDS-PAGE geler høyere enn anslått fra flagellin aminosyresekvens, og forstyrrelser i glykan observeres som reduksjoner i molekylvekten. I noen tilfeller kan det hende at endringene i glykanmodifisering til flagellinproteinet ikke kan påvises ved hjelp av SDS-PAGE. I disse tilfellene kan massespektrometrianalyse av enten intakt protein eller flagellinpeptider være nødvendig for å bekrefte tilstedeværelsen og massen av glykan.
Patogenisitet av Aeromonas, så vel som andre Gram-negative bakterier, kan påvirkes av fravær av flagellum, men også av endringer i sammensetningen av flagella glykaner. Disse endringene kan påvirke bakteriell interaksjon med biotiske og abiotiske overflater, autoagglutinasjon, spille en rolle i å unngå immunrespons og / eller induksjon av proinflammatorisk respons. Derfor kreves tilslutning, biofilmdannelse og proinflammatoriske responsanalyser for å evaluere forholdet mellom flagella glykosylering og Aeromonas patogenisitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Research Council Canada, for Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spania) og for Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
- Schäffer, C., Messner, P.
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M.
- Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
- Guerry, P., Szymanski, C. M.
- Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
- Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W.
- Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
- Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
- Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
- Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
- Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
- Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
- Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
- Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
- Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
- McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
- Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
- Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
- Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
- Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
- Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
- Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
- Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
- Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
- Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
- Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
- Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
- Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
- Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
- Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).
