Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av nollmutanter för att belysa rollen som bakteriella glykosyltransferaser i bakteriell motilitet

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63231
Automatic Translation
1, 2,3, 2,4, 1
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

Summary

Här beskriver vi konstruktionen av nollmutanter av Aeromonas i specifika glykosyltransferaser eller regioner innehållande glykosyltransferaser, motilitetsanalyserna och flagellarening som utförs för att fastställa involveringen och funktionen hos deras kodade enzymer i biosyntesen av en glykan, liksom rollen för denna glykan i bakteriell patogenes.

Abstract

Studien av glykosylering i prokaryoter är ett snabbt växande område. Bakterier har olika glykosylerade strukturer på ytan vars glykaner utgör en stamspecifik streckkod. De associerade glykanerna visar högre mångfald i sockerkomposition och struktur än hos eukaryoter och är viktiga i bakteriell-värdigenkänningsprocesser och interaktion med miljön. I patogena bakterier har glykoproteiner varit involverade i olika stadier av den infektiösa processen, och glykanmodifieringar kan störa specifika funktioner hos glykoproteiner. Trots de framsteg som gjorts i förståelsen av glykankomposition, struktur och biosyntesvägar är förståelsen för glykoproteinernas roll i patogenicitet eller interaktion med miljön fortfarande mycket begränsad. Vidare delas i vissa bakterier de enzymer som krävs för proteinglykosylering med andra polysackaridbiosyntetiska vägar, såsom lipopolysackarid och kapselbiosyntetiska vägar. Den funktionella betydelsen av glykosylering har belysts i flera bakterier genom mutation av specifika gener som tros vara involverade i glykosyleringsprocessen och studien av dess inverkan på uttrycket av målglykoproteinet och den modifierande glykanen. Mesofila Aeromonas har en enda och O-glykosylerad polär flagellum. Flagellärglykaner visar mångfald i kolhydratsammansättning och kedjelängd mellan Aeromonas-stammar . Alla stammar som hittills analyserats visar emellertid ett pseudaminsyraderivat som det länkande sockret som modifierar serin- eller treoninrester. Pseudaminsyraderivatet krävs för polär flagellamontering, och dess förlust har en inverkan på vidhäftning, biofilmbildning och kolonisering. Protokollet som beskrivs i denna artikel beskriver hur konstruktionen av nollmutanter kan användas för att förstå involveringen av gener eller genomregioner som innehåller förmodade glykosyltransferaser i biosyntesen av en flagellär glykan. Detta inkluderar potentialen att förstå funktionen hos de involverade glykosyltransferaserna och glykanens roll. Detta kommer att uppnås genom att jämföra glykanbristmutanten med vildtypsstammen.

Introduction

Proteinglykosylering har beskrivits i både grampositiva och gramnegativa bakterier och består av den kovalenta bindningen av en glykan till en aminosyra sidokedja 1,2. I prokaryoter sker denna process vanligtvis via två stora enzymatiska mekanismer: O- och N-glykosylering 3. Vid O-glykosylering är glykanen bunden till hydroxylgruppen av en serin (Ser) eller treonin (Thr) rest. Vid N-glykosylering är glykanen bunden till sidokedjeamidkväve av en asparagin (Asn) rest inom tripeptidsekvenserna Asn-X-Ser / Thr, där X kan vara vilken aminosyra som helst utom prolin.

Glykaner kan anta linjära eller grenade strukturer och består av monosackarider eller polysackarider kovalent kopplade av glykosidbindningar. I prokaryoter visar glykaner vanligtvis mångfald i sockerkomposition och struktur i jämförelse med eukaryota glykaner4. Vidare har två olika bakteriella glykosyleringsvägar som skiljer sig åt i hur glykanen sätts ihop och överförs till acceptorproteinet beskrivits: sekventiell och en bloc glykosylering 5,6. För sekventiell glykosylering byggs den komplexa glykanen upp direkt på proteinet genom successiv tillsats av monosackarider. Vid en bloc glykosylering överförs en förmonterad glykan till proteinet från en lipidbunden oligosackarid genom ett specialiserat oligosackaryltransferas (OTase). Båda vägarna har visat sig vara involverade i N- och O-glykosyleringsprocesser 7.

Proteinglykosylering har en roll i modulering av de fysikalisk-kemiska och biologiska egenskaperna hos proteiner. Närvaron av en glykan kan påverka hur proteinet interagerar med sin ligand, vilket påverkar proteinets biologiska aktivitet, men kan också påverka proteinstabilitet, löslighet, mottaglighet för proteolys, immunogenicitet och mikrob-värdinteraktioner 8,9. Emellertid kan flera glykosyleringsparametrar, såsom antalet glykaner, glykansammansättning, position och bindningsmekanism, också påverka proteinfunktionen och strukturen.

Glykosyltransferaser (GT) är de viktigaste enzymerna i biosyntesen av komplexa glykaner och glykokonjugat. Dessa enzymer katalyserar den glykosidiska bindningsbildningen mellan en sockerdel från en aktiverad donatormolekyl och en specifik substratacceptor. GT kan använda både nukleotider och icke-nukleotider som donatormolekyler och rikta in sig på olika substratacceptorer, såsom proteiner, sackarider, nukleinsyror och lipider10. Därför är det viktigt att förstå GT på molekylär nivå för att identifiera deras verkningsmekanismer och specificitet, och gör det också möjligt att förstå hur sockerkompositionen hos glykaner som modifierar relevanta molekyler är relaterade till patogenicitet. Kolhydrataktiv enzymdatabas (CAZy)11 klassificerar GT enligt deras sekvenshomologi, vilket ger ett prediktivt verktyg eftersom i de flesta GT-familjerna är den strukturella vikningen och verkningsmekanismerna invarianta. Fyra skäl gör det dock svårt att förutsäga substratspecificitet hos många GT: 1) inget tydligt sekvensmotiv som bestämmer substratspecificitet har bestämts i prokaryoter12, 2) många GT och OTases visar substratpromiskuitet 13,14, 3) funktionella GT är svåra att producera i högt utbyte i rekombinant form och 4) identifieringen av både donator- och acceptorsubstrat är komplex. Trots detta har de senaste mutagenesstudierna gjort det möjligt att erhålla betydande framsteg i förståelsen av katalytiska mekanismer och subtrahera bindning av GT.

I bakterier verkar O-glykosylering vara vanligare än N-glykosylering. O-glykosyleringsställena visar ingen konsensussekvens, och många av de O-glykosylerade proteinerna utsöndras eller cellyteproteiner, såsom flagelliner, pili eller autotransporter1. Flagellin glykosylering visar variation i antalet acceptorställen, glykankomposition och struktur. Till exempel har Burkholderia spp flagellins bara en acceptorplats, medan i Campylobacter jejuni har flagelliner så många som 19 acceptorplatser15,16. Vidare är glykanen för vissa bakterier en enda monosackarid, medan andra bakterier har heterogena glykaner som komprometteras av olika monosackarider för att bilda oligosackarider. Denna heterogenitet förekommer även bland stammar av samma art. Helicobacter flagelliner modifieras endast av pseudaminsyra (PseAc)17, och Campylobacter flagelliner kan modifieras av PseAc, acetamidinoformen av pseudaminsyra (PseAm) eller legionaminsyra (LegAm) och glykaner härledda från dessa sockerarter med acetyl, N-acetylglukosamin eller propioniska substitutioner18,19. I Aeromonas modifieras flagelliner av glykaner vars sammansättning sträcker sig från ett enda PseAc-syraderivat till en heteropolysackarid20, och bindningen av glykaner till flagellinmonomererna sker alltid via ett PseAc-derivat.

I allmänhet är glykosylering av flagelliner avgörande för flagellär filamentmontering, rörlighet, virulens och värdspecificitet. Men medan flagelliner av C. jejuni16, H. pylori17 och Aeromonas sp. 21 kan inte sättas ihop till filament om inte proteinmonomererna är glykosylerade, Pseudomonas spp. 15 kräver inte glykosylering för flagellamontering. Dessutom, i vissa C. jejuni-stammar, påverkar förändringar i sockersammansättningen av flagellaglykan bakteriell-värdinteraktion och kan spela en roll för att undvika vissa immunsvar16. Autoagglutination är en annan fenotypisk egenskap som påverkas av modifieringar i sammansättningen av glykaner associerade med flagelliner. En lägre autoagglutination leder till en minskning av förmågan att bilda mikrokolonier och biofilm22. I vissa bakterier var flagellens förmåga att utlösa ett proinflammatoriskt svar kopplat till flagellinglykosylering. Således inducerar glykosylerat flagellin i P. aeruginosa ett högre proinflammatoriskt svar än otykosylerat23.

Aeromonas är gramnegativa bakterier som finns överallt i miljön, vilket gör att de kan vara i gränssnittet för alla One Health-komponenter 24. Mesofila Aeromonas har ett enda polärt flagellum, som är konstitutivt producerat. Mer än hälften av kliniska isolat uttrycker också lateral flagellin, inducerbar i medier eller plattor med hög viskositet. Olika studier har relaterat båda flagelltyperna med de tidiga stadierna av bakteriell patogenes25. Medan polära flagelliner som hittills rapporterats är O-glykosylerade vid 5-8 Ser- eller Thr-rester av dess centrala immunogena domäner, är laterala flagelliner inte O-glykosylerade i alla stammar. Även om polära flagellaglykaner från olika stammar visar mångfald i sin kolhydratsammansättning och kedjelängd20, har det länkande sockret visat sig vara ett pseudaminsyraderivat.

Målet med detta manuskript är att beskriva en metod för att erhålla nollmutanter i specifika GT eller kromosomala regioner innehållande GT för att analysera deras engagemang i biosyntesen av relevanta polysackarider och i bakteriell patogenicitet, liksom glykanens roll. Som ett exempel identifierar och tar vi bort en kromosomal region som innehåller GT av Aeromonas för att fastställa dess engagemang i polär flagellinglykosylering och analysera flagellinglykanens roll. Vi visar hur man tar bort en specifik GT för att fastställa dess funktion i biosyntesen av denna glykan och rollen som modifierad glykan. Även om aeromonas används som exempel kan principen användas för att identifiera och studera flagellaglykosyleringsöar av andra gramnegativa bakterier och analysera funktionen hos GT som är involverade i biosyntesen av andra glykaner, såsom O-antigen lipopolysackarid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den schematiska representationen av proceduren visas i figur 1.

1. Bioinformatisk identifiering av flagellaglykosyleringsö (GCI) i Aeromonas

  1. För att identifiera PseAc biosyntetiska kluster i Aeromonas genom, använd tblastn-verktyget från NCBI-databasen26. Hämta först ortologa proteiner till PseC och PseI av A. piscicola AH-3 (identifieringskoderna är OCA61126.1 och OCA61113.1) från databaser med sekvenserade Aeromonas-stammar och använd sedan tblastnverktyget för att söka i deras översatta nukleotidsekvenser.
    PSE-generna flankerar Aeromonas FGIs, med pseB och pseC i ena änden av klustret och pseI i andra änden. Placeringen av resten av pse-generna kan skilja sig från en FGI-grupp till en annan.
  2. Med tanke på att de polära flagellingenerna hos många stammar ligger intill FGIs, använd tblastn från NCBI-databasen för att hitta ortologa proteiner till de polära flagellerna FlaA och FlaB av A. piscicola AH-3 (identifieringskoder är OCA61104.1 och OCA61105.1) och generna som kodar för dem.
  3. Dessutom innehåller Aeromonas FGIs som är involverade i biosyntesen av heteropolysackaridiska glykaner (grupp II)27 flera gener som kodar för enzymer som är involverade i fettsyrasyntesen, såsom luxC och luxE. Använd tblastn från NCBI-databasen för att hitta ortologa proteiner till LuxC av A. piscicola AH-3 (identifieringskod är OCA61121.1) och genen som kodar för den.

2. Generering av nollmutanter i flagella glykosyleringsögener

OBS: Denna metod för mutagenes är baserad på allelutbytet av polymeraskedjereaktion (PCR) i ramraderingsprodukter med användning av självmordsvektorn pDM428 (GenBank: KC795686.1). Replikation av pDM4-vektor är lambda pir-beroende , och det fullständiga allelbytet tvingas genom att använda sacB-genen som finns på vektorn.

  1. Konstruktion av PCR-raderingsprodukter i ramen.
    1. Designa två par primers som förstärker DNA-regioner uppströms (A- och B-primers) och nedströms (C- och D-primers) av den valda genen eller regionen som ska raderas (figur 2B).
    2. Se till att primers A och D har mer än 600 bp uppströms från början respektive nedströms från stoppet för genen eller generna som ska raderas. Dessa två primers måste inkludera i 5 'slutet en begränsningsplats för ett endonukleas som möjliggör kloning i pDM4.
      OBS: Begränsningsstället som ingår i 5'-änden av A- och D-primers bör inte vara detsamma som platser inom AB- eller CD-amplikoner.
    3. Se till att primer b och C finns inom genen som ska raderas eller inuti den första respektive sista genen i regionen som ska raderas. Se till att båda primers (B och C) är in-frame och ligger mellan 5-6 kodon inuti genen. Se dessutom till att båda primersna i 5'-änden innehåller en 21 bp komplementär sekvens (tabell 1) som gör det möjligt att sammanfoga DNA-amplikonerna AB och CD.
    4. Odla den valda Aeromonas-stammen i 5 ml tryptisk sojabuljong (TSB) över natten (O/N) vid 30 °C. Använd ett kommersiellt tillgängligt kit för genomisk DNA-rening och följ tillverkarens instruktioner (materialtabell). Kvantifiera 2 μl av det renade DNA:t med hjälp av en spektrofotometer.
      OBS: Använd dubbeldestillerat vatten som ett ämne, med instrumentet inställt på att registrera absorbans vid 260 nm. Registrera absorbans med 2 μl renat DNA 3-5 gånger och beräkna en genomsnittlig absorbansavläsning. Använd Beer-Lambert-lagen för att beräkna DNA-koncentrationen, där A = Ɛ.c.l. där "A" är absorbans, "Ɛ" är den molära genomsnittliga utrotningskoefficienten för DNA, "c" är DNA-koncentration och "l" är väglängden (se tillverkarens instruktion för väglängden för varje instrument).
    5. Använd 100 ng renat kromosomalt DNA som mall i två uppsättningar asymmetriska PCR med A-B- och C-D-primers (Materialtabell). Använd ett molförhållande på 10: 1 av A: B och D: C primerpar (kompletterande material).
      OBS: Asymmetriska PCR tillåter preferensförstärkning av en del av mallen mer än den andra.
    6. Analysera PCR-produkterna genom elektrofores i en 1% agarosgel. Använd TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) som gellöpningsbuffert och en effektinställning på 8 V/cm. För att visualisera DNA, tillsätt etidiumbromid (0,5 μg / ml) till gelén och visualisera PCR-produkterna med hjälp av en bioavbildningsstation (materialtabell).
    7. Skär ut amplikonerna från gelén med en skalpell, rena enligt tillverkarens protokoll (materialtabell) och kvantifiera dem.
    8. Gå med i AB- och CD-amplikoner genom deras 21 bp överlappande sekvenser i 3'-änden av PCR-produkter (Figur 3). Blanda 100 ng av varje amplicon (AB och CD) i ett PCR-rör med PCR-reagens (pre-AD PCR), men utan primers, och förläng med termocyklingsprogrammet (kompletterande material). Tillsätt sedan 100 μM A- och D-primers till reaktionen (AD PCR) och förstärk som ett enda fragment (kompletterande material).
    9. Analysera PCR-produkten (AD-amplicon) genom elektrofores i en 1% agarosgel med hjälp av de villkor som beskrivs i steg 2.1.6, skär ut amplikonen från gelén, rena enligt tillverkarens protokoll och kvantifiera ampliconen (materialtabell).
  2. Konstruktion av pDM4 rekombinant plasmid med in-frame deletion.
    1. Odla en O/N-odling av Escherichia coli cc18λ pir innehållande pDM4 i Luria-Bertani (LB) Miller-buljong (10 ml) med kloramfenikol (25 μg/ml) vid 30 °C.
    2. Spinna ner kulturen vid 5 000 x g vid 4 °C och suspendera pelleten i 600 μl sterilt destillerat vatten. Utför extraktion och rening av plasmid pDM4 med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt plasmidreningssats, enligt leverantörens instruktioner (materialtabell).
    3. Smält 1 μg pDM4 och 400 ng AD-amplicon i 2 timmar med ett endonukleas som kan smälta båda ändarna av AD-amplikonen och kloningsstället för pDM4 (figur 3). Följ enzymtillverkarens protokoll för reaktionsförhållanden (materialtabell).
    4. Rengör den smälta plasmiden och ampliconen med hjälp av ett DNA-reningssats och kvantifiera dem enligt tillverkarens instruktioner (materialtabell).
    5. För att förhindra religering av den linjäriserade pDM4, ta bort fosfatgruppen från båda 5 'ändarna med hjälp av det alkaliska fosfatasenzymet enligt tillverkarens instruktioner (materialtabell). Rengör sedan den behandlade plasmiden och kvantifiera den med hjälp av en spektrofotometer enligt beskrivningen i steg 2.1.4 (Materialtabell).
    6. Kombinera 150 ng av den smälta och fosfatas alkaliska behandlade pDM4 med 95-100 ng smält AD-amplicon vid ett molärt vektor: infoga-förhållande på 1: 4. Förbered ligeringsreaktionen i en volym av 15 μL, enligt tillverkarens instruktioner (materialtabell).
    7. Inkubera O/N vid 20 °C eller under veckoslutet vid 4 °C. Inaktivera T4-ligasan efter inkubation vid 70 °C i 20 minuter.
    8. Använd ligering för att införa plasmiden i Escherichia coli MC1061λpir-stam genom elektroporering. Använd elektrokompetenta bakterier och 2 mm-gap elektroporationskuvetter.
  3. Framställning av elektrokompetent E. coli och elektroporering av pDM4 rekombinant plasmid
    1. Inokulera en enda koloni av E. coli MC1061λpir-stam i Luria-Bertani (LB) Miller-buljong och odla O/N vid 30 °C med 200 rpm-skakning.
    2. Späd 2 ml av bakteriekulturen i 18 ml LB-buljong och inkubera vid 30 °C med skakning (200 rpm) tills en optisk densitet (OD600) mellan 0,4-0,6 uppnås.
    3. Pelletera bakteriekulturen genom centrifugering vid 5 000 x g och 4 °C i 15 minuter. Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 40 ml kyld destilleradH2O.
    4. Upprepa detta rengöringssteg ytterligare två gånger för att ta bort alla odlingssalter. Slutligen suspendera pelleten i 4 ml kyld destilleradH2Ooch överför 1 ml av suspensionen till vart och ett av fyra koniska 1,5 ml mikrofugerör.
    5. Pelletera bakteriekulturen genom centrifugering vid 14 000 x g och 4 °C i 5 min. Avlägsna supernatanten utan att störa pelleten och suspendera varje pellet i 100 μL kyld destilleradH2O.
    6. Tillsätt 3-3,5 μl av ligeringsblandningen till varje rör och inkubera på is i 5 minuter. Överför sedan innehållet i varje rör till en kyld elektroporeringskuvett med 2 mm mellanrum och applicera 2 kV, 129 Ω och tidskonstant runt 5 ms.
      OBS: Förkyl elektroporationskuvetterna på is. Håll bakterierna på is under hela proceduren.
    7. Efter elektroporering tillsätt 250 μL SOC-medium till var och en av de fyra cuvetterna för att återvinna innehållet, överför dem till ett odlingsrör (ca 1 ml) och inkubera i 1 timme vid 30 °C med skakning (200 rpm).
    8. Platta de transformerade cellerna på Luria-Bertani (LB) agarplattor kompletterade med kloramfenikol (25 μg / ml) för att säkerställa att alla kolonier som växer i plattan har plasmidens ryggrad.
    9. Plocka några kolonier från LB-agarplattorna med kloramfenikol och inkubera O/N vid 30 °C. När kolonier växer, kontrollera införandet av raderingskonstruktionen i pDM4 med PCR med hjälp av primers som flankerar pDM4-kloningssidan: pDM4for och pDM4rev (tabell 1) och lyserade kolonier som mall (kompletterande material).
    10. Välj en koloni med en steril tandpetare och doppa den i ett 1,5 ml rör som innehåller 15 μl 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Inkubera rören vid 100 °C i 5 min och sedan 1 min på is.
    11. Snurra rören i en mikrofuge vid 12 000 x g i 10 min för att pelletera bakterier och skräp. Använd 1 μL supernatanten som mall i PCR-reaktionen (materialtabell). Glödgningstemperaturen för primerparet är 50 °C och PCR-reaktionen kräver 10% DMSO (Supplementary Material).
    12. Inokulera kolonierna som förstärkte produkten av intresse i 10 ml LB-buljong med kloramfenikol (25 μg / ml) och odla O / N vid 30 ° C. Extrahera plasmiden från kulturer enligt beskrivningen i steg 2.2.1-2.2.2. Sekvens med pDM4-primrarna enligt tillverkarens instruktioner (materialtabell).
  4. Överföring av borttagning i ramen till Aeromonas anstränga
    ANMÄRKNING: Den rekombinanta pDM4-plasmiden måste införas i den valda Aeromonas stam genom triparental parning (Figur 4). Aeromonas stammen måste vara rifampicinresistent för att kunna väljas efter triparental parning. Odla därför de valda stammarna O/N på TSB vid 30 °C, centrifugera 2 ml, 4 ml och 6 ml kulturer vid 5 000 x g i 15 min, suspendera varje pellet i 100 μL TSB och platta i TSA med rifampicin (100 μg/ml).
    1. Bered O/N-kulturer av E. coli MC1061λpir med pDM4-rekombinant plasmid på LB-agar med 25 μg/ml kloramfenikol (donatorstam), Aeromonas-stammen rifampicinresistent på TSA med 100 μg/ml rifampicin (mottagarstam) och E. coli HB101 med pRK2073-plasmiden på LB-agar med 80 μg/ml spektinomycin (hjälparstam) vid 30 °C.
    2. När kolonierna har vuxit, suspendera samma antal kolonier (10-15 kolonier) av givaren, mottagaren och hjälpstammen försiktigt med en steril tandpetare i tre LB-rör med 150 μL LB.
    3. Blanda sedan de tre bakteriesuspensionerna på en LB-agarplatta utan antibiotika i två droppar hos en mottagare: hjälpare: givarförhållande på 5:1:1 (50 μl mottagare, 10 μl av givaren och 10 μl av hjälparen). Inkubera plattan uppåt O/N vid 30 °C. Utför negativ kontroll av konjugering med hjälp av donatorstammen utan rekombinant plasmid.
      OBS: Hjälpstammen bär den konjugativa plasmiden pRK2073 och hjälper till att överföra pDM4 till Aeromonas. Använd inte virvel för att stänga av givar-, mottagar- och hjälparstammarna för att undvika att bryta pili.
    4. Skörda bakterier från LB-agarplattan genom att tillsätta 1 ml LB-buljong och sprida den med en steril glasspridare för att erhålla en bakteriesuspension. Använd en pipett för att överföra bakteriesuspensionen till ett koniskt 1,5 ml mikrofugerör och virvel kraftigt.
    5. För att välja mottagarkolonier som innehåller pDM4-rekombinant plasmid, platta 100 μL av den skördade bakteriesuspensionen på LB-agarplattor med rifampicin (100 μg / ml) och kloramfenikol (25 μg / ml).
    6. Snurra ner 200 μL och 600 μL av proverna i en mikrofuge vid 5 000 x g i 15 min, suspendera pelleten i 100 μL LB-buljong och platta på LB-agar med rifampicin (100 μg/ml) och kloramfenikol (25 μg/ml). Inkubera alla plattor i 24-48 timmar vid 30 °C.
    7. Plocka upp de odlade kolonierna, överför till LB-plattor med rifampicin (100 μg / ml) och kloramfenikol (25 μg / ml) och inkubera dem O / N vid 30 ° C. Bekräfta sedan att kolonierna är Aeromonas genom oxidastestet29 och att pDM4 rekombinant plasmid infördes (första rekombinationen) i den specifika kromosomala regionen med PCR med användning av E- och F-primrarna (kompletterande material), som binder utanför regionen förstärkt med A- och D-primrarna (materialtabell). Som beskrivs i steg 2.3.11 använder du 1 μl lysade kolonier som mall.
    8. För att slutföra det alleliska utbytet för raderingen i ramen, tvinga kolonierna med den integrerade självmordsplasmiden till en andra rekombination. Odla de rekombinanta kolonierna i 2 ml LB med 10% sackaros och utan antibiotika, O/N vid 30 °C.
    9. Platta 100 μl av bakteriekulturerna från steg 2.4.8 på LB-agarplatta med sackaros (10%). Platta också 100 μl olika odlingsutspädningar (10-2-10-4) och inkubera O/N vid 30 °C.
    10. För att bekräfta förlusten av pDM4, plocka upp kolonierna, överför till LB-plattor med och utan kloramfenikol (25 μg / ml), inkubera dem O / N vid 30 ° C och välj sedan de kloramfenikolkänsliga kolonierna.
    11. Analysera de känsliga kolonierna med PCR med hjälp av E-F-primerparet och 1 μL lysade kolonier som mall (tabell över material och kompletterande material). Välj de kolonier vars PCR-produkt korrelerade med storleken på den borttagna konstruktionen.

3. Motilitetsanalyser

OBS: I vissa bakteriearter med glykosylerad flagella påverkar modifieringar i nivåerna av glykosylering eller glykankomposition sammansättningen av flagelliner, vilket vanligtvis återspeglas som en motilitetsreduktion eller frånvaro av motilitet. Därför utfördes två motilitetsanalyser med nollmutanterna.

  1. Motilitetsanalys i flytande media
    1. Culture Aeromonas stammar O/N i 1 ml TSB vid 25–30 °C. För att fästa ett mikroskopskyddsglas på en utgrävd bild, plocka upp en liten mängd silikon med spetsen på en tandpetare och lägg en liten droppe på de fyra hörnen på täckglaset. Deponera sedan 1 μL av Aeromonas-kulturen i mitten av täckglaset och blanda i en droppe färska TSB-medier (2 μL).
    2. Placera en utgrävd bild på täckglaset. Matcha utgrävningen med den deponerade droppen, tryck försiktigt och vänd bilden upp och ner.
    3. Analysera simmotilitet med ljusmikroskopi med hjälp av ett optiskt mikroskop (Tabell över material) med ett 100x mål med nedsänkningsolja.
      OBS: Aeromonas vildtypsstam måste användas som positiv kontroll. Som en negativ kontroll, använd en icke-flagellerad bakterie som Klebsiella.
  2. Motilitetsanalys i halvfast media
    1. Culture Aeromonas stammar O/N i TSB (1 ml) vid 25–30 °C. Överför sedan 3 μl av kulturen till mitten av en mjuk agarplatta (1% trypton, 0,5% NaCl, 0,25% bactoagar) och inkubera plattan uppåt O / N vid 25-30 ° C.
    2. Mät med hjälp av en linjal bakteriemigrationen genom agar från plattans centrum mot periferin.

4. Flagella rening

  1. Isolering av flageller förankrade på bakterieytan
    1. Culture Aeromonas stammar O/N i TSB (10 ml) vid 25–30 °C. Expandera sedan kulturen till en kolv med TSB (900 ml) och låt den växa O/N vid 25-30 °C med skakning (200 rpm).
    2. Centrifugera vid 5 000 x g i 20 minuter vid 4 °C. Suspendera pelleten i 20 ml 100 mM Tris-HCl-buffert (pH 7,8).
    3. För att ta bort den förankrade flagellen, skjuva suspensionen i en virvel med en glasstång (2-3 mm diameter) i 3-4 min och passera sedan repetitivt (minst sex gånger) genom en 21-G spruta.
    4. Pelletsbakterier genom två på varandra följande centrifugeringar vid 4 °C: först vid 8 000 x g i 30 minuter. Ta bort supernatanten och centrifugera vid 18 000 x g i 20 minuter. Samla supernatanten, som innehåller fri flagella.
    5. Ultracentrifugera supernatanten vid 100 000 x g i 1 timme vid 4 °C och suspendera pelleten i 150 μL 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA-buffert. Pelleten innehåller flagellafilament.
    6. Analysera 5-10 μL av den återsuspenderade pelleten från steg 4.1.5 genom elektrofores i en 12% SDS-Polyacrylamide gel och visualisera proteinerna med hjälp av Coomassie blå färgning.
      OBS: Följ tillverkarens instruktioner för proteinelektrofores och gelfärgning. Som en positiv kontroll av glykosylerat flagell, använd den renade flagellen av vildtypsstammen. Rena den berikade fraktionen av flageller i en cesiumkloridgradient (ClCs).
  2. Cesiumkloridgradient för att rena flageller.
    1. Blanda 12,1 g CsCl med 27 ml destilleratH2O.
    2. Överför den berikade fraktionen av flageller (150 μL) till ett tunnväggigt ultraklart rör (14 mm x 89 mm) (materialtabell) och fyll det med 12 ml CsCl-lösning.
    3. Ultracentrifugera röret vid 60 000 x g i 48 timmar vid 4 °C i en svängande skoprotor (materialtabell).
    4. Samla flagellabandet i CsCl-gradienten med en spruta och dialysera mot 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA. Analysera sedan den dialyserade flagellen genom elektrofores i en 12% SDS-polyakrylamidgel och Coomassie blå färgning (steg 4.1.6) eller med masspektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna metod ger ett effektivt system för att generera nollmutanter i gener eller kromosomala regioner i Aeromonas som kan påverka flagellaglykosylering och flagellafilamentets roll (Figur 1).

Protokollet börjar med den bioinformatiska identifieringen av förmodade FGIs och generna som kodar för GT presenteras i denna region. I Aeromonas är den kromosomala placeringen av FGIs baserad på detektion av tre typer av gener: gener som är involverade i biosyntesen av pseudaminsyran (pseI och pseC), polära flagellangener och luxC. Stammar vars polära flageller glykosyleras av ett enda pseudaminsyraderivat, såsom A. hydrophila AH-130, har inte gener som kodar för GT mellan pse-generna i FGIs grupp I27. De flesta stammar som tillhör denna FGI-grupp visar polära flagellngener intill denna region. Däremot visar stammar vars polära flageller glykosyleras med en heteropolysackaridglykan, såsom A. piscicola AH-319, olika gener som kodar för GT nedströms luxC, lokaliserade mellan PSE-gener i FGIs grupp II27, och de ligger inte alltid intill polära flagellingener (Figur 2A).

Regionen som är involverad i biosyntesen av flagella heteropolysackaridglykan och funktionen av förmodade GT som finns där bekräftades genom konstruktionen av nollmutanter. Genereringen av varje mutant kräver fyra primers: A, B, C och D (tabell 1). Primer B-glödgningar 5-6 kodon nedströms om början av genen (fgi-4) eller den första genen i klustret (fgi-1) som ska raderas och primer A-glödgningar 600-800 bp uppströms från början av denna gen (fgi-4 eller fgi-1). Primer C-glödgningar uppströms om de sista 5-6 kodonerna i genen (fgi-4) eller den sista genen i klustret (fgi-12) som ska raderas och primer D-glödgningar 600-800 bp nedströms från stoppet av denna gen (fgi-4 eller fgi-12) (figur 2B). Primers A och D för radering av fgi-kluster och fgi-4 av A. piscicola AH-3 innehåller ett restriktionsställe för endonukleas BamHI vid deras 5'-ändar (tabell 1). Detta endonukleas har inga interna mål i AB- eller CD PCR-fragmenten. Ett viktigt steg är utformningen av B- och C-primers. Båda måste vara in-frame för att inte bryta den öppna läsramen av gen eller fragment som ska raderas. De 21 bp komplementära sekvenserna vid 5'-änden av B- och C-primers möjliggör generering av AB- och CD-amplikoner med 3'-ändkompletterande sekvenser, vilket möjliggör sammanfogning och förlängning av dessa amplikoner. PCR-programmet för att sammanfoga och förlänga amplikonerna består av ett initialt denaturaliseringssteg och fem cykler med en glödgningstemperatur på 54 °C (kompletterande material). Därefter möjliggör tillsatsen av A- och D-primers förstärkningen av det förlängda fragmentet (figur 3). Den enzymatiska verkan av BamHI ger upphov till en amplicon med klibbiga ändar som är kompatibla för ligering med självmordsvektorn pDM4 smält med BglII.

Med tanke på att pDM4 är en λpirberoende plasmid, elektroporerades ligeringsprodukten i E. coli-stammen MC1061λpir (denna thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) och valdes i kloramfenikolplattor. pDM4 har inget direkt system för att välja de rekombinanta klonerna, och kolonier analyserades av PCR med ett pDM4-primerpar (pDM4for och pDM4rev) (tabell 1 och kompletterande material) som flankerar kloningsregionen. E. coli-stammen MC1061λpir utan pDM4 användes som negativ kontroll i PCR-reaktionen.

För att utföra allelbytet överfördes den rekombinanta pDM4-plasmiden till mottagarstammen A. piscicola AH-3. Med tanke på att många Aeromonas inte kan transformeras genom elektroporering överfördes den rekombinanta pDM4 genom konjugering med triparental parning (figur 4). För att välja de transkonjuganta kolonierna använder vi en rifampicinresistent mottagarstam, vilket gör det möjligt att välja Aeromonas-stammen från konjugationsparningen. Dessutom skickades de utvalda kolonierna till oxidastestet eftersom medan Aeromonas är oxidaspositiv, är E. coli oxidasnegativ. Den första och andra rekombinationen bekräftades av PCR med externa primers (E- och F-primers) av förstärkta regioner (AB- och CD-fragment) (Tabell 1, Kompletterande material och Figur 5A).

I Aeromonas är glykosyleringen av polära flagelliner avgörande för montering av flagellärfilamentet. Närvaron av funktionella polära flageller analyserades med hjälp av motilitetsanalyser av bakteriekolonierna med borttagna GT-gener eller region. Ljusmikroskopianalyser visade att simmotiliteten i flytande medium minskade hos båda mutanterna jämfört med vildtypsstammen. Dessutom visade båda en minskad radiell expansion i förhållande till vildtypsstammen när motilitet analyserades på mjuk agar (figur 5B). Med tanke på att båda mutanterna kunde simma men med minskad rörlighet i förhållande till vildtypstammen renades deras polära flageller och flagellinmolekylvikten analyserades i en 12% SDS-polyakrylamidgel. Denna analys visade att båda mutanterna har polära flagelliner med lägre molekylvikt än vildtypsstammen (figur 5C), vilket tyder på förändringar i flagellglykanen. Flageller renade med CsCl-gradienter (figur 5C) kommer att användas i masspektrometrianalyser för att identifiera glykankomposition och nollmutanter som används i biofilm, vidhäftning eller andra analyser för att identifiera rollen som glykan- och glykankompositionen.

Figure 1
Bild 1: Översikt över de steg som används i den här proceduren. Schema för processen som beskrivs i protokollet för att identifiera flagella glykosyleringsö Aeromonas och GT som är involverade i glykanbiosyntes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Bioinformatisk detektion av kromosomala regioner och primerdesign. (A) Schema över kromosomala regioner identifierade i A. hydrophila AH-1 och A. piscicola AH-3. A. hydrofila AH-1 flagella glykosylering ö är representativ för stammar vars flagellaglykan endast har ett pseudaminsyraderivat, och A. piscicola AH-3 flagella glykosylering ö är representativ för stammar vars flagellaglykan är en heteropolysackarid. Gener betecknade i svart är involverade i biosyntesen av pseudaminsyra, och de som betecknas gula är förmodade GT. (B) Schema för kromosomala placering av primerpar utformade för PCR-raderingar i ramen. Blå rutor i A- och D-primers innehåller begränsningsbindningsstället för ett endonukleas. Röda lådor i B- och C-primers innehåller 21 bp komplementära sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schema som visar metoden för att konstruera PCR-raderingar i ramen och ligering till självmordsplasmiden pDM4. MCS: multikloningsplats, CmR: kloramfenikolresistenta gener, sacB: kodar för Bacillus subtilis levansucrase, vars uttryck induceras av sackaros och är dödligt för gramnegativa bakterier, och mob: mobiliseringsgener. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Triparental konjugering och procedur som används för allelbytet. Första rekombinationen sker på grund av frånvaron av λpir i Aeromonas-stammarna och ger upphov till integrationen av den rekombinanta plasmiden i den valda genen. Andra rekombinationen induceras av tillväxt i LB med 10% sackaros, vilket leder till uttrycket av sacB-genen , och plasmiden skärs ut från kromosomen. Efter övergången kan vildtypen eller den muterade genen förbli på bakteriekromosomen. Nollmutanter väljs av PCR med externa primers. RifR: rifampicinresistent; CmR: kloramfenikolresistent; SpcR: resistent mot spektinomycin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Bekräftelse av nollmutanter och fenotypisk analys av polär flageller. (A) PCR med fgi-4 externa primers (EF-primers ) av A. piscicola AH-3 för att bekräfta allelbytet efter andra rekombinationen i kloramfenikolkänsliga kolonier. Körfält WT: A. piscicola AH-3; körfält 1-8: kloramfenikolkänsliga kolonier av den andra rekombinationen; St: HyperLadder 1 Kb markör. Lanes 1-3 och 5-8 visar kolonierna med vild-typ fgi-4 gen som lane WT. Lane 4 visar en koloni med den borttagna fgi-4-genen . (B) Motilitet på mjuk agar av A. piscicola AH-3 och nollmutanter i fgi-regionen (AH-3ΔFgi) och fgi-4-genen (AH-3ΔFgi-4) vid 25 ° C. (C) Polar flagellum från AH-3 (lane1) och nollmutanterna i fgi-regionen (lane 2) och fgi-4-genen (lane 3), isolerade, renade i CsCl-gradienter, analyserade i 12% SDS-PAGE och färgade med Coomassie blue. Storlek standard (St). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Primer namn Sekvens i 5 'till 3' riktning Används för
A. piscicola AH-3
A-Flgi1 CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA fgi mutant
B-Flgi1 CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA
C-Flgi12 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12 CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1 ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-Flgi12 TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-Fgi4 CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA fgi-4 mutant
B-Fgi4 CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT
C-Fgi4 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-Fgi4 CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-Fgi4 ATTTCCCTGCCAAATACG
F-Fgi4 CCTGCCAACAGGATGTAAG
pDM4 vektor
pDM4för AGTGATCTTCCGTCACAGG Infogningar i pDM4-vektorn
pDM4rev AAGGTTTAACGG TTGTGGA

Tabell 1: Primers som används för konstruktion av nollmutanter. Överlappande regioner i grundfärgerna B och C är understrukna. Bam HI-webbplatsen är fetstilt i primers A och D.

Kompletterande material. Reagenser och reaktioner som används i asymmetriska PCR för att erhålla AB- och CD-amplikoner, Pre-AD och AD PCR för att förlänga och erhålla AD-amplikonerna, pDM4 PCR för att verifiera införandet av borttagen konstruktion i pDM4-vektor och EF PCR för att verifiera den första och andra rekombinationen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det kritiska tidiga steget i denna metod är identifieringen av regioner som är involverade i glykosylering av flageller och förmodade GT eftersom dessa enzymer visar hög homologi och är involverade i många processer. Bioinformatisk analys av Aeromonas genom i offentliga databaser visar att denna region ligger intill den polära flagellregionen 2, som innehåller flagellingenerna i många stammar och innehåller gener som är involverade i biosyntesen av pseudaminsyra27. Detta har gjort det möjligt att utveckla en riktlinje för att detektera flagellglykosyleringsöar i Aeromonas som kan användas för att identifiera denna region i andra bakterier vars flagellallykan innehåller pseudaminsyraderivat. Dessutom, även om denna metod beskriver hur man analyserar ett genkluster som är involverat i flagellaglykosylering, kan den också användas för att studera gener som kodar för proteiner som kan vara involverade i flagellabildning, rotation eller reglering i olika gramnegativa bakterier.

Också viktigt vid generering av PCR-raderingar i ramen är utformningen av B- och C-primers. Dessa primers bör lokaliseras 5-6 kodon nedströms om starten (B primer) och uppströms stoppet (C primer) för den valda genen eller regionen som ska raderas och bör inte bryta den öppna läsramen. Dessutom är en viktig faktor att tänka på längden på homologiregionen som förstärks för att generera AB- och CD-amplikonerna. Detta protokoll rekommenderar att båda amplikonerna innehåller en homologregion på 600-800 bp vardera. Kortare homologregioner gör den första rekombinationen mer utmanande.

Aeromonas-stammar bär inte lambda pir-genen , som krävs för att replikera pDM4-självmordsplasmiden. Därför måste den pDM4-rekombinanta plasmiden integreras i kromosomalt DNA. Efter den triparentala parningen är det viktigt att identifiera bakteriekolonierna där den första rekombinationen har inträffat. Dessa kolonier innehåller den rekombinanta pDM4 införd i den homologa kromosomala regionen. Identifiering av rekombinanta kolonier utförs med hjälp av en PCR-reaktion med primers (E- och F-primers) utanför den region som är avsedd att raderas. Om ett standard-DNA-polymeras används kommer E-F-primrarna endast att leda till generering av en PCR-produkt i vildtyp. Detta primerpar kommer inte att producera någon PCR-produkt i bakteriekolonier där pDM4-rekombinant plasmid har införts i kromosomalt DNA. Bristen på PCR-produkt beror på avståndet mellan glödgningssekvenserna för E- och F-primers. Detta avstånd kan inte förstärkas med standardpolymeraser. Andra faktorer kan emellertid också förhindra bildandet av PCR-produkter. Därför kan de första rekombinanta kolonierna identifieras med DNA-polymeraser för lång fragmentförstärkning eller genom PCR-reaktioner med användning av par primers bestående av en pDM4 och en extern primer. När stora genetiska kluster raderas kräver förstärkning i vildtypsstammen användning av DNA-polymeraser för lång fragmentförstärkning. Bakteriekolonier med den första rekombinationen kan identifieras med PCR med pDM4-externa par primers. Första och andra rekombinationer produceras emellertid vanligtvis samtidigt och lämnar pDM4 med vildtypen eller med den borttagna genen efter rekombination. Detta leder till kloramfenikolresistenta kolonier vars PCR med hjälp av externa primers ger amplikoner med samma storlek på vildtypsgenen eller små amplikoner, som korrelerar med den borttagna genen eller fragmentet. Kolonier som visade sig ha rätt rekombinant insats inkuberades med sackaros för att avlägsna den icke-införda pDM4. Sackaros inducerar uttrycket av sacB-genen som ligger på pDM4, som kodar för ett dödligt enzym för gramnegativa bakterier. Därför kommer endast kolonier som saknar självmordsplasmiden att växa i LB med sackaros. För att stödja identiteten hos kolonier som innehåller den borttagna genen kan fragmentet förstärkt med det externa primerparet sedan sekvenseras.

Implementering av denna in-frame mutationsmetod i Aeromonas möjliggör generering av mer stabila nollmutanter utan modifieringar i uttrycksnivåerna för nedströms gener. Andra metoder, som att sätta in en antibiotikakassett, säkerställer transkriptionen av nedströms gener, men uttrycksnivån kan modifieras. Dessutom kan denna metod extrapoleras till andra målgener och regioner, inklusive andra gramnegativa bakterier 29,31,32,33.

I vissa bakteriestammar kan förlusten eller modifieringen av glykan kopplad till flagelliner leda till oförmågan hos flagellamontering eller instabiliteten hos flagellafilament, vilket leder till en minskning av polär flagellamotilitet. Även om det är lätt att skilja en icke-rörlig fenotyp från en rörlig med hjälp av motilitetsanalyser i flytande medier, kan skillnader i graden av rörlighet vara svåra att kvantifiera. Motilitetsplattanalyser krävs för att mäta skillnader i graden av rörlighet. Vissa bakteriearter, inklusive många mesofila Aeromonas-stammar , uttrycker emellertid inducerbar lateral flagella när de växer i högviskösa medier eller plattor, förutom den konstitutiva polära flagellen. Båda flagelltyperna bidrar till bakteriemotiliteten i halvfasta plattor. Därför leder modifieringar av polära eller laterala flageller endast till minskningar av migrationsdiametrarna. Således visar AH-3ΔFgi och AH-3ΔFgi-4 mutanter endast minskad rörlighet i förhållande till vildtypstammen. För att förbättra utvärderingen av rörlighet som produceras genom rotation av polära flageller bör expansionsdiametern för nollmutanter jämföras i förhållande till inte bara vildtypsstammen utan också en mutant som saknar det polära flagellumet. Vidare påverkar en minskning av antalet glykanrester eller förändringar i glykankompositionen den elektroforetiska rörligheten hos glykosylerade flagelliner. Till exempel är molekylvikten för glykosylerade flagelliner som observerats med användning av SDS-PAGE-geler högre än vad som förutsagts från flagellinaminosyrasekvensen, och störningar i glykanen observeras som minskningar i deras molekylvikt. I vissa fall kan förändringarna i glykanmodifiering av flagellinproteinet inte detekteras med SDS-PAGE. I dessa fall kan masspektrometrianalys av antingen intakt protein eller flagellinpeptider krävas för att bekräfta närvaron och massan av glykan.

Patogenicitet hos Aeromonas, liksom andra gramnegativa bakterier, kan påverkas av frånvaron av flagellum men också av förändringar i sammansättningen av flagellaglykaner. Dessa förändringar kan påverka bakteriell interaktion med biotiska och abiotiska ytor, autoagglutination, spela en roll för att undvika immunsvar och / eller induktion av proinflammatoriskt svar. Därför krävs vidhäftning, biofilmbildning och proinflammatoriska svarsanalyser för att utvärdera förhållandet mellan flagellaglykosylering och Aeromonas patogenicitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Research Council Canada, för Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) och för Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Applied Biosystems 4337455 Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity Invitrogen 12346-086 Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose Conda-Pronadise 8008 Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) Promega M1821 Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar Becton Dickinson 214010 Use for motility analysis
BamHI Promega R6021 Used for endonuclease restriction
BglII Promega R6081 Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System UVP Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase Bioline BIO-21040 Used for colony screening
Cesium chloride Applichem A1126,0100 Used for flagella purification
Chloramphenicol Applichem A1806,0025 Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit Cytivia 28-9034-71 Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA Applichem 131026.1211 Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap VWR 732-1133 Used for transformation
Ethidium bromide Applichem A1152,0025 Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker Bioline BIO-33053 DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit Invitrogen 10750204 Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar Condalab 996 Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth Condalab 1551 Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000 NanoDrop Techonologies Inc Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin Applichem A2220,0005 Used for triparental mating
SOC Medium Invitrogen 15544034 Used for electroporation recovery
Spectinomycin Applichem A3834,0005 Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman 331362 Used for flagella purification
T4 DNA ligase Invitrogen 15224017 Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar Condalab 1068 Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth Condalab 1224 Used for Aeromonas grown
Tryptone Condalab 1612 Use for motility analysis
Tris Applichem A2264,0500 Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100 Applichem A4975,0100 Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) Beckman 344059 Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler Applied Biosystems Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit Zymmo research D4020 Used for isolation of plasmid DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 181 O-glykosylylylering glykosyltransferaser heteroglykan in-frame mutanter mesofila Aeromonas flagelliner flagellarening CsCl-gradient
Generering av nollmutanter för att belysa rollen som bakteriella glykosyltransferaser i bakteriell motilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomás, J. M., Fulton, K. M.,… More

Tomás, J. M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Merino, S. Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility. J. Vis. Exp. (181), e63231, doi:10.3791/63231 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter