Summary
여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.
Abstract
원핵생물에서 글리코실화에 대한 연구는 빠르게 성장하는 영역이다. 박테리아는 표면에 다른 당화 된 구조를 가지고 있으며, 글리 칸은 균주 별 바코드를 구성합니다. 관련 글리 칸은 진핵 생물보다 설탕 조성과 구조에서 더 높은 다양성을 보여 주며 박테리아 - 숙주 인식 과정 및 환경과의 상호 작용에 중요합니다. 병원성 박테리아에서 당단백질은 감염 과정의 여러 단계에 관여했으며 글리 칸 변형은 당단백질의 특정 기능을 방해 할 수 있습니다. 그러나, 글리칸 조성, 구조 및 생합성 경로의 이해에서 이루어진 진보에도 불구하고, 병원성 또는 환경과의 상호작용에서 당단백질의 역할에 대한 이해는 매우 제한적이다. 또한, 일부 박테리아에서, 단백질 글리코실화에 필요한 효소는 리포폴리사카라이드 및 캡슐 생합성 경로와 같은 다른 다당류 생합성 경로와 공유된다. 글리코실화의 기능적 중요성은 글리코실화 과정에 관여하는 것으로 생각되는 특정 유전자의 돌연변이와 표적 당단백질 및 변형 글리칸의 발현에 미치는 영향에 대한 연구를 통해 여러 박테리아에서 해명되었다. 중온성 에어로모나스는 단일 및 O 글리코실화 극성 편모를 갖는다. 편모 글리 칸은 Aeromonas 균주 간의 탄수화물 구성과 사슬 길이의 다양성을 보여줍니다. 그러나, 현재까지 분석된 모든 균주는 세린 또는 트레오닌 잔기를 변형시키는 연결 당으로서 pseudaminic acid 유도체를 보여준다. pseudaminic acid 유도체는 극성 편모 조립에 필요하며 그 손실은 접착, 생물막 형성 및 식민지화에 영향을 미칩니다. 이 기사에 자세히 설명된 프로토콜은 편모 글리칸의 생합성에서 추정적 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 유전자 또는 게놈 영역의 관여를 이해하기 위해 널 돌연변이체의 구축이 어떻게 사용될 수 있는지를 기술한다. 여기에는 글리코실트랜스퍼라제의 기능 및 글리칸의 역할을 이해할 수 있는 잠재력이 포함된다. 이는 글리칸 결핍 돌연변이체를 야생형 균주와 비교함으로써 달성될 것이다.
Introduction
단백질 글리코실화는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아 둘 다에 기술되어 있으며, 아미노산 측쇄 1,2에 대한 글리칸의 공유 부착으로 구성된다. 원핵생물에서, 이 과정은 보통 두 가지 주요 효소적 메카니즘을 통해 발생한다: O- 및 N-글리코실화3. O-글리코실화에서, 글리칸은 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr) 잔기의 히드록실기에 부착된다. N-글리코실화에서, 글리칸은 트리펩티드 서열 Asn-X-Ser/Thr 내의 아스파라긴(Asn) 잔기의 측쇄 아미드 질소에 부착되며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있다.
글리칸은 선형 또는 분지 구조를 채택 할 수 있으며 글리코시드 결합에 의해 공유적으로 연결된 단당류 또는 다당류로 구성됩니다. 원핵생물에서, 글리칸은 보통 진핵 글리칸4과 비교하여 설탕 조성 및 구조에서 다양성을 나타낸다. 더욱이, 글리칸이 조립되고 수용체 단백질로 전달되는 방법에 있어서 상이한 두 개의 상이한 박테리아 글리코실화 경로가 기술되었다: 순차적 및 엔블럭 글리코실화 5,6. 순차적 글리코실화를 위해, 복합 글리칸은 단당류의 연속적인 첨가에 의해 단백질 상에 직접 구축된다. 엔블럭 글리코실화에서, 미리 조립된 글리칸은 특수화된 올리고사카릴트랜스퍼라제(OTase)에 의해 지질-연결된 올리고당으로부터 단백질로 전사된다. 두 경로 모두 N- 및 O-글리코실화 과정7에 관여하는 것으로 나타났다.
단백질 글리코실화는 단백질의 물리화학적 및 생물학적 특성을 조절하는 역할을 한다. 글리칸의 존재는 단백질이 리간드와 상호 작용하는 방식에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 만 단백질 안정성, 용해도, 단백질 분해에 대한 감수성, 면역원성 및 미생물 - 숙주 상호 작용 8,9에도 영향을 줄 수 있습니다. 그러나, 글리칸의 수, 글리칸 조성, 위치 및 부착 메카니즘과 같은 몇몇 글리코실화 파라미터는 또한 단백질 기능 및 구조에 영향을 미칠 수 있다.
글리코실트랜스퍼라제(GTs)는 복합 글리칸과 글리코컨쥬게이트의 생합성에 있어서 핵심 효소이다. 이들 효소는 활성화된 공여체 분자로부터의 당 모이어티와 특정 기질 수용체 사이의 글리코시드 결합 형성을 촉매한다. GTs는 공여체 분자로서 뉴클레오티드 및 비뉴클레오티드 둘 다를 사용할 수 있고, 단백질, 당류, 핵산 및 지질(10)과 같은 상이한 기질 수용체를 표적으로 할 수 있다. 따라서 분자 수준에서 GT를 이해하는 것은 작용 메커니즘과 특이성을 확인하는 데 중요하며 관련 분자를 변형시키는 글리 칸의 당 조성이 병원성과 어떻게 관련되어 있는지 이해할 수 있습니다. 탄수화물 활성 효소 데이터베이스 (CAZy)11은 GT를 서열 상동성에 따라 분류하며, 이는 대부분의 GT 패밀리에서 구조적 폴드 및 작용 메커니즘이 불변하기 때문에 예측 도구를 제공합니다. 그러나, 많은 GTs의 기질 특이성을 예측하기 어려운 네 가지 이유: 1) 원핵생물에서 기질 특이성을 결정하는 명확한 서열 모티프가 결정되지 않은12, 2) 많은 GTs 및 OTases는 기질 난잡함을 나타내고13,14, 3) 기능적 GTs는 재조합 형태로 고수율로 생산하기 어렵고 4) 공여체 및 수용체 기질 둘 다의 확인은 복잡하다. 그럼에도 불구하고, 최근의 돌연변이 유발 연구는 촉매 메커니즘의 이해와 GT의 뺄셈 결합에 상당한 진보를 얻는 것을 가능하게했다.
박테리아에서, O-글리코실화는 N-글리코실화보다 더 널리 퍼진 것으로 보인다. O-글리코실화 부위는 컨센서스 서열을 나타내지 않으며, 많은 O-글리코실화 단백질이 분비되거나 세포-표면 단백질, 예컨대 편모, 필리, 또는 자가수송체1. 편모 글리코실화는 수용체 부위의 수, 글리칸 조성, 및 구조에서 가변성을 나타낸다. 예를 들어, Burkholderia spp flagellins에는 하나의 수용체 사이트 만 있고 Campylobacter jejuni에서는 flagellins가 19 개의 수락자 사이트15,16을 가지고 있습니다. 또한, 일부 박테리아의 경우, 글리칸은 단일 단당류이며, 다른 박테리아는 올리고당을 형성하기 위해 다른 단당류로 손상된 이질적인 글리칸을 가지고 있습니다. 이러한 이질성은 동일한 종의 균주들 사이에서도 발생한다. 헬리코박터 편모는 pseudaminic acid (PseAc)17에 의해서만 변형되고, 캄필로박터 편모는 PseAc, 아세타미디노 형태의 pseudaminic acid (PseAm) 또는 레지오나민산 (LegAm)에 의해 변형될 수 있고, 이들 당으로부터 유래된 글리칸은 아세틸, N-아세틸글루코사민, 또는 프로피온성 치환18,19로 유도된다. Aeromonas에서 편모는 단일 PseAc 산 유도체에서 헤테로 다당류20에 이르는 조성의 글리 칸에 의해 변형되며 편모 단량체에 글리 칸을 부착하는 것은 항상 PseAc 유도체를 통해 이루어집니다.
일반적으로, 편모의 글리코실화는 편모 필라멘트 조립, 운동성, 독성, 및 숙주 특이성에 필수적이다. 그러나, C. jejuni16, H. pylori17 및 Aeromonas sp의 편모가 있는 동안. 도 21은 단백질 단량체가 글리코실화되지 않는 한 필라멘트로 조립할 수 없으며, 슈도모나스 spp. 및 Burkholderia spp. 도 15는 편모 조립을 위한 글리코실화를 필요로 하지 않는다. 더욱이, 일부 C. jejuni 균주에서, 편모 글리칸의 당 조성의 변화는 박테리아-숙주 상호작용에 영향을 미치고, 특정 면역 반응(16)을 회피하는 역할을 할 수 있다. 자가 응집은 편모와 관련된 글리 칸의 조성의 변형에 의해 영향을받는 또 다른 표현형 특성입니다. 더 낮은 자가응집은 마이크로콜로니 및 생물막(22)을 형성하는 능력의 감소를 유도한다. 일부 박테리아에서, 편모가 전염증 반응을 촉발시키는 능력은 편모 글리코실화와 관련이 있었다. 따라서, P. aeruginosa에서, 당화 편모는 당화되지 않은23보다 더 높은 전염증 반응을 유도한다.
에어로모나스는 그람 음성 박테리아로 환경에 유비쿼터스이며, 이는 모든 One Health 구성 요소(24)의 계면에 있을 수 있게 한다. 중온성 에어로모나스는 단일 극성 편모를 가지고 있으며, 이는 구성적으로 생산됩니다. 임상 단리물의 절반 이상은 또한 고점도 매질 또는 플레이트에서 유도성 측방향 편모를 발현한다. 다른 연구는 두 편모 유형을 박테리아 병인의 초기 단계와 관련시켰다25. 현재까지 보고된 극성 편모는 그의 중심 면역원성 도메인의 5-8 Ser 또는 Thr 잔기에서 O-글리코실화되는 반면, 측방 편모는 모든 균주에서 O-글리코실화되지 않는다. 상이한 균주로부터의 극성 편모 글리칸이 그들의 탄수화물 조성 및 사슬 길이20에서 다양성을 나타내지만, 연결 당은 pseudaminic acid 유도체인 것으로 나타났다.
이 원고의 목표는 GT를 포함하는 특정 GT 또는 염색체 영역에서 null 돌연변이를 얻는 방법을 설명하여 관련 다당류의 생합성 및 박테리아 병원성뿐만 아니라 글리칸 자체의 역할에 대한 관여를 분석하는 것입니다. 예를 들어, 우리는 극성 편모 글리코실화에 대한 관여를 확립하고 편모 글리칸의 역할을 분석하기 위해 Aeromonas 의 GT를 포함하는 염색체 영역을 확인하고 삭제합니다. 우리는이 글리 칸의 생합성과 변형 된 글리 칸의 역할에서 그 기능을 확립하기 위해 특정 GT를 삭제하는 방법을 보여줍니다. Aeromonas 를 예로 들자면, 이 원리는 다른 그람 음성 박테리아의 편모 글리코실화 섬을 확인 및 연구하고, O-항원 리포폴리사카라이드와 같은 다른 글리칸의 생합성에 관여하는 GT의 기능을 분석하는데 사용될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
절차의 개략적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.
1. 에어로모나스에서 편모 글리코실화 섬 (FGIs)의 생물 정보학 식별
- Aeromonas 게놈에서 PseAc 생합성 클러스터를 확인하려면, NCBI 데이터베이스(26)로부터의 tblastn 도구를 사용한다. 먼저, 서열화된 Aeromonas 균주의 데이터베이스로부터 A. piscicola AH-3(식별 코드는 OCA61126.1 및 OCA61113.1)의 PseC 및 PseI에 대한 직교 단백질을 검색한 다음, tblastn 도구를 사용하여 번역된 뉴클레오티드 서열을 검색한다.
참고: pse 유전자는 Aeromonas FGI를 옆으로 향하게 하며, pseB와 pseC는 클러스터의 한쪽 끝에, pseI는 다른 쪽 끝에 위치합니다. 나머지 pse 유전자의 위치는 FGI 그룹마다 다를 수 있다. - 많은 균주의 극성 편모 유전자가 FGIs에 인접해 있다는 것을 감안할 때, NCBI 데이터베이스의 tblastn을 사용하여 A. piscicola AH-3의 극성 편모 FlaA 및 FlaB에 대한 직교 단백질 (식별 코드는 OCA61104.1 및 OCA61105.1) 및 이를 인코딩하는 유전자를 찾으십시오.
- 또한, 헤테로폴리사카리칸 (그룹 II)27의 생합성에 관여하는 에어로모나스 FGI는 luxC 및 luxE와 같은 지방산 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 여러 유전자를 함유하고 있다. NCBI 데이터베이스의 tblastn을 사용하여 A. piscicola AH-3 (식별 코드는 OCA61121.1)의 LuxC와 이를 인코딩하는 유전자에 대한 직교 단백질을 찾으십시오.
2. 편모 글리코실화 섬 유전자에서 널 돌연변이체의 생성
참고: 이 돌연변이유발 방법은 자살벡터 pDM428 (GenBank: KC795686.1)을 이용한 프레임내 결실 산물인 중합효소 연쇄반응(PCR)의 대립유전자 교환에 기초한다. pDM4 벡터의 복제는 람다 피어 의존성이고, 완전한 대립유전자 교환은 벡터 상에 위치한 sacB 유전자를 이용함으로써 강제된다.
- PCR 인프레임 삭제 제품의 구축.
- 결실될 선택된 유전자 또는 영역의 상류(A 및 B 프라이머) 및 하류(C 및 D 프라이머)의 DNA 영역을 증폭시키는 두 쌍의 프라이머를 설계한다(도 2B).
- 프라이머 A 및 D가 결실될 유전자 또는 유전자의 정지로부터 각각 시작 및 하류로부터 600 bp 이상의 상류를 갖는지 확인한다. 이들 두 프라이머는 pDM4에서 클로닝을 허용하는 엔도뉴클레아제에 대한 제한 부위를 5' 말단에 포함시킬 필요가 있다.
참고: A 및 D 프라이머의 5' 말단에 포함된 제한 부위는 AB 또는 CD 앰플리콘 내의 부위와 동일해서는 안 됩니다. - 프라이머 B 및 C가 결실될 영역의 첫 번째 및 마지막 유전자 내부 또는 결실될 유전자 내에 있는지 확인하십시오. 두 프라이머 (B 및 C)가 모두 프레임 내에 있고 유전자 내부에 5-6 코돈 사이에 위치하는지 확인하십시오. 또한, 두 프라이머 모두 5' 말단에 DNA 앰플리콘 AB 및 CD에 접합할 수 있게 하는 21 bp 상보적 서열(표 1)을 포함하는지 확인한다.
- 선택된 에어로모나 스 균주를 5 mL의 트립틱 대두 브로스(TSB)로 30°C에서 밤새 성장(O/N)한다. 게놈 DNA 정제를 위해 시판되는 키트를 사용하고 제조업체의 지침(표 자료)을 따르십시오. 분광광도계를 이용하여 정제된 DNA 2 μL를 정량한다.
참고: 이중 증류수를 블랭크로 사용하고 계측기는 260nm에서 흡광도를 기록하도록 설정합니다. 정제된 DNA 2 μL로 흡광도를 3-5회 기록하고 평균 흡광도 판독값을 계산한다. Beer-Lambert 법칙을 사용하여 DNA 농도를 계산하십시오. 여기서 A = Ɛ.c.l. 여기서 "A"는 흡광도, "Ɛ"는 DNA의 몰 평균 흡광 계수, "c"는 DNA 농도, "l"은 경로 길이입니다 (각 장비의 경로 길이에 대한 제조업체의 지침 참조). - 100ng의 정제된 염색체 DNA를 A-B 및 C-D 프라이머를 사용한 두 세트의 비대칭 PCR 세트에서 주형으로 사용하십시오(표 자료). A:B 및 D:C 프라이머 쌍(보충 자료)의 10:1 몰비를 사용하십시오.
참고: 비대칭 PCR은 템플릿의 한 가닥을 다른 가닥보다 더 우선적으로 증폭할 수 있도록 합니다. - PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 분석한다. TAE(40mM 트리스아세테이트, 1mM EDTA)를 젤 러닝 버퍼로 사용하고 8V/cm의 전력 설정을 사용합니다. DNA를 시각화하려면 에티듐 브로마이드(0.5μg/mL)를 젤에 추가하고 바이오 이미징 스테이션을 사용하여 PCR 산물을 시각화합니다(자료 표).
- 메스를 사용하여 젤에서 앰플리콘을 소비하고 제조업체의 프로토콜 (재료 표)에 따라 정제하고 정량화하십시오.
- AB 및 CD 앰플리콘을 PCR 산물의 3' 말단에 있는 21bp 중첩 서열로 결합합니다(그림 3). 100 ng의 각 앰플리콘 (AB 및 CD)을 PCR 시약 (pre-AD PCR)과 함께 PCR 튜브에 혼합하되 프라이머는 사용하지 않고 thermocycler 프로그램 (보충 자료)을 사용하여 연장하십시오. 이어서, 100 μM의 A 및 D 프라이머를 반응물 (AD PCR)에 첨가하고, 단일 단편 (보충 자료)으로서 증폭시킨다.
- 단계 2.1.6에 기재된 조건을 이용하여 1% 아가로스 겔에서 전기영동에 의한 PCR 산물(AD 앰플리콘)을 분석하고, 겔로부터 앰플리콘을 절제하고, 제조자의 프로토콜에 따라 정제하고, 앰플리콘을 정량한다(표 of Materials).
- 인프레임 결실을 통한 pDM4 재조합 플라스미드의 구축.
- pDM4를 함유하는 에스케리치아 콜라이 cc18λ pir 의 O/N 배양물을 루리아-베르타니(LB) 밀러 브로스(10 mL)와 클로람페니콜(25 μg/mL)로 30°C에서 성장시킨다.
- 배양물을 4°C에서 5,000 x g으로 스핀다운하고, 펠렛을 600 μL의 멸균 증류수에 현탁시켰다. 공급자의 지시에 따라 상업적으로 이용가능한 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 pDM4의 추출 및 정제를 수행한다(표 오브 머티리얼).
- AD 앰플리콘의 양쪽 말단과 pDM4의 클로닝 부위를 소화할 수 있는 엔도뉴클레아제로 2시간 동안 1μg의 pDM4 및 400ng의 AD 앰플리콘을 소화시킨다(그림 3). 반응 조건에 대한 효소 제조업체의 프로토콜을 따르십시오 (물질 표).
- DNA 정제 키트를 사용하여 소화된 플라스미드와 앰플리콘을 세척하고 제조업체의 지시에 따라 정량화하십시오(표 재료).
- 선형화된 pDM4의 종교화를 방지하려면 제조업체의 지시에 따라 알칼리성 포스파타제 효소를 사용하여 5' 말단 모두에서 인산염 그룹을 제거하십시오 (표 of Materials). 이어서, 처리된 플라스미드를 정리하고, 단계 2.1.4 (물질의 표)에 기재된 바와 같이 분광광도계를 사용하여 정량한다.
- 150 ng의 소화된 포스파타제 알칼리성 처리된 pDM4를 몰 벡터:1:4의 비율로 삽입된 95-100 ng의 소화된 AD 앰플리콘과 결합시킨다. 라이게이션 반응을 15 μL의 부피로 제조하고, 제조자의 지시에 따라 (표 재료).
- O/N을 20°C에서 또는 주말 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, T4 리가아제를 70°C에서 20분 동안 불활성화시킨다.
- 라이게이션을 사용하여 전기천공에 의해 에스케리치아 콜라이 MC1061λpir 균주 내로 플라스미드를 도입한다. 전기 적격 박테리아와 2mm 간격 전기 천공 큐벳을 사용하십시오.
- 전기적격 대장균 의 제조 및 pDM4 재조합 플라스미드의 전기천공
- 대장균 MC1061λpir 균주의 단일 콜로니를 루리아-베르타니(LB) 밀러 브로스에 접종하고 200 rpm 진탕으로 30°C에서 O/N을 성장시킨다.
- 박테리아 배양물 2 mL를 LB 배양액 18 mL에 희석하고, 0.4-0.6 사이의 광학 밀도(OD600)가 달성될 때까지 진탕(200 rpm)하면서30°C에서 인큐베이션한다.
- 박테리아 배양물을 펠릿을 5,000 x g 및 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛한다. 상청액을 버리고 펠렛을 냉각된 증류H2O40 mL에 현탁시킨다.
- 이 세척 단계를 두 번 더 반복하여 모든 배양 염을 제거한다. 마지막으로, 펠렛을 냉각된 증류H2O4 mL에 현탁시키고, 현탁액 1 mL를 4개의 원뿔형 1.5 mL 마이크로퍼지 튜브 각각으로 옮긴다.
- 박테리아 배양물을 펠릿으로 14,000 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 방해하지 않고 상청액을 제거하고, 각각의 펠렛을 냉각된 증류H2O의 100 μL에 현탁시킨다.
- 라이게이션 혼합물 3-3.5 μL를 각 튜브에 첨가하고, 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 그런 다음 각 튜브의 내용물을 냉각 된 2mm 갭 전기 천공 큐벳으로 옮기고 2kV, 129 Ω 및 약 5ms의 시간 상수를 적용하십시오.
참고: 얼음 위에 전기 천공 큐벳을 미리 식힙니다. 전체 절차 중에 얼음 위에 박테리아를 유지하십시오. - 전기천공 후, 250 μL의 SOC 배지를 네 개의 큐벳 각각에 첨가하여 내용물을 회수하고, 이를 배양 튜브(약 1 mL)로 옮기고, 진탕(200 rpm)하면서 30°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 형질전환된 세포를 클로람페니콜(25 μg/mL)이 보충된 루리아-베르타니(LB) 한천 플레이트에 플레이트에 플레이트하여 플레이트에서 성장하는 모든 콜로니가 플라스미드 백본을 갖도록 한다.
- 클로람페니콜로 LB 한천 플레이트로부터 일부 콜로니를 선택하고 30°C에서 O/N을 인큐베이션한다. 콜로니가 자랄 때, pDM4 클로닝 측을 플랭크하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 pDM4 내로의 결실 작제물의 삽입을 확인한다: pDM4for 및 pDM4rev (표 1), 및 용해된 콜로니를 주형으로 (보충 물질).
- 멸균 이쑤시개로 콜로니 1개를 골라 1% 트리톤 X-100, 20mM Tris-HCl pH 8.0, 2mM EDTA pH 8.0의 15μL를 함유하는 1.5 mL 튜브에 담그십시오. 튜브를 100°C에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 얼음 상에서 1분 동안 인큐베이션한다.
- 튜브를 12,000 x g 의 미세 퍼지에서 10분 동안 회전시켜 박테리아와 파편을 펠릿화합니다. PCR 반응에서 주형으로서 1 μL의 상청액을 사용한다(표 물질). 프라이머 쌍의 어닐링 온도는 50°C이고, PCR 반응은 10% DMSO(보충 물질)를 필요로 한다.
- LB 배양액 10 mL에 목적하는 생성물을 증폭시킨 콜로니를 클로람페니콜 (25 μg/mL)로 접종하고 30°C에서 O/N을 성장시킨다. 단계 2.2.1-2.2.2에 기재된 바와 같이 배양물로부터 플라스미드를 추출한다. pDM4 프라이머를 사용하여 서열은 제조자의 지시에 따른다(표 물질).
- 프레임 내 삭제를 Aeromonas 거르다
참고: pDM4 재조합 플라스미드는 선택된 내로 도입되어야 한다. Aeromonas 삼부모 짝짓기에 의한 변형 (그림 4). Aeromonas 균주는 삼부모 짝짓기 후에 선택되기 위해 리팜피신 내성이어야 한다. 따라서, 선택된 균주 O/N을 TSB 상에서 30°C, 원심분리 2 mL, 4 mL 및 배양물 6 mL를 5,000 x g 15분 동안 각 펠렛을 100μL의 TSB에 현탁하고, 리팜피신(100μg/mL)으로 TSA에 플레이트를 넣었다.- 25 μg/mL 클로람페니콜 (공여자 균주)을 갖는 LB 한천에 pDM4 재조합 플라스미드를 사용하여 대장균 MC1061λpir의 O/N 배양물을 준비하고, 100 μg/mL 리팜피신(수용자 균주)을 갖는 TSA에 내성인 에어로모나스 균주 리팜피신(수용자 균주), 및 30°C에서 80 μg/mL 스펙티노마이신(헬퍼 균주)을 갖는 LB 한천에 pRK2073 플라스미드를 갖는 대장균 HB101을 준비한다.
- 콜로니가 성장했을 때, 공여자, 수용자 및 도우미의 동일한 수의 콜로니 (10-15 콜로니)를 150 μL의 LB와 함께 세 개의 LB 튜브에 멸균 이쑤시개로 부드럽게 정지시킨다.
- 그런 다음, 항생제가 없는 LB 한천 플레이트 상에서, 수용자에서 세 개의 박테리아 현탁액을 두 방울로 혼합한다: 헬퍼:공여체 비율 5:1:1 (수용자의 50 μL, 기증자의 10 μL, 및 헬퍼 10 μL). 플레이트를 O/N 위로 향하게 하여 30°C에서 인큐베이션한다. 재조합 플라스미드 없이 공여체 균주를 사용하여 컨쥬게이션의 음성 조절을 수행한다.
참고: 헬퍼 균주는 접합 플라스미드 pRK2073을 운반하고 pDM4가 에어로모나스로 전달되도록 돕습니다. 실리가 깨지지 않도록 기증자, 수혜자 및 도우미 균주를 일시 중지하기 위해 소용돌이를 사용하지 마십시오. - LB 한천 플레이트로부터 박테리아를 수확하여 LB 브로스 1 mL를 첨가하고 이를 멸균 유리 스프레더로 확산시켜 박테리아 현탁액을 얻었다. 피펫을 사용하여 박테리아 현탁액을 원뿔형 1.5 mL 미세 퍼지 튜브로 옮기고 격렬하게 와류하십시오.
- pDM4 재조합 플라스미드를 함유하는 수용자 콜로니를 선택하기 위해, 리팜피신 (100 μg/mL) 및 클로람페니콜 (25 μg/mL)을 갖는 LB 아가 플레이트 상에 수확된 박테리아 현탁액 100 μL를 플레이트에 플레이트한다.
- 샘플 200 μL 및 600 μL를 5,000 x g 의 마이크로퍼지에서 15분 동안 스핀다운하고, 펠렛을 100 μL의 LB 브로스에 현탁시키고, 리팜피신(100 μg/mL) 및 클로람페니콜(25 μg/mL)로 LB 아가에 플레이트를 씌운다. 모든 플레이트를 30°C에서 24-48시간 동안 인큐베이션한다.
- 성장한 콜로니를 집어 들고 리팜피신(100μg/mL) 및 클로람페니콜(25μg/mL)로 LB 플레이트로 옮기고, 30°C에서 O/N으로 배양한다. 그 후, 콜로니가 옥시다제 시험29에 의해 에어로모나스인지 확인하고 pDM4 재조합 플라스미드가 A 및 D 프라이머로 증폭된 E 및 F 프라이머(Supplementary Material)를 이용하여 PCR에 의해 특정 염색체 영역에 삽입(첫 번째 재조합)되었음을 확인하였다(표 of Materials). 단계 2.3.11에 기재된 바와 같이, 1 μL의 용해된 콜로니를 주형으로 사용한다.
- 인-프레임 결실을 위한 대립유전자 교환을 완료하기 위해, 통합된 자살 플라스미드로 콜로니를 두 번째 재조합으로 강제한다. 재조합 콜로니를 10% 수크로오스와 항생제 없이 30°C에서 O/N으로 LB 2 mL에서 성장시킨다.
- 플레이트 100 μL의 박테리아 배양물을 단계 2.4.8로부터의 박테리아 배양물을 수크로오스(10%)와 함께 LB 한천 플레이트 상에서 플레이트. 또한, 100 μL의 상이한 배양 희석물 (10-2-10-4)을 플레이트하고 30°C에서 O/N을 인큐베이션한다.
- pDM4의 손실을 확인하기 위해, 콜로니를 집어 들고, 클로람페니콜 유무에 관계없이 LB 플레이트로 옮기고(25 μg/mL), 30°C에서 O/N으로 인큐베이션한 다음, 클로람페니콜에 민감한 콜로니를 선택한다.
- E-F 프라이머 쌍 및 1 μL의 용해된 콜로니를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 민감한 콜로니를 분석한다(표 재료 및 보충 자료). PCR 산물이 삭제된 구축물의 크기와 상관관계가 있는 콜로니를 선택하십시오.
3. 운동성 분석
주: 당화 편모를 가진 일부 박테리아 종에서, 글리코실화 또는 글리칸 조성의 수준의 변형은 편모의 집합에 영향을 미치며, 이는 일반적으로 운동성 감소 또는 운동성의 부재로 반영된다. 따라서, 두 개의 운동성 검정이 널 돌연변이체와 함께 수행되었다.
- 액체 매질에서의 운동성 분석
- 에어로모나스 균주 O/N을 TSB 1 mL로 25-30°C에서 배양한다. 현미경 커버 슬라이드를 굴착 된 슬라이드에 부착하려면 이쑤시개 끝으로 소량의 실리콘을 집어 들고 커버 슬라이드의 네 모서리에 작은 방울을 놓습니다. 이어서, 에어로모나스 배양물 1 μL를 커버 슬라이드의 중간에 침착시키고, 신선한 TSB 배지 (2 μL)의 방울에 혼합한다.
- 발굴 된 슬라이드를 커버 슬라이드에 놓습니다. 발굴을 퇴적된 방울과 일치시키고, 부드럽게 누르고, 슬라이드를 거꾸로 뒤집습니다.
- 침지 오일을 사용하여 100x 대물이있는 광학 현미경 (재료 표)을 사용하여 광 현미경으로 수영 운동성을 분석하십시오.
참고: Aeromonas의 야생형 균주는 양성 대조군으로 사용되어야 합니다. 음성 대조군으로 Klebsiella와 같은 편모되지 않은 박테리아를 사용하십시오.
- 반고체 매질에서의 운동성 분석
- 에어로모나스 균주 O/N을 TSB(1 mL)로 25-30°C에서 배양한다. 이어서, 배양물 3 μL를 연질 한천 플레이트 (1% 트립톤, 0.5% NaCl, 0.25% 박토 한천)의 중앙 상에 옮기고 플레이트를 25-30°C에서 O/N을 위로 향하게 인큐베이션한다.
- 눈금자를 사용하여 플레이트의 중심에서 주변부쪽으로 한천을 통한 박테리아 이동을 측정하십시오.
4. 편모 정화
- 박테리아 표면에 고정 된 편모의 분리
- 에어로모나스 균주 O/N을 TSB(10 mL)로 25-30°C에서 배양한다. 이어서, 배양물을 TSB(900 mL)가 있는 플라스크로 팽창시키고, 진탕(200 rpm)으로 25-30°C에서 O/N을 성장시키게 한다.
- 4°C에서 20분 동안 5,000 x g 에서 원심분리한다. 펠렛을 20 mL의 100 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.8)에 현탁시켰다.
- 앵커 된 편모를 제거하려면 유리 바 (직경 2-3 mm)로 와류에서 현탁액을 3-4 분 동안 전단 한 다음 21-G 주사기를 통해 반복적으로 (최소 6 회) 통과시킵니다.
- 펠릿 박테리아는 4°C에서 두 번의 연속 원심분리에 의해: 먼저, 8,000 x g 에서 30분 동안 반응한다. 상청액을 제거하고 20분 동안 18,000 x g 에서 원심분리한다. 유리 편모가 들어있는 상청액을 수집하십시오.
- 상청액을 4°C에서 1시간 동안 100,000 x g 에서 초원심분리하고, 펠렛을 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) 플러스 2 mM EDTA 완충액의 150 μL에 현탁시켰다. 펠렛에는 편모 필라멘트가 들어 있습니다.
- 단계 4.1.5로부터 재현탁된 펠릿의 5-10 μL를 12% SDS-Polyacrylamide 겔에서 전기영동하여 분석하고, 쿠마시 블루 염색을 사용하여 단백질을 시각화한다.
참고: 단백질 전기영동 및 젤 염색에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오. 당화 편모의 양성 대조군으로서 야생형 균주의 정제된 편모를 사용한다. 편모의 농축 된 분획을 염화 세슘 (ClCs) 구배에서 정화하십시오.
- 편모를 정화하기위한 세슘 클로라이드 구배.
- 12.1g의 CsCl을 27mL의 증류된H2O와 혼합한다.
- 편모 (150 μL)의 농축 분획을 얇은 벽 초투명 튜브 (14 mm x 89 mm) (재료 표)로 옮기고 12 mL의 CsCl 용액으로 채 웁니다.
- 튜브를 60,000 x g 에서 4°C에서 48시간 동안 스윙 버킷 로터에서 초원심분리한다(표 재료).
- 편모 밴드를 주사기로 CsCl 구배 내로 수집하고, 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) 플러스 2 mM EDTA에 대해 투석한다. 이어서, 투석된 편모를 12% SDS-Polyacrylamide 겔 및 쿠마시 블루 염색(단계 4.1.6)에서 전기영동하거나 질량 분광법에 의해 분석한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 방법론은 편모 글리코실화 및 편모 필라멘트의 역할에 영향을 줄 수 있는 Aeromonas 의 유전자 또는 염색체 영역에서 널 돌연변이를 생성하는 효과적인 시스템을 제공합니다(그림 1).
이 프로토콜은 추정 FGI의 생물 정보학 적 확인과 GT를 코딩하는 유전자가이 영역에 제시하는 것으로 시작됩니다. 에어로모나스에서 FGI의 염색체 위치는 세 가지 유형의 유전자의 검출을 기반으로합니다 : pseudaminic acid (pseI 및 pseC)의 생합성에 관여하는 유전자, 극성 편모 유전자 및 luxC. A. 친수성 AH-130과 같은 단일 pseudaminic acid 유도체에 의해 당화되는 극성 편모가 그의 균주는 FGIs 그룹 I27에 위치한 pse 유전자 사이에 GTs를 코딩하는 유전자를 갖지 않는다. 이 FGI 그룹에 속하는 대부분의 균주는 이 영역에 인접한 극성 편모 유전자를 나타낸다. 대조적으로, 극성 편모가 A. piscicola AH-319와 같은 헤테로다당류 글리칸과 당화되는 균주는 럭스 하류의 GT를 코딩하는 상이한 유전자를 보여주며, FGIs 그룹 II27의 pse 유전자 사이에 국소화되어 있으며, 이들은 항상 극성 편모 유전자에 인접해 있는 것은 아니다(도 2A).
편모 헤테로다당류 글리칸의 생합성에 관여하는 부위와 거기에 포함된 추정적 GTs의 기능은 널 돌연변이체의 구축에 의해 확인되었다. 각 돌연변이체의 생성에는 네 개의 프라이머가 필요하다: A, B, C 및 D(표 1). 프라이머 B는 결실될 유전자(fgi-4) 또는 제1 유전자(fgi-1)의 개시 하류의 5-6 코돈을 어닐링하고, 프라이머 A는 이 유전자의 시작으로부터 600-800 bp 상류에서 어닐링한다(fgi-4 또는 fgi-1). 프라이머 C는 결실될 유전자 (fgi-4) 또는 마지막 유전자 (fgi-12)의 마지막 5-6 코돈의 상류를 어닐링하고, 프라이머 D는 이 유전자의 정지로부터 600-800 bp 하류에서 어닐링한다 (fgi-4 또는 fgi-12) (도 2B). A. 피시콜라 AH-3의 fgi 클러스터 및 fgi-4의 결실을 위한 프라이머 A 및 D는 그들의 5' 말단에서 엔도뉴클레아제 BamHI에 대한 제한 부위를 함유한다(표 1). 이 엔도뉴클레아제는 AB 또는 CD PCR 단편에 내부 표적이 없다. 한 가지 중요한 단계는 B 및 C 프라이머의 설계입니다. 둘 다 결실될 유전자 또는 단편의 개방 판독 프레임을 깨뜨리지 않기 위해 인프레임이어야 한다. B 및 C 프라이머의 5' 말단에 있는 21bp 상보적 서열은 3' 말단 상보성 서열을 갖는 AB 및 CD 앰플리콘의 생성을 허용하며, 이는 이들 앰플리콘의 결합 및 연장을 허용한다. 앰플리콘을 접합하고 확장하는 PCR 프로그램은 초기 탈자연화 단계와 54°C의 어닐링 온도를 갖는 5 사이클(보충 자료)로 구성된다. 이어서, A 및 D 프라이머의 첨가는 연장된 단편의 증폭을 허용한다(도 3). BamH I의 효소 작용은 BglII로 소화된 자살 벡터 pDM4와의 결찰을 위해 양립가능한 끈적끈적한 말단을 갖는 앰플리콘을 발생시킨다.
pDM4가 λpir 의존성 플라스미드임을 감안할 때, 라이게이션 생성물을 대장균 균주 MC1061λpir (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λpir) 내로 전기천공하고, 클로람페니콜 플레이트에서 선택하였다. pDM4는 재조합 클론을 선택하는 직접적인 시스템을 갖지 않으며, 콜로니를 클로닝 영역을 플랭크하는 pDM4 프라이머 쌍 (pDM4for 및 pDM4rev) (표 1 및 보충 자료)으로 PCR에 의해 분석하였다. pDM4가 없는 대장균 균주 MC1061λ피르 를 PCR 반응에서 음성 대조군으로 사용하였다.
대립유전자 교환을 수행하기 위해, 재조합 pDM4 플라스미드를 수용자 균주 A. 피시콜라 AH-3으로 옮겼다. 많은 에어로모나 스가 전기천공에 의해 변형가능하지 않다는 것을 감안할 때, 재조합 pDM4는 삼부모 짝짓기를 사용하여 접합에 의해 전달되었다(그림 4). 트랜스콘쥬게이트 콜로니를 선택하기 위해, 우리는 리팜피신 내성 수용자 균주를 사용하며, 이는 콘쥬게이션 짝짓기로부터 에어로모나스 균주를 선택할 수 있게 한다. 또한, 선택된 콜로니는 에어로모나스가 옥시다아제 양성인 반면, 대장균 은 옥시다아제 음성이기 때문에 옥시다제 시험에 제출되었다. 첫 번째 및 두 번째 재조합은 증폭된 영역(AB 및 CD 단편)의 외부 프라이머(E 및 F 프라이머)를 사용한 PCR에 의해 확인되었다(표 1, 보충 자료, 및 도 5A).
Aeromonas에서 극성 편모의 글리코실화는 편모 필라멘트의 조립에 필수적입니다. 기능적 극성 편모의 존재는 결실된 GTs 유전자 또는 영역을 갖는 박테리아 콜로니의 운동성 검정을 사용하여 분석하였다. 광 현미경 분석은 액체 배지에서의 수영 운동성이 야생형 균주와 비교하여 두 돌연변이체 모두에서 감소되었다는 것을 보여주었다. 더욱이, 둘 다 연질 한천 상에서 운동성을 분석하였을 때 야생형 균주와 관련하여 감소된 방사상 팽창을 나타냈다(도 5B). 두 돌연변이체 모두 수영할 수 있었으나 야생형 균주와 관련하여 운동성이 감소하였음을 감안할 때, 그들의 극성 편모는 정제되었고, 편모 분자량은 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다. 이 분석은 두 돌연변이체 모두 야생형 균주보다 분자량이 낮은 극성 편모를 가지고 있음을 보여 주었고 (그림 5C), 이는 편모 글리칸의 변화를 암시합니다. CsCl 구배에 의해 정제된 편모(도 5C)는 글리칸 및 글리칸 조성물의 역할을 확인하기 위해 생물막, 부착, 또는 다른 검정에 사용되는 글리칸 조성물 및 널 돌연변이체를 확인하기 위한 질량 분광법 검정에 사용될 것이다.
그림 1: 이 절차에 사용된 단계의 개요 Aeromonas 의 편모 글리코실화 섬을 확인하기 위한 프로토콜에 기재된 공정의 반응식, 및 글리칸 생합성에 관여하는 GTs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 염색체 영역의 생물정보적 검출 및 프라이머 설계. (A) A. 친수성 AH-1 및 A. 피시콜라 AH-3에서 확인된 염색체 영역의 반응식. A. 친수성 AH-1 편모 글리코실화 섬은 편모 글리칸이 프스다민산 유도체만을 갖는 균주를 대표하며, A. 피시콜라 AH-3 편모 글리코실화 섬은 편모 글리칸이 헤테로다당류인 균주를 대표한다. 검정으로 표시된 유전자는 pseudaminic acid의 생합성에 관여하고, 노란색으로 표시된 것들은 추정적인 GTs이다. (B) PCR in-frame 결실을 위해 설계된 프라이머 쌍의 염색체 위치의 반응식. A 및 D 프라이머 내의 블루 박스는 엔도뉴클레아제에 대한 제한 결합 부위를 함유한다. B 및 C 프라이머 내의 적색 박스는 21 bp 상보적 서열을 함유한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 자살 플라스미드 pDM4에 대한 PCR 인프레임 결실 및 라이게이션을 구축하기 위한 방법을 묘사하는 반응식. MCS: 다중 클로닝 부위, CmR: 클로람페니콜 내성 유전자, sacB: 바 실러스 서브틸리스 레반수크라제를 코딩하며, 그의 발현은 수크로오스에 의해 유도되고 그람 음성 박테리아에 치명적이며, mob: 동원 유전자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 대립유전자 교환에 사용되는 삼부모 접합 및 절차. 첫 번째 재조합은 에어로모나스 균주 내로의 λpir의 부재로 인해 발생하고, 선택된 유전자 내로의 재조합 플라스미드의 통합을 야기한다. 두 번째 재조합은 sacB 유전자의 발현을 유도하는 10% 수크로오스를 갖는 LB에서의 성장에 의해 유도되고, 플라스미드는 염색체로부터 절제된다. 크로스오버 후에, 야생형 또는 돌연변이된 유전자는 박테리아 염색체 상에 남아있을 수 있다. 널 돌연변이체는 외부 프라이머를 사용한 PCR에 의해 선택된다. RifR: 리팜피신 내성; CmR: 클로람페니콜 내성; SpcR: 스펙티노마이신 내성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 널 돌연변이체의 확인 및 극성 편모의 표현형 분석. (a) A. 피시콜라 AH-3의 fgi-4 외부 프라이머(EF 프라이머)로 PCR하여 클로람페니콜 민감성 콜로니에서 2차 재결합 후 대립유전자 교환을 확인하였다. 레인 WT: A. 피시콜라 AH-3; 레인 1-8: 클로람페니콜-민감성 콜로니의 제2 재조합; 세인트 : 하이퍼 래더 1 Kb 마커. 레인 1-3 및 5-8은 WT 레인으로서 야생형 fgi-4 유전자를 갖는 콜로니를 나타내고, 레인 4는 결실된 fgi-4 유전자를 갖는 콜로니를 나타낸다. (b) 25°C에서 A. 피시콜라 AH-3 및 fgi-4 유전자(AH-3ΔFgi) 및 fgi-4 유전자(AH-3ΔFgi-4)의 노말 돌연변이체의 연질 한천 상의 운동성. (C) AH-3(레인1)로부터의 극성 편모 및 fgi 영역(레인 2) 및 fgi-4 유전자(레인 3)에서의 널 돌연변이체를, CsCl 구배에서 단리, 정제하고, 12% SDS-PAGE에서 분석하고, 쿠마시 블루를 사용하여 염색하였다. 크기 표준 (St). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프라이머 이름 | 5' ~ 3' 방향의 시퀀스 | 에 사용 | ||
| A. 피시콜라 AH-3 | ||||
| A-플레지1 | CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA | fgi 돌연변이체 | ||
| B-플레지1 | CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA | |||
| C-Flgi12 | TGTTTAAGTTTAGTGGAGGG GGAACCTTAAATGCCATGA | |||
| D-플레지12 | CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC | |||
| E-Flgi1 | ACCCGCTTCATTCGCTAT | |||
| F-Flgi12 | TCCGATTTTCTGACTCAGGG | |||
| A-Fgi4 | CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA | fgi-4 돌연변이체 | ||
| B-Fgi4 | CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT | |||
| C-Fgi4 | TGTTTAAGTTTAGTGGAGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT | |||
| D-Fgi4 | CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC | |||
| E-Fgi4 | ATTTCCCTGCCAAATACG | |||
| F-Fgi4 | CCTGCCAACAGGATGTAAG | |||
| pDM4 벡터 | ||||
| pDM4for | AGTGATCTTCCGTCACAGG | pDM4 벡터에 삽입 | ||
| pDM4rev | AAGGTTTAACGG TTGTGGA | |||
표 1: 널 돌연변이체의 구축에 사용되는 프라이머. 프라이머 B 및 C에서 겹치는 영역은 밑줄이 그어져 있다. 뱀 HI 부위는 프라이머 A 및 D에서 굵게 표시된다.
보충 자료. 비대칭 PCRs에 사용되는 시약 및 반응은 AB 및 CD 앰플리콘을 얻기 위해, Pre-AD 및 AD PCRs를 확장 및 수득하기 위해 AD 앰플리콘, pDM4 벡터에 결실된 작제물의 삽입을 검증하기 위한 pDM4 PCR, 및 EF PCRs를 사용하여 첫 번째 및 두 번째 재조합을 검증한다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 방법의 중요한 초기 단계는 편모 및 추정 GT의 글리코실화에 관여하는 영역을 확인하는 것인데, 이는 이들 효소가 높은 상동성을 보이고 많은 과정에 관여하기 때문이다. 공공 데이터베이스에서 Aeromonas 게놈의 생물 정보학 분석은이 영역이 많은 균주의 편모 유전자를 포함하고 pseudaminic acid27의 생합성에 관여하는 유전자를 포함하는 극성 편모 영역 2에 인접 해 있음을 보여줍니다. 이로 인해 Aeromonas 에서 편모 글리코실화 섬을 검출하기위한 가이드 라인을 개발할 수있게되었으며, 이는 편모 글리칸에 pseudaminic acid 유도체가 포함 된 다른 박테리아에서이 영역을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 편모 글리코실화에 관여하는 유전자 클러스터를 분석하는 방법을 기술하지만, 다른 그람 음성 박테리아에서 편모 형성, 회전 또는 조절에 관여할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 연구하는 데에도 사용될 수 있다.
PCR 인프레임 결실의 생성에 있어서 또한 중요한 것은 B 및 C 프라이머의 설계이다. 이들 프라이머는 결실될 선택된 유전자 또는 영역의 개시 (B 프라이머) 및 정지 (C 프라이머)의 상류의 하류에 국소화되어야 하고, 개방 리딩 프레임을 깨뜨리지 않아야 한다. 더욱이, 고려해야 할 중요한 인자는 AB 및 CD 앰플리콘을 생성하기 위해 증폭된 상동성 영역의 길이이다. 이 프로토콜은 두 앰플리콘 모두 각각 600-800 bp의 상동체 영역을 포함함을 권장합니다. 더 짧은 상동체 영역은 첫 번째 재조합을 더욱 어렵게 만든다.
에어로모나스 균주는 pDM4 자살 플라스미드를 복제하는데 요구되는 람다 피어 유전자를 운반하지 않는다. 따라서, pDM4 재조합 플라스미드는 염색체 DNA에 통합되어야 한다. 삼부모 짝짓기 후, 첫 번째 재조합이 발생한 박테리아 식민지를 확인하는 것이 중요합니다. 이들 콜로니는 상동성 염색체 영역에 삽입된 재조합 pDM4를 함유한다. 재조합 콜로니의 동정은 결실될 영역을 표적화하는 외부 프라이머(E 및 F 프라이머)와의 PCR 반응을 사용하여 수행된다. 표준 DNA 중합효소가 사용되는 경우, E-F 프라이머는 야생형에서 PCR 산물의 생성만을 유도할 것이다. 이 프라이머 쌍은 pDM4 재조합 플라스미드가 염색체 DNA에 삽입된 박테리아 콜로니에서 어떠한 PCR 산물도 생성하지 않을 것이다. PCR 산물의 부족은 E 및 F 프라이머의 어닐링 서열 사이의 거리 때문이다. 이 거리는 표준 중합효소에 의해 증폭될 수 없다. 그러나, 다른 인자는 또한 PCR 산물의 형성을 방지할 수 있다. 따라서, 먼저 재조합 콜로니는 긴 단편 증폭을 위한 DNA 중합효소에 의해 또는 pDM4 및 외부 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 사용하는 PCR 반응에 의해 확인될 수 있다. 큰 유전 클러스터가 결실될 때, 야생형 균주에서의 증폭은 긴 단편 증폭을 위해 DNA 중합효소의 사용을 필요로 한다. 첫 번째 재조합을 갖는 박테리아 콜로니는 pDM4-외부 프라이머 쌍을 사용한 PCR에 의해 확인될 수 있다. 그러나, 첫 번째 및 두 번째 재조합은 일반적으로 동시에 생성되며, pDM4를 야생형으로 남겨두거나 재조합 후 결실된 유전자와 함께 남겨둔다. 이것은 클로람페니콜 내성 콜로니로 이어지는데, 외부 프라이머를 사용한 PCR은 야생형 유전자 또는 작은 앰플리콘과 동일한 크기의 앰플리콘을 제공하며, 이는 결실된 유전자 또는 단편과 관련이 있습니다. 정확한 재조합 삽입물을 갖는 것으로 나타난 콜로니를 수크로오스와 함께 인큐베이션하여 삽입되지 않은 pDM4를 제거하였다. 수크로스는 그람 음성 박테리아에 대한 치명적인 효소를 인코딩하는 pDM4 상에 위치한 sacB 유전자의 발현을 유도한다. 따라서, 자살 플라스미드가 결여된 콜로니만이 수크로오스와 함께 LB에서 성장할 것이다. 결실된 유전자를 함유하는 콜로니의 동일성을 지지하기 위해, 외부 프라이머 쌍으로 증폭된 단편은 이어서 서열화될 수 있다.
Aeromonas에서 이러한 프레임 내 돌연변이 방법을 구현하면 하류 유전자의 발현 수준에서 변형없이 더 안정적인 null 돌연변이를 생성 할 수 있습니다. 항생제 카세트를 삽입하는 것과 같은 다른 방법은 하류 유전자의 전사를 보장하지만 발현 수준은 변형 될 수 있습니다. 더욱이, 이 방법은 다른 그람 음성 박테리아29,31,32,33을 포함하는 다른 표적 유전자 및 영역에 외삽될 수 있었다.
일부 박테리아 균주에서, 편모와 연결된 글리칸의 손실 또는 변형은 편모 조립의 무능력 또는 편모 필라멘트의 불안정으로 이어질 수 있으며, 이는 극성 편모 운동성의 감소로 이어질 수 있다. 액체 매질에서 운동성 검정을 사용하여 비운동성 표현형과 운동성 표현형을 구별하는 것은 쉽지만, 운동성의 정도의 차이는 정량화하기가 어려울 수 있다. 운동성 플레이트 분석은 운동성의 정도의 차이를 측정하기 위해 요구된다. 그러나, 많은 중온성 에어로모나스 균주를 포함하는 일부 박테리아 종은 구성적 극성 편모 이외에 고점성 매질 또는 플레이트에서 성장할 때 유도성 측방 편모를 발현한다. 두 편모 유형 모두 반고체 판에서 박테리아 운동성에 기여합니다. 따라서 극성 또는 측면 편모의 변형은 이동 직경의 감소로 이어집니다. 따라서, AH-3ΔFgi 및 AH-3ΔFgi-4 돌연변이체는 야생형 균주와 관련하여 단지 감소된 운동성을 나타낸다. 극성 편모의 회전에 의해 생성 된 운동성의 평가를 향상시키기 위해, 널 돌연변이체의 팽창 직경은 야생형 균주뿐만 아니라 극성 편모가 결여된 돌연변이와 관련하여 비교되어야한다. 더욱이, 글리칸 잔기의 수의 감소 또는 글리칸 조성물의 변화는 글리코실화된 편모의 전기영동 운동성에 영향을 미친다. 예를 들어, SDS-PAGE 겔을 사용하여 관찰된 글리코실화 편모의 분자량은 편모 아미노산 서열로부터 예측된 것보다 높고, 글리칸에 대한 붕괴는 그들의 분자량의 감소로서 관찰된다. 일부 경우에, 편모 단백질에 대한 글리칸 변형의 변화는 SDS-PAGE를 사용하여 검출가능하지 않을 수 있다. 이러한 경우, 글리칸의 존재 및 질량을 확인하기 위해 무손상 단백질 또는 편모 펩티드의 질량 분광법 분석이 필요할 수 있습니다.
Aeromonas의 병원성뿐만 아니라 다른 그람 음성 박테리아는 편모의 부재뿐만 아니라 편모 글리 칸의 구성 변화에 의해 영향을받을 수 있습니다. 이러한 변화는 생물 및 비생물 표면에 대한 박테리아 상호 작용, 자기 응집에 영향을 미칠 수 있으며, 면역 반응을 회피 및 / 또는 전염증 반응의 유도에 중요한 역할을합니다. 따라서, 편모 글리코실화와 에어로모나스 병원성 사이의 관계를 평가하기 위해 부착, 생물막 형성 및 전염증 반응 분석이 요구된다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 국립 연구위원회 (Plan Nacional de I + D) (Ministerio de Economía y Competitividad, Spain) 및 Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
- Schäffer, C., Messner, P.
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M.
- Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
- Guerry, P., Szymanski, C. M.
- Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
- Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W.
- Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
- Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
- Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
- Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
- Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
- Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
- Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
- Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
- Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
- McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
- Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
- Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
- Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
- Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
- Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
- Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
- Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
- Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
- Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
- Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
- Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
- Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
- Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
- Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).
