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Immunology and Infection

बैक्टीरियल गतिशीलता में बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए नल उत्परिवर्ती की पीढ़ी

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63231
Automatic Translation
1, 2,3, 2,4, 1
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

Summary

यहां, हम विशिष्ट ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ या ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ वाले क्षेत्रों में एयरोमोनास के शून्य उत्परिवर्ती के निर्माण का वर्णन करते हैं, गतिशीलता assays, और फ्लैगेला शुद्धिकरण एक ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण में उनके एन्कोडेड एंजाइमों की भागीदारी और कार्य को स्थापित करने के लिए किया जाता है, साथ ही साथ जीवाणु रोगजनन में इस ग्लाइकन की भूमिका भी।

Abstract

प्रोकैरियोट्स में ग्लाइकोसिलेशन का अध्ययन एक तेजी से बढ़ता हुआ क्षेत्र है। बैक्टीरिया अपनी सतह पर विभिन्न ग्लाइकोसिलेटेड संरचनाओं को आश्रय देते हैं जिनके ग्लाइकन एक तनाव-विशिष्ट बारकोड का गठन करते हैं। संबद्ध ग्लाइकन यूकेरियोट्स की तुलना में चीनी संरचना और संरचना में उच्च विविधता दिखाते हैं और बैक्टीरिया-मेजबान मान्यता प्रक्रियाओं और पर्यावरण के साथ बातचीत में महत्वपूर्ण हैं। रोगजनक बैक्टीरिया में, ग्लाइकोप्रोटीन संक्रामक प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में शामिल किए गए हैं, और ग्लाइकन संशोधन ग्लाइकोप्रोटीन के विशिष्ट कार्यों में हस्तक्षेप कर सकते हैं। हालांकि, ग्लाइकन संरचना, संरचना और जैवसंश्लेषण मार्गों की समझ में की गई प्रगति के बावजूद, रोगजनकता या पर्यावरण के साथ बातचीत में ग्लाइकोप्रोटीन की भूमिका की समझ बहुत सीमित है। इसके अलावा, कुछ बैक्टीरिया में, प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के लिए आवश्यक एंजाइमों को अन्य पॉलीसेकेराइड बायोसिंथेटिक मार्गों के साथ साझा किया जाता है, जैसे कि लिपोपॉलीसेकेराइड और कैप्सूल बायोसिंथेटिक मार्ग। ग्लाइकोसिलेशन के कार्यात्मक महत्व को ग्लाइकोसिलेशन प्रक्रिया में शामिल होने के लिए माना जाने वाले विशिष्ट जीनों के उत्परिवर्तन के माध्यम से कई बैक्टीरिया में स्पष्ट किया गया है और लक्ष्य ग्लाइकोप्रोटीन की अभिव्यक्ति और संशोधित ग्लाइकन पर इसके प्रभाव का अध्ययन किया गया है। मेसोफिलिक एयरोमोनास में एक एकल और ओ-ग्लाइकोसिलेटेड ध्रुवीय फ्लैगेलम होता है। फ्लैगेलर ग्लाइकन एरोमोनास उपभेदों के बीच कार्बोहाइड्रेट संरचना और श्रृंखला की लंबाई में विविधता दिखाते हैं। हालांकि, आज तक विश्लेषण किए गए सभी उपभेदों में एक pseudaminic एसिड व्युत्पन्न को जोड़ने वाली चीनी के रूप में दिखाया गया है जो सेरीन या थ्रेओनिन अवशेषों को संशोधित करता है। ध्रुवीय फ्लैगेला असेंबली के लिए pseudaminic एसिड व्युत्पन्न की आवश्यकता होती है, और इसके नुकसान का आसंजन, बायोफिल्म गठन और उपनिवेशीकरण पर प्रभाव पड़ता है। इस लेख में विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है कि कैसे नल उत्परिवर्ती के निर्माण का उपयोग जीन या जीनोम क्षेत्रों की भागीदारी को समझने के लिए किया जा सकता है जिसमें फ्लैगेलर ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण में कल्पित ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ होते हैं। इसमें शामिल ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ के कार्य और ग्लाइकन की भूमिका को समझने की क्षमता शामिल है। यह ग्लाइकन की कमी वाले उत्परिवर्ती की तुलना जंगली प्रकार के तनाव से करके प्राप्त किया जाएगा।

Introduction

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन को ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया दोनों में वर्णित किया गया है और इसमें एक अमीनो एसिड साइड चेन 1,2 के लिए ग्लाइकन के सहसंयोजक लगाव शामिल हैं। प्रोकैरियोट्स में, यह प्रक्रिया आमतौर पर दो प्रमुख एंजाइमेटिक तंत्रों के माध्यम से होती है: ओ- और एन-ग्लाइकोसिलेशन 3। ओ-ग्लाइकोसिलेशन में, ग्लाइकन एक सेरीन (सेर) या थ्रेओनिन (थ्र) अवशेषों के हाइड्रॉक्सिल समूह से जुड़ा होता है। एन-ग्लाइकोसिलेशन में, ग्लाइकन को ट्रिपेप्टाइड अनुक्रमों के भीतर एक शतावरी (एएसएन) अवशेषों के साइड चेन एमाइड नाइट्रोजन से जोड़ा जाता है Asn-X-Ser / Thr, जहां एक्स प्रोलाइन को छोड़कर कोई भी अमीनो एसिड हो सकता है।

ग्लाइकन रैखिक या शाखित संरचनाओं को अपना सकते हैं और मोनोसेकेराइड या पॉलीसेकेराइड से बने होते हैं जो ग्लाइकोसिडिक बांड द्वारा सहसंयोजक रूप से जुड़े होते हैं। प्रोकैरियोट्स में, ग्लाइकन आमतौर पर यूकेरियोटिक ग्लाइकन4 की तुलना में चीनी संरचना और संरचना में विविधता दिखाते हैं। इसके अलावा, दो अलग-अलग बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन मार्ग जो इस बात से भिन्न होते हैं कि ग्लाइकन को कैसे इकट्ठा किया जाता है और स्वीकर्ता प्रोटीन में स्थानांतरित किया जाता है, का वर्णन किया गया है: अनुक्रमिक और एन ब्लॉक ग्लाइकोसिलेशन 5,6। अनुक्रमिक ग्लाइकोसिलेशन के लिए, जटिल ग्लाइकन को मोनोसेकेराइड के क्रमिक जोड़ द्वारा प्रोटीन पर सीधे बनाया जाता है। एन ब्लॉक ग्लाइकोसिलेशन में, एक पूर्व-इकट्ठे ग्लाइकन को लिपिड-लिंक्ड ओलिगोसेकेराइड से प्रोटीन में एक विशेष ओलिगोसेकरिलट्रांसफरेज़ (ओटास) द्वारा स्थानांतरित किया जाता है। दोनों मार्गों को एन- और ओ-ग्लाइकोसिलेशन प्रक्रियाओं 7 में शामिल होने के लिए दिखाया गयाहै।

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन की प्रोटीन के भौतिक-रासायनिक और जैविक गुणों को संशोधित करने में एक भूमिका है। ग्लाइकन की उपस्थिति प्रभावित कर सकती है कि प्रोटीन अपने लिगैंड के साथ कैसे बातचीत करता है, जो प्रोटीन की जैविक गतिविधि को प्रभावित करता है, लेकिन प्रोटीन स्थिरता, घुलनशीलता, प्रोटियोलिसिस, इम्युनोजेनेसिटी और माइक्रोब-होस्ट इंटरैक्शन के प्रति संवेदनशीलता को भी प्रभावित कर सकताहै। हालांकि, कई ग्लाइकोसिलेशन पैरामीटर, जैसे ग्लाइकन की संख्या, ग्लाइकन संरचना, स्थिति और अनुलग्नक तंत्र, प्रोटीन फ़ंक्शन और संरचना को भी प्रभावित कर सकते हैं।

ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ (जीटी) जटिल ग्लाइकन और ग्लाइकोकॉन्जुगेट्स के जैवसंश्लेषण में प्रमुख एंजाइम हैं। ये एंजाइम एक सक्रिय दाता अणु और एक विशिष्ट सब्सट्रेट स्वीकर्ता से एक चीनी समूह के बीच ग्लाइकोसिडिक बॉन्ड गठन को उत्प्रेरित करते हैं। जीटी न्यूक्लियोटाइड्स और गैर-न्यूक्लियोटाइड्स दोनों को दाता अणुओं के रूप में उपयोग कर सकते हैं और विभिन्न सब्सट्रेट स्वीकर्ताओं को लक्षित कर सकते हैं, जैसे कि प्रोटीन, सैकेराइड, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड10। इसलिए, आणविक स्तर पर जीटी को समझना कार्रवाई और विशिष्टता के उनके तंत्र की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह भी समझने में सक्षम बनाता है कि प्रासंगिक अणुओं को संशोधित करने वाले ग्लाइकन की चीनी संरचना रोगजनकता से कैसे संबंधित है। कार्बोहाइड्रेट सक्रिय एंजाइम डेटाबेस (CAZy) 11 अपने अनुक्रम होमोलॉजी के अनुसार जीटी को वर्गीकृत करता है, जो एक भविष्यवाणी उपकरण प्रदान करता है क्योंकि, अधिकांश जीटी परिवारों में, संरचनात्मक गुना और कार्रवाई के तंत्र अपरिवर्तनीय हैं। हालांकि, चार कारणों से कई जीटी की सब्सट्रेट विशिष्टता की भविष्यवाणी करना मुश्किल हो जाता है: 1) प्रोकैरियोट्स में सब्सट्रेट विशिष्टता का निर्धारण करने वाला कोई स्पष्ट अनुक्रम आकृति निर्धारित नहीं किया गया है12, 2) कई जीटी और ओटी सब्सट्रेट संकीर्णता दिखाते हैं13,14, 3) कार्यात्मक जीटी पुनः संयोजक रूप में उच्च उपज में उत्पादन करना मुश्किल है और 4) दाता और स्वीकर्ता सब्सट्रेट दोनों की पहचान जटिल है। इसके बावजूद, हाल के म्यूटाजेनेसिस अध्ययनों ने उत्प्रेरक तंत्र की समझ में महत्वपूर्ण प्रगति प्राप्त करना और जीटी के बंधन को घटाना संभव बना दिया है।

बैक्टीरिया में, ओ-ग्लाइकोसिलेशन एन-ग्लाइकोसिलेशन की तुलना में अधिक प्रचलित प्रतीत होता है। ओ-ग्लाइकोसिलेशन साइटें एक आम सहमति अनुक्रम नहीं दिखाती हैं, और कई ओ-ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन स्रावित या सेल-सतह प्रोटीन होते हैं, जैसे कि फ्लैगेलिन, पिली, या ऑटोट्रांसपोर्टर 1। फ्लैगेलिन ग्लाइकोसिलेशन स्वीकर्ता साइटों, ग्लाइकन संरचना और संरचना की संख्या में परिवर्तनशीलता दिखाता है। उदाहरण के लिए, Burkholderia spp flagellins में केवल एक स्वीकर्ता साइट है, जबकि कैम्पिलोबैक्टर जेजुनी में, फ्लैगेलिन में 19 स्वीकर्ता साइटें15,16 हैं। इसके अलावा, कुछ बैक्टीरिया के लिए, ग्लाइकन एक एकल मोनोसेकेराइड है, जबकि अन्य बैक्टीरिया में ओलिगोसेकेराइड बनाने के लिए विभिन्न मोनोसेकेराइड्स से समझौता करने वाले विषम ग्लाइकन होते हैं। यह विषमता एक ही प्रजाति के उपभेदों के बीच भी होती है। हेलिकोबैक्टर फ्लैगेलिन को केवल pseudaminic acid (PseAc)17 द्वारा संशोधित किया जाता है, और Campylobacter flagellins को PseAc द्वारा संशोधित किया जा सकता है, pseudaminic acid (PseAm) या legionaminic acid (LegAm) का एसिटामिडिनो रूप, और एसिटाइल, एन-एसिटाइलग्लूकोसामाइन, या प्रोपियोनिक प्रतिस्थापन 18,19 के साथ इन शर्करा से व्युत्पन्न ग्लाइकन। एयरोमोनास में, फ्लैगेलिन को ग्लाइकन द्वारा संशोधित किया जाता है, जिनकी संरचना एक एकल पीएसईएसी एसिड व्युत्पन्न से लेकर हेटेरोपॉलीसेकेराइड20 तक होती है, और फ्लैगेलिन मोनोमर्स के लिए ग्लाइकन का लगाव हमेशा पीएसईएसी व्युत्पन्न के माध्यम से होता है।

सामान्य तौर पर, फ्लैगेलिन का ग्लाइकोसिलेशन फ्लैगेलर फिलामेंट असेंबली, गतिशीलता, वायरस और मेजबान विशिष्टता के लिए आवश्यक है। हालांकि, जबकि सी जेजुनी16, एच पाइलोरी17, और एरोमोनास एसपी के फ्लैगेलिन। 21 फिलामेंट में इकट्ठा नहीं हो सकता है जब तक कि प्रोटीन मोनोमर्स ग्लाइकोसिलेटेड, स्यूडोमोनास एसपीपी और बर्कहोल्डेरिया एसपीपी न हों। 15 फ्लैगेला असेंबली के लिए ग्लाइकोसिलेशन की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, कुछ सी जेजुनी उपभेदों में, फ्लैगेला ग्लाइकन की चीनी संरचना में परिवर्तन बैक्टीरिया-मेजबान बातचीत को प्रभावित करते हैं और कुछ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने में भूमिका निभा सकते हैं। Autoagglutination एक और फेनोटाइपिक विशेषता है जो फ्लैगेलिन से जुड़े ग्लाइकन की संरचना में संशोधनों से प्रभावित होती है। एक कम autoagglutination microcolonies और biofilm22 बनाने की क्षमता में कमी की ओर जाता है। कुछ बैक्टीरिया में, एक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया को ट्रिगर करने के लिए फ्लैगेला की क्षमता फ्लैगेलिन ग्लाइकोसिलेशन से जुड़ी हुई थी। इस प्रकार, पी एरुगिनोसा में, ग्लाइकोसिलेटेड फ्लैगेलिन अनग्लाइकोसिलेटेड23 की तुलना में एक उच्च समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है।

एयरोमोनास पर्यावरण में सर्वव्यापी ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया हैं, जो उन्हें सभी एक स्वास्थ्य घटकों के इंटरफ़ेस पर होने की अनुमति देता है। मेसोफिलिक एयरोमोनास में एक एकल ध्रुवीय फ्लैगेलम होता है, जो संरचनात्मक रूप से उत्पादित होता है। नैदानिक आइसोलेट्स के आधे से अधिक भी पार्श्व फ्लैगेलिन व्यक्त करते हैं, जो उच्च चिपचिपाहट मीडिया या प्लेटों में कम करने योग्य है। विभिन्न अध्ययनों ने बैक्टीरियल रोगजनन 25 के शुरुआती चरणों के साथ दोनों फ्लैगेला प्रकारों से संबंधितकिया है। जबकि आज तक रिपोर्ट किए गए ध्रुवीय फ्लैगेलिन ओ-ग्लाइकोसिलेटेड होते हैं, जो इसके केंद्रीय इम्युनोजेनिक डोमेन के 5-8 सेर या थ्र अवशेषों पर होते हैं, पार्श्व फ्लैगेलिन सभी उपभेदों में ओ-ग्लाइकोसिलेटेड नहीं होते हैं। यद्यपि विभिन्न उपभेदों से ध्रुवीय फ्लैगेला ग्लाइकन अपने कार्बोहाइड्रेट संरचना और श्रृंखला की लंबाई20 में विविधता दिखाते हैं, चीनी को जोड़ने के लिए एक pseudaminic एसिड व्युत्पन्न होने के लिए दिखाया गया है।

इस पांडुलिपि का लक्ष्य विशिष्ट जीटी या क्रोमोसोमल क्षेत्रों में शून्य उत्परिवर्ती प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन करना है जिसमें जीटी शामिल हैं ताकि प्रासंगिक पॉलीसेकेराइड के जैवसंश्लेषण में और जीवाणु रोगजनकता में उनकी भागीदारी का विश्लेषण किया जा सके, साथ ही ग्लाइकन की भूमिका भी। एक उदाहरण के रूप में, हम ध्रुवीय फ्लैगेलिन ग्लाइकोसिलेशन में अपनी भागीदारी स्थापित करने और फ्लैगेलिन ग्लाइकन की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए एयरोमोनास के जीटी वाले क्रोमोसोमल क्षेत्र की पहचान करते हैं और हटाते हैं। हम दिखाते हैं कि इस ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण और संशोधित ग्लाइकन की भूमिका में अपने कार्य को स्थापित करने के लिए एक विशिष्ट जीटी को कैसे हटाया जाए। हालांकि एक उदाहरण के रूप में एरोमोनास का उपयोग करते हुए, सिद्धांत का उपयोग अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन द्वीपों की पहचान और अध्ययन करने और ओ-एंटीजन लिपोपॉलीसेकेराइड जैसे अन्य ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण में शामिल जीटी के कार्य का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

प्रक्रिया का योजनाबद्ध निरूपण चित्र 1 में दिखाया गया है।

1. एयरोमोनास में फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन द्वीप (एफजीआई) की जैव सूचना विज्ञान पहचान

  1. Aeromonas जीनोम में PseAc बायोसिंथेटिक क्लस्टर की पहचान करने के लिए, NCBI डेटाबेस26 से tblastn उपकरण का उपयोग करें। सबसे पहले, अनुक्रमित एयरोमोनास उपभेदों के डेटाबेस से PseC और PseI के लिए ऑर्थोलॉगस प्रोटीन प्राप्त करें (पहचान कोड OCA61126.1 और OCA61113.1 हैं) OCA61126.1 और OCA61113.1 हैं), और फिर उनके अनुवादित न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों की खोज करने के लिए tblastn उपकरण का उपयोग करें।
    नोट: पीएसई जीन एयरोमोनास एफजीआई को फ्लैंक करते हैं, जिसमें पीएसईबी और पीएसईसी क्लस्टर के एक छोर पर स्थित होते हैं और दूसरे छोर पर पीएसईआई होते हैं। पीएसई जीन के बाकी हिस्सों का स्थान एक एफजीआई समूह से दूसरे में अलग हो सकता है।
  2. यह देखते हुए कि कई उपभेदों के उन ध्रुवीय फ्लैगेलिन जीन एफजीआई से सटे हुए हैं, ध्रुवीय फ्लैगेलिन FlaA और FlaB के लिए ऑर्थोलॉगस प्रोटीन खोजने के लिए एनसीबीआई डेटाबेस से tblastn का उपयोग करें A. piscicola AH-3 (पहचान कोड OCA61104.1 और OCA61105.1 हैं) और जीन जो उन्हें एन्कोड करते हैं।
  3. इसके अलावा, हेटेरोपॉलीसेकेरिडिक ग्लाइकन (समूह II) 27 के जैवसंश्लेषण में शामिल एयरोमोनास एफजीआई में फैटी एसिड संश्लेषण में शामिल एंजाइमों को एन्कोडिंग करने वाले कई जीन होते हैं, जैसे कि लक्ससी और लक्स। एनसीबीआई डेटाबेस से tblastn का उपयोग करें A. piscicola AH-3 के LuxC के लिए ऑर्थोलॉगस प्रोटीन खोजने के लिए (पहचान कोड OCA61121.1 है) और जीन जो इसे एन्कोड करता है।

2. flagella ग्लाइकोसिलेशन द्वीप जीन में नल mutants की पीढ़ी

नोट: म्यूटाजेनेसिस की यह विधि पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) इन-फ्रेम विलोपन उत्पादों के एलेलिक एक्सचेंज पर आधारित है, जो आत्महत्या वेक्टर pDM428 (GenBank: KC795686.1) का उपयोग कर रही है। PDM4 वेक्टर की प्रतिकृति लैम्ब्डा पीर निर्भर है, और वेक्टर पर स्थित sacB जीन का उपयोग करके पूर्ण एलेलिक एक्सचेंज को मजबूर किया जाता है।

  1. PCR इन-फ्रेम विलोपन उत्पादों का निर्माण।
    1. प्राइमरों के दो जोड़े डिज़ाइन करें जो डीएनए क्षेत्रों को अपस्ट्रीम (ए और बी प्राइमर) और चयनित जीन या क्षेत्र के डाउनस्ट्रीम (सी और डी प्राइमर) को हटा दिया जाए (चित्रा 2 बी)।
    2. सुनिश्चित करें कि प्राइमरों ए और डी में शुरू से 600 बीपी से अधिक अपस्ट्रीम और स्टॉप से डाउनस्ट्रीम है, क्रमशः, जीन या जीन को नष्ट करने के लिए। इन दो प्राइमरों को 5 'अंत में एक एंडोन्यूक्लिएज के लिए एक प्रतिबंध साइट शामिल करने की आवश्यकता है जो पीडीएम 4 में क्लोनिंग की अनुमति देता है।
      नोट:: A और D प्राइमरों के 5 'अंत में शामिल प्रतिबंध साइट AB या CD amplicons के भीतर साइटों के रूप में ही नहीं होना चाहिए।
    3. सुनिश्चित करें कि प्राइमर बी और सी हटाए जाने वाले जीन के भीतर या हटाए जाने वाले क्षेत्र के क्रमशः पहले और अंतिम जीन के अंदर हैं। सुनिश्चित करें कि दोनों प्राइमर (बी और सी) इन-फ्रेम हैं और जीन के अंदर 5-6 कोडोन के बीच स्थित हैं। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि दोनों प्राइमरों में 5 'अंत में एक 21 बीपी पूरक अनुक्रम (तालिका 1) शामिल है जो डीएनए एम्प्लिकॉन एबी और सीडी में शामिल होने की अनुमति देता है।
    4. 30 डिग्री सेल्सियस पर रातभर (ओ / एन) रातभर (ओ / एन) ट्रिप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी) के 5 मिलीलीटर में चयनित एयरोमोनास तनाव को बढ़ाएं। जीनोमिक डीएनए शुद्धिकरण के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करें। एक spectrophotometer का उपयोग करके शुद्ध डीएनए के 2 μL की मात्रा निर्धारित करें।
      नोट: एक रिक्त के रूप में डबल आसुत पानी का उपयोग करें, उपकरण के साथ 260 एनएम पर absorbance रिकॉर्ड करने के लिए सेट के साथ। शुद्ध डीएनए के 2 μL के साथ 3-5 बार रिकॉर्ड absorbance और एक औसत absorbance पढ़ने की गणना करें। डीएनए एकाग्रता की गणना करने के लिए बीयर-लैम्बर्ट कानून का उपयोग करें, जहां ए = π.c.l. जिसमें "ए" अवशोषण है, "π" डीएनए के लिए दाढ़ औसत विलुप्त होने का गुणांक है, "सी" डीएनए एकाग्रता है, और "एल" पथ की लंबाई है (प्रत्येक उपकरण की पथ लंबाई के लिए निर्माता के निर्देश को देखें)।
    5. ए-बी और सी-डी प्राइमरों (सामग्री की तालिका) के साथ असममित पीसीआर के दो सेटों में टेम्पलेट के रूप में शुद्ध क्रोमोसोमल डीएनए के 100 एनजी का उपयोग करें। A: B और D: C प्राइमर जोड़े (अनुपूरक सामग्री) के 10: 1 दाढ़ अनुपात का उपयोग करें।
      नोट: असममित PCRs टेम्पलेट के एक स्ट्रैंड के अधिमान्य प्रवर्धन की अनुमति देते हैं और दूसरे से अधिक.
    6. एक 1% agarose जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें। टीएई (40 एमएम ट्रिस-एसीटेट, 1 एमएम ईडीटीए) का उपयोग जेल रनिंग बफर और 8 वी / सेमी की पावर सेटिंग के रूप में करें। डीएनए की कल्पना करने के लिए, जेल में एथिडियम ब्रोमाइड (0.5 μg / mL) जोड़ें और बायो-इमेजिंग स्टेशन (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके पीसीआर उत्पादों की कल्पना करें।
    7. एक स्केलपेल का उपयोग करके जेल से एम्प्लिकॉन्स को एक्साइज करें, निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए शुद्ध करें और उन्हें निर्धारित करें।
    8. पीसीआर उत्पादों के 3 'अंत में उनके 21 बीपी अतिव्यापी अनुक्रमों द्वारा एबी और सीडी amplicons में शामिल हों (चित्रा 3). पीसीआर अभिकर्मकों (पूर्व-एडी पीसीआर) के साथ एक पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक एम्प्लिकॉन (एबी और सीडी) के 100 एनजी को मिलाएं, लेकिन प्राइमरों के बिना, और थर्मोसाइकलर प्रोग्राम (पूरक सामग्री) का उपयोग करके विस्तारित करें। फिर, प्रतिक्रिया (एडी पीसीआर) में ए और डी प्राइमरों के 100 μM जोड़ें और एक एकल टुकड़ा (पूरक सामग्री) के रूप में बढ़ाएं।
    9. चरण 2.1.6 में वर्णित शर्तों का उपयोग करके 1% agarose जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद (एडी एम्प्लिकॉन) का विश्लेषण करें, जेल से एम्प्लिकॉन को एक्साइज करें, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए शुद्ध करें और एम्प्लिकॉन (सामग्री की तालिका) को निर्धारित करें।
  2. इन-फ्रेम विलोपन के साथ pDM4 पुनः संयोजक प्लास्मिड का निर्माण।
    1. 30 डिग्री सेल्सियस पर क्लोराम्फेनिकोल (25 μg / mL) के साथ लुरिया-बर्टानी (एलबी) मिलर शोरबा (10 मिलीलीटर) में पीडीएम 4 युक्त एस्चेरिचिया कोलाई cc18π पीर की एक ओ / एन संस्कृति विकसित करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x g पर संस्कृति को नीचे स्पिन करें और बाँझ आसुत पानी के 600 μL में गोली को निलंबित करें। प्रदाता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्मिड शुद्धिकरण किट का उपयोग करके प्लास्मिड pDM4 का निष्कर्षण और शुद्धिकरण करें।
    3. एक endonuclease के साथ pDM4 के 1 μg और 2 ज के लिए एडी amplicon के 400 ng को पचाने में सक्षम AD amplicon और pDM4 की क्लोनिंग साइट (चित्रा 3) के दोनों सिरों को पचाने में सक्षम है। प्रतिक्रिया की स्थिति के लिए एंजाइम निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें (सामग्री की तालिका)।
    4. डीएनए शुद्धिकरण किट का उपयोग करके पचे हुए प्लास्मिड और एम्प्लिकॉन को साफ करें और निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए उन्हें निर्धारित करें।
    5. Linearized pDM4 के religation को रोकने के लिए, निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए क्षारीय फॉस्फेट एंजाइम का उपयोग करके दोनों 5 'सिरों से फॉस्फेट समूह को हटा दें। फिर, उपचारित प्लास्मिड को साफ करें और चरण 2.1.4 (सामग्री की तालिका) में वर्णित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके इसे निर्धारित करें।
    6. पचाए गए और फॉस्फेट क्षारीय उपचारित pDM4 के 150 एनजी को एक दाढ़ वेक्टर पर पचाए गए एडी एम्प्लिकॉन के 95-100 एनजी के साथ मिलाएं: 1: 4 का सम्मिलित अनुपात। निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए, 15 μL की मात्रा में बंधाव प्रतिक्रिया तैयार करें।
    7. O/N को 20 °C पर या सप्ताहांत में 4 °C पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, 20 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर T4 लिगेज़ को निष्क्रिय करें।
    8. Escherichia कोलाई MC1061 में प्लास्मिड को पेश करने के लिए बंधाव का उपयोग करें electroporation द्वाराπpir तनाव। Electrocompetent बैक्टीरिया और 2 मिमी-गैप इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट का उपयोग करें।
  3. electrocompetent E. coli और pDM4 पुनः संयोजक प्लास्मिड के electroporation की तैयारी
    1. लुरिया-बर्टानी (एलबी) मिलर शोरबा में ई कोलाई MC1061πpir तनाव की एक एकल कॉलोनी को संक्रमित करें और 200 आरपीएम मिलाने के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन बढ़ाएं।
    2. एलबी शोरबा के 18 मिलीलीटर में बैक्टीरियल संस्कृति के 2 एमएल को पतला करें और 30 डिग्री सेल्सियस पर हिलाते हुए (200 आरपीएम) के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि0.4-0.6 के बीच एक ऑप्टिकल घनत्व (ओडी 600) प्राप्त न हो जाए।
    3. 5,000 x g और 4 °C पर 15 मिनट के लिए centrifugation द्वारा जीवाणु संस्कृति गोली. supernatant त्यागें और ठंडा आसुत एच2ओ के 40 मिलीलीटर में गोली निलंबित.
    4. सभी संस्कृति लवणों को हटाने के लिए इस सफाई चरण को दो बार और दोहराएं। अंत में, ठंडा आसुत एच2ओ के 4 मिलीलीटर में गोली को निलंबित करें और चार शंक्वाकार 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक को निलंबन के 1 एमएल को स्थानांतरित करें।
    5. 5 मिनट के लिए 14,000 x g और 4 °C पर centrifugation द्वारा जीवाणु संस्कृति गोली. गोली को परेशान किए बिना supernatant निकालें और ठंडा आसुत एच2ओ के 100 μL में प्रत्येक गोली को निलंबित.
    6. प्रत्येक ट्यूब के लिए बंधाव मिश्रण के 3-3.5 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। फिर, प्रत्येक ट्यूब की सामग्री को एक ठंडा 2 मिमी-गैप इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें और 2 केवी, 129 Ω, और 5 एमएस के आसपास समय स्थिरांक लागू करें।
      नोट: बर्फ पर electroporation cuvettes पूर्व ठंडा. पूरी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर बैक्टीरिया को बनाए रखें।
    7. इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, अपनी सामग्री को पुनर्प्राप्त करने के लिए चार क्यूवेट में से प्रत्येक में एसओसी माध्यम के 250 μL जोड़ें, उन्हें एक संस्कृति ट्यूब (लगभग 1 एमएल) में स्थानांतरित करें, और हिलाते हुए (200 आरपीएम) के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    8. प्लेट में बढ़ने वाले सभी उपनिवेशों में प्लास्मिड बैकबोन सुनिश्चित करने के लिए क्लोराम्फेनिकोल (25 μg / mL) के साथ पूरक लुरिया-बर्टानी (एलबी) आगर प्लेटों पर रूपांतरित कोशिकाओं को प्लेट करें।
    9. क्लोराम्फेनिकोल के साथ एलबी अगर प्लेटों से कुछ कॉलोनियों को चुनें और 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन को इनक्यूबेट करें। जब कालोनियां बढ़ती हैं, तो पीसीआर द्वारा pDM4 में विलोपन निर्माण के सम्मिलन की जांच करें जो pDM4 क्लोनिंग पक्ष को फ्लैंक करने वाले प्राइमरों का उपयोग करके: pDM4for और pDM4rev (तालिका 1), और टेम्पलेट (पूरक सामग्री) के रूप में lysed कॉलोनियों को फ़्लैंक करते हैं।
    10. एक बाँझ टूथपिक के साथ एक कॉलोनी चुनें और इसे 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में डुबोएं जिसमें 1% ट्राइटन एक्स -100, 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 2 एमएम ईडीटीए पीएच 8.0 के 15 μL शामिल हैं। 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, और फिर बर्फ पर 1 मिनट।
    11. गोली बैक्टीरिया और मलबे के लिए 10 मिनट के लिए 12,000 x g पर एक microfuge में ट्यूबों स्पिन. PCR प्रतिक्रिया (सामग्री की तालिका) में टेम्पलेट के रूप में supernatant के 1 μL का उपयोग करें। प्राइमर जोड़ी का एनीलिंग तापमान 50 डिग्री सेल्सियस है, और पीसीआर प्रतिक्रिया को 10% डीएमएसओ (पूरक सामग्री) की आवश्यकता होती है।
    12. उन उपनिवेशों को संक्रमित करें जो क्लोराम्फेनिकोल (25 μg / mL) के साथ एलबी शोरबा के 10 मिलीलीटर में ब्याज के उत्पाद को प्रवर्धित करते हैं और 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन बढ़ते हैं। 2.2.1-2.2.2 चरणों में वर्णित संस्कृतियों से प्लास्मिड निकालें। निर्माता के निर्देशों (सामग्री की तालिका) का पालन करते हुए pDM4 प्राइमरों का उपयोग करके अनुक्रम।
  4. इन-फ्रेम विलोपन का स्थानांतरण करने के लिए Aeromonas मोच
    नोट:: pDM4 पुनः संयोजक प्लास्मिड चयनित में पेश किया जा करने के लिए है Aeromonas त्रिपरांतीय संभोग द्वारा तनाव (चित्र 4). Aeromonas तनाव को त्रिपरेंतल संभोग के बाद चुने जाने के लिए रिफैम्पिसिन-प्रतिरोधी होना चाहिए। इसलिए, 30 डिग्री सेल्सियस पर टीएसबी पर चयनित उपभेदों O / N को विकसित करें, 5,000 x पर संस्कृतियों के 2 mL, 4 mL और 6 mL सेंट्रीफ्यूज करें g 15 मिनट के लिए, टीएसबी के 100 μL में प्रत्येक गोली को निलंबित करें, और टीएसए में रिफैम्पिसिन (100 μg / mL) के साथ प्लेट करें।
    1. 25 μg / mL क्लोराम्फेनिकोल (दाता तनाव) के साथ एलबी आगर पर pDM4 पुनः संयोजक प्लास्मिड के साथ ई कोलाई MC1061πpir की O / N संस्कृतियों को तैयार करें, एरोमोनास स्ट्रेन रिफैम्पिसिन-टीएसए पर 100 μg / mL रिफैम्पिसिन (प्राप्तकर्ता तनाव) के साथ प्रतिरोधी, और ई कोलाई HB101 के साथ LB आगर पर pRK2073 प्लास्मिड के साथ 80 μg / mL spectinomycin (सहायक तनाव) के साथ।
    2. जब उपनिवेश बढ़ गए हैं, तो दाता, प्राप्तकर्ता और सहायक उपभेदों की समान संख्या (10-15 कॉलोनियों) को निलंबित कर दें, जो एलबी के 150 μL के साथ तीन एलबी ट्यूबों में एक बाँझ टूथपिक के साथ धीरे-धीरे उपभेदों।
    3. फिर, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना, एक एलबी अगर प्लेट पर, एक प्राप्तकर्ता पर दो बूंदों में तीन जीवाणु निलंबन को मिलाएं: सहायक: 5: 1: 1 (प्राप्तकर्ता का 50 μL, दाता का 10 μL, और सहायक का 10 μL) का दाता अनुपात)। प्लेट चेहरे को 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन तक इनक्यूबेट करें। पुनः संयोजक प्लास्मिड के बिना दाता तनाव का उपयोग कर संयुग्मन का नकारात्मक नियंत्रण प्रदर्शन.
      नोट: सहायक तनाव संयुग्मी प्लास्मिड pRK2073 वहन करता है और Aeromonas में pDM4 के हस्तांतरण में सहायता करता है। पिली को तोड़ने से बचने के लिए दाता, प्राप्तकर्ता और सहायक उपभेदों को निलंबित करने के लिए भंवर का उपयोग न करें।
    4. एलबी शोरबा के 1 एमएल जोड़कर और एक जीवाणु निलंबन प्राप्त करने के लिए एक बाँझ ग्लास स्प्रेडर के साथ इसे फैलाने के द्वारा एलबी अगर प्लेट से बैक्टीरिया की कटाई करें। एक शंक्वाकार 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब और भंवर को सख्ती से बैक्टीरियल निलंबन स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
    5. PDM4 पुनः संयोजक प्लास्मिड युक्त प्राप्तकर्ता उपनिवेशों का चयन करने के लिए, रिफैम्पिसिन (100 μg / mL) और chloramphenicol (25 μg / mL) के साथ एलबी अगर प्लेटों पर काटे गए जीवाणु निलंबन की प्लेट 100 μL।
    6. 15 मिनट के लिए 5,000 x g पर एक माइक्रोफ्यूज में नमूनों के 200 μL और 600 μL नीचे स्पिन, LB शोरबा के 100 μL में गोली को निलंबित करें और रिफैम्पिसिन (100 μg / mL) और chloramphenicol (25 μg / mL) के साथ एलबी आगर पर प्लेट। 30 डिग्री सेल्सियस पर 24-48 घंटे के लिए सभी प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
    7. उगाए गए उपनिवेशों को उठाएं, रिफैम्पिसिन (100 μg / mL) और क्लोरैम्फेनिकोल (25 μg / mL) के साथ एलबी प्लेटों में स्थानांतरित करें, और उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन इनक्यूबेट करें। फिर, पुष्टि करें कि उपनिवेश ऑक्सीडेज परीक्षण29 द्वारा एयरोमोनास हैं और यह कि पीडीएम 4 पुनः संयोजक प्लास्मिड को ई और एफ प्राइमर (पूरक सामग्री) का उपयोग करके पीसीआर द्वारा विशिष्ट गुणसूत्र क्षेत्र में (पहला पुनर्संयोजन) डाला गया था, जो ए और डी प्राइमरों (सामग्री की तालिका) के साथ प्रवर्धित क्षेत्र के बाहर बांधता है। जैसा कि चरण 2.3.11 में वर्णित है, टेम्पलेट के रूप में lysed कालोनियों के 1 μL का उपयोग करें।
    8. इन-फ्रेम विलोपन के लिए एलेलिक एक्सचेंज को पूरा करने के लिए, एकीकृत आत्महत्या प्लास्मिड के साथ उपनिवेशों को दूसरे पुनर्संयोजन के लिए मजबूर करें। 10% सुक्रोज के साथ और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एलबी के 2 मिलीलीटर में पुनः संयोजक उपनिवेशों को बढ़ाएं, ओ / एन 30 डिग्री सेल्सियस पर।
    9. सुक्रोज (10%) के साथ एलबी अगर प्लेट पर चरण 2.4.8 से बैक्टीरियल संस्कृतियों की प्लेट 100 μL। इसके अलावा, प्लेट 100 μL विभिन्न संस्कृति dilutions (10-2-10-4) और 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन इनक्यूबेट।
    10. PDM4 के नुकसान की पुष्टि करने के लिए, कॉलोनियों को उठाएं, क्लोराम्फेनिकोल (25 μg / mL) के साथ और बिना एलबी प्लेटों में स्थानांतरित करें, उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन इनक्यूबेट करें, और फिर क्लोरैंफेनिकोल संवेदनशील कॉलोनियों का चयन करें।
    11. ई-एफ प्राइमर जोड़ी और टेम्पलेट (सामग्री और पूरक सामग्री की तालिका) के रूप में lysed कालोनियों के 1 μL का उपयोग करके पीसीआर द्वारा संवेदनशील उपनिवेशों का विश्लेषण करें। उन कॉलोनियों का चयन करें जिनका पीसीआर उत्पाद हटाए गए निर्माण के आकार के साथ सहसंबद्ध है।

3. गतिशीलता assays

नोट: ग्लाइकोसिलेटेड फ्लैगेला के साथ कुछ जीवाणु प्रजातियों में, ग्लाइकोसिलेशन या ग्लाइकन संरचना के स्तर में संशोधन फ्लैगेलिन की असेंबली को प्रभावित करते हैं, जो आमतौर पर गतिशीलता में कमी या गतिशीलता की अनुपस्थिति के रूप में परिलक्षित होता है। इसलिए, शून्य उत्परिवर्ती के साथ दो गतिशीलता assays प्रदर्शन किया गया था।

  1. तरल मीडिया में गतिशीलता परख
    1. संस्कृति एयरोमोनास 25-30 डिग्री सेल्सियस पर टीएसबी के 1 मिलीलीटर में ओ / एन उपभेदों। एक खुदाई की गई स्लाइड पर माइक्रोस्कोप कवर स्लाइड का पालन करने के लिए, एक टूथपिक की नोक के साथ सिलिकॉन की एक छोटी मात्रा उठाएं और कवर स्लाइड के चार कोनों पर एक छोटी सी बूंद डालें। फिर, कवर स्लाइड के बीच में एयरोमोनास संस्कृति के 1 μL जमा करें और ताजा TSB मीडिया (2 μL) की एक बूंद में मिश्रण करें।
    2. कवर स्लाइड पर एक खुदाई की गई स्लाइड रखें। जमा ड्रॉप के साथ खुदाई का मिलान करें, धीरे से दबाएं, और स्लाइड को उल्टा कर दें।
    3. विसर्जन तेल का उपयोग करके 100x उद्देश्य के साथ एक ऑप्टिक माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा तैराकी गतिशीलता का विश्लेषण करें।
      नोट: Aeromonas के जंगली प्रकार के तनाव सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, एक गैर-फ्लैगेलेटेड बैक्टीरिया जैसे कि क्लेबसिएला का उपयोग करें।
  2. गतिशीलता अर्ध ठोस मीडिया में परख
    1. संस्कृति एयरोमोनास 25-30 डिग्री सेल्सियस पर टीएसबी (1 एमएल) में ओ / एन उपभेदों। फिर, एक नरम आगर प्लेट (1% ट्रिप्टोन, 0.5% NaCl, 0.25% bacto agar) के केंद्र पर संस्कृति के 3 μL को स्थानांतरित करें और प्लेट फेस को 25-30 डिग्री सेल्सियस पर O / N तक इनक्यूबेट करें।
    2. एक शासक का उपयोग करते हुए, परिधि की ओर प्लेट के केंद्र से आगर के माध्यम से जीवाणु प्रवास को मापें।

4. Flagella शुद्धिकरण

  1. बैक्टीरिया की सतह पर लंगर डाले गए फ्लैगेला का अलगाव
    1. संस्कृति एयरोमोनास 25-30 डिग्री सेल्सियस पर टीएसबी (10 मिलीलीटर) में ओ / एन उपभेदों। फिर, टीएसबी (900 एमएल) के साथ एक फ्लास्क में संस्कृति का विस्तार करें और इसे हिलाते हुए (200 आरपीएम) के साथ 25-30 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन बढ़ने दें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। 100 mM Tris-HCl बफर (pH 7.8) के 20 mL में गोली को निलंबित करें।
    3. लंगर वाले फ्लैगेला को हटाने के लिए, 3-4 मिनट के लिए ग्लास बार (2-3 मिमी व्यास) के साथ भंवर में निलंबन को कतरनी करें, और फिर 21-जी सिरिंज के माध्यम से बार-बार (न्यूनतम छह बार) पारित करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर दो लगातार सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पैलेट बैक्टीरिया: सबसे पहले, 30 मिनट के लिए 8,000 एक्स जी पर । 20 मिनट के लिए 18,000 x g पर supernatant और centrifuge निकालें। supernatant, जो मुक्त flagella शामिल हैं ले लीजिए.
    5. Ultracentrifuge supernatant 100,000 x g पर 4 °C पर 1 ज के लिए और 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) प्लस 2 mM EDTA बफर के 150 μL में गोली निलंबित. गोली में फ्लैगेला फिलामेंट्स होते हैं।
    6. एक 12% SDS-Polyacrylamide जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा चरण 4.1.5 से resuspended गोली के 5-10 μL का विश्लेषण करें और Coomassie नीले दाग का उपयोग कर प्रोटीन की कल्पना।
      नोट: प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन और जेल धुंधला के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। ग्लाइकोसिलेटेड फ्लैगेलिन के सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, जंगली-प्रकार के तनाव के शुद्ध फ्लैगेला का उपयोग करें। एक सीज़ियम क्लोराइड (ClCs) ढाल में flagella के समृद्ध अंश को शुद्ध.
  2. सीज़ियम क्लोराइड ग्रेडिएंट फ्लैगेला को शुद्ध करने के लिए।
    1. आसुतएच 2ओ के 27 मिलीलीटर के साथ सीएससीएल के 12.1 ग्राम को मिलाएं।
    2. फ्लैगेला (150 μL) के समृद्ध अंश को एक पतली दीवारों वाली अल्ट्रा-क्लियर ट्यूब (14 मिमी x 89 मिमी) (सामग्री की तालिका) में स्थानांतरित करें और इसे सीएससीएल समाधान के 12 मिलीलीटर के साथ भरें।
    3. Ultracentrifuge 60,000 x g पर 48 h पर 48 h पर एक झूलती बाल्टी रोटर (सामग्री की तालिका) में ट्यूब.
    4. एक सिरिंज के साथ CsCl ढाल में flagella बैंड ले लीजिए और 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) प्लस 2 mM EDTA के खिलाफ dialyze. फिर, एक 12% SDS-Polyacrylamide जेल और Coomassie नीले दाग (चरण 4.1.6) या मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा वैद्युतकणसंचलन द्वारा dialyzed flagella का विश्लेषण करें।

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Representative Results

यह पद्धति एरोमोनास के जीन या क्रोमोसोमल क्षेत्रों में शून्य उत्परिवर्ती उत्पन्न करने के लिए एक प्रभावी प्रणाली प्रदान करती है जो फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन और फ्लैगेला फिलामेंट की भूमिका को प्रभावित कर सकती है (चित्रा 1)।

प्रोटोकॉल परिष्कृत एफजीआई की जैव सूचना विज्ञान की पहचान के साथ शुरू होता है और इस क्षेत्र में जीटी एन्कोडिंग जीन प्रस्तुत करता है। एयरोमोनास में, एफजीआई का गुणसूत्र स्थान तीन प्रकार के जीनों का पता लगाने पर आधारित है: जीन जो pseudaminic एसिड (pseI और pseC), ध्रुवीय फ्लैगेलिन जीन और luxC के जैवसंश्लेषण में शामिल हैं। उपभेदों जिनके ध्रुवीय फ्लैगेला को एक एकल pseudaminic एसिड व्युत्पन्न द्वारा ग्लाइकोसिलेटेड किया जाता है, जैसे कि ए हाइड्रोफिला एएच -130, एफजीआई समूह I27 में स्थित पीएसई जीन के बीच जीटी को एन्कोडिंग करने वाले जीन नहीं होते हैं। इस एफजीआई समूह से संबंधित अधिकांश उपभेद इस क्षेत्र से सटे ध्रुवीय फ्लैगेलिन जीन दिखाते हैं। इसके विपरीत, उपभेद जिनके ध्रुवीय फ्लैगेला को हेटरोपॉलीसेकेराइड ग्लाइकन के साथ ग्लाइकोसिलेटेड किया जाता है, जैसे कि ए पिसिकोला एएच -319, एलएक्ससी के डाउनस्ट्रीम में जीटी को एन्कोडिंग करने वाले विभिन्न जीन दिखाते हैं, जो एफजीआई समूह II27 के पीएसई जीन के बीच स्थानीयकृत होते हैं, और वे हमेशा ध्रुवीय फ्लैगेलिन जीन (चित्रा 2 ए) के बगल में नहीं होते हैं।

फ्लैगेला हेटेरोपॉलीसेकेराइड ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण में शामिल क्षेत्र और वहां निहित परिष्कृत जीटी के कार्य की पुष्टि नल उत्परिवर्ती के निर्माण से की गई थी। प्रत्येक उत्परिवर्ती की पीढ़ी के लिए चार प्राइमरों की आवश्यकता होती है: ए, बी, सी, और डी (तालिका 1)। प्राइमर बी anneals 5-6 जीन (fgi-4) या क्लस्टर के पहले जीन (fgi-1) की शुरुआत के डाउनस्ट्रीम के नीचे की ओर anneals और प्राइमर ए anneals 600-800 बीपी इस जीन की शुरुआत से ऊपर की ओर (fgi-4 या fgi-1). प्राइमर सी जीन (fgi-4) या क्लस्टर के अंतिम जीन (fgi-12) के अंतिम जीन के पिछले 5-6 कोडोन के अपस्ट्रीम के अपस्ट्रीम को हटा दिया जाता है और प्राइमर डी इस जीन (fgi-4 या fgi-12) (चित्रा 2B) के स्टॉप से 600-800 बीपी डाउनस्ट्रीम में एनील करता है। प्राइमर ए और डी एफजीआई क्लस्टर के विलोपन के लिए और ए पिसिकोला एएच -3 के एफजीआई -4 में एंडोन्यूक्लिएज बाएमएचआई के लिए उनके 5 'सिरों पर एक प्रतिबंध स्थल होता है (तालिका 1)। इस एंडोन्यूक्लिएज का एबी और न ही सीडी पीसीआर टुकड़ों में कोई आंतरिक लक्ष्य नहीं है। एक महत्वपूर्ण कदम बी और सी प्राइमरों का डिजाइन है। दोनों को हटाने के लिए जीन या टुकड़े के खुले पढ़ने के फ्रेम को तोड़ने के लिए इन-फ्रेम होना चाहिए। बी और सी प्राइमरों के 5 'अंत में 21 बीपी पूरक अनुक्रम 3 'अंत पूरक अनुक्रमों के साथ एबी और सीडी एम्प्लिकॉन की पीढ़ी की अनुमति देते हैं, जो इन एम्प्लिकॉन्स के जुड़ने और विस्तार की अनुमति देते हैं। AMPlicons में शामिल होने और विस्तार करने के लिए पीसीआर कार्यक्रम में एक प्रारंभिक विकृतीकरण चरण और 54 डिग्री सेल्सियस (पूरक सामग्री) के एनीलिंग तापमान के साथ पांच चक्र शामिल हैं। फिर, ए और डी प्राइमरों के अलावा विस्तारित टुकड़े (चित्रा 3) के प्रवर्धन की अनुमति देता है। BamHI की एंजाइमेटिक कार्रवाई Bglद्वितीय के साथ पचा आत्महत्या वेक्टर pDM4 के साथ बंधाव के लिए संगत चिपचिपा अंत के साथ एक amplicon को जन्म देता है.

यह देखते हुए कि pDM4 एक πpir निर्भर प्लास्मिड है, बंधाव उत्पाद को ई कोलाई स्ट्रेन MC1061πpir (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 π pir) में इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था और क्लोरैम्फेनिकोल प्लेटों में चुना गया था। pDM4 में पुनः संयोजक क्लोन का चयन करने के लिए एक सीधी प्रणाली नहीं है, और कॉलोनियों का विश्लेषण पीसीआर द्वारा एक pDM4 प्राइमर जोड़ी (pDM4for और pDM4rev) (तालिका 1 और पूरक सामग्री) के साथ किया गया था जो क्लोनिंग क्षेत्र को फ्लैंक करता है। पीडीएम 4 के बिना ई कोलाई तनाव MC1061πpir पीसीआर प्रतिक्रिया में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

एलेलिक एक्सचेंज करने के लिए, पुनः संयोजक pDM4 प्लास्मिड को प्राप्तकर्ता तनाव A. piscicola AH-3 में स्थानांतरित कर दिया गया था। यह देखते हुए कि कई एयरोमोनास इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा परिवर्तनीय नहीं हैं, पुनः संयोजक पीडीएम 4 को त्रिपरेंतल संभोग (चित्रा 4) का उपयोग करके संयुग्मन द्वारा स्थानांतरित किया गया था। transconjugant उपनिवेशों का चयन करने के लिए, हम एक rifampicin प्रतिरोधी प्राप्तकर्ता तनाव का उपयोग करें, जो संयुग्मन संभोग से Aeromonas तनाव का चयन करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, चयनित कालोनियों को ऑक्सीडेज परीक्षण के लिए प्रस्तुत किया गया था क्योंकि जबकि एयरोमोनास ऑक्सीडेज-पॉजिटिव है, ई कोलाई ऑक्सीडेज नकारात्मक है। पहले और दूसरे पुनर्संयोजन की पुष्टि पीसीआर द्वारा प्रवर्धित क्षेत्रों (एबी और सीडी टुकड़े) (तालिका 1, पूरक सामग्री और चित्रा 5 ए) के बाहरी प्राइमरों (ई और एफ प्राइमर) के साथ की गई थी।

एयरोमोनास में, ध्रुवीय फ्लैगेलिन का ग्लाइकोसिलेशन फ्लैगेलर फिलामेंट की असेंबली के लिए आवश्यक है। कार्यात्मक ध्रुवीय फ्लैगेला की उपस्थिति का विश्लेषण हटाए गए जीटी जीन या क्षेत्र के साथ जीवाणु उपनिवेशों की गतिशीलता का उपयोग करके किया गया था। लाइट माइक्रोस्कोपी assays से पता चला है कि तरल माध्यम में तैराकी गतिशीलता जंगली प्रकार के तनाव की तुलना में दोनों उत्परिवर्ती में कम हो गया था। इसके अलावा, दोनों ने जंगली-प्रकार के तनाव के संबंध में एक कम रेडियल विस्तार दिखाया जब गतिशीलता का विश्लेषण नरम आगर (चित्रा 5 बी) पर किया गया था। यह देखते हुए कि दोनों उत्परिवर्ती तैरने में सक्षम थे, लेकिन जंगली-प्रकार के तनाव के संबंध में कम गतिशीलता के साथ, उनके ध्रुवीय फ्लैगेला को शुद्ध किया गया था, और फ्लैगेलिन आणविक वजन का विश्लेषण 12% एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल में किया गया था। इस विश्लेषण से पता चला है कि दोनों उत्परिवर्ती में जंगली-प्रकार के तनाव (चित्रा 5 सी) की तुलना में कम आणविक वजन के साथ ध्रुवीय फ्लैगेलिन होते हैं, जो फ्लैगेला ग्लाइकन में परिवर्तन का सुझाव देता है। फ्लैगेला CsCl gradients (चित्रा 5C) द्वारा शुद्ध किया जाएगा बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री assays ग्लाइकन संरचना और शून्य उत्परिवर्ती biofilm, आसंजन, या अन्य assays में इस्तेमाल किया की पहचान करने के लिए ग्लाइकन और ग्लाइकन संरचना की भूमिका की पहचान करने के लिए.

Figure 1
चित्र1: इस प्रक्रिया में उपयोग किए गए चरणों का अवलोकन. एरोमोनास के फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन द्वीप की पहचान करने के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रिया की योजना, और ग्लाइकन जैवसंश्लेषण में शामिल जीटी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: क्रोमोसोमल क्षेत्रों और प्राइमर डिजाइन का जैव सूचना विज्ञान का पता लगाना। (ए) ए हाइड्रोफिला एएच -1 और ए पिसिकोला एएच -3 में पहचाने गए क्रोमोसोमल क्षेत्रों की योजना। A. हाइड्रोफिला एएच -1 फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन द्वीप उपभेदों का प्रतिनिधि है, जिनके फ्लैगेला ग्लाइकन में केवल एक pseudaminic एसिड व्युत्पन्न है, और ए पिसिकोला एएच -3 फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन द्वीप उपभेदों का प्रतिनिधि है जिसका फ्लैगेला ग्लाइकन एक हेटेरोपॉलीसेकेराइड है। काले रंग में निरूपित जीन pseudaminic एसिड के जैवसंश्लेषण में शामिल हैं, और पीले रंग को निरूपित करने वाले लोग परिष्कृत जीटी हैं। (बी) पीसीआर इन-फ्रेम विलोपन के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर जोड़े के क्रोमोसोमल स्थान की योजना। ए और डी प्राइमरों में नीले बक्से में एक एंडोन्यूक्लिएज के लिए प्रतिबंध बाध्यकारी साइट होती है। बी और सी प्राइमर में लाल बक्से में 21 बीपी पूरक अनुक्रम होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आत्महत्या प्लास्मिड pDM4 के लिए पीसीआर इन-फ्रेम विलोपन और बंधाव का निर्माण करने की विधि को दर्शाने वाली योजना। MCS: मल्टी क्लोनिंग साइट, मुख्यमंत्रीआर: chloramphenicol प्रतिरोधी जीन, sacB: बैसिलस subtilis levansucrase, जिनकी अभिव्यक्ति सुक्रोज से प्रेरित है और ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए घातक है, और भीड़ एन्कोड करता है: जुटाने जीन एन्कोड करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: त्रिपरिवर्तन संयुग्मन और प्रक्रिया का उपयोग एलेलिक एक्सचेंज के लिए किया जाता है। पहला पुनर्संयोजन एयरोमोनास उपभेदों में πpir की अनुपस्थिति के कारण होता है और चयनित जीन में पुनः संयोजक प्लास्मिड के एकीकरण को जन्म देता है। दूसरा पुनर्संयोजन 10% सुक्रोज के साथ एलबी में वृद्धि से प्रेरित होता है, जो सैकबी जीन की अभिव्यक्ति की ओर जाता है, और प्लास्मिड गुणसूत्र से उत्पादित होता है। क्रॉस-ओवर के बाद, जंगली-प्रकार या उत्परिवर्तित जीन जीवाणु गुणसूत्र पर रह सकता है। नल उत्परिवर्ती बाहरी प्राइमरों के साथ पीसीआर द्वारा चुने जाते हैं। Rifआर: rifampicin प्रतिरोधी; सेमीआर: chloramphenicol प्रतिरोधी; एसपीसीआर: spectinomycin प्रतिरोधी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: शून्य उत्परिवर्ती की पुष्टि और ध्रुवीय फ्लैगेला के फेनोटाइपिक विश्लेषण। (ए) क्लोरैम्फेनिकोल संवेदनशील कॉलोनियों में दूसरे पुनर्संयोजन के बाद एलेलिक एक्सचेंज की पुष्टि करने के लिए ए पिसिकोला एएच -3 के एफजीआई -4 बाहरी प्राइमरों (ईएफ प्राइमरों) के साथ पीसीआर। लेन डब्ल्यूटी: ए piscicola AH-3; लेन 1-8: दूसरे पुनर्संयोजन के क्लोरैम्फेनिकोल-संवेदनशील उपनिवेश; सेंट: HyperLadder 1 Kb मार्कर. लेन 1-3 और 5-8 लेन WT के रूप में जंगली-प्रकार के fgi-4 जीन के साथ उपनिवेशों को दिखाते हैं। लेन 4 हटाए गए fgi-4 जीन के साथ एक कॉलोनी दिखाता है। (बी) ए. पिसिकोला एएच -3 के नरम आगर पर गतिशीलता और एफजीआई क्षेत्र (एएच -3 ΠFgi) और एफजीआई -4 जीन (एएच -3 ΠFgi -4) में शून्य उत्परिवर्ती 25 डिग्री सेल्सियस पर (सी) एएच -3 (लेन 1) से ध्रुवीय फ्लैगेलम और एफजीआई क्षेत्र (लेन 2) और एफजीआई -4 जीन (लेन 3) में नल उत्परिवर्ती, अलग-थलग, सीएससीएल ग्रेडिएंट में शुद्ध, 12% एसडीएस-पेज का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। आकार मानक (सेंट). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमर नाम 5' से 3' दिशा में अनुक्रम के लिए उपयोग किया जाता है
A. piscicola AH-3
A-Flgi1 CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA एफजीआई उत्परिवर्ती
B-Flgi1 CCCATCCACTAAACTAACA GATCACCTCGAACTCGAAA
C-Flgi12 TGTTTAAGTTTAGTGGGGGGGG GGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12 CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1 ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-Flgi12 TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-Fgi4 CGCGGATCCGATGCGTCGCTAATATGAA fgi-4 उत्परिवर्ती
B-Fgi4 CCCATCCACTAAACTAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT
C-Fgi4 TGTTTAAGTTTAGTGGGGGGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-Fgi4 CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-Fgi4 ATTTCCCTGCCAAATACG
F-Fgi4 CCTGCCAACAGGATGTAAG
pDM4 सदिश
pDM4for AGTGATCTTCTCTCACAGG PDM4 वेक्टर में सम्मिलन
pDM4rev AAGGTTTAACGG TTGTGGA

तालिका 1: प्राइमर नल उत्परिवर्ती के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया. प्राइमर बी और सी में ओवरलैपिंग क्षेत्रों को रेखांकित किया गया है। Bam HI साइट प्राइमरों ए और डी में बोल्ड किया गया है।

अनुपूरक सामग्री। अभिकर्मकों और प्रतिक्रियाओं असममित PCRs में इस्तेमाल करने के लिए AB और CD amplicons प्राप्त करने के लिए, पूर्व एडी और AD PCRs का विस्तार करने के लिए और AD amplicons प्राप्त करने के लिए, pDM4 PCRs pDM4 वेक्टर में हटाए गए निर्माण के सम्मिलन को सत्यापित करने के लिए, और EF PCRs पहले और दूसरे पुनर्संयोजन को सत्यापित करने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

इस विधि का महत्वपूर्ण प्रारंभिक चरण फ्लैगेला और कल्पित जीटी के ग्लाइकोसिलेशन में शामिल क्षेत्रों की पहचान है क्योंकि ये एंजाइम उच्च होमोलॉजी दिखाते हैं और कई प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं। सार्वजनिक डेटाबेस में एयरोमोनास जीनोम के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण से पता चलता है कि यह क्षेत्र ध्रुवीय फ्लैगेला क्षेत्र 2 से सटे हुए है, जिसमें कई उपभेदों में फ्लैगेलिन जीन होते हैं और इसमें प्यूडेमिनिक एसिड27 के जैवसंश्लेषण में शामिल जीन होते हैं। इसने एयरोमोनास में फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन द्वीपों का पता लगाने के लिए एक दिशानिर्देश विकसित करना संभव बना दिया है जिसका उपयोग अन्य बैक्टीरिया में इस क्षेत्र की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिनके फ्लैगेलर ग्लाइकन में प्यूडेमिनिक एसिड डेरिवेटिव होते हैं। इसके अलावा, हालांकि यह विधि बताती है कि फ्लैगेला ग्लाइकोसिलेशन में शामिल जीन क्लस्टर का विश्लेषण कैसे किया जाए, इसका उपयोग प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन का अध्ययन करने के लिए भी किया जा सकता है जो विभिन्न ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में फ्लैगेला गठन, रोटेशन या विनियमन में शामिल हो सकते हैं।

पीसीआर इन-फ्रेम विलोपन की पीढ़ी में भी महत्वपूर्ण बी और सी प्राइमरों का डिजाइन है। इन प्राइमरों को स्थानीयकृत किया जाना चाहिए 5-6 कोडोन शुरू (बी प्राइमर) के डाउनस्ट्रीम और चयनित जीन या क्षेत्र के स्टॉप (सी प्राइमर) के अपस्ट्रीम को हटा दिया जाना चाहिए और खुले पढ़ने के फ्रेम को नहीं तोड़ना चाहिए। इसके अलावा, विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक एबी और सीडी एम्प्लिकॉन उत्पन्न करने के लिए प्रवर्धित होमोलॉजी क्षेत्र की लंबाई है। यह प्रोटोकॉल अनुशंसा करता है कि दोनों amplicons में प्रत्येक 600-800 बीपी का होमोलॉग क्षेत्र होता है। छोटे होमोलॉग क्षेत्र पहले पुनर्संयोजन को अधिक चुनौतीपूर्ण बनाते हैं।

एरोमोनास उपभेदों में लैम्ब्डा पीर जीन नहीं होता है, जो पीडीएम 4 आत्महत्या प्लास्मिड को दोहराने के लिए आवश्यक है। इसलिए, pDM4 पुनः संयोजक प्लास्मिड गुणसूत्र डीएनए में एकीकृत होना चाहिए। त्रिपरेंतल संभोग के बाद, जीवाणु कालोनियों की पहचान करना महत्वपूर्ण है जिसमें पहला पुनर्संयोजन हुआ है। इन उपनिवेशों में होमोलोगस क्रोमोसोमल क्षेत्र में डाला गया पुनः संयोजक pDM4 होता है। पुनः संयोजक कालोनियों की पहचान प्राइमरों (ई और एफ प्राइमरों) के साथ एक पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग करके की जाती है, जो हटाए जाने के लिए लक्षित क्षेत्र के लिए बाहरी है। यदि एक मानक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है, तो ई-एफ प्राइमर केवल जंगली-प्रकार में एक पीसीआर उत्पाद की पीढ़ी का कारण बनेंगे। यह प्राइमर जोड़ी बैक्टीरिया कॉलोनियों में किसी भी पीसीआर उत्पाद का उत्पादन नहीं करेगी जिसमें पीडीएम 4 पुनः संयोजक प्लास्मिड को क्रोमोसोमल डीएनए में डाला गया है। पीसीआर उत्पाद की कमी ई और एफ प्राइमरों के एनीलिंग अनुक्रमों के बीच की दूरी के कारण है। इस दूरी को मानक पोलीमरेज़ द्वारा प्रवर्धित नहीं किया जा सकता है। हालांकि, अन्य कारक भी पीसीआर उत्पादों के गठन को रोक सकते हैं। इसलिए, पहले पुनः संयोजक कालोनियों को लंबे टुकड़े प्रवर्धन के लिए डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा या पीसीआर प्रतिक्रियाओं द्वारा प्राइमरों के जोड़े का उपयोग करके पहचाना जा सकता है जिसमें एक pDM4 और एक बाहरी प्राइमर शामिल है। जब बड़े आनुवंशिक समूहों को हटा दिया जाता है, तो जंगली-प्रकार के तनाव में प्रवर्धन को लंबे टुकड़े प्रवर्धन के लिए डीएनए पोलीमरेज़ के उपयोग की आवश्यकता होती है। पहले पुनर्संयोजन के साथ बैक्टीरियल कालोनियों को पीसीआर द्वारा प्राइमरों के pDM4-बाहरी जोड़े के साथ पहचाना जा सकता है। हालांकि, पहले और दूसरे पुनर्संयोजन आमतौर पर एक ही समय में उत्पादित होते हैं, पीडीएम 4 को जंगली-प्रकार के साथ या पुनर्संयोजन के बाद हटाए गए जीन के साथ छोड़ देते हैं। यह क्लोरैम्फेनिकोल प्रतिरोधी कॉलोनियों की ओर जाता है, जिनके पीसीआर बाहरी प्राइमरों का उपयोग करके जंगली-प्रकार के जीन या छोटे एम्प्लिकॉन के समान आकार के साथ एम्प्लिकॉन देते हैं, जो हटाए गए जीन या टुकड़े से संबंधित हैं। सही पुनः संयोजक डालने के लिए दिखाया गया उपनिवेशों को गैर-सम्मिलित pDM4 को हटाने के लिए सुक्रोज के साथ इनक्यूबेट किया गया था। सुक्रोज pDM4 पर स्थित sacB जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है, जो ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए एक घातक एंजाइम को एन्कोड करता है। इसलिए, केवल आत्महत्या प्लास्मिड की कमी वाले उपनिवेश सुक्रोज के साथ एलबी में बढ़ेंगे। हटाए गए जीन वाले उपनिवेशों की पहचान का समर्थन करने के लिए, बाहरी प्राइमर जोड़ी के साथ प्रवर्धित टुकड़े को तब अनुक्रमित किया जा सकता है।

एयरोमोनास में इस इन-फ्रेम उत्परिवर्तन विधि को लागू करने से डाउनस्ट्रीम जीन के अभिव्यक्ति स्तरों में संशोधनों के बिना अधिक स्थिर नल उत्परिवर्ती की पीढ़ी की अनुमति मिलती है। अन्य तरीके, जैसे कि एक एंटीबायोटिक कैसेट सम्मिलित करना, डाउनस्ट्रीम जीन के प्रतिलेखन को आश्वस्त करता है, लेकिन अभिव्यक्ति स्तर को संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि को अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया 29,31,32,33 सहित अन्य लक्षित जीनों और क्षेत्रों में एक्सट्रपलेटेड किया जा सकता है।

कुछ जीवाणु उपभेदों में, फ्लैगेलिन से जुड़े ग्लाइकन के नुकसान या संशोधन से फ्लैगेला असेंबली की अक्षमता या फ्लैगेला फिलामेंट की अस्थिरता हो सकती है, जिससे ध्रुवीय फ्लैगेला गतिशीलता में कमी आती है। जबकि तरल मीडिया में गतिशीलता का उपयोग करके एक गैर-गतिशील फेनोटाइप को एक गतिशील से अलग करना आसान है, गतिशीलता की डिग्री में अंतर को मापना मुश्किल हो सकता है। गतिशीलता की डिग्री में अंतर को मापने के लिए गतिशीलता प्लेट assays की आवश्यकता होती है। हालांकि, कुछ जीवाणु प्रजातियां, जिनमें कई मेसोफिलिक एरोमोनास उपभेद शामिल हैं, उच्च चिपचिपा मीडिया या प्लेटों में बढ़ते समय इंड्यूसिबल पार्श्व फ्लैगेला व्यक्त करते हैं, इसके अलावा, घटक ध्रुवीय फ्लैगेला के अलावा। दोनों फ्लैगेला प्रकार अर्ध-ठोस प्लेटों में जीवाणु गतिशीलता में योगदान करते हैं। इसलिए, ध्रुवीय या पार्श्व फ्लैगेला के संशोधन केवल माइग्रेशन व्यास में कटौती का कारण बनते हैं। इस प्रकार, AH-3ΠFgi और AH-3ΠFgi-4 उत्परिवर्ती जंगली-प्रकार के तनाव के संबंध में केवल कम गतिशीलता दिखाते हैं। ध्रुवीय फ्लैगेला के रोटेशन द्वारा उत्पादित गतिशीलता के मूल्यांकन में सुधार करने के लिए, नल उत्परिवर्ती के विस्तार व्यास की तुलना न केवल जंगली-प्रकार के तनाव के संबंध में की जानी चाहिए, बल्कि ध्रुवीय फ्लैगेलम की कमी वाले उत्परिवर्ती के संबंध में भी की जानी चाहिए। इसके अलावा, ग्लाइकन अवशेषों की संख्या में कमी या ग्लाइकन संरचना में परिवर्तन ग्लाइकोसिलेटेड फ्लैगेलिन की इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता को प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, एसडीएस-पेज जैल का उपयोग करके देखे गए ग्लाइकोसिलेटेड फ्लैगेलिन का आणविक वजन फ्लैगेलिन अमीनो एसिड अनुक्रम से भविष्यवाणी की तुलना में अधिक है, और ग्लाइकन में व्यवधान उनके आणविक वजन में कमी के रूप में मनाया जाता है। कुछ मामलों में, फ्लैगेलिन प्रोटीन के लिए ग्लाइकन संशोधन में परिवर्तन SDS-PAGE का उपयोग करके पता लगाने योग्य नहीं हो सकता है। इन मामलों में, ग्लाइकन की उपस्थिति और द्रव्यमान की पुष्टि करने के लिए या तो बरकरार प्रोटीन या फ्लैगेलिन पेप्टाइड्स के द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की आवश्यकता हो सकती है।

एयरोमोनास की रोगजनकता, साथ ही साथ अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया, फ्लैगेलम की अनुपस्थिति से प्रभावित हो सकते हैं, लेकिन फ्लैगेला ग्लाइकन की संरचना में परिवर्तन से भी प्रभावित हो सकते हैं। ये परिवर्तन जैविक और अजैविक सतहों के लिए जीवाणु बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं, ऑटोएग्लूटीनेशन, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने और / या प्रो-इंफ्लेमेटरी प्रतिक्रिया के प्रेरण में भूमिका निभा सकते हैं। इसलिए, पालन, बायोफिल्म गठन, और प्रो-भड़काऊ प्रतिक्रिया assays flagella ग्लाइकोसिलेशन और Aeromonas रोगजनकता के बीच संबंध का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद कनाडा द्वारा समर्थित किया गया था, योजना Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, स्पेन) के लिए और Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Applied Biosystems 4337455 Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity Invitrogen 12346-086 Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose Conda-Pronadise 8008 Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) Promega M1821 Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar Becton Dickinson 214010 Use for motility analysis
BamHI Promega R6021 Used for endonuclease restriction
BglII Promega R6081 Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System UVP Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase Bioline BIO-21040 Used for colony screening
Cesium chloride Applichem A1126,0100 Used for flagella purification
Chloramphenicol Applichem A1806,0025 Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit Cytivia 28-9034-71 Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA Applichem 131026.1211 Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap VWR 732-1133 Used for transformation
Ethidium bromide Applichem A1152,0025 Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker Bioline BIO-33053 DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit Invitrogen 10750204 Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar Condalab 996 Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth Condalab 1551 Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000 NanoDrop Techonologies Inc Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin Applichem A2220,0005 Used for triparental mating
SOC Medium Invitrogen 15544034 Used for electroporation recovery
Spectinomycin Applichem A3834,0005 Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman 331362 Used for flagella purification
T4 DNA ligase Invitrogen 15224017 Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar Condalab 1068 Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth Condalab 1224 Used for Aeromonas grown
Tryptone Condalab 1612 Use for motility analysis
Tris Applichem A2264,0500 Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100 Applichem A4975,0100 Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) Beckman 344059 Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler Applied Biosystems Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit Zymmo research D4020 Used for isolation of plasmid DNA

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 181 ओ-ग्लाइकोसिलेशन ग्लाइकोसिलट्रांसफरेज़ हेटरोग्लाइकन इन-फ्रेम म्यूटेंट मेसोफिलिक एयरोमोनास फ्लैगेलिन फ्लैगेला शुद्धिकरण सीएससीएल ग्रेडिएंट
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