Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

A aplicação de abordagens baseadas em pesquisa aberta para a identificação de Glycopeptides ligados ao Acinetobacter baumannii O

Published: November 2, 2021 doi: 10.3791/63242
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

A busca aberta permite identificar glycopeptídeos decorados com composições glican até então desconhecidas. Dentro deste artigo, uma abordagem simplificada para realizar buscas abertas e subsequentes pesquisas de gliocopeptídio focadas em glycan são apresentadas para amostras bacterianas usando Acinetobacter baumannii como modelo.

Abstract

A glicossomilação proteica é cada vez mais reconhecida como uma modificação comum dentro de organismos bacterianos, contribuindo para a fisiologia procariótica e a ótima infectividade de espécies patogênicas. Devido a isso, há um crescente interesse em caracterizar a glicossylation bacteriana e a necessidade de ferramentas analíticas de alto rendimento para identificar esses eventos. Embora a proteômica de baixo para cima permita prontamente a geração de dados de glicopticídeos ricos, a amplitude e diversidade de glicanos observados em espécies procarióticas tornam a identificação de eventos de glicoslação bacteriana extremamente desafiadora.

Tradicionalmente, a determinação manual das composições glican dentro de conjuntos de dados proteômicos bacterianos fez desta uma análise em grande parte sob medida restrita a especialistas específicos de campo. Recentemente, abordagens abertas baseadas em busca surgiram como uma alternativa poderosa para a identificação de modificações desconhecidas. Ao analisar a frequência de modificações únicas observadas em sequências de peptídeos, técnicas de busca aberta permitem a identificação de glicanos comuns ligados a peptídeos dentro de amostras complexas. Este artigo apresenta um fluxo de trabalho simplificado para a interpretação e análise de dados glicoproteômicos, demonstrando como técnicas de busca aberta podem ser utilizadas para identificar glicocopeptídeos bacterianos sem conhecimento prévio das composições glicânicas.

Usando essa abordagem, os glicaptocidas dentro das amostras podem ser rapidamente identificados para entender as diferenças de glicoseção. Utilizando a Acinetobacter baumannii como modelo, essas abordagens permitem a comparação de composições glican entre cepas e a identificação de novas glicoproteínas. Em conjunto, este trabalho demonstra a versatilidade de técnicas abertas de busca de banco de dados para a identificação da glicossilção bacteriana, tornando a caracterização desses glicoproteomes altamente diversos mais fácil do que nunca.

Introduction

A glicossomilação proteica, o processo de anexação de carboidratos a moléculas de proteínas, é uma das modificações pós-translacionais mais comuns (PTMs) na natureza 1,2. Em todos os domínios da vida, uma gama de máquinas complexas evoluiu dedicada à geração de glicoproteínas que impactam uma miríade de funções celulares 1,3,4,5. Enquanto a glicossilation proteica ocorre em uma gama de aminoácidos 6,7, eventos de glicosylation ligados a N são duas formas dominantes observadas na natureza. A glicosylação ligada a N envolve a fixação de glicocanos a um átomo de nitrogênio de resíduos de asparagine (Asn), enquanto na glicosylação ligada a O, os glicanos são ligados a um átomo de oxigênio deresíduos de serina (Ser), threonine (Thr) ou tyrosine (Tyr). Apesar das semelhanças nos resíduos visados pelos sistemas de glicoseção, as diferenças dentro dos glicanos ligados às proteínas resultam na glicossylation sendo a classe mais quimicamente diversificada de PTMs encontrados na natureza.

Embora os sistemas de glicoseção eucariótica possuam diversidade glican, esses sistemas são tipicamente restritos no número de carboidratos únicos utilizados. A diversidade resultante decorre da forma como esses carboidratos são dispostos em glicanos 8,9,10,11,12. Em contraste, as espécies bacterianas e arqueais possuem uma diversidade glican praticamente ilimitada devido à pura variedade de açúcares únicos gerados nesses sistemas 2,10,13,14,15,16,17. Essas diferenças na diversidade glican observada entre os domínios da vida representam um desafio analítico significativo para a caracterização e identificação dos eventos de glicosylation. Para a glicosylation eucariótica, a capacidade de antecipar composições glican facilitou o crescente interesse pela glicobiologia; no entanto, o mesmo não se aplica à glicossylation bacteriana, que ainda é amplamente restrita ao estudo por laboratórios especializados. Como a acessibilidade da instrumentação da espectrometria de massa (MS) aumentou nas biociências, as abordagens baseadas em MS são agora o principal método para análise glicoproteômica.

A ESM emergiu como a ferramenta quintessencial para a caracterização da glicosylation, com abordagens de cima para baixo e de baixo para cima agora comumente usadas para caracterizar glicoproteínas6. Enquanto a proteômica de cima para baixo é usada para avaliar padrões globais de glicosylação de proteínas específicas18,19, abordagens de baixo para cima são usadas para permitir a caracterização glican-específica de glicaptocidas, mesmo a partir de misturas complexas 6,20,21,22,23. Para a análise dos glicacopeptídeos, a geração de informações informativas de fragmentação é essencial para a caracterização dos eventos de glicossylation24,25. Uma série de abordagens de fragmentação agora é rotineiramente acessível em instrumentos, incluindo dissociação induzida por colisão baseada em ressonância ion trap (TI-CID), dissociação induzida por colisão do tipo feixe (CID) e dissociação de transferência de elétrons (ETD). Cada abordagem possui diferentes pontos fortes e fracos para a análise de glicocopepcida25,26, com progresso significativo na última década na aplicação dessas abordagens de fragmentação para analisar a glicosylação 6,20. No entanto, para a análise da glicostilação bacteriana, a limitação crítica não tem sido a capacidade de fragmentar glycopeptídeos, mas sim a incapacidade de prever as potenciais composições glica dentro das amostras. Dentro desses sistemas, a natureza desconhecida de diversos glicanos bacterianos limita a identificação de glicocopeptídeos, mesmo com ferramentas de busca focadas em glicosylation agora comuns para a análise de glicoptodides eucarióticos, como O-Par27, GlycopeptideGraphMS28 e GlycReSoft29. Para superar essa questão, é necessário um método alternativo de busca, com o uso de ferramentas de busca aberta emergindo como uma abordagem poderosa para o estudo da glicosylation bacteriana30.

A busca aberta, também conhecida como busca de curinga, permite a identificação de peptídeos com PTMs desconhecidos ou inesperados 21,30,31,32. Pesquisas abertas utilizam uma variedade de técnicas computacionais, incluindo pesquisas de modificação com curadoria, pesquisas de banco de dados multicamados ou pesquisa tolerante em larga massa 33,34,35,36,37. Embora a busca aberta tenha grande potencial, seu uso tem sido tipicamente dificultado pelo aumento significativo dos tempos de análise e perda de sensibilidade da detecção de peptídeos não modificados em comparação com pesquisas restritas31,32. A diminuição na detecção de partidas espectrais de peptídeos não modificados (PSMs) é resultado do aumento das taxas de PSM falso-positivo associadas a essas técnicas, o que requer uma filtragem rigorosa aumentada para manter as taxas de falsas descobertas desejadas (FDRs)33,34,35,36,37 . Recentemente, várias ferramentas se tornaram disponíveis que melhoram significativamente a acessibilidade da pesquisa aberta, incluindo Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 e MSFragger21,41. Essas ferramentas permitem a identificação robusta de eventos de glicosylation, reduzindo significativamente os tempos de análise e implementando abordagens para lidar com composições glicas heterogêneas.

Este artigo apresenta um método simplificado para a identificação de glicoptocidas bacterianos por busca aberta, utilizando como modelo o patógeno nosocomial Gram-negativo, Acinetobacter baumannii. A. baumannii possui um sistema de glicoslação orientado ligado a O responsável pela modificação de múltiplos substratos proteicos, conhecido como sistema de glicoslação de proteínasPGLL 42,43,44. Embora proteínas semelhantes sejam destinadas à glicosylation entre cepas, o sistema de glicosylation pglL é altamente variável devido à biossíntese do glicano usado para glicossite de proteínas derivadas do locus cápsula (conhecido como K-locus)44,45,46. Isso resulta em diversos glicocanos (também conhecidos como unidade K), derivados de unidades K polimerizadas únicas ou limitadas, sendo adicionados a substratos proteicos 30,44,46. Dentro deste trabalho, o uso da ferramenta de pesquisa aberta, MSfragger, dentro do software FragPipe, é usado para identificar glycans em cepas A. baumannii. Combinando buscas abertas e curadoria manual, "pesquisas focadas em glycan" podem ser realizadas para melhorar ainda mais a identificação de glycopeptídeos bacterianos. Em conjunto, essa abordagem de identificação multistep permite a identificação de glycopeptídeos sem ampla experiência na caracterização de novos eventos de glicosylação.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTA: A preparação e análise de amostras de glicoptocida bacteriano podem ser divididas em quatro seções (Figura 1). Para este estudo, foi avaliada a glicosylation de três cepas sequenciadas de A. baumannii (Tabela 1). Os bancos de dados Proteome FASTA de cada uma dessas cepas são acessíveis via Uniprot. Consulte a Tabela 2 para a composição dos buffers utilizados neste protocolo.

1. Preparação de amostras de proteínas para análise proteômica

  1. Isolamento de amostras de proteome de interesse
    1. Se usar células inteiras, certifique-se de que as células foram lavadas com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover potenciais contaminantes proteicos presentes na mídia. Estomular células inteiras após a lavagem e armazená-las a -80 °C até que seja necessário.
    2. Se forem utilizadas amostras fracionadas (como preparações de membrana), certifique-se de que os reagentes utilizados não interferirão na análise50 da cromatografia líquida a jusante (LC-MS).
    3. Se detergentes, como o dodecyl-sulfato de sódio (SDS), Triton X-100, NP-40 ou lauroylsarcosine, forem usados, remova esses detergentes usando precipitação de acetona, métodos de preparação de amostras SP351 ou colunas de limpeza proteômicas comerciais, como s-traps52. Alternativamente, substitua detergentes incompatíveis por um detergente compatível com MS ou removível, como desoxicolato de sódio (SDC) ou glucopyranoside octil.
    4. Certifique-se de que todos os plásticos e vidros a serem usados para a preparação da amostra não foram autoclavados. Vidros e plásticos autoclavados são tipicamente fortemente contaminados com pequenos compostos de peso molecular, como polímeros, que são facilmente detectados dentro do MS.
  2. Solubilização de amostras de células inteiras
    1. Resuspend ~10 mg de células lavadas e congeladas em 200 μL de tampão de desoxicolato de sódio recém-preparado (tampão de lise SDC: 4% SDC em 100 mM Tris, pH 8.5).
      NOTA: Os inibidores de protease podem ser adicionados ao tampão de lise SDC para limitar a degradação da proteína.
    2. Ferva as amostras por 10 min a 95 °C com agitação (2000 rpm em um termomixer), e depois deixe no gelo por 10 minutos. Repita este processo duas vezes para garantir a lise eficiente e a solubilização das amostras.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a longo prazo neste ponto a -80 °C. Se armazenado, resolubilize por aquecimento a 95 °C antes de processamento posterior.
  3. Quantifique as concentrações de proteínas amostrais usando um ensaio proteico bicinchonínico (BCA)53. Armazene amostras no gelo enquanto realiza quantificação para limitar a degradação da proteína.
    NOTA: Para a análise proteome total, 20-100 μg de proteína é mais do que suficiente para nano LC-MS, que normalmente requer menos de 2 μg de digestão proteica por análise. A preparação do peptídeo em excesso permite a análise de replicação ou fracionamento posterior se for necessária uma cobertura proteômica profunda. Para análise baseada em enriquecimento de glicopticida utilizando cromatografia de interação hidrofílica (HILIC), é necessário 100-500 μg de proteína.
  4. Reduzir e aquilar amostras.
    1. Adicionar 1/10do volume de 10x de redução/tampão de alquilação (100 mM Tris 2-carboxyethyl phosphine cloridide; 400 mM 2-cloroacetamida em 1 M Tris, pH 8.5) para amostras para uma concentração final de 1x e incubar amostras no escuro por 30 min a 45 °C com agitação a 1.500 rpm.
      NOTA: Verifique o pH do buffer de redução/alquilação de 10x para garantir um pH de aproximadamente 7,0-8,0 antes de adicionar às amostras, pois um pH mais baixo fará com que o SDC precipitasse.
  5. Gire brevemente as amostras e adicione os proteases Trypsin/Lys-C (~10 μL, resuspended em 100 mM Tris, pH 8.5) para uma razão final protease:proteína de 1:100. Incubar os digestos durante a noite a 37 °C com agitação a 1.500 rpm (até 18 h). Para garantir a digestão completa da proteína, use uma razão de protease trypsin/lys-C: proporção de proteína de 1:50 a 1:200.
  6. A saciar digere adicionando 1,25 volumes de isopropanol 100% às amostras. Vórtice as amostras por 1 min para misturar e rapidamente rodá-las.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -20 °C para serem processadas posteriormente.
  7. Acidificar as amostras adicionando 0,115 volumes de ácido trifluoroacético de 10% (TFA; concentração final de ~1% TFA), vórtice das amostras e rapidamente spin-los para baixo.

2. Processamento de amostras de proteome

  1. Limpeza de peptídeos de amostras de proteome
    1. Prepare uma ponta de sulfonato de fase inversa (SDB-RPS) Para cada amostra, conforme descrito anteriormente54.
      1. Empiricamente, para ligar 50 μg de peptídeo, extirpa três discos SDB-RPS de uma membrana SDB-RPS de 47 mm2 usando uma agulha cega (14 G). Para maiores quantidades de peptídeos, aumente o número de discos em conformidade.
    2. Antes de usar as Dicas de Estágio SDB-RPS, prepare as dicas adicionando sequencialmente pelo menos dez volumes de cama dos seguintes buffers e girando o buffer através da coluna por centrifugação (25 °C, 3 min, 500 × g) ou empurrando o buffer através da coluna aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
      1. Molhe as pontas com 150 μL de 100% acetonitrila.
      2. Lave as pontas com 150 μL de 30% de metanol, 1% TFA em 18,2 MΩ H2O.
      3. Equilibre as pontas com 150 μL de isopropanol de 90%, 1% TFA equilibrada com 18,2 MΩ H2O.
    3. Carregue as amostras (contendo isopropanol de 50%, 1% TFA) nas Pontas de Estágio SDB-RPS por centrifugação (25 °C, 3 min, 500 × g) ou aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
    4. Lave as Dicas de Estágio SDB-RPS com os seguintes buffers por centrifugação (25 °C, 3 min, 500 × g) ou aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
      NOTA: Lavagens adicionais ou tampões alternativos podem ser usados para remover contaminantes não peptídeos, como o uso de acetato etílico em vez de isopropanol55.
      1. Lave as pontas com 150 μL de isopropanol de 90%, 1% TFA.
      2. Lave as pontas com 150 μL de 1% TFA em 18,2 MΩ H2O.
    5. Elute os peptídeos das Pontas de Estágio SDB-RPS com 150 μL de hidróxido de amônio de 5% em 80% de acetonitrila por centrifugação ou aplicando suavemente pressão usando uma seringa. Coletar as amostras em tubos individuais.
      NOTA: Prepare 5% hidróxido de amônio em 80% de acetonitrilo em um recipiente plástico imediatamente antes de usar dentro de um capô de fumaça.
    6. Seque os peptídeos elucidos por centrifugação de vácuo a 25 °C.
      NOTA: Se realizar o enriquecimento HILIC, 1-10% dos eluatos de peptídeos podem ser removidos neste momento, secos e usados como controles totais de entrada proteome.
  2. Enriquecimento de amostras de glicoptoptida
    1. Prepare dicas de estágio de cromografia líquida de interação hidrofínica zwitteriônica (ZIC-HILIC) como descrito anteriormente54,56.
      1. Resumidamente, extirpa um disco C8 de uma membrana de 47 mm2 C8 usando uma agulha cega (14 G) e embale o disco em uma ponta P200 para criar um frit. Adicione aproximadamente 5 mm de material ZIC-HILIC, resuspended em acetonitrilo de 50%, 50% 18,2 MΩ H2O, no frit aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
    2. Antes de usar as Pontas de Estágio ZIC-HILIC, condicionar a resina adicionando sequencialmente os seguintes buffers e aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
      NOTA: Para garantir a integridade da camada pseudo-água na superfície da resina ZIC-HILIC (necessária para enriquecer glycopeptídeos), a resina deve permanecer sempre molhada. Ao lavar a resina, deixe sempre ~10 μL de solvente acima da resina e certifique-se de que as lavagens/amostras sejam encanar diretamente neste solvente residual.
      1. Equilibre a resina com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de eluição ZIC-HILIC (0,1% TFA em 18,2 MΩ H2O).
      2. Lave a resina com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de preparação ZIC-HILIC (95% de acetonitrilo em 18,2 MΩ H2O).
      3. Lave a resina com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de carga/lavagem ZIC-HILIC (80% de acetonitrilo, 1% TFA equilibrado com 18,2 MΩ H2O).
    3. Resuspend as amostras digeridas secas (da etapa 2.1.6) em zic-HILIC carregando/lavando tampão para uma concentração final de 4 μg/μL (por exemplo, para 200 μg de peptídeo, resuspend em 50 μL de suporte/tampão de lavagem ZIC-HILIC). Vórtice brevemente por 1 min para garantir que as amostras sejam resuspended, e gire para baixo por 1 min a 2.000 × g a 25 °C.
    4. Carregue a amostra de peptídeo resuspended em uma coluna ZIC-HILIC condicionada.
      1. Lave três vezes com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de carga/lavagem ZIC-HILIC (para 60 lavagens de volume de cama total) aplicando suavemente a pressão usando uma seringa.
      2. Glicopeptídeos eluto com 20 volumes de cama (200 μL) de tampão de eluição ZIC-HILIC em um tubo de 1,5 mL aplicando suavemente a pressão usando uma seringa e, em seguida, seque o elunato por centrifugação de vácuo a 25 °C.

3. LC-MS de amostras enriquecidas com proteome/glicoptopídio

  1. Resuspenque as amostras em Buffer A* (2% acetonitrilo, 0,1% TFA) a uma concentração final de 1 μg/μL (por exemplo, para 50 μg de peptídeo, resuspend em 50 μL de Buffer A*).
  2. Carregue as amostras em um HPLC/UPLC acoplado a um MS para permitir a separação e identificação de glicoptocidas.
    NOTA: Os parâmetros da coluna, incluindo diâmetro interno, comprimento, taxas de fluxo, tipo de resina cromatografia e quantidades necessárias de injeção de peptídeo, devem ser otimizados para a configuração analítica e comprimento de gradiente a ser utilizado; para um exemplo de como empreender a otimização de configurações analíticas, consulte57.
  3. Monitore a coleta dos dados de MS resultantes garantindo que os dados sejam coletados com os parâmetros desejados.
    NOTA: Para análise composicional, a fragmentação do CID é suficiente. Devido à adição de glicídeos aos glicopeptídeos, íons de glicoptoptídeos são tipicamente observados com uma densidade de carga maior e menor do que os peptídeos não dilatados. Para garantir que esses íons sejam observáveis, permita uma faixa de massa MS1 de 400 a 2.000 m/z.
  4. Fragmentos selecionados ions utilizando CID, garantindo a coleta de íons de fragmentos de m/z baixos que contêm íons de oxonium importantes para a caracterização dos glicanos.
    NOTA: A fragmentação dos glicoptocidas utilizando CID é influenciada tanto pelas sequências de peptídeos e glicocanos, quanto pela energia aplicada durante a fragmentação 25,58,59. Embora uma gama de diferentes energias de colisão possa ser usada, uma estratégia ideal para fragmentar glycopeptídeos é o uso de energias de colisão escalonada combinando o uso de múltiplas energias de colisão 25,59,60.
  5. Use métodos alternativos de fragmentação, se disponíveis, como ETD para localização do local ou TI-CID para auxiliar na determinação de composições glicanas.
    NOTA: Nenhuma dessas abordagens de fragmentação são essenciais para a análise composicional, mas podem ser coletadas para permitir um interrogatório adicional de glycopeptídeos de interesse.

4. Análise de amostras enriquecidas com proteome/glicoptopídio

  1. Pré-filtramento de arquivos de dados para permitir a pesquisa no FragPipe
    1. Se as varreduras ETD ou IT-CID tiverem sido adquiridas nos conjuntos de dados, filtre esses eventos de varredura dos arquivos de dados usando o MSConvert61 antes de pesquisar com o FragPipe.
      NOTA: Para os parâmetros de pesquisa abertos descritos abaixo, são necessários apenas dados de CID do tipo feixe.
  2. Realizando buscas abertas no FragPipe
    1. Abra FragPipe e clique na guia Fluxo de trabalho . No menu de retirada do fluxo de trabalho, selecione a opção Abrir e clique em Adicionar arquivos para importar os arquivos de dados a serem pesquisados no FragPipe (Figura 2A).
    2. Clique na guia Banco de dados e inicie o gerenciador de downloads clicando em Download. Isso permite que os bancos de dados proteome sejam baixados da Uniprot usando um ID Uniprot Proteome. Clique na opção Adicionar isca e contaminantes dentro do gerenciador de downloads para incorporar proteínas chamariz e contaminantes em bancos de dados.
    3. Para obter limites FDR mais rigorosos, clique na guia Validação e modifique o valor do filtro e do relatório de 0,01 para o FDR necessário.
      NOTA: As configurações padrão do FragPipe garantirão um FDR de 1% no nível da proteína.
    4. Clique na guia MSfragger . Dentro da caixa de correspondência Peak , aumente a tolerância de massa precursora do padrão de 500 Da para 2.000 Da para permitir a identificação de grandes modificações (Figura 2A).
    5. Clique na guia Executar e defina a localização das saídas do FragPipe. Clique no botão Executar para iniciar a pesquisa.
  3. Utilizando os PSMs identificados entre conjuntos de dados (contidos nas saídas psm.tsv do FragPipe), identifique potenciais glicocanos plotando a frequência de massas delta observadas dentro dos conjuntos de dados (Figura 3). Crie plots de massa delta a partir de saídas MSfragger usando os scripts R acessíveis através da adesão do PRIDE PXD027820.
    NOTA: O pósprocessamento mínimo dos resultados de pesquisa aberta é realizado dentro desses scripts, pois o principal objetivo desses scripts é auxiliar na visualização de perfis de massa delta. É importante ressaltar que a observação de massas delta abundantes por si só não é a prova de que uma modificação é um potencial glicano, pois atribuir massas delta como glicanos requer uma análise mais aprofundada dos eventos MS2 correspondentes.
  4. Para permitir a caracterização de glycopeptides dentro das amostras, foque em identificações de massa delta de alta confiança, correspondendo a atribuições com hiperescores elevados.
    1. Para auxiliar na avaliação dos espectros de glicopticida, use ferramentas de anotação de peptídeos, como o Anotador Espectral De Peptídeo Interativo63, que permite a atribuição de íons associados ao peptídeo dentro de espectros, permitindo a identificação manual dos íons associados ao glicano (Figura 4).
      NOTA: Dentro dos conjuntos de dados aqui apresentados, hiperscores de >30 são considerados de alta pontuação, pois correspondem a pontuações entre os 50% mais altos de todos os glipcopeptídeos identificados (Figura 5).
  5. Com glycopeptides de alta confiança atribuídos, identifique íons glicanos comumente observados (Figura 4) para melhorar a identificação de glicoptocidas.
    NOTA: Ao incorporar íons associados ao glicano dentro das pesquisas, conhecidas como pesquisas focadas em glycan, a qualidade das atribuições de glicocopeptodo pode ser melhorada.
    1. Clique na guia MSfragger de FragPipe, incorpore as massas delta determinadas dos glicanos observados nas seções De modificações variáveis e deslocamentos em massa . Adicione essas massas digitando valores nas seções De modificações variáveis e deslocamentos em massa com massas individuais separadas com a /. Adicione as massas de fragmentos associadas ao glicano desses glicanos na seção de mods Glyco/Labile do MSFragger.
      NOTA: A Figura 2B descreve as principais informações necessárias para uma pesquisa focada em glycan da cepa A. baumannii AB307-0294.
  6. Carregue todos os dados de MS associados a estudos proteômicos para repositórios proteômicos centralizados, como os repositórios PRIDE ou MASSIVE.
    NOTA: Todos os dados associados a este estudo foram depositados no repositório proteômico do PRIDE e podem ser acessados através da adesão ao PRIDE: PXD027820.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para ilustrar a utilidade da busca aberta por análise de glicoptocida bacteriano, a diversidade química de glicocanos ligados a O dentro de três cepas de A. baumannii-AB307-0294, ACICU e D1279779-- foi avaliada. Os glicoproteomes ligados ao O são altamente variáveis entre as cepas de A. baumannii, pois os glicos usados para glicossolation são derivados da cápsula altamente variável loci 44,45,46. Essa diversidade química faz da A. baumannii um sistema modelo ideal para estudos de busca aberta. Embora os glicoproteomes das três cepas não tenham sido previamente avaliados, as estruturas cápsulas de duas dessas cepas, AB307-029464 eACICU 65, são conhecidas, com a cápsula de D1279779 ainda a ser elucidada.

Consistente com a cápsula de AB307-0294, a busca aberta de AB307-0294 revelou duas massas delta dominantes, correspondendo a 648,25 Da e 692,28 Da (Figura 3A). Essas massas correspondem às estruturas da cápsula previamente determinadas por Russo et al., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA, onde o resíduo quinac4NR corresponde a 2,4-diamino-2,4,6-trideoxy-glicose, modificado com 3-OH-butyrate ou um grupo de acetil64. Da mesma forma, a cápsula ACICU é conhecida por ser composta por uma unidade K tetrassacaride, anteriormente identificada como Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc-, correspondendo a uma massa prevista de 843,31 Da65. Esta estrutura da cápsula é consistente com a massa delta mais frequentemente observada dentro dos dados da ACICU (Figura 3B). Finalmente, a análise de busca aberta da cepa D1279779 revelou a presença de múltiplas massas delta consistentes com 203,08, 794,31 e 1588,62 Da (Figura 3C). Enquanto a massa 203.08 é consistente com a de um único resíduo HexNAc, 794,31 e 1588,62 correspondem a modificações desconhecidas. Deve-se notar que a massa 1588,62 é exatamente o dobro da de 794,31, sugerindo que esses peptídeos são decorados com dimers de unidade K glicano, como já foi observado anteriormente em outros Glicoproteomes Acinetobacter 30,44,46.

As parcelas de massa Delta fornecem uma maneira rápida e eficaz de avaliar a frequência de modificações observadas dentro das amostras. No entanto, para modificações complexas, como os glicanos, a presença de uma massa delta por si só não fornece as informações para definir a composição exata de um glicano. Para auxiliar na determinação de composições glicas, podem ser utilizados os dados de MS/MS resultantes de PSMs atribuídos a massas delta específicas. Ao focar em atribuições de gliopcida de alta confiança (em MSFragger correspondente a PSMs com hiperscores elevados), a análise manual pode ser usada para caracterizar ainda mais os glicanos utilizados por uma cepa para glicosylação proteica. Deve-se notar que as atribuições de peptídeos de alta confiança normalmente contêm informações genéricas robustas que permitem a determinação de composições glican baseadas em íons Y. Essas informações podem ser usadas para identificar os fragmentos correspondentes onde os glicanos permaneceram ligados aos peptídeos, bem como a íons relacionados a B e oxonium úteis para a atribuição dos glicanos66. Diretrizes detalhadas sobre como atribuir composições glicosas foram previamente delineadas, e recomenda-se que os leitores consultem Harvey et al.67. Usando ferramentas como o Annoteator Espectral De Peptídeo Interativo63, íons associados ao peptídeo podem ser facilmente identificados, permitindo que os usuários determinem a identidade dos glicanos ligados aos peptídeos.

Utilizando o Anotador Espectral de Peptídeo Interativo, foram avaliados glicopeptídeos identificados nessas três amostras de A. baumannii, revelando potenciais íons glicanos associados. Considere o espectro MS/MS do Glycopeptide AB307-0294 SAGDQAASDIATATDNASAK, decorado com os glicocanos 648,25 e 692,28 Da (Figura 4A,B); sob condições de fragmentação semelhantes, os íons relacionados com glicos são altamente semelhantes, mas mudam em massa em 44,02 Da. A análise dos íons gliccanos dentro desses PSMs permite a confirmação de que as massas delta observadas para esses glicocopeptídeos correspondem a trissacarídeos contendo quatro carboidratos diferentes: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) e HexNAc (203 Da). Deve-se notar que ao atribuir fragmentos de glicano, vários monossacarídeos são propensos a perder água quando fragmentados usando CID. Isso pode ser visto no glicano da ACICU, onde o monossacarídeo Pse5Ac7Ac (316 Da) leva à geração de dois fragmentos proeminentes relacionados ao glycano: MH+ 299,12 e 317,13, a diferença de massa correspondente à massa de água (18,01 Da) (Figura 4C).

Além disso, ao analisar os glicanos bacterianos, é comum observar massas inesperadas de monossacarídeos correspondentes a açúcares não observados dentro de eucariotes. Um exemplo disso pode ser visto dentro dos PSMs glicoptoptidas de D1279779, onde a análise da massa delta mais frequente 794.31 Da revela a presença de um incomum monossacarídeo dHexNAc (187 Da, observado como um MH+ de 188,09, Figura 4D), que foi previamente observado dentro de A. baumannii O-ligado glycans44. Embora as medições de alta precisão de massa e o comportamento característico dos glicanos como modificações labile, que são perdidas da espinha dorsal do peptídeo, possam auxiliar na determinação de potenciais composições químicas de glicanos, é aconselhável minimizar a superinterpretação dos dados de MS. Se a estereoquímica de açúcares específicos ou as informações de ligação de um glicano são desconhecidas, é melhor usar atribuições estruturalmente agonísticas, inclusive referindo-se a monossacarídeos por suas classes específicas. Um exemplo disso é referir-se a 203.08 Resíduos da da como N-acetylhexosamines (HexNAc) e evitando a atribuição de tipos de linkage. Se necessário, recomenda-se que técnicas adicionais sejam utilizadas para definir as identidades químicas exatas de uma modificação desconhecida, como o uso de Ressonância Magnética Nuclear (RMN).

Embora abordagens de busca aberta permitam a identificação rápida de peptídeos modificados, é importante notar que essa abordagem de pesquisa pode ignorar potenciais glipcopeptídeos dentro de conjuntos de dados. Em buscas abertas, os glycopeptides podem deixar de ser identificados por várias razões, incluindo informações insuficientes de fragmentação de peptídeos ou penalização do peptídeo atribuído devido à presença de múltiplos íons não atribuídos dentro do evento MS2. Este último é especialmente verdadeiro para PSMs de glicoptoptídeo bacteriano, pois esses espectros podem conter fragmentos associados ao glicano não considerados por parâmetros de busca aberto padrão. Como características incomparáveis impactam negativamente a pontuação de PSMs, minimizar íons incomparáveis dentro dos espectros de MS/MS permite a identificação de glipcopeptídeos que foram inicialmente excluídos devido aos limites de pontuação mínima controlados pelo FDR. Para superar essa limitação, as massas definidas a partir das pesquisas abertas (Figura 3) e dos íons glicanos definidos manualmente (Figura 4) podem ser incorporadas aos parâmetros de pesquisa para melhorar a identificação de glycopeptides. É importante notar que esses íons associados ao glicano podem ser identificados manualmente com base na determinação de novo do glicano, conhecimento prévio dos íons oxonium comuns44,68, ou o uso de ferramentas que podem capturar íons recorrentes dentro de espectros, como a ferramenta de detecção de íons de imônio spectral69,76.

Para demonstrar isso, as massas de fragmentos glicanos atípicos identificados através da análise de busca aberta foram incorporadas nos parâmetros de pesquisa no MSFragger, e a busca focada em glycan empreendida (as configurações focadas em glycan para a cepa AB307-0294 são mostradas na Figura 2B). Deve-se notar que quando vários glicanos estão sendo pesquisados juntos, devem ser tomados cuidados na seleção de íons Y e massas diagnósticas para garantir que reflitam com precisão os íons fragmentados associados a cada massa delta. Embora isso nem sempre seja possível para combinações de massas Y e diagnósticas que são mutuamente exclusivas, como os fragmentos dos 648,25 e 692,28 glycans de AB307-0294 (Figura 4A,B), a busca focada em glycan ainda é possível, embora isso possa impactar a robustez dos resultados de pesquisa. As pesquisas focadas em Glycan levaram a um aumento notável no número total de PSMs de glicoptoptídeos identificados nas três cepas A. baumannii, correspondendo a um aumento de 37% no ACICU, um aumento de 117% no AB307-0294 e um aumento de 363% na D1279779 (Figura 5A-C). Para eventos individuais de MS, a inclusão de informações específicas de glycan normalmente resulta em um aumento dentro do hiperscore observado, embora este aumento seja altamente dependente de glycano (Figura 5D,E). Assim, refinando os parâmetros de pesquisa utilizando as massas de glicocanos revelados através da busca aberta e, posteriormente, incorporando informações de fragmentos de glycan com curadoria manual em pesquisas direcionadas, uma análise mais detalhada dos glipcopeptídeos dentro das amostras pode ser obtida.

Figure 1
Figura 1: Visão geral das principais etapas na preparação e análise de glycopeptídeos bacterianos. A identificação bem sucedida de glycopeptídeos bacterianos depende da geração de amostras de alta qualidade contendo glycopeptides. As amostras contendo glicopeptídeos são então analisadas pelo LC-MS e, posteriormente, abordagens de busca abertas são usadas para identificar potenciais glipcopeptídeos com base em massas delta únicas. Usando a curadoria manual, essas massas delta podem ser identificadas como glicanos. Finalmente, para melhorar a identificação de glycopeptides, as informações glican podem ser incorporadas em pesquisas de banco de dados focadas em glycan. Abreviaturas: LC-MS = cromatografia líquida acoplado à espectrometria de massa; OD = densidade óptica; SDB-RPS = sulfonato de fase inversa de estireito; ZIC-HILIC = Cromatografia Líquida de Interação Hidrofílica Zwitterionic; PSMs = partidas espectrais de peptídeos; CID = dissociação induzida por colisão; ETD = dissociação da transferência de elétrons. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Visão geral de como ativar pesquisas abertas e focadas em glycan no FragPipe. (A) A pesquisa aberta pode ser ativada carregando o fluxo de trabalho aberto dentro da guia Workflow do FragPipe. Para permitir a identificação de glicanos maiores que 500 Da em tamanho, aumentar a janela de tolerância de massa precursora para 2.000 pesquisas focadas em Glycan para glicocanos atípicos exigem a entrada de informações glican na guia MSFragger para definir as massas esperadas das modificações (nas seções de modificações variáveis e deslocamentos em massa), os íons Y associados a esses glicanos (na lista de massas Y Ion da seção Glyco/Labile seção), e os íons de fragmento glicano de baixa massa (na lista de massas de fragmentos de diagnóstico da seção Glyco/Labile). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Parcelas em massa delta de resultados de busca aberta para as três cepas de Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU e D1279779). Consistente com a diversidade da cápsula loci, cada cepa A. baumannii possui um perfil de massa delta único com modificações proeminentes de maior que 140 Da em tamanho, denotadas pelas massas delta observadas. (A) Dentro do lote de massa delta AB307-0294, as massas 648.25 e 692.28 correspondem a modificações consistentes com -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-, onde o QuiNAc4NR é modificado com um grupo 3-OH-butyrate ou acetil64. (B) Dentro do lote de massa delta da ACICU, as massas 203.08 e 843.31 correspondem a modificações consistentes com HexNAc e Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc, respectivamente65. (C) Dentro do lote de massa delta D1279779, as massas 203.08, 794.31 e 1588.62 correspondem a HexNAc, HexNAc-217-187-187, e um dimer de HexNAc-217-187-187. As massas Delta avaliadas manualmente e confirmadas na Figura 4 são glíricas denotadas por *. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Caracterização ms/MS de massas delta observadas ao longo das três cepas de Acinetobacter baumannii. (A, B)  AB307-0294, (C) ACICU e (D) D1279779. Espectros anotados de glipos representativos assistidos pelo Peptídeos Espectrais Interativos. Para cada espectro, os íons de fragmento de peptídeo são denotados em azul e vermelho, enquanto os íons glicanos atribuídos manualmente são denotados em verde. Os glicanos foram anotados usando a Nomenclatura símbolo para glicocanos com HexNAc denotado como um quadrado, Hex como um círculo, e monossacarídeos atípicos denotados como trapezoides com a massa do glycan denotado nos trapézios. Abreviação: MS/MS = espectrometria de massa tandem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Comparação de glycopeptídeos identificados entre cepas de Acinetobacter baumannii usando busca aberta vs glycan.. (A-C) Comparação de hipercores e número de atribuições de PSM dentro de D1279779, ACICU e AB307-0294 usando busca aberta e focada em glycan. (D-F) Comparação de eventos ms2 individuais atribuídos à mesma sequência de peptídeos usando buscas abertas e focadas em glycan para D1279779, ACICU e AB307-0294. Abreviação: PSM = peptídeo-espectral match. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A. baumannii Cepas Uniprot Proteome IDs
AB307-0294 15 UP000006924
ACICU 47,48 UP000008839
D1279779 49 UP000011860

Mesa 1. Os IDs de Cepa e Uniprot Proteome utilizados neste estudo.

Nome tampão Composição tampão / pH
Buffer A* Acetonitrilo de 2% em 18,2 MΩ H2O, ácido trifluroacético de 0,1% / pH 1.0
PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, e 2 mM KH2PO4 / pH 7.4
Buffer de redução/alquilação 100 mM Tris 2-carboxyethyl phosphine cloridrato, 400 mM 2-Cloroacetamida em 1 M Tris / pH 7.5
Tampão de eluição da ponta de estágio SDB-RPS Hidróxido de amônio 5% em 80% acetonitrilo / pH 11
Tampão de equlibração da ponta de palco SDB-RPS 30% de metanol, 1% ácido trifluroacético, em 18,2 MΩ H2O / pH 1.0
SDB-RPS Stage Tip equlibration/wash buffer 90% isopropanol, 1% ácido trifluroacético / pH 1.0
Tampão de lavagem da ponta de estágio SDB-RPS 1% ácido trifluroacético em 18,2 MΩ H2O / pH 1.0
Tampão de lise SDC 4% SDC em 100 mM Tris / pH 8.5
Tampão de eluição ZIC-HILIC 0,1% ácido trifluroacético em 18,2 MΩ H2O /pH 1.0
Tampão de carregamento/lavagem ZIC-HILIC 80% de acetonitrilo, 1% ácido trifluroacético em 18,2 MΩ H2O / pH 1.0
Tampão de preparação ZIC-HILIC Acetonitrilo de 95% em 18,2 MΩ H2O / pH 7.0

Tabela 2: Composição de tampões utilizados neste estudo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

A busca aberta é um método eficaz e sistemático para a identificação de modificações desconhecidas. Embora a identificação de glícans desconhecidos em amostras de proteome bacteriano tenha sido tradicionalmente um empreendimento demorado e tecnicamente especializado, os recentes desenvolvimentos de ferramentas como MSfragger21,41 e Byonic31,38 agora permitem a identificação rápida e eficaz de massas delta para caracterização posterior como potenciais glicocanos ligados aos peptídeos. A busca aberta de amostras de proteome padronizadas e glicoptoptidas pode identificar potenciais glicocopeptídeos (Figura 1). A comunalidade e abundância de glycopeptides dentro do proteome de muitos sistemas bacterianos tornam possível a detecção direta dessas modificações sem o enriquecimento de glicopticides6. Embora as abordagens de enriquecimento de glicopticide normalmente ainda superem os métodos baseados em nonenrichment para muitos sistemas de glicosylation70, é notável que nem todos os glicanos são igualmente favoráveis ao enriquecimento 71,72. Este fato deve ser considerado ao determinar a abordagem mais adequada para identificar eventos de glicosylation utilizando a busca aberta por uma determinada amostra biológica.

Embora a busca aberta identifique efetivamente os glicanos observados em alta frequência dentro de uma amostra, ela permanece ineficaz na identificação de eventos de glicosylation que raramente ocorrem dentro de conjuntos de dados. Em termos práticos, para que uma massa delta única de um glicano seja identificada, pelo menos 10 PSMs com uma massa delta idêntica devem estar presentes dentro das amostras. Esta frequência mínima permite que um potencial glicano seja distinguível acima das atribuições de massa delta de fundo (Figura 3). Embora este critério seja tipicamente satisfeito por sistemas gerais de glicoslação visando múltiplos substratos para glicosylação, sistemas onde uma única proteína é alvo de glicosylation podem ser menos favoráveis a essa abordagem. À medida que a velocidade e a sensibilidade dos instrumentos de ESM melhoram, é provável que isso permita cada vez mais a avaliação de populações de glicoptocidas de menor abundância, o que, por sua vez, aumentará a eficácia das abordagens de busca aberta, desde que espectros de qualidade suficientes possam ser gerados para glicoformes raros/baixos abundantes.

Embora a MS possibilite a identificação efetiva de novos glicocanos, é importante notar que essa percepção por si só raramente fornece uma caracterização estrutural completa de glycopeptides/glycans, com ferramentas como espectroscopia NMR ainda sendo crítica para caracterização completa de glycan. Como observado aqui, a MS forneceu confirmação complementar de unidades K previamente determinadas utilizando RMN de cápsulas isoladas de A. baumannii ACICU e AB307-029464,65. No entanto, para o glycano principal identificado em D1279779, apenas informações sobre as classes putativas de monossacarídeos dentro deste glicano foram atribuídas com MS não fornecendo informações sobre os tipos de ligação ou a estereoquímica dessas unidades de açúcar (Figura 4). À medida que novos métodos de fragmentação de MS se tornam mais amplamente disponíveis, como a fotodissociação ultravioleta73,74, uma caracterização estrutural mais detalhada dos glicoptocidas pode ser possível. No entanto, deve-se tomar cuidado ao inferir ligações ou informações estereoquímicas com instrumentação atual. Além dessas considerações, foram levantadas questões recentemente sobre a adequação dos controles baseados em FDR para a busca aberta75. Assim, embora a busca aberta seja uma abordagem poderosa, essas considerações destacam a necessidade de cuidado na interpretação das atribuições glican baseadas apenas na busca aberta de informações.

Embora este trabalho demonstre que a busca aberta é uma abordagem eficaz para a identificação não supervisionada de glicocanos usados para glicoslação bacteriana, a busca aberta por si só fornece acesso a apenas um subconjunto de todos os glicaptocidas contidos nas amostras. Devido à natureza labile dos glicocanos, os PSMs de glicopticide normalmente contêm uma variedade diversificada de fragmentos associados ao glicano que, se não forem contabilizados, afetarão negativamente a pontuação dos PSMs. Para superar essa questão e permitir uma identificação mais aprofundada dos glycopeptides, as informações glican obtidas através da busca aberta podem ser posteriormente usadas para informar pesquisas focadas em glycan (Figura 2B). Desta forma, a busca aberta, juntamente com a determinação manual de fragmentos associados ao glicano, pode ser usada para melhorar a qualidade e a quantidade de glycopeptides atribuídos dentro das amostras (Figura 5). Embora o refinamento dos parâmetros de pesquisa de glicocopeptos seja realizado manualmente com versões atuais de ferramentas, como o MSfragger, é provável que, à medida que o campo amadurece, essas etapas sejam feitas de forma automatizada. Estudos já demonstraram abordagens computacionais para identificar íons de baixo peso molecular associados a PTMsespecíficos 69, bem como estratégias para identificar oxonium-íons e repetição de massas de íons Y associadas a gliopides desconhecidas76. Assim, é provável que essas etapas sejam incorporadas em novas iterações de ferramentas como o FragPipe, tornando ainda mais fácil identificar eventos de glicosilação até então desconhecidos dentro de amostras bacterianas e eucarióticas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

A N.E.S é apoiada por uma Bolsa futura do Conselho de Pesquisa Australiano (FT200100270) e uma subvenção do Projeto ARC Discovery (DP210100362). Agradecemos ao Centro de Espectrometria de Massa de Melbourne e Proteômica do Instituto bio21 de ciência molecular e biotecnologia pelo acesso à instrumentação de MS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 G Kel-F Hub point style 3 Hamilton company hanc90514
2-Chloroacetamide Sigma Aldrich Pty Ltd C0267-100G
Acetonitrile Sigma Aldrich Pty Ltd 34851-4L
Ammonium hydroxide (28%) Sigma Aldrich Pty Ltd 338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A Pierce 23228
BCA Protein Assay Reagent B Pierce 23224
C8 Empore SPE Sigma Aldrich Pty Ltd 66882-U An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 5.33002
Isopropanol Sigma Aldrich Pty Ltd 650447-2.5L
Methanol Fisher Chemical M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) Sigma Aldrich Pty Ltd 66886-U An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate Sigma Aldrich Pty Ltd D6750-100G
ThermoMixer C Eppendorf 2232000083
trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride Sigma Aldrich Pty Ltd C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich Pty Ltd 252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture Promega V5073
Vacuum concentrator Labconco 7810040
ZIC-HILIC material Merck 1504580001 Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
  4. Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
  5. Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
  7. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
  8. Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
  9. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
  10. Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
  11. Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
  12. McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
  13. Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
  14. Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
  15. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
  16. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Reviews Microbiology. 3 (3), 225-237 (2005).
  17. Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
  18. Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
  19. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
  20. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: growing up fast. Current Opinion in Structural Biology. 68, 18-25 (2020).
  21. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  22. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
  23. Yu, A., et al. Advances in mass spectrometry-based glycoproteomics. Electrophoresis. 39 (24), 3104-3122 (2018).
  24. Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
  25. Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
  26. Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
  27. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  28. Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
  29. Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
  30. Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
  31. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
  32. Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
  33. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
  34. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  35. Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
  36. Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
  37. Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
  38. Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
  39. Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
  40. Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
  41. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  42. Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
  43. Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
  44. Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
  45. Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
  46. Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
  47. Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
  48. Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
  49. Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
  50. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  51. Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
  52. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  53. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  54. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  55. Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
  56. Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
  57. Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
  58. Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
  59. Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  60. Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
  61. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  62. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
  63. Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
  64. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
  65. Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
  66. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
  67. Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
  68. Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
  69. Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
  70. Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
  71. Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
  72. Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
  73. Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
  74. Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
  75. Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
  76. Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).

Tags

Bioquímica Edição 177 Glycosylation,Acinetobacter baumannii Busca aberta Modificações pós-translationais Proteômica
A aplicação de abordagens baseadas em pesquisa aberta para a identificação de Glycopeptides ligados ao <em>Acinetobacter baumannii</em> O
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L.,… More

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L., McDaniels, T. A., Scott, N. E. The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides. J. Vis. Exp. (177), e63242, doi:10.3791/63242 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter