Summary
오픈 서닝은 이전에 알려지지 않은 글리칸 조성물로 장식된 글리코펩티드의 동정을 가능하게 한다. 이 기사에서는 Acinetobacter baumannii 를 모델로 사용하여 박테리아 샘플에 대해 공개 검색 및 후속 글리칸 중심의 글리코 펩티드 검색을 수행하기위한 간소화 된 접근 방식을 제시합니다.
Abstract
단백질 글리코실화는 박테리아 유기체 내에서 일반적인 변형으로 점점 더 인식되어 원핵 생리학 및 병원성 종의 최적 감염성에 기여합니다. 이로 인해 박테리아 글리코실화를 특성화하는 데 대한 관심이 증가하고 있으며 이러한 사건을 식별하기위한 고처리량 분석 도구에 대한 필요성이 커지고 있습니다. 상향식 프로테오믹스는 풍부한 글리코펩티드 데이터의 생성을 쉽게 가능하게 하지만, 원핵 종에서 관찰되는 글리칸의 폭과 다양성은 박테리아 글리코실화 사건의 식별을 매우 어렵게 만든다.
전통적으로, 박테리아 프로테오믹 데이터 세트 내에서 글리칸 조성물의 수동 결정은 이것을 현장 특정 전문가로 제한된 맞춤형 분석으로 만들었습니다. 최근에, 개방형 검색 기반 접근법은 알려지지 않은 수정의 식별을 위한 강력한 대안으로 등장하고 있다. 펩티드 서열에서 관찰되는 독특한 변형의 빈도를 분석함으로써, 개방 검색 기술은 복잡한 샘플 내의 펩티드에 부착된 일반적인 글리칸의 동정을 허용한다. 이 기사에서는 글리코프로테오믹 데이터의 해석 및 분석을 위한 간소화된 워크플로우를 제시하며, 글리칸 조성물에 대한 사전 지식 없이 박테리아 글리코펩타이드를 식별하기 위해 공개 검색 기술을 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.
이 접근법을 사용하여, 샘플 내의 글리코펩티드는 글리코실화 차이를 이해하기 위해 신속하게 확인될 수 있다. 아시네토박터 바우마니 를 모델로 사용하여, 이러한 접근법은 균주 간의 글리칸 조성물의 비교와 신규한 당단백질의 동정을 가능하게 한다. 종합하면,이 연구는 박테리아 글리코실화의 확인을위한 개방형 데이터베이스 검색 기술의 다양성을 보여 주므로 이러한 매우 다양한 글리코 프로테옴의 특성화가 그 어느 때보 다 쉬워졌습니다.
Introduction
단백질 분자에 탄수화물을 부착하는 과정인 단백질 글리코실화는 자연 1,2에서 가장 흔한 번역 후 변형(PTM) 중 하나입니다. 삶의 모든 영역에서 다양한 복잡한 기계가 무수한 세포 기능에 영향을 미치는 당단백질의 생성에 전념하여 진화했습니다 1,3,4,5. 단백질 글리코실화는 아미노산6,7의 범위에서 발생하는 반면, N-결합 및 O-연결된 글리코실화 이벤트는 자연에서 관찰되는 두 가지 우세한 형태이다. N-연결된 글리코실화는 아스파라긴(Asn) 잔기의 질소 원자에 글리칸의 부착을 수반하는 반면, O-연결된 글리코실화에서, 글리칸은 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 또는 티로신(Tyr) 잔기7의 산소 원자에 부착된다. 글리코실화 시스템에 의해 표적화된 잔기의 유사성에도 불구하고, 단백질에 부착된 글리칸 내의 차이는 글리코실화가 자연에서 발견되는 PTM의 가장 화학적으로 다양한 부류임을 초래한다.
진핵 글리코실화 시스템은 글리칸 다양성을 보유하지만, 이들 시스템은 전형적으로 이용되는 독특한 탄수화물의 수에서 제한된다. 그 결과 다양성은 이러한 탄수화물이 글리 칸 8,9,10,11,12로 배열되는 방식에서 비롯됩니다. 대조적으로, 박테리아 및 고세균 종은 이러한 시스템내에서 생성 된 독특한 설탕의 깎아 지른 배열로 인해 사실상 무제한의 글리 칸 다양성을 가지고 있습니다 2,10,13,14,15,16,17. 생명의 영역에 걸쳐 관찰된 글리칸 다양성의 이러한 차이는 글리코실화 사건의 특성화 및 확인에 대한 중요한 분석적 도전을 나타낸다. 진핵 글리코실화의 경우, 글리칸 조성물을 예측하는 능력은 글리코생물학에 대한 관심의 증가를 촉진시켰다; 그러나 박테리아 글리코실화에 대해서도 마찬가지이며, 이는 여전히 전문 실험실의 연구로 크게 제한됩니다. 생명 과학에서 질량 분광법 (MS) 계측의 접근성이 증가함에 따라 MS 기반 접근법은 이제 글리코 프로테오믹 분석의 주요 방법입니다.
MS는 글리코실화의 특성화를 위한 전형적인 도구로서 등장하였으며, 현재 당단백질6을 특성화하기 위해 하향식 및 상향식 접근법 둘 다 일반적으로 사용되고 있다. 하향식 프로테오믹스는 특정 단백질18,19의 글로벌 글리코실화 패턴을 평가하기 위해 사용되는 반면, 상향식 접근법은 복합 혼합물6,20,21,22,23에서도 글리칸 특이적 글리코펩티드의 특성화를 가능하게 하기 위해 사용된다. 글리코펩티드의 분석을 위해, 유익한 단편화 정보의 생성은 글리코실화 사건24,25의 특성화에 필수적이다. 공진 이온 트랩 기반 충돌 유도 해리(IT-CID), 빔형 충돌 유도 해리(CID) 및 전자 전달 해리(ETD)를 포함한 다양한 단편화 접근법이 기기에서 일상적으로 접근 가능합니다. 각 접근법은 글리코펩티드 분석 25,26에 대해 서로 다른 강점과 약점을 가지고 있으며, 글리코실화 6,20을 분석하기 위해 이러한 단편화 접근법을 적용하는 데 지난 십 년 동안 상당한 진전이 있었다. 그러나, 박테리아 글리코실화 분석의 경우, 중요한 한계는 글리코펩티드를 단편화하는 능력이 아니라 샘플 내에서 잠재적인 글리칸 조성물을 예측할 수 없다는 것이었다. 이러한 시스템 내에서, 다양한 박테리아 글리칸의 알려지지 않은 성질은 글리코펩티드의 식별을 제한하며, 심지어 글리코실화에 초점을 맞춘 검색 도구는 현재 O-Pair27, GlycopeptideGraphMS 28 및 GlycReSoft29와 같은 진핵 글리코펩티드의 분석을 위해 흔히 사용되고 있다. 이 문제를 극복하기 위해, 박테리아 글리코실화30의 연구를 위한 강력한 접근법으로 떠오르는 오픈 서닝 도구의 사용과 함께 대안적인 검색 방법이 요구된다.
블라인드 또는 와일드카드 검색이라고도 하는 개방형 검색은 알 수 없거나 예기치 않은 PTM 21,30,31,32를 가진 펩티드를 식별할 수 있게 합니다. 개방형 검색은 큐레이팅된 수정 검색, 다단계 데이터베이스 검색 또는 광질량 내성 검색(33,34,35,36,37)을 포함하는 다양한 계산 기술을 활용합니다. 오픈 서빙은 큰 잠재력을 가지고 있지만, 그의 사용은 전형적으로 제한된 검색(31,32)에 비해 변형되지 않은 펩티드의 검출에 대한 분석 시간의 현저한 증가 및 민감도의 손실에 의해 방해를 받았다. 변형되지 않은 펩티드-스펙트럼 매칭(PSMs)의 검출의 감소는 이들 기술과 관련된 위양성 PSM 비율의 증가의 결과이며, 이는 원하는 거짓 발견률(FDR)을 유지하기 위해 증가된 엄격한 필터링을 필요로 한다(FDR)33,34,35,36,37 . 최근에는 Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo 40 및 MSFragger 21,41을 포함하여 공개 검색의 접근성을 크게 향상시키는 몇 가지 도구가 제공되었습니다. 이러한 도구는 분석 시간을 현저하게 줄이고 이종 글리칸 조성물을 처리하기 위한 접근법을 구현함으로써 글리코실화 이벤트의 강력한 식별을 가능하게 한다.
이 글은 그람 음성 병원체인 아시네토박터 바우마니이를 모델로 사용하여 열린 탐색에 의한 박테리아 글리코펩티드의 동정을 위한 간소화된 방법을 제시한다. A. baumannii는 PglL 단백질 글리코실화 시스템42,43,44로 알려진 다중 단백질 기질의 변형을 담당하는 보존된 O-연결된 글리코실화 시스템을 보유한다. 유사한 단백질이 균주 간의 글리코실화를 표적으로 하는 반면, PglL 글리코실화 시스템은 캡슐 유전자좌(K-locus로 알려짐)로부터 유래되는 단백질 글리코실화에 사용되는 글리칸의 생합성으로 인해 매우 가변적이다(K-locus로 알려짐)44,45,46. 이로 인해 단일 또는 제한된 중합된 K-단위로부터 유래된 다양한 글리칸(K-단위라고도 함)이 단백질 기질(30,44,46)에 첨가된다. 이 작업에서 소프트웨어 FragPipe에서 열린 검색 도구 인 MSfragger를 사용하여 A. baumannii 균주에서 글리 칸을 식별하는 데 사용됩니다. 오픈 서치와 수동 큐레이션을 결합함으로써, 박테리아 글리코펩티드의 동정을 더욱 개선하기 위해 "글리칸 중심 검색"을 수행할 수 있다. 함께, 이러한 다단계 동정 접근법은 신규한 글리코실화 사건의 특성화에 대한 광범위한 경험 없이 글리코펩티드의 동정을 가능하게 한다.
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Protocol
참고: 박테리아 글리코펩타이드 샘플의 준비 및 분석은 네 개의 섹션으로 나눌 수 있습니다(그림 1). 본 연구를 위해, 세 개의 서열화된 A. baumannii 균주의 글리코실화를 평가하였다(표 1). 이들 균주 각각의 프로테옴 FASTA 데이터베이스는 Uniprot를 통해 액세스할 수 있다. 이 프로토콜에 사용되는 완충제의 조성에 대해서는 표 2 를 참조한다.
1. 프로테오믹 분석을 위한 단백질 시료의 제조
- 관심있는 프로테옴 샘플의 분리
- 전체 세포를 사용하는 경우, 세포가 배지에 존재하는 잠재적인 단백질 오염물을 제거하기 위해 인산완충식염수(PBS)로 세척되었는지 확인하십시오. 세척 후 전체 세포를 스냅-동결시키고 필요할 때까지 -80°C에서 보관한다.
- 분획된 샘플(예: 막 제제)이 사용되는 경우, 사용된 시약이 하류 액체 크로마토그래피 MS(LC-MS) 분석(50)을 방해하지 않도록 보장한다.
- 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 트리톤 X-100, NP-40 또는 라우로일사르코신과 같은 세제가 사용되었다면, 아세톤 침전, SP3 샘플 제조 방법51 또는 S-트랩52와 같은 상업적 프로테오믹 클린업 컬럼을 사용하여 이들 세제를 제거한다. 대안으로, 호환되지 않는 세제를 MS 호환 또는 탈착식 세제(예: 소듐 데옥시콜레이트(SDC) 또는 옥틸 글루코피라노사이드)로 대체하십시오.
- 샘플 준비에 사용되는 모든 플라스틱 제품 및 유리 제품이 오토클레이브되지 않았는지 확인하십시오. 오토클레이브 유리 제품 및 플라스틱은 일반적으로 MS 내에서 쉽게 검출되는 폴리머와 같은 작은 분자량 화합물로 심하게 오염됩니다.
- 전체 세포 샘플의 가용화
- 세척, 스냅-냉동 세포의 ∼10 mg을 갓 제조된 소듐 데옥시콜레이트 용해 완충액 200 μL에 재현탁시킨다(SDC 용해 완충액: 100 mM 트리스, pH 8.5 중의 4% SDC).
참고: 프로테아제 억제제는 단백질 분해를 제한하기 위해 SDC 용해 완충액에 첨가될 수 있다. - 샘플을 95°C에서 10분 동안 진탕(열믹서 상에서 2000 rpm)으로 끓인 다음, 10분 동안 얼음 위에 두어라. 샘플의 효율적인 용해 및 가용화를 보장하기 위해이 과정을 두 번 반복하십시오.
참고: 샘플은 -80°C에서 이 시점에서 장기간 보관할 수 있습니다. 보관하는 경우, 추가 처리 전에 95°C에서 가열하여 재가용화한다.
- 세척, 스냅-냉동 세포의 ∼10 mg을 갓 제조된 소듐 데옥시콜레이트 용해 완충액 200 μL에 재현탁시킨다(SDC 용해 완충액: 100 mM 트리스, pH 8.5 중의 4% SDC).
- 비신코닌산(BCA) 단백질 분석법53을 사용하여 샘플 단백질 농도를 정량한다. 단백질 분해를 제한하기 위해 정량화를 수행하는 동안 샘플을 얼음에 보관하십시오.
참고: 총 프로테옴 분석의 경우, 20-100 μg의 단백질이 나노LC-MS에 충분하며, 이는 일반적으로 분석 당 2 μg 미만의 단백질 소화를 필요로 한다. 과량의 펩티드의 제조는 깊은 프로테오믹 커버리지가 필요한 경우 복제 분석 또는 추가 분획화를 허용한다. 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)를 이용한 글리코펩티드 농축 기반 분석을 위해서는 100-500 μg의 단백질이 필요하다. - 샘플을 감소시키고 알킬화하십시오.
- 1x의 최종 농도에 대한 샘플에 10x 환원/알킬화 완충액 (100 mM 트리스 2-카르복시에틸포스핀 하이드로클로라이드; 1 M 트리스, pH 8.5 중 400 mM 2-클로로아세트아미드)의 부피의 1/10을 첨가하고, 샘플을 1,500 rpm에서 진탕하면서 45°C에서 30분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
참고: 10x 환원/알킬화 완충액의 pH를 확인하여 pH가 낮을수록 SDC가 침전되기 때문에 샘플에 추가하기 전에 약 7.0-8.0의 pH를 확인하십시오.
- 1x의 최종 농도에 대한 샘플에 10x 환원/알킬화 완충액 (100 mM 트리스 2-카르복시에틸포스핀 하이드로클로라이드; 1 M 트리스, pH 8.5 중 400 mM 2-클로로아세트아미드)의 부피의 1/10을 첨가하고, 샘플을 1,500 rpm에서 진탕하면서 45°C에서 30분 동안 어둠 속에서 인큐베이션한다.
- 샘플을 간단히 스핀 다운하고 프로테아제 트립신 / Lys-C (~ 10 μL, 100 mM 트리스, pH 8.5에 재현탁)를 첨가하여 최종 프로테아제 : 단백질 비율 1:100. 소화물을 1,500 rpm (최대 18 h)에서 진탕하면서 37°C에서 밤새 인큐베이션한다. 완전한 단백질 소화를 보장하려면 트립신/Lys-C 프로테아제:단백질 비율 1:50~1:200을 사용하십시오.
- 담금질은 1.25 부피의 100% 이소프로판올을 샘플에 첨가하여 소화한다. 샘플을 1 분 동안 소용돌이 치며 혼합하고 간단히 회전시킵니다.
참고: 샘플은 -20°C에서 저장하여 나중에 추가로 처리할 수 있습니다. - 0.115 부피의 10% 트리플루오로아세트산 (TFA; ~1% TFA의 최종 농도)을 첨가하여 샘플을 산성화시키고, 샘플을 와류하고, 간단히 스핀다운시킨다.
2. 프로테옴 샘플의 처리
- 프로테옴 샘플의 펩티드 정리
- 앞서 기술한 바와 같이 각 샘플에 대해 하나의 스티렌디비닐벤젠-역상 설포네이트(SDB-RPS) 스톱-앤고-추출(Stage) 팁을 준비한다(54).
- 경험적으로, 50 μg의 펩티드 결합을 위해, 무딘 바늘 (14 G)을 사용하여 47mm2 SDB-RPS 막으로부터 3개의 SDB-RPS 디스크를 절제한다. 펩티드 양이 더 많으면 그에 따라 디스크 수를 늘리십시오.
- SDB-RPS 스테이지 팁을 사용하기 전에, 다음 버퍼의 적어도 열 베드 부피를 순차적으로 첨가하고, 원심분리(25°C, 3분, 500 × g)에 의해 컬럼을 통해 버퍼를 방사하거나, 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 컬럼을 통해 버퍼를 밀어서 팁을 준비한다.
- 팁을 100% 아세토니트릴의 150μL로 적시십시오.
- 팁을 150 μL의 30% 메탄올, 18.2 MΩH2O 중의 1% TFA로 세척한다.
- 팁을 150μL의 90% 이소프로판올, 18.2MΩH2O로 평형을 이루는 1% TFA로 평형을 이룹니다.
- 샘플(50% 이소프로판올, 1% TFA 함유)을 원심분리(25°C, 3분, 500 × g)로 SDB-RPS 스테이지 팁 상에 로딩하거나 주사기를 사용하여 압력을 부드럽게 가하여 로딩한다.
- SDB-RPS 스테이지 팁을 원심분리(25°C, 3분, 500 × g)로 세척하거나 주사기를 사용하여 압력을 부드럽게 가하여 다음 버퍼로 세척합니다.
참고: 추가 세척 또는 대체 완충액을 사용하여 이소프로판올55 대신 에틸 아세테이트를 사용하는 것과 같은 비펩타이드성 오염물질을 제거할 수 있습니다.- 팁을 150 μL의 90% 이소프로판올, 1% TFA로 세척한다.
- 팁을 18.2MΩH2O중의 1% TFA의 150 μL로 세척한다.
- SDB-RPS 스테이지 팁으로부터 펩티드를 원심분리에 의해 80% 아세토니트릴 중의 5% 수산화암모늄 150 μL로 희석하거나 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가함으로써 분리한다. 개별 튜브에서 샘플을 수집합니다.
참고: 흄 후드 내에서 사용하기 직전에 플라스틱 용기에 80% 아세토니트릴로 5% 수산화암모늄을 준비하십시오. - 용출된 펩티드를 25°C에서 진공 원심분리하여 건조시킨다.
참고: HILIC 농축을 수행하는 경우, 이 시점에서 펩티드 용출액의 1-10%를 제거하고, 건조시키고, 총 프로테옴 입력 대조군으로 사용할 수 있다.
- 앞서 기술한 바와 같이 각 샘플에 대해 하나의 스티렌디비닐벤젠-역상 설포네이트(SDB-RPS) 스톱-앤고-추출(Stage) 팁을 준비한다(54).
- 글리코펩티드 샘플의 농축
- 앞서 기술한 바와 같이 Zwitterionic 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(ZIC-HILIC) 스테이지 팁(54,56)을 준비한다.
- 간단히 말해서, 무딘 바늘 (14G)을 사용하여 47 mm2C8 멤브레인에서 하나의C8 디스크를 절제하고 디스크를P200 팁에 포장하여 프릿을 만듭니다. 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 프릿에 50% 아세토니트릴, 50% 18.2MΩH2O에 재현탁한 약 5mm의 ZIC-HILIC 재료를 프릿에추가합니다.
- ZIC-HILIC 스테이지 팁을 사용하기 전에, 다음 버퍼를 순차적으로 첨가하고 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 수지를 조절하십시오.
참고: ZIC-HILIC 수지 표면의 의사 물층의 무결성을 보장하려면(글리코펩티드를 풍부하게 하기 위해 필요함), 수지는 항상 젖은 상태로 유지되어야 합니다. 수지를 세척 할 때 항상 ~ 10μL의 용매를 수지 위에 놓고 세척 / 샘플이이 잔류 용매에 직접 피펫팅되도록하십시오.- 수지를 ZIC-HILIC 용출 완충액(18.2MΩH2O 중 0.1% TFA)의 20베드 부피(200μL)로 평형화시킨다.
- 수지를 ZIC-HILIC 준비 완충액 (18.2 MΩH2O 중 95% 아세토니트릴)의 20 베드 부피 (200μL)로 세척한다.
- 수지를 20베드 부피(200μL)의 ZIC-HILIC 로딩/세척 버퍼(80% 아세토니트릴, 18.2MΩH2O와 균형을 이룬 1% TFA)로 세척합니다.
- 건조된 소화된 샘플(단계 2.1.6부터)을 ZIC-HILIC 로딩/세척 완충액에 재현탁하여 최종 농도 4μg/μL로 재현탁시킨다(예를 들어, 펩티드 200μg의 경우, ZIC-HILIC 로딩/세척 버퍼 50μL에 재현탁). 샘플이 재현탁되도록 1분 동안 간단히 소용돌이치고, 25°C에서 2,000 × g에서 1 분 동안 스핀다운한다.
- 재현탁된 펩티드 샘플을 컨디셔닝된 ZIC-HILIC 컬럼 상에 로딩한다.
- 주사기를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 ZIC-HILIC 로딩/세척 버퍼(총 60베드 부피 세척용)의 20베드 부피(200μL)로 세 번 세척합니다.
- 20층 부피(200 μL)의 ZIC-HILIC 용출 완충액으로 당펩티드를 1.5 mL 튜브에 넣고 주사기를 이용하여 압력을 부드럽게 가한 다음 25°C에서 진공 원심분리하여 용출액을 건조시켰다.
- 앞서 기술한 바와 같이 Zwitterionic 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(ZIC-HILIC) 스테이지 팁(54,56)을 준비한다.
3. 프로테옴/글리코펩티드-풍부 샘플의 LC-MS
- 샘플을 버퍼 A*(2% 아세토니트릴, 0.1% TFA)에 재현탁하여 최종 농도 1μg/μL로 재현탁합니다(예: 펩티드 50μg의 경우 50μL의 버퍼 A*에 재현탁).
- 샘플을 MS에 결합된 HPLC/UPLC에 로드하여 글리코펩티드의 분리 및 식별을 가능하게 한다.
참고: 내부 직경, 길이, 유속, 크로마토그래피 수지의 유형 및 필요한 펩티드 주입량을 포함한 컬럼 파라미터는 사용할 분석 설정 및 구배 길이에 맞게 최적화되어야 합니다. 분석 설정의 최적화를 수행하는 방법에 대한 예는57을 참조하십시오. - 결과 MS 데이터의 수집을 모니터링하여 데이터가 원하는 파라미터로 수집되고 있는지 확인합니다.
참고: 구성 분석의 경우 CID 단편화로 충분합니다. 글리코펩티드에 글리칸을 첨가하기 때문에, 글리코펩티드 이온은 전형적으로 비글리코실화된 펩티드보다 더 높은 m/z 및 더 낮은 전하 밀도로 관찰된다. 이러한 이온을 관찰 할 수 있도록하려면 MS1 질량 범위를 400 ~ 2,000 m / z로 허용하십시오. - CID를 사용하여 선택된 이온을 단편화하여 글리칸의 특성화에 중요한 옥소늄 이온을 포함하는 낮은 m/z 단편 이온의 수집을 보장합니다.
참고: CID를 사용한 글리코펩티드의 단편화는 펩티드 및 글리칸 서열 둘 다뿐만 아니라 단편화 동안 적용된 에너지 25,58,59에 의해 영향을 받는다. 다양한 충돌 에너지가 사용될 수 있지만, 글리코펩티드를 단편화하기 위한 최적의 전략은 다중 충돌 에너지(25,59,60)의 사용을 결합한 계단식 충돌 에너지의 사용이다. - 글리칸 조성물의 결정을 돕기 위해 부위 국소화를 위한 ETD 또는 IT-CID와 같은 대안적인 단편화 방법을 이용한다.
참고: 이러한 단편화 접근법 중 어느 것도 조성 분석에 필수적이지는 않지만, 관심있는 글리코펩티드의 추가 심문을 가능하게 하기 위해 수집될 수 있다.
4. 프로테옴/글리코펩타이드 농축 시료 분석
- FragPipe에서 검색을 사용하도록 데이터 파일을 사전 필터링합니다.
- ETD 또는 IT-CID 스캔이 데이터 세트 내에서 획득된 경우, FragPipe로 검색하기 전에 MSConvert61 을 사용하여 데이터 파일에서 이러한 스캔 이벤트를 필터링하십시오.
참고: 아래에 설명된 개방형 검색 파라미터의 경우 빔 유형 CID 데이터만 필요합니다.
- ETD 또는 IT-CID 스캔이 데이터 세트 내에서 획득된 경우, FragPipe로 검색하기 전에 MSConvert61 을 사용하여 데이터 파일에서 이러한 스캔 이벤트를 필터링하십시오.
- FragPipe에서 열린 검색 수행
- FragPipe를 열고 워크플로 탭을 클릭합니다. 워크플로 풀다운 메뉴에서 검색 열기 옵션을 선택하고 파일 추가를 클릭하여 검색할 데이터 파일을 FragPipe로 가져옵니다(그림 2A).
- 데이터베이스 탭을 클릭하고 다운로드를 클릭하여 다운로드 관리자를 시작하십시오. 이렇게 하면 Uniprot Proteome ID를 사용하여 Uniprot에서 프로테옴 데이터베이스를 다운로드할 수 있습니다. 다운로드 관리자 내에서 디코이 및 오염 물질 추가 옵션을 클릭하여 데코이 및 오염 단백질을 데이터베이스에 통합합니다.
- 보다 엄격한 FDR 임계값을 보려면 유효성 검사 탭을 클릭하고 필터 및 보고서 값을 0.01 에서 필요한 FDR로 수정합니다.
참고: 기본 FragPipe 설정은 단백질 수준에서 1% FDR을 보장합니다. - MSfragger 탭을 클릭합니다. 피크 정합 상자 내에서 전구체 질량 공차를 기본 500Da에서 2,000Da로 늘려 큰 수정을 식별할 수 있도록 합니다(그림 2A).
- 실행 탭을 클릭하고 FragPipe의 출력 위치를 정의합니다. 실행 단추를 클릭하여 검색을 시작합니다.
- 데이터 세트(FragPipe의 psm.tsv 출력 내에 포함됨)에서 식별된 PSM을 사용하여 데이터 세트 내에서 관찰된 델타 질량의 빈도를 플로팅하여 잠재적 글리칸을 식별합니다(그림 3). PRIDE 수탁 PXD027820을 통해 액세스할 수 있는 R 스크립트를 사용하여 MSfragger 출력에서 델타 질량 플롯을 만듭니다.
참고: 열린 검색 결과의 최소 후처리는 이러한 스크립트 내에서 수행되며, 이러한 스크립트의 주요 목적은 델타 질량 프로파일의 시각화를 지원하는 것입니다. 중요하게도, 풍부한 델타 질량의 관찰만으로는 변형이 잠재적 글리칸이라는 증거가 아니며, 델타 질량을 글리칸으로 할당하는 것은 상응하는 MS2 사건에 대한 추가 분석이 필요하기 때문이다. - 샘플 내에서 글리코펩티드의 특성화를 가능하게 하기 위해, 높은 하이퍼스코어를 갖는 할당에 대응하는 높은 신뢰도 델타 질량 식별에 초점을 맞춘다.
- 글리코펩티드 스펙트럼을 평가하는 것을 돕기 위해, 스펙트럼 내에서 펩티드 관련 이온의 할당을 가능하게 하는 인터랙티브 펩티드 스펙트럼 주석기(63)와 같은 펩티드 주석 도구를 사용하여, 글리칸 관련 이온의 수동 식별을 가능하게 한다(도 4).
참고: 여기에 제시된 데이터 세트 내에서 >30의 하이퍼스코어는 확인된 모든 글리코펩티드의 상위 50% 이내의 점수에 해당하므로 높은 점수로 간주됩니다(그림 5).
- 글리코펩티드 스펙트럼을 평가하는 것을 돕기 위해, 스펙트럼 내에서 펩티드 관련 이온의 할당을 가능하게 하는 인터랙티브 펩티드 스펙트럼 주석기(63)와 같은 펩티드 주석 도구를 사용하여, 글리칸 관련 이온의 수동 식별을 가능하게 한다(도 4).
- 고신뢰도 글리코펩티드가 할당되면서, 글리코펩티드의 동정을 개선하기 위해 일반적으로 관찰되는 글리칸 관련 이온(도 4)을 동정한다.
참고: 글리칸 중심 검색으로 알려진 검색 내에 글리칸 관련 이온을 통합함으로써 글리코펩티드 할당의 품질을 향상시킬 수 있습니다.- FragPipe의 MSfragger 탭을 클릭하고 관찰된 글리칸의 결정된 델타 질량을 변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에 통합합니다. 변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에 값을 입력하여 이러한 질량을 /로 구분된 개별 질량으로 추가합니다. 이 글리칸의 글리칸 관련 단편 덩어리를 MSFragger의 글리코 / 불안정 모드 섹션에 추가하십시오.
참고: 그림 2B는 A. baumannii 균주 AB307-0294의 글리칸 중심 검색에 필요한 주요 정보를 간략하게 설명합니다.
- FragPipe의 MSfragger 탭을 클릭하고 관찰된 글리칸의 결정된 델타 질량을 변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에 통합합니다. 변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에 값을 입력하여 이러한 질량을 /로 구분된 개별 질량으로 추가합니다. 이 글리칸의 글리칸 관련 단편 덩어리를 MSFragger의 글리코 / 불안정 모드 섹션에 추가하십시오.
- 프로테오믹 연구와 관련된 모든 MS 데이터를 PRIDE 또는 MASSIVE 저장소와 같은 중앙 집중식 프로테오믹 저장소에 업로드합니다.
참고: 이 연구와 관련된 모든 데이터는 PRIDE 프로테오믹 저장소에 보관되었으며 PRIDE 수탁: PXD027820을 통해 액세스할 수 있습니다.
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Representative Results
박테리아 글리코펩티드 분석을 위한 개방 검색의 유용성을 예시하기 위해, A. baumannii-AB307-0294, ACICU 및 D1279779의 세 균주 내에서 O-연결된 글리칸의 화학적 다양성을 평가하였다. O-연결된 글리코프로테옴은 A. baumannii 균주 사이에서 매우 가변적이며, 글리코실화에 사용되는 글리칸은 고도로 가변적인 캡슐 유전자좌 44,45,46으로부터 유래된다. 이러한 화학적 다양성은 A. baumannii를 오픈 검색 연구를위한 이상적인 모델 시스템으로 만듭니다. 세 균주의 글리코프로테옴은 이전에 평가되지 않았지만, 이들 균주 중 두 균주인 AB307-029464 및 ACICU65의 캡슐 구조는 공지되어 있으며, D1279779의 캡슐은 아직 해명되지 않았다.
AB307-0294의 캡슐과 일관되게 AB307-0294의 공개 검색은 648.25 Da 및 692.28 Da에 해당하는 두 개의 우세한 델타 질량을 나타냈다 (그림 3A). 이들 질량은 Russo et al., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA에 의해 이전에 결정된 캡슐 구조와 일치하며, 여기서 QuiNAc4NR 잔기는 3-OH-부티레이트 또는 아세틸기64로 변형된 2,4-디아미노-2,4,6-트리데옥시글루코스에 상응한다. 유사하게, ACICU 캡슐은 이전에 Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc-로 확인된 테트라사카라이드 K 단위로 구성되는 것으로 알려져 있으며, 이는 843.31Da65의 예측된 질량에 상응한다. 이 캡슐 구조는 ACICU 데이터 내에서 가장 빈번하게 관찰되는 델타 질량과 일치한다(그림 3B). 마지막으로, 균주 D1279779의 개방 검색 분석은 203.08, 794.31 및 1588.62 Da와 일치하는 다중 델타 질량의 존재를 밝혀냈다(도 3C). 질량 203.08은 단일 HexNAc 잔기의 질량과 일치하지만, 794.31 및 1588.62는 알려지지 않은 변형에 해당합니다. 질량 1588.62는 794.31의 정확히 두 배이며, 이는 이들 펩티드가 다른 아시네토박터 글리코프로테옴 30,44,46에서 이전에 관찰된 바와 같이, 글리칸 K-유닛 이량체로 장식되어 있음을 시사한다.
델타 질량 플롯은 샘플 내에서 관찰된 변형의 빈도를 평가하는 빠르고 효과적인 방법을 제공합니다. 그러나, 글리칸과 같은 복잡한 변형의 경우, 델타 질량의 존재 단독으로는 글리칸의 정확한 조성을 정의하기 위한 정보를 제공하지 않는다. 글리칸 조성물의 결정을 돕기 위해, 특정 델타 질량에 할당된 PSM의 결과적인 MS/MS 데이터가 사용될 수 있다. 높은 신뢰도 글리코펩티드 할당(하이퍼스코어가 높은 PSM에 상응하는 MSFragger에서)에 초점을 맞춤으로써, 수동 분석을 사용하여 단백질 글리코실화를 위한 균주에 의해 이용된 글리칸을 추가로 특성화할 수 있다. 고신뢰도 펩티드 할당은 전형적으로 Y 이온에 기초한 글리칸 조성물의 결정을 허용하는 강력한 글리칸 정보를 함유한다는 점에 유의해야 한다. 이 정보는 글리칸이 펩티드에 부착되어 남아 있는 상응하는 단편을 확인하는데 사용될 수 있으며, 글리칸66의 할당에 유용한 B 및 옥소늄-관련 이온에 대해서도 사용될 수 있다. 글리칸 조성물을 할당하는 방법에 대한 자세한 지침은 이전에 설명되었으며, 독자는 Harvey et al.67을 참조하는 것이 좋습니다. 인터랙티브 펩티드 스펙트럼 주석기63과 같은 도구를 사용하여, 펩티드-관련 이온이 쉽게 식별될 수 있고, 사용자가 펩티드에 부착된 글리칸의 동일성을 결정할 수 있게 한다.
인터랙티브 펩티드 스펙트럼 주석기를 사용하여, 이들 세 개의 A. baumannii 샘플에서 확인된 글리코펩티드를 평가하여, 잠재적인 글리칸-관련 이온을 밝혀냈다. 글리칸 648.25 및 692.28 Da로 장식된 AB307-0294 글리코펩티드 SAGDQAASDIATATDNASAK의 MS/MS 스펙트럼을 고려하십시오(그림 4A,B); 유사한 단편화 조건 하에서, 글리칸 관련 이온은 매우 유사하지만, 질량이 44.02 Da로 이동한다. 이들 PSM 내의 글리칸 이온의 분석은 이들 글리코펩티드에 대해 관찰된 델타 질량이 네 개의 상이한 탄수화물을 함유하는 삼당류에 상응한다는 것을 확인할 수 있게 한다: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da), 및 HexNAc (203 Da). 글리칸 단편을 할당 할 때, 여러 단당류는 CID를 사용하여 단편화 될 때 물을 잃는 경향이 있다는 점에 유의해야합니다. 이것은 ACICU의 글리칸에서 볼 수 있는데, 여기서 단당류 Pse5Ac7Ac (316 Da)는 두 가지 두드러진 글리칸 관련 단편의 생성을 유도합니다 : MH + 299.12 및 317.13, 물의 질량 (18.01 Da)에 해당하는 질량의 차이 (그림 4C).
또한, 박테리아 글리칸을 분석 할 때, 진핵 생물 내에서 관찰되지 않는 설탕에 해당하는 예기치 않은 단당류 덩어리를 관찰하는 것이 일반적입니다. 이것의 예는 D1279779의 글리코펩티드 PSMs 내에서 볼 수 있으며, 여기서 가장 빈번한 델타 질량 794.31 Da의 분석은 A. baumannii O 결합 글리칸44 내에서 이전에 관찰된 특이한 단당류 dHexNAc (187 Da, 188.09의 MH+로서 관찰됨, 도 4D)의 존재를 드러낸다. 높은 질량 정확도 측정 및 펩티드 골격에서 손실되는 불안정한 변형으로서의 글리칸의 특징적인 거동은 글리칸의 잠재적 인 화학 조성의 결정에 도움이 될 수 있지만, MS 데이터의 과대 해석을 최소화하는 것이 좋습니다. 특정 당류의 입체 화학 또는 글리 칸의 연결 정보가 알려지지 않은 경우, 특정 클래스에 의한 단당류를 언급하는 것을 포함하여 구조적으로 작용제 할당을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 이것의 예는 203.08 Da 잔기를 N-아세틸헥소사민 (HexNAc)으로 언급하고 연결 유형의 할당을 피하는 것이다. 필요한 경우 핵 자기 공명 (NMR)의 사용과 같은 알려지지 않은 변형의 정확한 화학적 정체성을 정의하기 위해 추가 기술을 사용하는 것이 좋습니다.
개방형 검색 접근법은 변형된 펩티드의 신속한 식별을 가능하게 하지만, 이러한 검색 접근법은 데이터 세트 내에서 잠재적인 글리코펩티드를 간과할 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 공개 검색 내에서, 글리코펩티드는 MS2 이벤트 내에 다수의 할당되지 않은 이온의 존재로 인한 불충분한 펩티드 단편화 정보 또는 할당된 펩티드의 벌화를 포함하는 여러 이유로 확인되지 않을 수 있다. 후자는 박테리아 글리코펩티드 PSM에 대해 특히 그러한데, 이들 스펙트럼은 기본적으로 개방 검색 파라미터로 간주되지 않는 글리칸 관련 단편을 함유할 수 있기 때문이다. 타의 추종을 불허하는 특징이 PSM의 점수에 악영향을 미치기 때문에 MS/MS 스펙트럼 내에서 타의 추종을 불허하는 이온을 최소화하면 FDR 제어 최소 점수 역치로 인해 초기에 제외되었던 글리코펩타이드를 식별할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 개방 검색(도 3) 및 수동으로 정의된 글리칸-관련 이온(도 4)으로부터 정의된 질량은 글리코펩티드의 식별을 개선하기 위해 검색 파라미터에 통합될 수 있다. 이러한 글리칸-관련 이온은 글리칸의 드노보 결정, 일반적인 옥소늄 이온(44,68)에 대한 사전 지식, 또는 SPectral Immonium Ion Detection tool(69,76)과 같은 스펙트럼 내에서 재발하는 이온을 포획할 수 있는 도구의 사용에 기초하여 수동으로 식별될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
이를 입증하기 위해, 공개 검색 분석을 통해 확인된 비정형 글리칸 단편의 질량을 MSFragger의 검색 파라미터 내로 통합하고, 글리칸-집중 검색을 수행하였다(균주 AB307-0294에 대한 글리칸-집중 설정은 도 2B에 도시됨). 여러 글리칸이 함께 검색될 때, Y 이온 및 진단 질량의 선택에 주의를 기울여 각 델타 질량과 관련된 단편 이온을 정확하게 반영하도록 해야 한다는 점에 유의해야 한다. AB307-0294의 648.25 및 692.28 글리칸의 단편과 같이 Y와 진단 질량의 조합에 대해 항상 가능하지는 않지만 (그림 4A, B), 글리칸 중심 검색은 여전히 가능하지만 검색 결과의 견고성에 영향을 줄 수 있습니다. 글리칸 집중 검색은 세 가지 A. baumannii 균주 모두에서 확인된 글리코펩티드 PSM의 총 수의 현저한 증가를 가져왔으며, 이는 ACICU의 37% 증가, AB307-0294의 117% 증가, D1279779의 363% 증가에 해당한다(도 5A-C). 개별 MS 이벤트의 경우, 글리칸 특이적 정보의 포함은 전형적으로 관찰된 하이퍼스코어 내에서 증가를 초래하지만, 이러한 증가는 글리칸 의존적이다(도 5D, E). 따라서, 오픈 서치를 통해 밝혀진 글리칸의 질량을 사용하여 검색 파라미터를 정제하고, 이어서 수동으로 큐레이팅된 글리칸 단편 정보를 표적화된 검색에 통합함으로써, 샘플 내의 글리코펩티드에 대한 보다 상세한 분석이 얻어질 수 있다.
그림 1 : 박테리아 글리코 펩타이드의 준비 및 분석의 주요 단계 개요. 박테리아 글리코펩티드의 성공적인 동정은 글리코펩티드를 함유하는 고품질 샘플의 생성에 의존한다. 글리코펩티드-함유 샘플은 LC-MS에 의해 분석되고, 이어서, 개방 검색 접근법이 독특한 델타 질량에 기초한 잠재적인 글리코펩티드를 확인하기 위해 사용된다. 수동 큐레이션을 사용하여, 이들 델타 질량은 글리칸으로 식별될 수 있다. 마지막으로, 글리코펩티드의 동정을 개선하기 위해, 글리칸 정보는 글리칸 중심의 데이터베이스 검색에 통합될 수 있다. 약어: LC-MS = 질량 분광법에 결합된 액체 크로마토그래피; OD = 광학 밀도; SDB-RPS = 스티렌디비닐벤젠-역상 설포네이트; ZIC-HILIC = Zwitterionic 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피; PSMs = 펩티드-스펙트럼 매치; CID = 충돌-유도된 해리; ETD = 전자 전달 해리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: FragPipe에서 개방형 검색 및 글리칸 중심 검색을 활성화하는 방법에 대한 개요. (A) FragPipe의 워크플로 탭 내에서 열린 워크플로를 로드하여 개방형 검색을 활성화할 수 있습니다. 크기가 500Da 이상인 글리칸을 식별하려면 전구체 질량 공차 창을 2,000 Da로 늘립니다. (B) 비정형 글리칸에 대한 글리칸 중심 검색은 MSFragger 탭에 글리칸 정보를 입력해야 수정의 예상 질량을 정의해야 합니다(변수 수정 및 질량 오프셋 섹션에서), 이러한 글리칸과 관련된 Y 이온(글리코/불안정의 Y 이온 질량 목록에서). 섹션) 및 저질량 글리칸 단편 이온 (글리코 / 불안정 섹션의 진단 단편 질량 목록으로). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 아시네토박터 바우마니(AB307-0294, ACICU 및 D1279779)의 3개 균주에 대한 개방 검색 결과의 델타 질량 플롯. 캡슐 유전자좌의 다양성과 일치하여, 각각의 A. baumannii 균주는 관찰된 델타 질량으로 표시된 크기가 140 Da 초과인 두드러진 변형을 갖는 독특한 델타 질량 프로파일을 보유한다. (a) AB307-0294 델타 질량 플롯 내에서, 질량 648.25 및 692.28은 -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-와 일치하는 변형에 상응하며, 여기서 QuiNAc4NR은 3-OH-부티레이트 또는 아세틸 그룹(64)으로 변형된다. (b) ACICU 델타 질량 플롯 내에서, 질량 203.08 및 843.31은 각각 HexNAc 및 Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc, 각각65와 일치하는 변형에 상응한다. (c) D1279779 델타 질량 플롯 내에서, 질량 203.08, 794.31 및 1588.62는 HexNAc, HexNAc-217-187-187 및 HexNAc-217-187-187의 이량체에 상응한다. 델타 질량은 수동으로 평가되고 도 4에서 *로 표시된 글리칸으로 확인되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 아시네토박터 바우마니의 세 균주에서 관찰된 델타 질량의 MS/MS 특성화. (A, B) AB307-0294, (C) ACICU 및 (D) D1279779. 인터랙티브 펩티드 스펙트럼 주석기-보조 주석 처리된 스펙트럼의 대표적인 글리코펩티드. 각 스펙트럼에 대해, 펩티드 단편 이온은 청색 및 적색으로 표기되는 반면, 수동으로 할당된 글리칸-관련 이온은 녹색으로 표시된다. 글리칸은 사각형으로 표시된 HexNAc, 원으로 Hex, 사다리꼴로 표시된 글리칸의 질량을 가진 사다리꼴로 표시된 비정형 단당류를 사용하여 주석을 달았습니다. 약어: MS/MS = 탠덤 질량 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 개방 대 글리칸 집중 검색을 이용한 아시네토박터 바우마니의 균주에 걸쳐 확인된 글리코펩티드의 비교. (A-C) 개방 및 글리칸 중심 검색을 사용하여 D1279779, ACICU 및 AB307-0294 내의 하이퍼스코어와 PSM 할당 수를 비교합니다. (D-F) D1279779, ACICU 및 AB307-0294에 대한 개방 및 글리칸 집중 검색을 사용하여 동일한 펩티드 서열에 할당된 개별 MS2 이벤트의 비교. 약어: PSM = 펩티드-스펙트럼 일치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| A. 바우마니이 변종 | Uniprot Proteome ID |
| AB307-0294 15 | UP000006924 |
| 아시쿠 47,48 | UP000008839 |
| D1279779 49 | UP000011860 |
표 1. 균주 및 Uniprot 프로테옴 ID가 본 연구에서 사용되었다.
| 버퍼 이름 | 완충제 조성물/pH | |
| 버퍼 A* | 18.2 MΩ H2O에서 2% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루로아세트산/pH 1.0 | |
| 증권 시세 표시기 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 및 2 mM KH2PO4/pH7.4 | |
| 환원/알킬화 버퍼 | 100 mM 트리스 2-카르복시에틸포스핀 염산염, 400 mM 2-클로로아세트아미드 중 1 M 트리스/pH 7.5 | |
| SDB-RPS 스테이지 팁 용리 버퍼 | 80% 아세토니트릴/pH 11에서 5% 수산화암모늄 | |
| SDB-RPS 스테이지 팁 평형 버퍼 | 30% 메탄올, 1% 트리플루로아세트산, 18.2MΩH2O/pH 1.0에서 | |
| SDB-RPS 스테이지 팁 적정/세척 버퍼 | 90% 이소프로판올, 1% 트리플루로아세트산/pH 1.0 | |
| SDB-RPS 스테이지 팁 세척 버퍼 | 18.2 MΩH2O/pH 1.0에서 1% 트리플루로아세트산 | |
| SDC 용해 버퍼 | 100 mM 트리스/pH 8.5에서 4% SDC | |
| ZIC-HILIC 용출 버퍼 | 18.2 MΩ H2O/pH 1.0에서 0.1% 트리플루로아세트산 | |
| ZIC-HILIC 로딩/세척 버퍼 | 80% 아세토니트릴, 18.2 MΩH2O/pH 1.0에서 1% 트리플루로아세트산 | |
| ZIC-HILIC 준비 버퍼 | 95% 아세토니트릴 중 18.2MΩH2O/pH 7.0 | |
표 2: 본 연구에 사용된 완충제의 조성.
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Discussion
공개 검색은 알려지지 않은 수정 사항을 식별하기위한 효과적이고 체계적인 방법입니다. 박테리아 프로테옴 샘플 내에서 알려지지 않은 글리칸의 확인은 전통적으로 시간이 많이 걸리고 기술적으로 전문화 된 사업이었지만, MSfragger21,41 및 Byonic31,38과 같은 도구의 최근 개발은 이제 펩티드에 부착 된 잠재적 인 글리 칸으로서의 추가 특성화를 위해 델타 질량을 빠르고 효과적으로 식별 할 수있게되었습니다. 표준 및 글리코펩티드-풍부 프로테옴 샘플 둘 다의 공개 검색은 잠재적인 글리코펩티드를 동정할 수 있다(도 1). 많은 박테리아 시스템의 프로테옴 내에서 글리코펩티드의 공통성과 풍부함은 글리코펩티드 농축 없이 이러한 변형의 직접적인 검출을 가능하게 한다6. 비록 글리코펩티드 농축 접근법이 전형적으로 여전히 많은 글리코실화 시스템(70)에 대한 비농축-기반 방법보다 우수하지만, 모든 글리칸이 농축(71,72)에 동등하게 복종할 수 있는 것은 아니라는 것이 주목할 만하다. 이러한 사실은 주어진 생물학적 샘플에 대한 공개 검색을 사용하여 글리코실화 사건을 식별하기 위한 가장 적절한 접근법을 결정할 때 고려되어야 한다.
오픈 검색은 샘플 내에서 고주파로 관찰된 글리칸을 효과적으로 식별하지만, 데이터 세트 내에서 거의 발생하지 않는 글리코실화 이벤트를 식별하는 데는 여전히 효과가 없습니다. 실용적인 측면에서, 글리칸의 독특한 델타 질량이 확인되기 위해서는 동일한 델타 질량을 가진 적어도 10 PSM이 샘플 내에 존재해야합니다. 이 최소 주파수를 통해 잠재적 글리칸은 배경 델타 질량 할당보다 더 구별 될 수 있습니다 (그림 3). 이 기준은 일반적으로 글리코실화를 위해 다수의 기질을 표적화하는 일반적인 글리코실화 시스템에 의해 충족되지만, 단일 단백질이 글리코실화를 표적화하는 시스템은 이러한 접근법에 덜 적합할 수 있다. MS 기기의 속도와 감도가 향상됨에 따라, 이것은 점점 더 낮은 풍부 글리코 펩티드 집단의 평가를 가능하게하고, 이는 희귀 / 저 풍부한 글리코 폼에 대해 충분한 품질의 스펙트럼이 생성 될 수 있다면 오픈 서치 접근법의 효과를 향상시킬 것입니다.
MS는 신규한 글리칸의 효과적인 동정을 가능하게 하지만, 이러한 통찰력만으로는 글리코펩티드/글리칸의 완전한 구조적 특성화를 거의 제공하지 않으며, NMR 분광법과 같은 도구는 완전한 글리칸 특성화를 위해 여전히 중요하다는 점에 유의해야 한다. 여기에서 관찰된 바와 같이, MS는 A. baumannii ACICU 및 AB307-029464,65의 단리된 캡슐로부터 NMR을 사용하여 이전에 결정된 K-유닛의 상보적인 확인을 제공하였다. 그러나, D1279779에서 확인된 주요 글리칸의 경우, 이 글리칸 내의 단당류의 추정적 부류에 대한 정보만이 이들 당 단위의 결합 유형 또는 입체화학에 대한 정보를 제공하지 않는 MS와 함께 할당될 수 있었다(도 4). 자외선 광해리73,74와 같은 새로운 MS 단편화 방법이 더욱 널리 이용가능해짐에 따라, 글리코펩티드의 보다 상세한 구조적 특성화가 가능할 수 있다. 그러나 현재 계측기와의 연계 또는 입체 화학 정보를 추론 할 때는주의해야합니다. 이러한 고려사항 외에도, 최근 개방형 검색(75)을 위한 FDR 기반 제어의 적절성에 대한 의문이 제기되었다. 따라서, 오픈 서치가 강력한 접근법이지만, 이러한 고려사항들은 오픈 검색 정보에만 기초한 글리칸 할당의 해석에 있어서 주의가 취해질 필요성을 강조한다.
이 연구는 오픈 서치가 박테리아 글리코실화에 사용되는 글리칸의 감독되지 않은 식별을위한 효과적인 접근법임을 보여 주지만, 공개 검색만으로는 샘플 내에 포함 된 모든 글리코 펩타이드의 하위 집합에 대한 액세스를 제공합니다. 글리칸의 불안정한 특성으로 인해, 글리코펩티드 PSM은 전형적으로 다양한 범위의 글리칸 관련 단편을 함유하며, 이는 설명되지 않더라도 PSM의 스코어링에 악영향을 미칠 것이다. 이 문제를 극복하고 글리코펩티드의 보다 심층적인 식별을 허용하기 위해, 오픈 검색을 통해 얻은 글리칸 정보는 후속적으로 글리칸 중심 검색을 알리는 데 사용될 수 있다(도 2B). 이러한 방식으로, 글리칸-관련 단편의 수동 결정과 결합된 개방 검색은 샘플 내에 할당된 글리코펩티드의 품질 및 양을 개선하는데 사용될 수 있다(도 5). 글리코펩티드 검색 파라미터의 개선은 MSfragger와 같은 현재 버전의 도구에서 수동으로 수행되지만, 분야가 성숙함에 따라 이러한 단계는 자동화된 방식으로 수행될 가능성이 높습니다. 연구는 이미 특정 PTMs69와 관련된 반복되는 저분자량 이온을 식별하기위한 전산 접근법뿐만 아니라 알려지지 않은 글리코 펩티드76과 관련된 옥소늄 이온 및 반복 Y 이온 질량을 식별하기위한 전략을 입증했습니다. 따라서 이러한 단계는 FragPipe와 같은 도구의 새로운 반복에 통합되어 박테리아 및 진핵 샘플 내에서 이전에 알려지지 않은 글리코실화 사건을 더욱 쉽게 식별 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
N.E.S는 Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) 및 ARC Discovery Project Grant (DP210100362)의 지원을 받습니다. MS 계측에 대한 액세스를 위해 Bio21 분자 과학 및 생명 공학 연구소의 멜버른 질량 분광법 및 프로테오믹스 시설에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 G Kel-F Hub point style 3 | Hamilton company | hanc90514 | |
| 2-Chloroacetamide | Sigma Aldrich Pty Ltd | C0267-100G | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich Pty Ltd | 34851-4L | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 338818-100ML | |
| BCA Protein Assay Reagent A | Pierce | 23228 | |
| BCA Protein Assay Reagent B | Pierce | 23224 | |
| C8 Empore SPE | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66882-U | An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Formic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 5.33002 | |
| Isopropanol | Sigma Aldrich Pty Ltd | 650447-2.5L | |
| Methanol | Fisher Chemical | M/4058/17 | |
| SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66886-U | An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich Pty Ltd | D6750-100G | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 2232000083 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 302031-10X1ML | |
| Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | C4706-2G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich Pty Ltd | 252859-500G | |
| Trypsin/Lys-C protease mixture | Promega | V5073 | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810040 | |
| ZIC-HILIC material | Merck | 1504580001 | Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin |
References
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