Summary
オープン検索は、これまで知られていなかった糖鎖組成で装飾された糖ペプチドの同定を可能にする。この記事では、 アシネトバクター・バウマンニを モデルとして細菌サンプルについて、オープン検索とその後のグリカン中心の糖ペプチド検索を行うための合理化されたアプローチを紹介します。
Abstract
タンパク質グリコシル化は、細菌生物内の一般的な修飾としてますます認識されており、原核生物生理学および病原種の最適な感染力に寄与する。このため、細菌のグリコシル化を特徴付けることへの関心が高まっており、これらの事象を同定するためのハイスループット分析ツールの必要性が高まっています。ボトムアッププロテオミクスは豊富な糖ペプチドデータの生成を容易に可能にするが、原核生物種で観察されるグリカンの幅広さと多様性は、細菌のグリコシル化事象の同定を非常に困難にしている。
従来、細菌プロテオミクスデータセット内のグリカン組成の手動測定は、これを主に分野固有の専門家に限定されたオーダーメイドの分析にしました。最近、オープンな検索ベースのアプローチが、未知の変更を特定するための強力な代替手段として浮上しています。ペプチド配列で観察されるユニークな修飾の頻度を分析することにより、オープンサーチ技術により、複雑なサンプル内のペプチドに結合した一般的なグリカンの同定が可能になります。この記事では、グリコプロテオームデータの解釈と分析のための合理化されたワークフローを提示し、グリカン組成の事前知識なしに細菌の糖ペプチドを同定するためにオープン検索技術をどのように使用できるかを実証する。
このアプローチを使用して、サンプル内の糖ペプチドを迅速に同定し、グリコシル化の違いを理解することができます。 モデルとしてアシネトバクターバウマンニ を使用して、これらのアプローチは、株間のグリカン組成の比較および新規糖タンパク質の同定を可能にする。まとめると、この研究は、細菌のグリコシル化を同定するためのオープンデータベース検索技術の汎用性を実証し、これらの非常に多様なグリコプロテオームの特性評価をこれまで以上に容易にする。
Introduction
タンパク質グリコシル化は、タンパク質分子に炭水化物を結合させるプロセスであり、自然界で最も一般的な翻訳後修飾(PTM)の1つである1,2。生命のすべての領域にわたって、無数の細胞機能に影響を与える糖タンパク質の生成に特化した一連の複雑な機械が進化してきました1,3,4,5。タンパク質グリコシル化はアミノ酸6、7の範囲で起こるが、N結合型およびO結合型グリコシル化事象は、自然界で観察される2つの支配的な形態である。N結合型グリコシル化は、アスパラギン(Asn)残基の窒素原子へのグリカンの結合を伴うが、O結合型グリコシル化において、グリカンは、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)、またはチロシン(Tyr)残基の酸素原子に結合している7。グリコシル化系によって標的とされる残基の類似性にもかかわらず、タンパク質に結合しているグリカン内の相違により、グリコシル化は自然界で見出されるPTMの最も化学的に多様なクラスである。
真核生物グリコシル化系はグリカンの多様性を有するが、これらの系は典型的には、利用される固有の炭水化物の数に制限されている。結果として生じる多様性は、これらの炭水化物がグリカン8、9、10、11、12にどのように配置されるかに由来する。対照的に、細菌および古細菌種は、これらの系内で生成されるユニークな糖の膨大な配列のために、事実上無限のグリカン多様性を有する2、10、13、14、15、16、17。生命のドメイン間で観察されるグリカン多様性のこれらの違いは、グリコシル化事象の特性評価および同定のための重要な分析上の課題を表す。真核生物のグリコシル化の場合、グリカン組成物を予測する能力は、糖生物学への関心の高まりを促進してきた。しかし、細菌のグリコシル化についても同じことは当てはまらず、専門の研究室による研究にはまだ大きく制限されています。バイオサイエンスにおいて質量分析(MS)機器のアクセシビリティが高まるにつれて、MSベースのアプローチがグリコプロテオーム分析の主要な方法になりました。
MSはグリコシル化の特性評価のための典型的なツールとして浮上しており、トップダウンとボトムアップの両方のアプローチが糖タンパク質6の特性評価に一般的に使用されています。トップダウンプロテオミクスは、特定のタンパク質のグローバルなグリコシル化パターンを評価するために使用されるが18,19、ボトムアップアプローチは、複雑な混合物6、20、21、22、23からでさえも、糖ペプチドのグリカン特異的特性評価を可能にするために使用される。糖ペプチドの分析のためには、有益な断片化情報の生成が、グリコシル化事象の特性評価に不可欠である24、25。現在、共鳴イオントラップベースの衝突誘起解離(IT-CID)、ビーム型衝突誘起解離(CID)、電子移動解離(ETD)など、さまざまなフラグメンテーションアプローチが機器で日常的にアクセス可能です。各アプローチは、糖ペプチド分析25,26に対して異なる長所と短所を有しており、これらの断片化アプローチをグリコシル化6,20の分析に適用する上で過去10年間で著しい進歩を遂げている。しかし、細菌のグリコシル化分析にとって、重要な制限は糖ペプチドを断片化する能力ではなく、むしろサンプル内の潜在的なグリカン組成を予測できないことでした。これらのシステム内では、多様な細菌グリカンの未知の性質は、O-Pair27、GlycopeptideGraphMS28、およびGlycReSoft29などの真核生物糖ペプチドの分析のために現在一般的であるグリコシル化に焦点を当てた検索ツールを使用しても、糖ペプチドの同定を制限する。この問題を克服するためには、細菌のグリコシル化30の研究のための強力なアプローチとして、オープンな検索ツールの使用が浮上している代替の検索方法が必要である。
オープン検索は、ブラインドまたはワイルドカード検索としても知られており、不明または予期しないPTM21、30、31、32を有するペプチドの同定を可能にする。オープン検索は、キュレーションされた修正検索、多段階データベース検索、または広質量耐性検索33、34、35、36、37を含む様々な計算技術を利用する。オープン検索は大きな可能性を秘めているが、その使用は、典型的には、制限された検索と比較して、分析時間の有意な増加および非修飾ペプチドの検出の感度の損失によって妨げられてきた31、32。非修飾ペプチドスペクトルマッチ(PSM)の検出の減少は、これらの技術に関連する偽陽性PSM率の増加の結果であり、所望の偽発見率(FDR)を維持するためには、より厳格なフィルタリングの増加が必要である33、34、35、36、37.最近、Byonic 31,38、Open-pFind39、ANN-SoLo 40、MSFragger21,41など、オープン検索のアクセシビリティを大幅に向上させるいくつかのツールが利用可能になりました。これらのツールは、分析時間を大幅に短縮し、不均一なグリカン組成物を処理するためのアプローチを実装することによって、グリコシル化イベントの堅牢な同定を可能にします。
本稿では、グラム陰性院内病原体であるアシネトバクター・バウマンニをモデルとして、オープンサーチによる細菌糖ペプチドの同定のための合理化された方法を提示する。A. baumanniiは、PglLタンパク質グリコシル化システム42、43、44として知られる複数のタンパク質基質の修飾に関与する保存されたO結合型グリコシル化システムを有する。類似のタンパク質が株間のグリコシル化を標的としているが、PglLグリコシル化システムは、タンパク質グリコシル化に使用されるグリカンの生合成がカプセル遺伝子座(K遺伝子座として知られている)に由来するため、非常に可変である44,45,46。これは、単一または限定された重合K単位に由来する多様なグリカン(K単位としても知られる)を、タンパク質基質30、44、46に付加する結果とする。この研究の中で、ソフトウェアFragPipe内のオープン検索ツールMSfraggerの使用は、A. baumannii株全体のグリカンを同定するために使用される。オープン検索と手作業によるキュレーションを組み合わせることで、「糖鎖に着目した探索」を行い、細菌の糖ペプチドの同定をさらに向上させることができます。一緒に、この多段階同定アプローチは、新規グリコシル化事象の特性評価において広範な経験なしに糖ペプチドの同定を可能にする。
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Protocol
注:細菌糖ペプチドサンプルの調製および分析は、4つのセクションに分けることができる(図1)。この研究のために、3つの配列決定された A.バウマンニ株のグリコシル化が評価された(表1)。これらの各株のプロテオームFASTAデータベースは、Uniprotを介してアクセス可能です。このプロトコルで使用されるバッファーの構成については、 表 2 を参照してください。
1. プロテオミクス解析用タンパク質試料の調製
- 目的のプロテオームサンプルの単離
- 全細胞を使用する場合は、培地中に存在する潜在的なタンパク質夾雑物を除去するために、細胞がリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄されていることを確認してください。洗浄後の全細胞をスナップフリーズし、必要になるまで-80°Cで保存する。
- 分画されたサンプル(膜調製物など)が使用される場合、使用される試薬が下流の液体クロマトグラフィーMS(LC-MS)分析50を妨げないことを確認する。
- ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、Triton X-100、NP-40、またはラウロイルサルコシンなどの洗剤が使用されている場合は、アセトン沈殿、SP3サンプル調製方法51、またはSトラップ52などの市販のプロテオミクスクリーンアップカラムを使用してこれらの洗剤を除去します。あるいは、非相溶性洗剤を、デオキシコール酸ナトリウム(SDC)またはオクチルグルコピラノシドなどのMS適合性または取り外し可能な洗剤で代用する。
- サンプル調製に使用するすべてのプラスチック製品およびガラス製品がオートクレーブ処理されていないことを確認します。オートクレーブ処理されたガラス製品およびプラスチックは、通常、ポリマーなどの小さな分子量化合物でひどく汚染されており、MS内で容易に検出される。
- 全細胞サンプルの可溶化
- 洗浄したスナップ凍結細胞約10 mgを、200 μLの新しく調製したデオキシコール酸ナトリウム溶解緩衝液(SDC溶解緩衝液:100mM Tris中の4% SDC、pH 8.5)に再懸濁する。
注: プロテアーゼ阻害剤を SDC 溶解バッファーに添加して、タンパク質の分解を制限することができます。 - サンプルを振とうしながら95°Cで10分間煮沸し(サーモミキサーで2000rpm)、氷上で10分間放置した。このプロセスを2回繰り返して、サンプルの効率的な溶解と可溶化を確保します。
注:サンプルは、この時点で-80°Cで長期間保存することができます。 保存した場合は、さらに処理する前に95°Cで加熱して再可溶化する。
- 洗浄したスナップ凍結細胞約10 mgを、200 μLの新しく調製したデオキシコール酸ナトリウム溶解緩衝液(SDC溶解緩衝液:100mM Tris中の4% SDC、pH 8.5)に再懸濁する。
- ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ53を用いてサンプルタンパク質濃度を定量する。サンプルを氷上に保管しながら、タンパク質の分解を制限する定量を行います。
注:総プロテオーム分析では、20〜100μgのタンパク質がナノLC-MSには十分であり、通常、分析ごとに2μg未満のタンパク質消化が必要です。過剰なペプチドの調製により、深いプロテオミクスカバレッジが必要な場合に、複製分析またはさらなる分画が可能になります。親水性相互作用クロマトグラフィー(HILIC)を用いた糖ペプチド濃縮ベースの分析には、100~500μgのタンパク質が必要です。 - サンプルを減らしてアルキル化する。
- 10倍の還元/アルキル化緩衝液(100mM Tris 2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩;400mM 2-クロロアセトアミド中1Mトリス、pH8.5)の1/10番目の容量を終濃度1xのサンプルに加え、1,500rpmで振とうしながら45°Cで30分間暗所でサンプルをインキュベートする。
注:pHが低いとSDCが沈殿するため、サンプルに添加する前に、10倍の還元/アルキル化バッファーのpHをチェックして、pHが約7.0〜8.0であることを確認してください。
- 10倍の還元/アルキル化緩衝液(100mM Tris 2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩;400mM 2-クロロアセトアミド中1Mトリス、pH8.5)の1/10番目の容量を終濃度1xのサンプルに加え、1,500rpmで振とうしながら45°Cで30分間暗所でサンプルをインキュベートする。
- サンプルを短時間スピンダウンし、プロテアーゼ Trypsin/Lys-C (約 10 μL、100 mM Tris、pH 8.5 に再懸濁) を加えて、最終的なプロテアーゼ対タンパク質比を 1:100 にします。消化物を1,500rpm(最大18時間)で振とうしながら37°Cで一晩インキュベートする。完全なタンパク質消化を確実に行うには、トリプシン/Lys-Cプロテアーゼ:タンパク質比1:50~1:200を使用してください。
- 1.25倍量の100%イソプロパノールをサンプルに加えて消化を急冷する。サンプルを1分間渦巻きにして混合し、短時間スピンダウンします。
注:サンプルは-20°Cで保存して、後でさらに処理することができます。 - 0.115容量の10%トリフルオロ酢酸(TFA;終濃度〜1%TFA)を加えてサンプルを酸性にし、サンプルを渦巻き、短時間スピンダウンします。
2. プロテオーム試料の処理
- プロテオームサンプルのペプチドクリーンアップ
- スチレンジビニルベンゼン逆相スルホネート(SDB-RPS)ストップアンドゴー抽出(ステージ)チップを、前述のように各サンプルごとに1つ用意する54。
- 経験的に、50 μg のペプチドを結合するために、鈍い針 (14 G) を使用して 47 mm2 SDB-RPS 膜から 3 枚の SDB-RPS ディスクを切り取ります。ペプチド量が多い場合は、それに応じてディスクの数を増やします。
- SDB-RPS ステージチップを使用する前に、少なくとも 10 床容量の以下のバッファーを順次追加し、遠心分離 (25 °C、3 分、500 × g) によってバッファーをカラムを通して回転させるか、シリンジを使用して静かに圧力をかけてバッファーをカラムに押し込むことによって、チップを準備します。
- 先端を150μLの100%アセトニトリルで濡らす。
- 先端を 150 μL の 30% メタノール、1% TFA (18.2 MΩ H2 O)で洗浄します。
- 先端を150 μLの90%イソプロパノール、18.2 MΩH2Oとのバランスのとれた1% TFAで平衡化します。
- 遠心分離(25°C、3分、500× g)またはシリンジを使用して静かに圧力をかけることによって、サンプル(50%イソプロパノール、1%TFAを含む)をSDB-RPSステージチップにロードする。
- SDB-RPSステージチップを以下のバッファーで洗浄するには、遠心分離(25°C、3分、500× g)するか、シリンジを使用して静かに圧力をかけます。
注:追加の洗浄または代替緩衝液を使用して、イソプロパノール55の代わりに酢酸エチルを使用するなど、非ペプチド汚染物質を除去することができます。- 先端を150μLの90%イソプロパノール、1%TFAで洗浄する。
- 先端を18.2 MΩ H2 O中の1% TFAの150 μLで洗浄します。
- SDB-RPSステージチップから、遠心分離またはシリンジを使用して静かに圧力をかけることによって、80%アセトニトリル中の5%水酸化アンモニウム150 μLでペプチドを溶出します。サンプルを個々のチューブに集めます。
注:ヒュームフード内で使用する直前に、プラスチック容器に80%アセトニトリル中に5%水酸化アンモニウムを準備してください。 - 溶出したペプチドを25°Cで真空遠心分離により乾燥させた。
注: HILIC 濃縮を行う場合、この時点でペプチド溶出液の 1 ~ 10% を除去し、乾燥させて、全プロテオーム入力コントロールとして使用できます。
- スチレンジビニルベンゼン逆相スルホネート(SDB-RPS)ストップアンドゴー抽出(ステージ)チップを、前述のように各サンプルごとに1つ用意する54。
- 糖ペプチドサンプルの濃縮
- Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) ステージチップを前述のように54,56 に調製します。
- 簡単に言えば、鈍い針(14G)を使用して47mm2C8膜から1枚のC8ディスクを切り取り、ディスクをP200チップに詰めてフリットを作成します。シリンジを使用して静かに圧力をかけることによって、50%アセトニトリル、50%18.2MΩH2Oに再懸濁した約5mmのZIC-HILIC材料をフリットに加える。
- ZIC-HILICステージチップを使用する前に、以下のバッファーを順次添加し、シリンジを使用して静かに圧力をかけて樹脂をコンディショニングします。
注:ZIC-HILIC樹脂(糖ペプチドを濃縮するために必要)の表面上の擬似水層の完全性を確保するために、樹脂は常に濡れたままでなければなりません。樹脂を洗浄するときは、常に樹脂の上に約10 μLの溶剤を残し、洗浄/サンプルがこの残留溶剤に直接ピペットで送られるようにしてください。- 20 床容量 (200 μL) の ZIC-HILIC 溶出バッファー (18.2 MΩ H2O 中の 0.1% TFA) で樹脂を平衡化します。
- 20 床容量 (200 μL) の ZIC-HILIC 調製バッファー (18.2 MΩ H 2 O 中の 95% アセトニトリル) で樹脂を洗浄します。
- 20 ベッド容量 (200 μL) の ZIC-HILIC ローディング/洗浄バッファー (80% アセトニトリル、1% TFA バランス x 18.2 MΩ H 2 O) で樹脂を洗浄します。
- 乾燥した消化サンプル(ステップ2.1.6から)をZIC-HILICローディング/ウォッシュバッファーに最終濃度4 μg/μLまで再懸濁します(例えば、200 μgのペプチドについては、50 μLのZIC-HILICローディング/ウォッシュバッファーに再懸濁します)。ボルテックスを1分間短時間かけてサンプルを再懸濁させ、25°Cで2,000 × g で1分間スピンダウンします。
- 再懸濁ペプチドサンプルをコンディショニング ZIC-HILIC カラムにロードします。
- シリンジを使用して静かに圧力をかけて、20 ベッド容量 (200 μL) の ZIC-HILIC ローディング/ウォッシュバッファー (合計 60 ベッド容量洗浄の場合) で 3 回洗浄します。
- シリンジを使用して穏やかに圧力をかけることによって、20床容量(200 μL)のZIC-HILIC溶出緩衝液で糖ペプチドを1.5mLチューブに溶出させ、次いで25°Cで真空遠心分離によって溶出液を乾燥させた。
- Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) ステージチップを前述のように54,56 に調製します。
3. プロテオーム/糖ペプチド富化サンプルのLC-MS
- サンプルをバッファー A* (2% アセトニトリル、0.1% TFA) に最終濃度 1 μg/μL まで再懸濁します (たとえば、50 μg のペプチドについては、50 μL のバッファー A* に再懸濁します)。
- MSに結合したHPLC/UPLCにサンプルをロードして、糖ペプチドの分離と同定を可能にします。
注: 内径、長さ、流速、クロマトグラフィー樹脂の種類、必要なペプチド注入量などのカラムパラメータは、使用する分析セットアップとグラジエント長に合わせて最適化する必要があります。分析設定の最適化を行う方法の例については、57を参照してください。 - 結果の MS データの収集を監視して、データが目的のパラメーターで収集されていることを確認します。
注: 組成分析では、CID フラグメンテーションで十分です。糖ペプチドへのグリカンの付加のために、糖ペプチドイオンは、典型的には、非糖化ペプチドよりも高い m / z および低い電荷密度で観察される。これらのイオンが確実に観察可能であるようにするには、MS1 の質量範囲を 400 ~ 2,000 m/z にしてください。 - CIDを使用して選択されたイオンをフラグメント化し、グリカンの特性評価に重要なオキソニウムイオンを含む低 m / z フラグメントイオンの収集を保証する。
注:CIDを用いた糖ペプチドの断片化は、ペプチドおよびグリカン配列の両方、ならびに断片化25、58、59の間に加えられるエネルギーによって影響される。異なる衝突エネルギーの範囲を使用することができるが、糖ペプチドを断片化するための最適な戦略は、複数の衝突エネルギーの使用を組み合わせた段階的な衝突エネルギーの使用である25、59、60。 - 利用可能な場合は、部位局在化のためのETD、またはグリカン組成の決定を支援するためにIT-CIDなどの代替フラグメンテーション方法を使用する。
注:これらの断片化アプローチのいずれも組成分析に必須ではありませんが、目的の糖ペプチドのさらなる尋問を可能にするために収集することができます。
4. プロテオーム/糖ペプチド富化試料の分析
- FragPipe での検索を可能にするためのデータファイルの事前フィルタリング
- データセット内で ETD または IT-CID スキャンが取得されている場合は、FragPipe で検索する前に、MSConvert61 を使用してこれらのスキャン イベントをデータ ファイルからフィルター処理します。
メモ: 以下に概説するオープンサーチパラメータでは、ビームタイプの CID データのみが必要です。
- データセット内で ETD または IT-CID スキャンが取得されている場合は、FragPipe で検索する前に、MSConvert61 を使用してこれらのスキャン イベントをデータ ファイルからフィルター処理します。
- FragPipe でのオープン検索の実行
- FragPipe を開き、[ ワークフロー] タブをクリックします。ワークフローのプルダウン メニューで、[検索 を開く ] オプションを選択し、[ ファイルの追加] をクリックして、検索するデータ ファイルを FragPipe にインポートします (図 2A)。
- 「データベース」タブをクリックし、「ダウンロード」をクリックしてダウンロード・マネージャーを起動します。これにより、Uniprot プロテオーム ID を使用して Uniprot からプロテオーム データベースをダウンロードできます。ダウンロード マネージャの [おとりと汚染物質の追加] オプションをクリックして、おとりと汚染物質のタンパク質をデータベースに組み込むことができます。
- より厳しい FDR しきい値については、「 検証 」タブをクリックし、「 フィルターとレポート」 の値を 0.01 から 必要な FDR に変更します。
注: デフォルトの FragPipe 設定では、タンパク質レベルで 1% FDR が保証されます。 - 「 MSfragger」 タブをクリックします。 [ピークマッチング] ボックス内で、 前駆体の質量許容誤差 をデフォルトの500Daから 2,000Da に増やして、大きな変化を識別できるようにします(図2A)。
- 「 実行 」タブをクリックし、FragPipe の出力場所を定義します。「 実行 」ボタンをクリックして検索を開始します。
- データセット間で識別されたPSM(FragPipeからのpsm.tsv出力に含まれる)を使用して、データセット内で観察されたデルタ質量の頻度をプロットすることによって、潜在的なグリカンを特定します(図3)。PRIDEアクセッションPXD027820を介してアクセス可能なRスクリプトを使用して、MSfragger出力からデルタ質量プロットを作成します。
メモ: これらのスクリプトの主な目的はデルタマスプロファイルの視覚化を支援することであるため、これらのスクリプト内では、開いている検索結果の最小限の後処理が行われます。重要なことに、デルタ塊をグリカンとして割り当てるには、対応するMS2事象のさらなる分析が必要であるため、豊富なデルタ塊の観察のみは修飾が潜在的なグリカンであることを証明しない。 - サンプル内の糖ペプチドの特性評価を可能にするために、高いハイパースコアを持つ割り当てに対応する、信頼性の高いデルタ質量同定に焦点を当てます。
- 糖ペプチドスペクトルの評価を支援するには、Interactive Peptide Spectrum Annotator63などのペプチド注釈ツールを使用して、スペクトル内のペプチド関連イオンの割り当てを可能にし、グリカン関連イオンの手動同定を可能にします(図4)。
注:ここに示したデータセット内では、>30のハイパースコアは、同定されたすべての糖ペプチドの上位50%以内のスコアに対応するため、高スコアリングと見なされます(図5)。
- 糖ペプチドスペクトルの評価を支援するには、Interactive Peptide Spectrum Annotator63などのペプチド注釈ツールを使用して、スペクトル内のペプチド関連イオンの割り当てを可能にし、グリカン関連イオンの手動同定を可能にします(図4)。
- 信頼性の高い糖ペプチドを割り当てたら、一般的に観察されるグリカン関連イオンを同定し(図4)、糖ペプチドの同定を改善します。
注:グリカン中心検索として知られる検索内にグリカン関連イオンを組み込むことにより、糖ペプチド割り当ての品質を向上させることができる。- FragPipeの MSfragger タブをクリックし、観察されたグリカンの決定されたデルタ質量を 変数修正 セクションと 質量オフセット セクションに組み込みます。これらの質量を追加するには、[ 変数の変更] セクションと [質量オフセット] セクションに値を入力し、個々の質量を/で区切 って追加します。これらのグリカンのグリカン関連フラグメント塊をMSFraggerの グリコ/ラビールモッズ セクションに追加します。
注: 図2B は、 A. baumannii 株AB307-0294のグリカンに焦点を当てた探索に必要な重要な情報を概説している。
- FragPipeの MSfragger タブをクリックし、観察されたグリカンの決定されたデルタ質量を 変数修正 セクションと 質量オフセット セクションに組み込みます。これらの質量を追加するには、[ 変数の変更] セクションと [質量オフセット] セクションに値を入力し、個々の質量を/で区切 って追加します。これらのグリカンのグリカン関連フラグメント塊をMSFraggerの グリコ/ラビールモッズ セクションに追加します。
- プロテオミクス研究に関連するすべてのMSデータを、PRIDEやMASSIVE リポジトリなどの一元化されたプロテオミクスリポジトリにアップロードします。
注:この研究に関連するすべてのデータはPRIDEプロテオミクスリポジトリに寄託されており、PRIDEアクセッション(PXD027820)を介してアクセスできます。
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Representative Results
細菌糖ペプチド分析のためのオープン検索の有用性を例示するために、A. baumannii-AB307-0294、ACICU、およびD1279779-の3つの株におけるO結合型グリカンの化学的多様性を評価した。O結合型グリコプロテオームは、グリコシル化に使用されるグリカンが高度に可変のカプセル遺伝子座44、45、46に由来するため、A.バウマンニ株間で高度に可変である。この化学的多様性により、A. baumanniiはオープンサーチ研究に理想的なモデルシステムとなっています。3つの菌株のグリコプロテオームはこれまで評価されていないが、これらの株のうちの2つ、AB307-029464およびACICU65のカプセル構造は公知であり、D1279779のカプセルはまだ解明されていない。
AB307-0294のカプセルと一致して、AB307-0294のオープン検索は、648.25Daおよび692.28Daに対応する2つの支配的なデルタ塊を明らかにした(図3A)。これらの塊は、Russoらによって以前に決定されたカプセル構造、-β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcAと一致し、ここでQuiNAc4NR残基は2,4-ジアミノ-2,4,6-トリデオキシグルコースに相当し、3-OH-ブチレートまたはアセチル基64のいずれかで修飾されている。同様に、ACICUカプセルは、以前にPse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc-として同定された4糖K-単位から構成されることが知られており、843.31Da65の予測質量に対応する。このカプセル構造は、ACICUデータ内で最も頻繁に観察されたデルタ質量と一致する(図3B)。最後に、株D1279779のオープンサーチ分析により、203.08、794.31、および1588.62Daと一致する複数のデルタ質量の存在が明らかになった(図3C)。質量203.08は単一のHexNAc残基の質量と一致するが、794.31および1588.62は未知の修飾に対応する。質量1588.62は794.31のちょうど2倍であり、これらのペプチドが他のアシネトバクターグリコプロテオーム30、44、46内で以前に観察されたように、グリカンK単位二量体で装飾されていることを示唆していることに留意すべきである。
デルタ質量プロットは、サンプル内で観察された修飾の頻度を評価するための迅速かつ効果的な方法を提供します。しかしながら、グリカンのような複雑な修飾の場合、デルタ質量の存在だけでは、グリカンの正確な組成を定義する情報は提供されない。グリカン組成の決定を支援するために、特定のデルタ質量に割り当てられたPSMの結果のMS/MSデータを使用することができる。(高ハイパースコアのPSMに対応するMSFraggerでは)高信頼糖ペプチド割り当てに焦点を当てることにより、手動分析を使用して、タンパク質グリコシル化のための株によって利用されるグリカンをさらに特徴付けることができる。高信頼ペプチド割り当ては、典型的には、Yイオンに基づくグリカン組成物の決定を可能にする堅牢なグリカン情報を含むことに留意されたい。この情報は、グリカンがペプチドに結合したままの対応する断片、ならびにグリカン66の割り当てに有用なBおよびオキソニウム関連イオンを同定するために使用することができる。グリカン組成物を割り当てる方法に関する詳細なガイドラインは以前に概説されており、読者はHarveyら67を参照することが推奨される。Interactive Peptide Spectral Annotator63などのツールを使用して、ペプチド関連イオンを容易に同定することができ、ユーザーはペプチドに結合したグリカンの同一性を決定することができる。
Interactive Peptide Spectrum Annotatorを用いて、これら3つの A. baumannii サンプルにわたって同定された糖ペプチドを評価し、潜在的なグリカン関連イオンを明らかにした。グリカン648.25および692.28Daで装飾されたAB307-0294糖ペプチドSAGDQAASDIATATDNASAKのMS/MSスペクトルを考えてみましょう(図4A、B)。これらのPSM内のグリカンイオンの分析により、これらの糖ペプチドについて観察されるデルタ質量は、dHexNAcNAc(228Da)、dHexNAcNBu(272Da)、HexNAcA(217Da)、およびHexNAc(203Da)の4つの異なる炭水化物を含む三糖に対応することが確認できる。グリカン断片を割り当てる場合、複数の単糖はCIDを用いて断片化すると水分を失う傾向があることに留意すべきである。これはACICUのグリカンに見られ、単糖Pse5Ac7Ac(316Da)は2つの顕著なグリカン関連フラグメントの生成につながります:MH+ 299.12および317.13、水の質量(18.01Da)に対応する質量の差(図4C)。
また、細菌の糖鎖を分析する場合、真核生物内では観察されない糖に対応する予期せぬ単糖塊を観察することが一般的である。この例は、D1279779の糖ペプチドPSM内で見ることができ、そこでは、最も頻度の高いデルタ質量794.31Daの分析により、A. baumannii O結合型グリカン44内で以前に観察された異常な単糖dHexNAc(187Da、188.09のMH+として観察される、図4D)の存在が明らかになる。高い質量精度の測定と、ペプチド骨格から失われる不安定な修飾としてのグリカンの特徴的な挙動は、グリカンの潜在的な化学組成の決定に役立つ可能性がありますが、MSデータの過剰解釈を最小限に抑えることをお勧めします。特定の糖の立体化学またはグリカンの連鎖情報が不明な場合、単糖をそれらの特定のクラスによって参照することを含む、構造的にアゴニスト的割り当てを使用することがベストプラクティスである。この例は、203.08Da残基をN-アセチルヘキソサミン(HexNAc)として参照し、連鎖型の割り当てを回避することである。必要に応じて、核磁気共鳴(NMR)の使用など、未知の修飾の正確な化学的同一性を定義するために追加の技術を利用することが推奨される。
オープン検索アプローチは修飾ペプチドの迅速な同定を可能にしますが、この検索アプローチはデータセット内の潜在的な糖ペプチドを見落とす可能性があることに注意することが重要です。オープン検索では、糖ペプチドは、不十分なペプチド断片化情報またはMS2イベント内に複数の未割り当てイオンが存在することによる割り当てられたペプチドのペナルティ化を含むいくつかの理由で同定されない可能性がある。後者は、これらのスペクトルがデフォルトでオープン検索パラメータとは見なされないグリカン関連フラグメントを含む可能性があるため、細菌糖ペプチドPSMに特に当てはまる。比類のない特徴はPSMのスコアリングに悪影響を及ぼすため、MS/MSスペクトル内の不一致イオンを最小限に抑えることで、FDR制御の最小スコア閾値のために最初に除外された糖ペプチドの同定が可能になります。この制限を克服するために、オープン検索(図3)および手動で定義されたグリカン関連イオン(図4)から定義された質量を検索パラメータに組み込んで、糖ペプチドの同定を改善することができる。これらのグリカン関連イオンは、グリカンのde novo決定、一般的なオキソニウムイオン44,68の事前知識、またはSPectralイモニウムイオン検出ツール69,76などのスペクトル内で再発するイオンを捕捉できるツールの使用に基づいて手動で識別できることに注意することが重要です。
これを実証するために、オープンサーチ分析によって同定された非定型グリカン断片の塊をMSFraggerの検索パラメータに組み込み、グリカンに焦点を当てた検索を行った(株AB307-0294のグリカンに焦点を当てた設定を図2Bに示す)。複数のグリカンが一緒に検索される場合、Yイオンおよび診断質量の選択には注意が必要であり、各デルタ質量に関連するフラグメントイオンを正確に反映するように注意すべきである。AB307-0294の648.25および692.28グリカンの断片(図4A,B)など、相互に排他的なYと診断塊の組み合わせでは、これは常に可能ではないかもしれませんが、グリカンに焦点を当てた検索は依然として可能ですが、これは検索結果の堅牢性に影響を与える可能性があります。グリカンに焦点をあてた検索は、3つのA. baumannii株すべてにわたって同定された糖ペプチドPSMの総数の顕著な増加をもたらし、ACICUの37%の増加、AB307-0294の117%の増加、およびD1279779の363%の増加に対応する(図5A-C)。個々のMS事象について、グリカン特異的情報を含めると、典型的には、観察されたハイパースコア内での増加をもたらすが、この増加はグリカン依存性が高い(図5D、E)。このように、オープンサーチによって明らかになったグリカンの塊を用いて探索パラメータを精緻化し、続いて手動でキュレーションしたグリカン断片情報を標的探索に組み込むことにより、サンプル中の糖ペプチドのより詳細な分析を得ることができる。
図1:細菌性糖ペプチドの調製および分析における重要なステップの概要。 細菌の糖ペプチドの同定が成功するかどうかは、糖ペプチドを含む高品質のサンプルの生成にかかっています。次に、糖ペプチド含有サンプルをLC-MSによって分析し、続いて、オープン検索アプローチを使用して、固有のデルタ質量に基づいて潜在的な糖ペプチドを同定する。手動キュレーションを使用して、これらのデルタ塊はグリカンとして識別することができる。最後に、糖ペプチドの同定を改善するために、グリカン情報をグリカンに焦点を当てたデータベース検索に組み込むことができる。略語: LC-MS = 質量分析に結合された液体クロマトグラフィー;OD = 光学密度;SDB-RPS = スチレンジビニルベンゼン逆相スルホネート;ZIC-HILIC = 双性イオン親水性相互作用液体クロマトグラフィー;PSM = ペプチドスペクトル一致;CID = 衝突誘発解離;ETD = 電子移動解離。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: FragPipe でオープン検索とグリカン中心検索を有効にする方法の概要。(A) オープン検索を有効にするには、FragPipe の [ワークフロー] タブで [ワークフローを開く] をロードします。サイズが 500 Da を超えるグリカンの同定を可能にするには、[前駆体質量許容度] ウィンドウを 2,000 Da に増やします。(B) グリカンに重点を置いた非定型グリカンの検索では、MSFragger タブにグリカン情報を入力して、予想される修飾の質量 (「可変修飾」および「質量オフセット」セクション)、これらのグリカンに関連する Y イオン (Glyco/Labile の Y イオン質量リスト内) を定義する必要があります。 セクション)、および低質量グリカンフラグメントイオン(グリコ/不安定セクションの診断フラグメント質量リストへ)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アシネトバクター・バウマンニ(AB307-0294、ACICU、およびD1279779)の3つの菌株についてのオープン検索結果のデルタ質量プロット。 カプセル遺伝子座の多様性と一致して、各A. baumannii株は、観察されたデルタ質量によって示される、サイズが140Daを超える顕著な改変を有するユニークなデルタ質量プロファイルを有する。(a)AB307-0294デルタ質量プロット内で、質量648.25および692.28は、-β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-と一致する修飾に対応し、ここで、QuiNAc4NRは3-OH-酪酸またはアセチル基64のいずれかで修飾される。(B)ACICUデルタ質量プロット内では、質量203.08および843.31は、HexNAcおよびPse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Galp-β-D-Gal p-NAcと一致する修飾に対応する。(C) D1279779デルタ質量プロット内では、質量203.08、794.31、および1588.62は、HexNAc、HexNAc-217-187-187、およびHexNAc-217-187-187の二量体に対応する。デルタ塊を手動で評価し、*で表記したグリカンであることを図4で確認した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:アシネトバクター・バウマンニの3つの菌株にわたって観察されたデルタ塊のMS/MS特性評価。(A, B) AB307-0294、(C)ACICU、および(D)D1279779。相互作用性ペプチドスペクトルアノテーター支援アノテーションスペクトル代表的な糖ペプチドの注釈付きスペクトル。各スペクトルについて、ペプチド断片イオンは青と赤で示され、手動で割り当てられたグリカン関連イオンは緑で示されます。グリカンは、HexNAcが正方形、Hexが円、および非定型単糖が台形として表され、グリカンの質量が台形として表されるグリカンのシンボル命名法を使用して注釈が付けられている。略語: MS/MS = タンデム質量分析。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:オープン対グリカン焦点検索を用いたアシネトバクター・バウマンニの株間で同定された糖ペプチドの比較。 (A-C)オープン検索とグリカン中心検索を使用したD1279779、ACICU、およびAB307-0294内のハイパースコアとPSM割り当て数の比較。(D-F)D1279779、ACICU、およびAB307-0294に対するオープンおよびグリカン焦点検索を用いた同じペプチド配列に割り当てられた個々のMS2イベントの比較。略語: PSM = ペプチドスペクトル一致。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| A. バウマンニ 株 | Uniprot Proteome ID |
| AB307-0294 15 | UP000006924 |
| アシキュ 47,48 | UP000008839 |
| D1279779 49 | UP000011860 |
表 1.この研究で使用した株およびユニプロトプロテオームID。
| バッファ名 | 緩衝液組成/pH | |
| バッファ A* | 2%アセトニトリル中18.2MΩ H2O、0.1%トリフルロ酢酸/pH1.0 | |
| ティッカー | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mMNa2HPO 4, および 2 mM KH2PO 4 / pH7.4 | |
| 還元/アルキル化バッファー | 100 mM トリス 2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩、400 mM 2-クロロアセトアミド 1 M トリス/pH 7. | |
| SDB-RPS ステージチップ溶出バッファー | 5%水酸化アンモニウム、80%アセトニトリル中/pH11 | |
| SDB-RPS ステージ ヒント エクイリブレーション バッファー | 30%メタノール、1%トリフルロ酢酸、18.2MΩH2O/pH中 1. | |
| SDB-RPS ステージチップ エクイティレーション/ウォッシュ バッファー | 90%イソプロパノール、1%トリフルロ酢酸/pH1. | |
| SDB-RPS ステージ チップ洗浄バッファー | 1%トリフルロ酢酸中18.2MΩH2O/pH1. | |
| SDC 溶解バッファー | 4% SDC 100 mM トリス / pH 8.5 | |
| ZIC-HILIC 溶出バッファー | 0.1% トリフルロ酢酸中 18.2 MΩH2O/pH 1.0 | |
| ZIC-HILIC ローディング/ウォッシュバッファ | 80%アセトニトリル、1%トリフルロ酢酸中18.2MΩH2O/pH1. | |
| ZIC-HILIC 調製バッファー | 95%アセトニトリル中18.2MΩH2O/pH 7. | |
表2:本試験で使用した緩衝液の組成。
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Discussion
オープン検索は、未知の修飾を識別するための効果的かつ体系的な方法です。細菌プロテオームサンプル中の未知のグリカンの同定は、伝統的に時間がかかり、技術的に専門的な作業であったが、MSfragger21,41およびByonic31,38などのツールの最近の開発により、ペプチドに結合した潜在的なグリカンとしてさらなる特性評価のためのデルタ塊の迅速かつ効果的な同定が可能になった。標準プロテオームサンプルと糖ペプチド富化プロテオームサンプルの両方をオープンサーチすることで、潜在的な糖ペプチドを同定できます(図1)。多くの細菌系のプロテオーム内の糖ペプチドの共通性と豊富さは、糖ペプチド濃縮なしでこれらの修飾の直接検出を可能にする6。糖ペプチド富化アプローチは、典型的には、多くのグリコシル化系70について非濃縮ベースの方法を依然として凌駕するが、すべてのグリカンが濃縮に等しく従順であるわけではないことは注目に値する71、72。この事実は、所与の生物学的試料のオープン検索を用いてグリコシル化事象を同定するための最も適切なアプローチを決定する際に考慮されるべきである。
オープン検索は、サンプル内で高い頻度で観察されたグリカンを効果的に識別しますが、データセット内でめったに発生しないグリコシル化イベントを特定するのには効果がありません。実際には、グリカンのユニークなデルタ質量が同定されるためには、同一のデルタ質量を有する少なくとも10個のPSMがサンプル内に存在しなければならない。この最小周波数により、潜在的なグリカンをバックグラウンドデルタ質量割り当てよりも区別することができます(図3)。この基準は、典型的には、グリコシル化のために複数の基質を標的とする一般的なグリコシル化系によって満たされるが、単一のタンパク質がグリコシル化のために標的とされるシステムは、このアプローチにあまり従順ではない可能性がある。MS機器の速度と感度が向上するにつれて、希少/低豊富グリコフォームに対して十分な品質スペクトルを生成できる場合、これはますます存在量の少ない糖ペプチド集団の評価を可能にし、その結果、オープン検索アプローチの有効性を高める可能性があります。
MSは新規グリカンの効果的な同定を可能にしますが、この洞察だけで糖ペプチド/グリカンの完全な構造特性評価を提供することはめったになく、NMR分光法などのツールが完全なグリカン特性評価に依然として重要であることに注意することが重要です。ここで観察されるように、MSは、A. baumannii ACICUおよびAB307-029464、65の単離カプセルからNMRを用いて以前に決定されたK単位の相補的な確認を提供した。しかし、D1279779で同定された主要糖鎖については、このグリカン内の単糖の推定クラスに関する情報のみが割り当て可能であり、MSはこれらの糖単位の連鎖型または立体化学に関する情報を提供しなかった(図4)。紫外線光解離73,74などの新しいMSフラグメンテーション法がより広く利用可能になるにつれて、糖ペプチドのより詳細な構造特性評価が可能になる可能性がある。ただし、現在のインストゥルメンテーションとのリンケージや立体化学情報を推測する場合は注意が必要です。これらの考慮事項に加えて、オープン検索75に対するFDRベースのコントロールの妥当性について最近疑問が提起されている。したがって、オープン検索は強力なアプローチであるが、これらの考慮事項は、オープン検索情報のみに基づくグリカン割り当ての解釈に注意が必要であることを強調する。
この研究は、オープンサーチが細菌のグリコシル化に使用されるグリカンの教師なし同定のための効果的なアプローチであることを実証しているが、オープンサーチのみでは、サンプル内に含まれるすべての糖ペプチドのサブセットのみへのアクセスを提供する。グリカンの不安定な性質のために、糖ペプチドPSMは、典型的には、考慮されなければ、PSMのスコアリングに悪影響を及ぼすであろう多様な範囲のグリカン関連断片を含む。この問題を克服し、糖ペプチドのより詳細な同定を可能にするために、オープン検索によって得られたグリカン情報は、その後、グリカンに焦点を当てた検索に情報を提供するために使用することができる(図2B)。このようにして、オープン検索は、グリカン関連フラグメントの手動決定と相まって、サンプル内で割り当てられた糖ペプチドの質と量を改善するために使用することができます(図5)。糖ペプチド検索パラメータの改良は、MSfraggerなどの現在のバージョンのツールで手動で行われますが、フィールドが成熟するにつれて、これらのステップは自動化された方法で実行される可能性があります。研究は、特定のPTMに関連する繰り返し低分子量イオンを同定するための計算アプローチ69、ならびに未知の糖ペプチドに関連するオキソニウムイオンおよび繰り返しYイオン塊を同定するための戦略をすでに実証している76。したがって、これらのステップは、FragPipeなどのツールの新しい反復に組み込まれる可能性が高く、細菌および真核生物サンプル内のこれまで知られていなかったグリコシル化事象の同定がさらに容易になる。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
N.E.S.は、Australian Research Council Future Fellowship(FT200100270)とARC Discovery Project Grant(DP210100362)の支援を受けています。我々は、MS機器へのアクセスについて、Bio21分子科学バイオテクノロジー研究所のメルボルン質量分析およびプロテオミクス施設に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 G Kel-F Hub point style 3 | Hamilton company | hanc90514 | |
| 2-Chloroacetamide | Sigma Aldrich Pty Ltd | C0267-100G | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich Pty Ltd | 34851-4L | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 338818-100ML | |
| BCA Protein Assay Reagent A | Pierce | 23228 | |
| BCA Protein Assay Reagent B | Pierce | 23224 | |
| C8 Empore SPE | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66882-U | An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Formic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 5.33002 | |
| Isopropanol | Sigma Aldrich Pty Ltd | 650447-2.5L | |
| Methanol | Fisher Chemical | M/4058/17 | |
| SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66886-U | An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich Pty Ltd | D6750-100G | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 2232000083 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 302031-10X1ML | |
| Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | C4706-2G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich Pty Ltd | 252859-500G | |
| Trypsin/Lys-C protease mixture | Promega | V5073 | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810040 | |
| ZIC-HILIC material | Merck | 1504580001 | Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin |
References
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