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Biochemistry

Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides की पहचान के लिए ओपन सर्च-आधारित दृष्टिकोण का अनुप्रयोग

Published: November 2, 2021 doi: 10.3791/63242
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

खुली खोज पहले से अज्ञात ग्लाइकन रचनाओं के साथ सजाए गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान को सक्षम बनाती है। इस लेख के भीतर, खुले खोज और बाद में ग्लाइकन-केंद्रित ग्लाइकोपेप्टाइड खोजों के उपक्रम के लिए एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण एक मॉडल के रूप में एसिनेटोबैक्टर बौमनी का उपयोग करके बैक्टीरिया के नमूनों के लिए प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन को तेजी से जीवाणु जीवों के भीतर एक सामान्य संशोधन के रूप में पहचाना जाता है, जो प्रोकैरियोटिक फिजियोलॉजी और रोगजनक प्रजातियों की इष्टतम संक्रामकता में योगदान देता है। इस वजह से, बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन की विशेषता में रुचि बढ़ रही है और इन घटनाओं की पहचान करने के लिए उच्च-थ्रूपुट विश्लेषणात्मक उपकरणों की आवश्यकता है। हालांकि बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स आसानी से समृद्ध ग्लाइकोपेप्टाइड डेटा की पीढ़ी को सक्षम बनाता है, प्रोकैरियोटिक प्रजातियों में देखे गए ग्लाइकन की चौड़ाई और विविधता बैक्टीरिया ग्लाइकोसिलेशन की घटनाओं की पहचान को बेहद चुनौतीपूर्ण बनाती है।

परंपरागत रूप से, बैक्टीरियल प्रोटिओमिक डेटासेट के भीतर ग्लाइकन रचनाओं के मैनुअल निर्धारण ने इसे क्षेत्र-विशिष्ट विशेषज्ञों तक सीमित एक बड़े पैमाने पर बेस्पोक विश्लेषण बना दिया। हाल ही में, खुले खोज-आधारित दृष्टिकोण अज्ञात संशोधनों की पहचान के लिए एक शक्तिशाली विकल्प के रूप में उभरे हैं। पेप्टाइड अनुक्रमों पर देखे गए अद्वितीय संशोधनों की आवृत्ति का विश्लेषण करके, खुली खोज तकनीकें जटिल नमूनों के भीतर पेप्टाइड्स से जुड़े सामान्य ग्लाइकन की पहचान की अनुमति देती हैं। यह लेख ग्लाइकोप्रोटिओमिक डेटा की व्याख्या और विश्लेषण के लिए एक सुव्यवस्थित वर्कफ़्लो प्रस्तुत करता है, यह दर्शाता है कि ग्लाइकन रचनाओं के पूर्व ज्ञान के बिना जीवाणु ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए खुली खोज तकनीकों का उपयोग कैसे किया जा सकता है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, नमूनों के भीतर ग्लाइकोपेप्टाइड्स को ग्लाइकोसिलेशन मतभेदों को समझने के लिए तेजी से पहचाना जा सकता है। एक मॉडल के रूप में Acinetobacter baumannii का उपयोग करते हुए, ये दृष्टिकोण उपभेदों और उपन्यास ग्लाइकोप्रोटीन की पहचान के बीच ग्लाइकन रचनाओं की तुलना को सक्षम करते हैं। एक साथ लिया गया, यह काम बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन की पहचान के लिए खुले डेटाबेस-खोज तकनीकों की बहुमुखी प्रतिभा को दर्शाता है, जिससे इन अत्यधिक विविध ग्लाइकोप्रोटियोम के लक्षण वर्णन पहले से कहीं अधिक आसान हो जाते हैं।

Introduction

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन, प्रोटीन अणुओं के लिए कार्बोहाइड्रेट संलग्न करने की प्रक्रिया, प्रकृति में सबसे आम पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) में से एक है 1,2। जीवन के सभी डोमेन में, जटिल मशीनरी की एक श्रृंखला ग्लाइकोप्रोटीन की पीढ़ी के लिए समर्पित विकसित हुई है जो सेलुलर कार्यों के असंख्य को प्रभावित करतीहै 1,3,4,5। जबकि प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन अमीनो एसिड 6,7 की एक श्रृंखला पर होता है, एन-लिंक्ड और ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन घटनाएं प्रकृति में देखे जाने वाले दो प्रमुख रूप हैं। एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन में शतावरी (एएसएन) अवशेषों के नाइट्रोजन परमाणु के लिए ग्लाइकन का लगाव शामिल है, जबकि ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन में, ग्लाइकन सेरीन (सेर), थ्रेओनिन (थ्र), या टायरोसिन (टायर) अवशेषोंके ऑक्सीजन परमाणु से जुड़े होते हैं। ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम द्वारा लक्षित अवशेषों में समानता के बावजूद, प्रोटीन से जुड़े ग्लाइकन के भीतर के अंतर के परिणामस्वरूप ग्लाइकोसिलेशन प्रकृति में पाए जाने वाले पीटीएम का सबसे रासायनिक रूप से विविध वर्ग है।

जबकि यूकेरियोटिक ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम में ग्लाइकन विविधता होती है, ये प्रणालियां आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अद्वितीय कार्बोहाइड्रेट की संख्या में प्रतिबंधित होती हैं। परिणामी विविधता इस बात से उपजी है कि इन कार्बोहाइड्रेट को ग्लाइकन 8,9,10,11,12 में कैसे व्यवस्थित किया जाता है। इसके विपरीत, बैक्टीरियल और आर्कियल प्रजातियों में इन प्रणालियों के भीतर उत्पन्न अद्वितीय शर्करा की सरासर सरणी के कारण लगभग असीमित ग्लाइकन विविधता होती है 2,10,13,14,15,16,17। जीवन के डोमेन में देखे गए ग्लाइकन विविधता में ये अंतर ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं के लक्षण वर्णन और पहचान के लिए एक महत्वपूर्ण विश्लेषणात्मक चुनौती का प्रतिनिधित्व करते हैं। यूकेरियोटिक ग्लाइकोसिलेशन के लिए, ग्लाइकन रचनाओं का अनुमान लगाने की क्षमता ने ग्लाइकोबायोलॉजी में बढ़ती रुचि को सुविधाजनक बनाया है; फिर भी, बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन के लिए भी यही सच नहीं है, जो अभी भी विशेष प्रयोगशालाओं द्वारा अध्ययन करने के लिए काफी हद तक प्रतिबंधित है। जैसा कि बायोसाइंसेज में मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) इंस्ट्रूमेंटेशन की पहुंच में वृद्धि हुई है, एमएस-आधारित दृष्टिकोण अब ग्लाइकोप्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्राथमिक विधि हैं।

एमएस ग्लाइकोसिलेशन के लक्षण वर्णन के लिए उत्कृष्ट उपकरण के रूप में उभरा है, जिसमें ऊपर-नीचे और नीचे-ऊपर दोनों दृष्टिकोण अब आमतौर पर ग्लाइकोप्रोटीन 6 को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जातेहैं। जबकि टॉप-डाउन प्रोटिओमिक्स का उपयोग विशिष्ट प्रोटीन18,19 के वैश्विक ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न का आकलन करने के लिए किया जाता है, बॉटम-अप दृष्टिकोण का उपयोग ग्लाइकोपेप्टाइड्स के ग्लाइकन-विशिष्ट लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए किया जाता है, यहां तक कि जटिल मिश्रण 6,20,21,22,23 से भी। ग्लाइकोपेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए, सूचनात्मक विखंडन जानकारी की पीढ़ी ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं24,25 के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक है। विखंडन दृष्टिकोण की एक श्रृंखला अब उपकरणों पर नियमित रूप से सुलभ है, जिसमें अनुनाद आयन ट्रैप-आधारित टक्कर-प्रेरित पृथक्करण (आईटी-सीआईडी), बीम-प्रकार के टकराव-प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी), और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण पृथक्करण (ईटीडी) शामिल हैं। प्रत्येक दृष्टिकोण में ग्लाइकोपेप्टाइड विश्लेषण25,26 के लिए अलग-अलग ताकत और कमजोरियां हैं, पिछले दशक में ग्लाइकोसिलेशन 6,20 का विश्लेषण करने के लिए इन विखंडन दृष्टिकोणों को लागू करने में महत्वपूर्ण प्रगति के साथ। हालांकि, बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन विश्लेषण के लिए, महत्वपूर्ण सीमा ग्लाइकोपेप्टाइड्स को टुकड़े करने की क्षमता नहीं है, बल्कि नमूनों के भीतर संभावित ग्लाइकन रचनाओं की भविष्यवाणी करने में असमर्थता है। इन प्रणालियों के भीतर, विविध बैक्टीरियल ग्लाइकन की अज्ञात प्रकृति ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान को सीमित करती है, यहां तक कि ग्लाइकोसिलेशन-केंद्रित खोज उपकरणों के साथ भी अब यूकेरियोटिक ग्लाइकोपेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए आम है, जैसे कि ओ-पेयर27, ग्लाइकोपेप्टाइडग्राफएमएस28, और ग्लाइक्रेसॉफ्ट29। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, एक वैकल्पिक खोज विधि की आवश्यकता होती है, जिसमें खुले खोज उपकरणों का उपयोग बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन30 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण के रूप में उभरता है।

खुली खोज, जिसे अंधा या वाइल्डकार्ड खोज के रूप में भी जाना जाता है, अज्ञात या अप्रत्याशित पीटीएम21,30,31,32 के साथ पेप्टाइड्स की पहचान की अनुमति देता है। खुली खोजें विभिन्न प्रकार की कम्प्यूटेशनल तकनीकों का उपयोग करती हैं, जिनमें क्यूरेटेड संशोधन खोजें, मल्टीस्टेप डेटाबेस खोजें, या व्यापक-द्रव्यमान सहिष्णु खोज 33,34,35,36,37 शामिल हैं। यद्यपि खुली खोज में बड़ी क्षमता है, इसके उपयोग को आमतौर पर विश्लेषण के समय में महत्वपूर्ण वृद्धि और प्रतिबंधितखोजों 31,32 की तुलना में असंशोधित पेप्टाइड्स का पता लगाने की संवेदनशीलता में नुकसान से बाधित किया गया है। असंशोधित पेप्टाइड-स्पेक्ट्रल मैचों (PSMs) का पता लगाने में कमी इन तकनीकों से जुड़ी झूठी-सकारात्मक PSM दरों में वृद्धि का एक परिणाम है, जिसके लिए वांछित झूठी खोज दरों (FDRs) को बनाए रखने के लिए कड़े फ़िल्टरिंग में वृद्धि की आवश्यकता होती है 33,34,35,36,37 . हाल ही में, कई उपकरण उपलब्ध हो गए हैं जो ओपन सर्चिंग की पहुंच में काफी सुधार करते हैं, जिनमें बायोनिक31,38, ओपन-पीफाइंड39, एएनएन-सोलो40 और एमएसफ्रेगर21,41 शामिल हैं। ये उपकरण विश्लेषण समय को काफी कम करके और विषम ग्लाइकन रचनाओं को संभालने के लिए दृष्टिकोण को लागू करके ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं की मजबूत पहचान को सक्षम करते हैं।

यह लेख एक मॉडल के रूप में ग्राम-नकारात्मक nosocomial रोगज़नक़, Acinetobacter baumannii का उपयोग करके खुली खोज द्वारा बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान के लिए एक सुव्यवस्थित विधि प्रस्तुत करता है। A. baumannii के पास एक संरक्षित O-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम है जो कई प्रोटीन सब्सट्रेट्स के संशोधन के लिए जिम्मेदार है, जिसे PglL प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम 42,43,44 के रूप में जाना जाता है। जबकि इसी तरह के प्रोटीन उपभेदों के बीच ग्लाइकोसिलेशन के लिए लक्षित हैं, पीजीएल ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लाइकन के जैवसंश्लेषण के कारण अत्यधिक परिवर्तनशील है, जो कैप्सूल लोकस (के-लोकस के रूप में जाना जाता है) 44,45,46 से व्युत्पन्न किया जा रहा है। इसके परिणामस्वरूप विविध ग्लाइकन (जिसे के-यूनिट के रूप में भी जाना जाता है), एकल या सीमित पॉलिमराइज्ड के-इकाइयों से व्युत्पन्न होता है, जिसे प्रोटीन सब्सट्रेट्स 30,44,46 में जोड़ा जाता है। इस काम के भीतर, खुले खोज उपकरण का उपयोग, MSfragger, सॉफ्टवेयर FragPipe के भीतर, A. baumannii उपभेदों भर में glycans की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है। खुली खोज और मैनुअल क्यूरेशन के संयोजन से, "ग्लाइकन-केंद्रित खोजों" को बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान में और सुधार करने के लिए किया जा सकता है। साथ में, यह मल्टीस्टेप पहचान दृष्टिकोण उपन्यास ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं के लक्षण वर्णन में व्यापक अनुभव के बिना ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान को सक्षम बनाता है।

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Protocol

नोट: बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड नमूनों की तैयारी और विश्लेषण को चार वर्गों में विभाजित किया जा सकता है (चित्रा 1)। इस अध्ययन के लिए, तीन अनुक्रमित ए. बौमनी उपभेदों के ग्लाइकोसिलेशन का मूल्यांकन किया गया था (तालिका 1)। इन उपभेदों में से प्रत्येक के Proteome FASTA डेटाबेस Uniprot के माध्यम से सुलभ हैं। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स की संरचना के लिए तालिका 2 देखें.

1. प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए प्रोटीन के नमूनों की तैयारी

  1. ब्याज के proteome नमूनों का अलगाव
    1. यदि पूरी कोशिकाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को मीडिया में मौजूद संभावित प्रोटीन संदूषकों को हटाने के लिए फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा समाधान (पीबीएस) के साथ धोया गया है। धोने के बाद पूरी कोशिकाओं को स्नैप-फ्रीज करें और उन्हें आवश्यक होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. यदि fractionated नमूनों का उपयोग किया जाता है (जैसे झिल्ली तैयारी), तो सुनिश्चित करें कि उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक डाउनस्ट्रीम तरल क्रोमैटोग्राफी एमएस (एलसी-एमएस) विश्लेषण50 के साथ हस्तक्षेप नहीं करेंगे।
    3. यदि डिटर्जेंट, जैसे सोडियम डोडेसिल-सल्फेट (एसडीएस), ट्राइटन एक्स -100, एनपी -40, या लॉरॉयलसरकोसिन का उपयोग किया गया है, तो एसीटोन वर्षा, एसपी 3 नमूना तैयारीविधियों 51, या वाणिज्यिक प्रोटिओमिक क्लीन-अप कॉलम जैसे एस-ट्रैप52 का उपयोग करके इन डिटर्जेंट को हटा दें। वैकल्पिक रूप से, एक एमएस-संगत या हटाने योग्य डिटर्जेंट जैसे सोडियम डीऑक्सीकोलेट (एसडीसी) या ऑक्टिल ग्लूकोपाइरानोसाइड के साथ असंगत डिटर्जेंट को प्रतिस्थापित करें।
    4. सुनिश्चित करें कि नमूना तैयारी के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी प्लास्टिकवेयर और ग्लासवेयर को ऑटोक्लेव नहीं किया गया है। ऑटोक्लेव्ड ग्लासवेयर और प्लास्टिक आमतौर पर छोटे आणविक भार यौगिकों से भारी दूषित होते हैं, जैसे कि पॉलिमर, जो एमएस के भीतर आसानी से पता लगाए जाते हैं।
  2. पूरे सेल के नमूनों का घुलनशीलता
    1. Resuspend ~ 10 मिलीग्राम धोया, स्नैप-जमे हुए कोशिकाओं में 200 μL ताजा तैयार सोडियम deoxycholate लाइसिस बफर (SDC lysis बफर: 100 mM Tris, पीएच 8.5 में 4% SDC).
      नोट:: प्रोटीन क्षरण को सीमित करने के लिए प्रोटीज अवरोधकों को SDC lysis बफर में जोड़ा जा सकता है।
    2. मिलाते हुए (थर्मोमिक्सर पर 2000 आरपीएम) के साथ 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूनों को उबालें, और फिर 10 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें। नमूनों के कुशल लाइसिस और घुलनशीलता को सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
      नोट: नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर इस बिंदु पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है। यदि संग्रहीत किया जाता है, तो आगे के प्रसंस्करण से पहले 95 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग करके पुन: समेकन करें।
  3. एक bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख53 का उपयोग कर नमूना प्रोटीन सांद्रता की मात्रा निर्धारित करें. प्रोटीन क्षरण को सीमित करने के लिए परिमाणीकरण का उपक्रम करते समय बर्फ पर नमूनों को स्टोर करें।
    नोट: कुल proteome विश्लेषण के लिए, प्रोटीन का 20-100 μg नैनो एलसी-एमएस के लिए पर्याप्त से अधिक है, जो आमतौर पर प्रति विश्लेषण प्रोटीन डाइजेस्ट के 2 μg से कम की आवश्यकता होती है। अतिरिक्त पेप्टाइड की तैयारी विश्लेषण को दोहराने या आगे फ्रैक्शनेशन के लिए अनुमति देती है यदि गहरी प्रोटिओमिक कवरेज की आवश्यकता होती है। हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (एचआईएलआईसी) का उपयोग करके ग्लाइकोपेप्टाइड संवर्धन-आधारित विश्लेषण के लिए, 100-500 μg प्रोटीन की आवश्यकता होती है।
  4. कम और alkylate नमूने.
    1. 1/1010x कमी / alkylation बफर (100 mM Tris 2-carboxyethyl फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड; 400 mM 2-chloroacetamide में 1 M Tris, pH 8.5) की मात्रा जोड़ें 1x की अंतिम एकाग्रता के लिए नमूनों के लिए और 1,500 rpm पर मिलाने के साथ 45 °C पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में नमूने इनक्यूबेट करें।
      नोट:: नमूनों में जोड़ने से पहले लगभग 7.0-8.0 का पीएच सुनिश्चित करने के लिए 10x कमी/alkylation बफ़र के pH की जाँच करें, के रूप में एक कम पीएच SDC अवक्षेप करने के लिए कारण होगा।
  5. संक्षेप में नमूनों को नीचे स्पिन करें और प्रोटीज ट्रिप्सिन / लाइस-सी (~ 10 μL, 100 mM Tris, pH 8.5 में पुन: निलंबित) को अंतिम प्रोटीज के लिए जोड़ें: 1: 100 का प्रोटीन अनुपात। 1,500 आरपीएम (18 घंटे तक) पर हिलाने के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर डाइजेस्ट को इनक्यूबेट करें। पूर्ण प्रोटीन पाचन सुनिश्चित करने के लिए, ट्रिप्सिन / लाइस-सी प्रोटीज: 1: 50 से 1: 200 के प्रोटीन अनुपात का उपयोग करें।
  6. नमूनों के लिए 100% आइसोप्रोपेनॉल के 1.25 संस्करणों को जोड़कर पचाने को बुझाएं। भंवर 1 मिनट के लिए नमूनों को मिश्रण करने के लिए और संक्षेप में उन्हें नीचे स्पिन.
    नोट: नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ताकि बाद में संसाधित किया जा सके।
  7. 10% trifluoroacetic एसिड (TFA; ~ 1% TFA की अंतिम एकाग्रता) के 0.115 संस्करणों को जोड़कर नमूनों को अम्लीकृत करें, नमूनों को भंवर करें, और संक्षेप में उन्हें नीचे स्पिन करें।

2. proteome नमूनों का प्रसंस्करण

  1. प्रोटिओम नमूनों की पेप्टाइड सफाई
    1. प्रत्येक नमूने के लिए एक स्टाइरीनेडिविनाइलबेंजीन-रिवर्स-फेज सल्फोनेट (एसडीबी-आरपीएस) स्टॉप-एंड-गो-निष्कर्षण (स्टेज) टिप तैयार करें जैसा कि पहले वर्णित54 था।
      1. अनुभवजन्य रूप से, पेप्टाइड के 50 μg को बाध्य करने के लिए, एक कुंद सुई (14 जी) का उपयोग करके 47 मिमी2 एसडीबी-आरपीएस झिल्ली से तीन एसडीबी-आरपीएस डिस्क को एक्साइज करें। बड़ी पेप्टाइड मात्रा के लिए, तदनुसार डिस्क की संख्या बढ़ाएं।
    2. एसडीबी-आरपीएस स्टेज टिप्स का उपयोग करने से पहले, निम्नलिखित बफ़र्स के कम से कम दस बिस्तर वॉल्यूम को क्रमिक रूप से जोड़कर और या तो सेंट्रीफ्यूजेशन (25 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट, 500 × जी) द्वारा कॉलम के माध्यम से बफर को कताई करके या एक सिरिंज का उपयोग करके धीरे-धीरे दबाव लागू करके कॉलम के माध्यम से बफर को धक्का देकर युक्तियों को तैयार करें।
      1. 100% एसिटोनिट्राइल के 150 μL के साथ युक्तियों को गीला करें।
      2. 30% मेथनॉल के 150 μL, 18.2 MΩ H2O में 1% TFA के साथ युक्तियों को धोएं।
      3. 90% आइसोप्रोपेनॉल के 150 μL के साथ युक्तियों को संतुलित करें, 1% TFA 18.2 MΩ H2O के साथ संतुलित।
    3. नमूनों (50% isopropanol, 1% TFA युक्त) को SDB-RPS स्टेज टिप्स पर centrifugation (25 °C, 3 मिनट, 500 × g) या धीरे-धीरे एक सिरिंज का उपयोग करके दबाव लागू करके लोड करें।
    4. SDB-RPS स्टेज टिप्स को सेंट्रीफ्यूजेशन (25 °C, 3 मिनट, 500 × g) द्वारा निम्नलिखित बफ़र्स के साथ धोएं या धीरे-धीरे एक सिरिंज का उपयोग करके दबाव लागू करके।
      नोट: अतिरिक्त धोने या वैकल्पिक बफ़र्स का उपयोग गैर-पेप्टाइड संदूषकों को हटाने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि आइसोप्रोपेनॉल55 के बजाय एथिल एसीटेट का उपयोग।
      1. 90% isopropanol, 1% TFA के 150 μL के साथ युक्तियों को धोएं।
      2. 18.2 MΩ H2O में 1% TFA के 150 μL के साथ युक्तियों को धोलें।
    5. SDB-RPS स्टेज टिप्स से पेप्टाइड्स को 80% एसिटोनिट्राइल में 5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के 150 μL के साथ centrifugation द्वारा या धीरे से एक सिरिंज का उपयोग करके दबाव लागू करके। अलग-अलग ट्यूबों में नमूने ले लीजिए.
      नोट: एक धुएं हुड के भीतर उपयोग करने से तुरंत पहले प्लास्टिक कंटेनर में 80% एसिटोनिट्राइल में 5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड तैयार करें।
    6. 25 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एल्यूटेड पेप्टाइड्स को सुखाएं।
      नोट: यदि HILIC संवर्धन उपक्रम, पेप्टाइड eluates के 1-10% इस बिंदु पर हटाया जा सकता है, सूखे, और कुल proteome इनपुट नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया.
  2. ग्लाइकोपेप्टाइड नमूनों का संवर्धन
    1. Zwitterionic हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (ZIC-HILIC) स्टेज टिप्स तैयार करें जैसा कि पहले54,56 वर्णित किया गया था।
      1. संक्षेप में, एककुंद सुई (14 जी) का उपयोग करके 47 मिमी2 सी 8 झिल्ली से एक सी8 डिस्क को एक्साइज करें और एक फ्रिट बनाने के लिए डिस्क को पी 200 टिप में पैक करें। ZIC-HILIC सामग्री के लगभग 5 मिमी जोड़ें, 50% एसिटोनिट्राइल में फिर से निलंबित, 50% 18.2 MΩ H2O, एक सिरिंज का उपयोग करके धीरे से दबाव लागू करके फ्रिट पर।
    2. ZIC-HILIC स्टेज टिप्स का उपयोग करने से पहले, क्रमिक रूप से निम्नलिखित बफ़र्स को जोड़कर और धीरे-धीरे एक सिरिंज का उपयोग करके दबाव लागू करके राल की स्थिति।
      नोट: ZIC-HILIC राल (ग्लाइकोपेप्टाइड्स को समृद्ध करने के लिए आवश्यक) की सतह पर छद्म पानी की परत की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए, राल को हमेशा गीला रहना चाहिए। राल को धोते समय, हमेशा राल के ऊपर विलायक के ~ 10 μL को छोड़ दें और सुनिश्चित करें कि धोने / नमूनों को सीधे इस अवशिष्ट विलायक में पाइप किया जाता है।
      1. ZIC-HILIC क्षालन बफर (18.2 MΩH 2O में 0.1% TFA) के 20 बिस्तर वॉल्यूम (200 μL) के साथ राल को संतुलित करें।
      2. ZIC-HILIC तैयारी बफर (18.2 MΩH 2O में 95% acetonitrile) के 20 बिस्तर वॉल्यूम (200 μL) के साथ राल को धोएं।
      3. ZIC-HILIC लोडिंग / वॉश बफर (80% एसिटोनिट्राइल, 1% TFA 18.2 MΩ H2O के साथ संतुलित) के 20 बिस्तर वॉल्यूम (200 μL) के साथ राल को धोएं।
    3. ZIC-HILIC लोडिंग / वॉश बफर में सूखे पचे हुए नमूनों (चरण 2.1.6 से) को 4 μg / μL की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया (उदाहरण के लिए, पेप्टाइड के 200 μg के लिए, ZIC-HILIC लोडिंग / वॉश बफर के 50 μL में पुन: निलंबित)। भंवर संक्षेप में 1 मिनट के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूनों को फिर से निलंबित कर दिया गया है, और 25 डिग्री सेल्सियस पर 2,000 × जी पर 1 मिनट के लिए नीचे स्पिन करें।
    4. एक वातानुकूलित ZIC-HILIC स्तंभ पर पुन: निलंबित पेप्टाइड नमूना लोड करें।
      1. ZIC-HILIC लोडिंग / वॉश बफर के 20 बिस्तर वॉल्यूम (200 μL) के साथ तीन बार धोएं (कुल 60 बेड वॉल्यूम धोने के लिए) धीरे-धीरे एक सिरिंज का उपयोग करके दबाव लागू करके।
      2. ZIC-HILIC क्षालन बफर के 20 बिस्तर की मात्रा (200 μL) के साथ एल्यूट ग्लाइकोपेप्टाइड्स को धीरे से एक सिरिंज का उपयोग करके दबाव लागू करके 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में बफर किया जाता है और फिर 25 डिग्री सेल्सियस पर वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एलुएट को सूखा देता है।

3. proteome / ग्लाइकोपेप्टाइड समृद्ध नमूनों के एलसी-एमएस

  1. बफर ए * (2% एसिटोनिट्राइल, 0.1% टीएफए) में नमूनों को 1 μg / μL की अंतिम एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया (उदाहरण के लिए, पेप्टाइड के 50 μg के लिए, बफर ए * के 50 μL में पुन: निलंबित)।
  2. ग्लाइकोपेप्टाइड्स के पृथक्करण और पहचान को सक्षम करने के लिए एक एमएस के लिए युग्मित एक एचपीएलसी / यूपीएलसी पर नमूनों को लोड करें।
    नोट: स्तंभ पैरामीटर, आंतरिक व्यास, लंबाई, प्रवाह दर, क्रोमैटोग्राफी राल के प्रकार, और आवश्यक पेप्टाइड इंजेक्शन मात्रा सहित, विश्लेषणात्मक सेटअप और ग्रेडिएंट लंबाई का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए; विश्लेषणात्मक सेटअप के अनुकूलन को कैसे शुरू किया जाए, इसके एक उदाहरण के लिए,57 देखें।
  3. परिणामी एमएस डेटा के संग्रह की निगरानी करें यह सुनिश्चित करते हुए कि डेटा वांछित पैरामीटर के साथ एकत्र किया जा रहा है।
    नोट:: compositional विश्लेषण के लिए, सीआईडी विखंडन पर्याप्त है। ग्लाइकोपेप्टाइड्स में ग्लाइकन के अतिरिक्त के कारण, ग्लाइकोपेप्टाइड आयनों को आमतौर पर उच्च एम / जेड और कम चार्ज घनत्व के साथ देखा जाता है, जो कि अनग्लाइकोसिलेटेड पेप्टाइड्स की तुलना में होता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि ये आयन अवलोकन योग्य हैं, 400 से 2,000 मीटर / जेड तक एक एमएस 1 द्रव्यमान रेंज की अनुमति दें।
  4. सीआईडी का उपयोग करके चयनित आयनों को विभाजित करना, कम एम / जेड टुकड़ा आयनों के संग्रह को सुनिश्चित करना जिसमें ग्लाइकन के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण ऑक्सोनियम आयन होते हैं।
    नोट: सीआईडी का उपयोग करके ग्लाइकोपेप्टाइड्स का विखंडन पेप्टाइड और ग्लाइकन अनुक्रमों दोनों से प्रभावित होता है, साथ ही साथविखंडन 25,58,59 के दौरान लागू ऊर्जा भी होती है। जबकि विभिन्न टकराव ऊर्जाओं की एक श्रृंखला का उपयोग किया जा सकता है, ग्लाइकोपेप्टाइड्स को खंडित करने के लिए एक इष्टतम रणनीति कई टकराव ऊर्जा 25,59,60 के उपयोग के संयोजन के साथ कदम टकराव ऊर्जा का उपयोग है।
  5. वैकल्पिक विखंडन विधियों का उपयोग करें, यदि उपलब्ध हो, जैसे कि साइट स्थानीयकरण के लिए ETD, या ग्लाइकन रचनाओं के निर्धारण में सहायता करने के लिए IT-CID.
    नोट: इन विखंडन दृष्टिकोणों में से कोई भी रचनात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं है, फिर भी ब्याज के ग्लाइकोपेप्टाइड्स की आगे की पूछताछ को सक्षम करने के लिए एकत्र किया जा सकता है।

4. proteome / ग्लाइकोपेप्टाइड समृद्ध नमूनों का विश्लेषण

  1. FragPipe में खोज को सक्षम करने के लिए डेटा फ़ाइलों को प्रीफ़िल्टर करना
    1. यदि ETD या IT-CID स्कैन डेटासेट के भीतर अधिग्रहित किए गए हैं, तो FragPipe के साथ खोज करने से पहले MSConvert61 का उपयोग करके डेटाफ़ाइलों से इन स्कैन ईवेंट को फ़िल्टर करें.
      नोट:: नीचे उल्लिखित खुले खोज पैरामीटर के लिए, केवल बीम-प्रकार CID डेटा की आवश्यकता होती है।
  2. FragPipe में खुली खोजें कर रहा है
    1. FragPipe खोलें और वर्कफ़्लो टैब क्लिक करें. वर्कफ़्लो पुलडाउन मेनू में, खोज खोलें विकल्प का चयन करें, और FragPipe (चित्र 2A) में खोजी जाने वाली डेटा फ़ाइलों को आयात करने के लिए फ़ाइलें जोड़ें क्लिक करें.
    2. डेटाबेस टैब क्लिक करें और डाउनलोड प्रबंधक डाउनलोड पर क्लिक करके लॉन्च करें। यह proteome डेटाबेस को Uniprot Proteome ID का उपयोग करके Uniprot से डाउनलोड करने की अनुमति देता है। डेटाबेस में डिकॉय और संदूषक प्रोटीन को शामिल करने के लिए डाउनलोड प्रबंधक के भीतर डिकॉय और संदूषक जोड़ें विकल्प पर क्लिक करें।
    3. अधिक कड़े FDR थ्रेशोल्ड के लिए, मान्यता टैब क्लिक करें और फ़िल्टर करें और आवश्यक FDR के लिए 0.01 से रिपोर्ट मान को संशोधित करें।
      नोट:: डिफ़ॉल्ट FragPipe सेटिंग्स प्रोटीन स्तर पर एक 1% FDR सुनिश्चित करेगा।
    4. MSfragger टैब क्लिक करें। पीक मिलान बॉक्स के भीतर, बड़े संशोधनों (चित्रा 2A) की पहचान की अनुमति देने के लिए डिफ़ॉल्ट 500 Da से 2,000 Da करने के लिए अग्रदूत द्रव्यमान सहिष्णुता को बढ़ाएँ।
    5. चलाएँ टैब क्लिक करें और FragPipe के आउटपुट का स्थान निर्धारित करें. खोज प्रारंभ करने के लिए चलाएँ बटन क्लिक करें.
  3. डेटासेट में पहचाने गए PSMs का उपयोग करना (FragPipe से psm.tsv आउटपुट के भीतर निहित), डेटासेट (चित्रा 3) के भीतर देखे गए डेल्टा द्रव्यमान की आवृत्ति की साजिश करके संभावित ग्लाइकन की पहचान करें। MSfragger आउटपुट से डेल्टा द्रव्यमान भूखंडों का उपयोग कर आर स्क्रिप्ट प्राइड परिग्रहण PXD027820 के माध्यम से सुलभ बनाएँ.
    नोट: खुले खोज परिणामों की न्यूनतम postprocessing इन लिपियों के भीतर किया जाता है, क्योंकि इन लिपियों का मुख्य उद्देश्य डेल्टा मास प्रोफाइल के विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता करना है। महत्वपूर्ण रूप से, अकेले प्रचुर मात्रा में डेल्टा द्रव्यमान का अवलोकन इस बात का सबूत नहीं है कि एक संशोधन एक संभावित ग्लाइकन है, क्योंकि ग्लाइकन के रूप में डेल्टा द्रव्यमान को असाइन करने के लिए संबंधित एमएस 2 घटनाओं के आगे के विश्लेषण की आवश्यकता होती है।
  4. नमूनों के भीतर ग्लाइकोपेप्टाइड्स के लक्षण वर्णन को सक्षम करने के लिए, उच्च आत्मविश्वास डेल्टा द्रव्यमान पहचान पर ध्यान केंद्रित करें, जो उच्च हाइपरस्कोर के साथ असाइनमेंट के अनुरूप है।
    1. ग्लाइकोपेप्टाइड स्पेक्ट्रा का आकलन करने में सहायता करने के लिए, पेप्टाइड एनोटेशन टूल का उपयोग करें, जैसे कि इंटरएक्टिव पेप्टाइड स्पेक्ट्रल एनोटेटर63, जो स्पेक्ट्रा के भीतर पेप्टाइड से जुड़े आयनों के असाइनमेंट को सक्षम बनाता है, जिससे ग्लाइकन से जुड़े आयनों की मैन्युअल पहचान की अनुमति मिलती है (चित्रा 4)।
      नोट: यहां प्रस्तुत डेटासेट के भीतर, >30 के हाइपरस्कोर को उच्च स्कोरिंग माना जाता है, क्योंकि ये सभी पहचाने गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स (चित्रा 5) के शीर्ष 50% के भीतर स्कोर के अनुरूप हैं।
  5. उच्च आत्मविश्वास वाले ग्लाइकोपेप्टाइड्स के साथ, ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान में सुधार करने के लिए आमतौर पर देखे जाने वाले ग्लाइकन-संबद्ध आयनों (चित्रा 4) की पहचान करें।
    नोट: खोजों के भीतर ग्लाइकन-संबद्ध आयनों को शामिल करके, जिसे ग्लाइकन-केंद्रित खोजों के रूप में जाना जाता है, ग्लाइकोपेप्टाइड असाइनमेंट की गुणवत्ता में सुधार किया जा सकता है।
    1. FragPipe के MSfragger टैब पर क्लिक करें, चर संशोधनों और मास ऑफसेट अनुभागों में मनाया glycans के निर्धारित डेल्टा द्रव्यमान को शामिल करें। इन द्रव्यमानों को चर संशोधनों में मान टाइप करके जोड़ें और एक / के साथ अलग किए गए अलग-अलग द्रव्यमानों के साथ मास ऑफसेट अनुभागों को जोड़ें। MSFragger के ग्लाइको / Labile mods अनुभाग में इन ग्लाइकन के ग्लाइकन से जुड़े टुकड़े द्रव्यमान जोड़ें।
      नोट:: चित्रा 2B A. baumannii तनाव AB307-0294 की एक ग्लाइकन-केंद्रित खोज के लिए आवश्यक कुंजी जानकारी को रेखांकित करता है।
  6. प्रोटिओमिक अध्ययन से जुड़े सभी एमएस डेटा को केंद्रीकृत प्रोटिओमिक रिपॉजिटरीज़ जैसे प्राइड या बड़े पैमाने पर रिपॉजिटरीज़ पर अपलोड करें।
    नोट: इस अध्ययन से जुड़े सभी डेटा को प्राइड प्रोटिओमिक रिपॉजिटरी में जमा किया गया है और प्राइड परिग्रहण के माध्यम से पहुँचा जा सकता है: PXD027820।

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Representative Results

बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड विश्लेषण के लिए खुली खोज की उपयोगिता को स्पष्ट करने के लिए, A. baumannii-AB307-AB307-0294, ACICU, और D1279779 के तीन उपभेदों के भीतर O-linked glycans की रासायनिक विविधता का आकलन किया गया था। O-linked glycoproteomes A. baumannii उपभेदों के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं क्योंकि ग्लाइकोसिलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लाइकन अत्यधिक चर कैप्सूल लोकी 44,45,46 से व्युत्पन्न होते हैं। यह रासायनिक विविधता A. baumannii को खुले खोज अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाती है। जबकि तीन उपभेदों के ग्लाइकोप्रोटियोम का पहले मूल्यांकन नहीं किया गया है, इनमें से दो उपभेदों, AB307-029464 और ACICU65 की कैप्सूल संरचनाएं ज्ञात हैं, D1279779 के कैप्सूल के साथ अभी तक स्पष्ट नहीं किया गया है।

AB307-0294 के कैप्सूल के अनुरूप, AB307-0294 की खुली खोज से दो प्रमुख डेल्टा द्रव्यमान का पता चला, जो 648.25 Da और 692.28 Da (चित्रा 3A) के अनुरूप है। ये द्रव्यमान कैप्सूल संरचनाओं से मेल खाते हैं जो पहले रूसो एट अल द्वारा निर्धारित किए गए थे, -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA, जहां QuiNAc4NR अवशेष 2,4-diamino-2,4,6-trideoxy-glucose से मेल खाते हैं, या तो 3-OH-butyrate या एक एसिटाइल समूह64 के साथ संशोधित। इसी तरह, एसीआईसीयू कैप्सूल को टेट्रासेकेराइड के-यूनिट से बना माना जाता है, जिसे पहले Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Galp-β-D-Gal p-NAc-के रूप में पहचाना जाता है, जो 843.31 Da65 के अनुमानित द्रव्यमान के अनुरूप है। यह कैप्सूल संरचना ACICU डेटा (चित्रा 3B) के भीतर सबसे अधिक बार देखे जाने वाले डेल्टा द्रव्यमान के अनुरूप है। अंत में, तनाव D1279779 के खुले खोज विश्लेषण से 203.08, 794.31, और 1588.62 Da (चित्रा 3C) के अनुरूप कई डेल्टा द्रव्यमानों की उपस्थिति का पता चला। जबकि द्रव्यमान 203.08 एक एकल हेक्सएनएसी अवशेषों के अनुरूप है, 794.31 और 1588.62 अज्ञात संशोधनों के अनुरूप हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि द्रव्यमान 1588.62 794.31 की तुलना में बिल्कुल दोगुना है, यह सुझाव देते हुए कि इन पेप्टाइड्स को ग्लाइकन के-यूनिट डिमर्स से सजाया गया है, जैसा कि पहले अन्य एसिनेटोबैक्टर ग्लाइकोप्रोटिओम 30,44,46 के भीतर देखा गया है।

डेल्टा मास प्लॉट नमूनों के भीतर देखे गए संशोधनों की आवृत्ति का आकलन करने के लिए एक त्वरित और प्रभावी तरीका प्रदान करते हैं। हालांकि, जटिल संशोधनों के लिए, जैसे कि ग्लाइकन, अकेले डेल्टा द्रव्यमान की उपस्थिति ग्लाइकन की सटीक संरचना को परिभाषित करने के लिए जानकारी प्रदान नहीं करती है। ग्लाइकन रचनाओं के निर्धारण में सहायता करने के लिए, विशिष्ट डेल्टा द्रव्यमान को असाइन किए गए पीएसएम के परिणामी एमएस / एमएस डेटा का उपयोग किया जा सकता है। उच्च आत्मविश्वास वाले ग्लाइकोपेप्टाइड असाइनमेंट (उच्च हाइपरस्कोर वाले पीएसएम के अनुरूप एमएसफ्रैगर में) पर ध्यान केंद्रित करके, मैन्युअल विश्लेषण का उपयोग प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के लिए एक तनाव द्वारा उपयोग किए जाने वाले ग्लाइकन को और अधिक चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि उच्च आत्मविश्वास पेप्टाइड असाइनमेंट में आमतौर पर मजबूत ग्लाइकन जानकारी होती है जो वाई आयनों के आधार पर ग्लाइकन रचनाओं के निर्धारण की अनुमति देती है। इस जानकारी का उपयोग संबंधित टुकड़ों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जहां ग्लाइकन पेप्टाइड्स से जुड़े हुए हैं, साथ ही साथ बी और ऑक्सीनियम से संबंधित आयनों के लिए ग्लाइकन66 के असाइनमेंट के लिए उपयोगी हैं। ग्लाइकन रचनाओं को असाइन करने के तरीके के बारे में विस्तृत दिशानिर्देश पहले उल्लिखित किए गए हैं, और पाठकों को हार्वे एट अल.67 से परामर्श करने की सिफारिश की जाती है। इंटरैक्टिव पेप्टाइड स्पेक्ट्रल एनोटेटर63 जैसे उपकरणों का उपयोग करके, पेप्टाइड से जुड़े आयनों को आसानी से पहचाना जा सकता है, जिससे उपयोगकर्ता पेप्टाइड्स से जुड़े ग्लाइकन की पहचान निर्धारित कर सकते हैं।

इंटरैक्टिव पेप्टाइड स्पेक्ट्रल एनोटेटर का उपयोग करते हुए, इन तीन ए बाउमनी नमूनों में पहचाने गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स का मूल्यांकन किया गया था, जिससे संभावित ग्लाइकन से जुड़े आयनों का खुलासा हुआ था। AB307-0294 ग्लाइकोपेप्टाइड SAGDQAASDIATATDNASAK के एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा पर विचार करें, जिसे ग्लाइकन 648.25 और 692.28 Da (चित्रा 4A, B) के साथ सजाया गया है; इसी तरह के विखंडन की स्थिति में, ग्लाइकन से संबंधित आयन अत्यधिक समान हैं, फिर भी 44.02 Da द्वारा द्रव्यमान में बदलाव इन PSM के भीतर ग्लाइकन आयनों का विश्लेषण इस बात की पुष्टि करने में सक्षम बनाता है कि इन ग्लाइकोपेप्टाइड्स के लिए देखे गए डेल्टा द्रव्यमान चार अलग-अलग कार्बोहाइड्रेट वाले ट्राइसेकेराइड्स के अनुरूप हैं: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da), और HexNAc (203 Da)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ग्लाइकन टुकड़ों को असाइन करते समय, सीआईडी का उपयोग करके खंडित होने पर कई मोनोसेकेराइड पानी खोने की संभावना रखते हैं। यह ACICU के ग्लाइकन में देखा जा सकता है, जहां मोनोसेकेराइड Pse5Ac7Ac (316 Da) दो प्रमुख ग्लाइकन से संबंधित टुकड़ों की पीढ़ी की ओर जाता है: MH + 299.12 और 317.13, पानी के द्रव्यमान (18.01 Da) (चित्रा 4C) के अनुरूप द्रव्यमान में अंतर।

इसके अतिरिक्त, बैक्टीरियल ग्लाइकन का विश्लेषण करते समय, यूकेरियोट्स के भीतर नहीं देखे गए शर्करा के अनुरूप अप्रत्याशित मोनोसेकेराइड द्रव्यमान का निरीक्षण करना आम है। इसका एक उदाहरण D1279779 के ग्लाइकोपेप्टाइड PSMs के भीतर देखा जा सकता है, जहां सबसे लगातार डेल्टा द्रव्यमान 794.31 Da के विश्लेषण से एक असामान्य मोनोसेकेराइड dHexNAc (187 Da, 188.09 के MH + के रूप में मनाया जाता है, चित्रा 4D), जो पहले A. baumannii O-linked glycans44 के भीतर देखा गया है। जबकि उच्च द्रव्यमान सटीकता माप और लेबाइल संशोधनों के रूप में ग्लाइकन की विशेषता व्यवहार, जो पेप्टाइड बैकबोन से खो जाते हैं, ग्लाइकन की संभावित रासायनिक रचनाओं के निर्धारण में सहायता कर सकते हैं, एमएस डेटा की अतिव्याख्या को कम करने की सलाह दी जाती है। यदि विशिष्ट शर्करा की स्टीरियोकेमिस्ट्री या ग्लाइकन की लिंकेज जानकारी अज्ञात है, तो संरचनात्मक रूप से एगोनिस्टिक असाइनमेंट का उपयोग करना सबसे अच्छा अभ्यास है, जिसमें उनके विशिष्ट वर्गों द्वारा मोनोसेकेराइड का उल्लेख करना शामिल है। इसका एक उदाहरण 203.08 Da अवशेषों को N-acetylhexosamines (HexNAc) के रूप में संदर्भित कर रहा है और लिंकेज प्रकारों के असाइनमेंट से बच रहा है। यदि आवश्यक हो, तो यह अनुशंसा की जाती है कि एक अज्ञात संशोधन की सटीक रासायनिक पहचान को परिभाषित करने के लिए अतिरिक्त तकनीकों का उपयोग किया जाता है, जैसे कि परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) का उपयोग।

जबकि खुले खोज दृष्टिकोण संशोधित पेप्टाइड्स की तेजी से पहचान को सक्षम करते हैं, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह खोज दृष्टिकोण डेटासेट के भीतर संभावित ग्लाइकोपेप्टाइड्स को अनदेखा कर सकता है। खुली खोजों के भीतर, ग्लाइकोपेप्टाइड्स कई कारणों से पहचाने जाने में विफल हो सकते हैं, जिसमें अपर्याप्त पेप्टाइड विखंडन जानकारी या एमएस 2 घटना के भीतर कई अनिर्दिष्ट आयनों की उपस्थिति के कारण असाइन किए गए पेप्टाइड का दंड शामिल है। उत्तरार्द्ध विशेष रूप से बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड पीएसएम के लिए सच है, क्योंकि इन स्पेक्ट्रा में ग्लाइकन से जुड़े टुकड़े हो सकते हैं जिन्हें डिफ़ॉल्ट रूप से खुले खोज पैरामीटर द्वारा नहीं माना जाता है। जैसा कि बेजोड़ विशेषताएं पीएसएम के स्कोरिंग पर प्रतिकूल प्रभाव डालती हैं, एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा के भीतर बेजोड़ आयनों को कम करने से ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान को सक्षम बनाता है जिन्हें शुरू में एफडीआर-नियंत्रित न्यूनतम स्कोर थ्रेसहोल्ड के कारण बाहर रखा गया था। इस सीमा को दूर करने के लिए, खुली खोजों (चित्रा 3) और मैन्युअल रूप से परिभाषित ग्लाइकन-संबद्ध आयनों (चित्रा 4) से परिभाषित द्रव्यमान को ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान में सुधार करने के लिए खोज मापदंडों में शामिल किया जा सकता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन ग्लाइकन से जुड़े आयनों को ग्लाइकन के डे नोवो निर्धारण, सामान्य ऑक्सीनियम आयनों के पूर्व ज्ञान 44,68, या उपकरणों के उपयोग के आधार पर मैन्युअल रूप से पहचाना जा सकता है जो स्पेक्ट्रा के भीतर पुन: उत्पन्न आयनों को कैप्चर कर सकते हैं, जैसे कि Spectral Immonium Ion Detection Tool69,76।

इसे प्रदर्शित करने के लिए, खुले खोज विश्लेषण के माध्यम से पहचाने गए एटिपिकल ग्लाइकन टुकड़ों के द्रव्यमान को MSFragger में खोज पैरामीटर में शामिल किया गया था, और ग्लाइकन-केंद्रित खोज की गई थी (तनाव AB307-0294 के लिए ग्लाइकन-केंद्रित सेटिंग्स चित्रा 2B में दिखाई गई हैं)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जब कई ग्लाइकन को एक साथ खोजा जा रहा है, तो वाई आयन और नैदानिक द्रव्यमान के चयन में देखभाल की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि वे प्रत्येक डेल्टा द्रव्यमान से जुड़े टुकड़े आयनों को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करते हैं। हालांकि यह हमेशा वाई और नैदानिक द्रव्यमानों के संयोजन के लिए संभव नहीं हो सकता है जो पारस्परिक रूप से अनन्य हैं, जैसे कि AB307-0294 (चित्रा 4A, B) के 648.25 और 692.28 ग्लाइकन के टुकड़े, ग्लाइकन-केंद्रित खोज अभी भी संभव है, हालांकि यह खोज परिणामों की मजबूती को प्रभावित कर सकता है। ग्लाइकन-केंद्रित खोजों ने सभी तीन ए बाउमनी उपभेदों में पहचाने गए ग्लाइकोपेप्टाइड पीएसएम की कुल संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि की, जो एसीआईसीयू में 37% की वृद्धि, एबी 307-0294 में 117% की वृद्धि और D1279779 (चित्रा 5ए-सी) में 363% की वृद्धि के अनुरूप है। अलग-अलग एमएस घटनाओं के लिए, ग्लाइकन-विशिष्ट जानकारी को शामिल करने के परिणामस्वरूप आमतौर पर मनाया हाइपरस्कोर के भीतर वृद्धि होती है, हालांकि यह वृद्धि अत्यधिक ग्लाइकन-निर्भर है (चित्रा 5 डी, ई)। इस प्रकार, खुली खोज के माध्यम से पता चला ग्लाइकन के द्रव्यमान का उपयोग करके खोज मापदंडों को परिष्कृत करके और बाद में लक्षित खोजों में मैन्युअल रूप से क्यूरेटेड ग्लाइकन टुकड़ा जानकारी को शामिल करके, नमूनों के भीतर ग्लाइकोपेप्टाइड्स का अधिक विस्तृत विश्लेषण प्राप्त किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड्स की तैयारी और विश्लेषण में महत्वपूर्ण चरणों का अवलोकन। बैक्टीरियल ग्लाइकोपेप्टाइड्स की सफल पहचान ग्लाइकोपेप्टाइड्स युक्त उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों की पीढ़ी पर निर्भर करती है। ग्लाइकोपेप्टाइड युक्त नमूनों का विश्लेषण तब एलसी-एमएस द्वारा किया जाता है, और बाद में, अद्वितीय डेल्टा द्रव्यमान के आधार पर संभावित ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए खुले खोज दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है। मैन्युअल क्यूरेशन का उपयोग करके, इन डेल्टा द्रव्यमानों को ग्लाइकन के रूप में पहचाना जा सकता है। अंत में, ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान में सुधार करने के लिए, ग्लाइकन जानकारी को ग्लाइकन-केंद्रित डेटाबेस खोजों में शामिल किया जा सकता है। संक्षेप: एलसी-एमएस = तरल क्रोमैटोग्राफी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित; OD = ऑप्टिकल घनत्व; SDB-RPS = styrenedivinylbenzine-रिवर्स-फेज सल्फोनेट; ZIC-HILIC = Zwitterionic हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन तरल क्रोमैटोग्राफी; PSMs = पेप्टाइड-वर्णक्रमीय मैच; सीआईडी = टक्कर-प्रेरित पृथक्करण; ETD = इलेक्ट्रॉन स्थानांतरण पृथक्करण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: FragPipe में खुली खोज और ग्लाइकन-केंद्रित खोजों को सक्षम करने के तरीके का अवलोकन. (A) खोलें खोज FragPipe के वर्कफ़्लो टैब में खोलें वर्कफ़्लो लोड करके सक्षम किया जा सकता है। आकार में 500 दा से अधिक ग्लाइकन की पहचान को सक्षम करने के लिए, अग्रदूत मास टॉलरेंस विंडो को 2,000 Da तक बढ़ाएं (B) एटिपिकल ग्लाइकन के लिए ग्लाइकन-केंद्रित खोजों को संशोधनों के अपेक्षित द्रव्यमान (चर संशोधनों और मास ऑफसेट वर्गों में) को परिभाषित करने के लिए MSFragger टैब में ग्लाइकन जानकारी के प्रवेश की आवश्यकता होती है, इन ग्लाइकन से जुड़े वाई आयन (ग्लाइको / लाबिले की वाई आयन मास सूची में) अनुभाग), और कम द्रव्यमान ग्लाइकन टुकड़ा आयनों (ग्लाइको / लेबिल अनुभाग की नैदानिक टुकड़ा द्रव्यमान सूची में)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU, और D1279779) के तीन उपभेदों के लिए खुले खोज परिणामों के डेल्टा द्रव्यमान भूखंडों। कैप्सूल लोकी की विविधता के अनुरूप, प्रत्येक ए बौमनी स्ट्रेन के पास आकार में 140 डीए से अधिक के प्रमुख संशोधनों के साथ एक अद्वितीय डेल्टा द्रव्यमान प्रोफ़ाइल है, जिसे मनाया डेल्टा द्रव्यमान द्वारा दर्शाया गया है। (ए) AB307-0294 डेल्टा मास प्लॉट के भीतर, द्रव्यमान 648.25 और 692.28 -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-के अनुरूप संशोधनों के अनुरूप है, जहां QuiNAc4NR को या तो 3-OH-butyrate या एसिटाइल समूह64 के साथ संशोधित किया जाता है। (बी) एसीआईसीयू डेल्टा द्रव्यमान भूखंड के भीतर, द्रव्यमान 203.08 और 843.31 हेक्सएनएसी और पीएसई5एसी 7 एसी-β-डी-जीएलसीपी-β-डी-गैल पी-β-डी-गैल पी-एनएसी के अनुरूप संशोधनों के अनुरूप है। (सी) D1279779 डेल्टा द्रव्यमान भूखंड के भीतर, द्रव्यमान 203.08, 794.31, और 1588.62 हेक्सएनएसी, हेक्सएनएसी -217-187-187, और हेक्सएनएसी -217-187-187 के एक डिमर के अनुरूप है। डेल्टा द्रव्यमान का मैन्युअल रूप से मूल्यांकन किया गया और चित्रा 4 में पुष्टि की गई ग्लाइकन * द्वारा निरूपित किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एसिनेटोबैक्टर baumannii के तीन उपभेदों में मनाया डेल्टा द्रव्यमान के एमएस / एमएस लक्षण वर्णन। (A, B)  AB307-0294, (C) ACICU, और (D) D1279779. इंटरैक्टिव पेप्टाइड स्पेक्ट्रल एनोटेटर-प्रतिनिधि ग्लाइकोपेप्टाइड्स के एनोटेटेड स्पेक्ट्रा की सहायता से। प्रत्येक स्पेक्ट्रम के लिए, पेप्टाइड टुकड़ा आयनों को नीले और लाल रंग में दर्शाया जाता है, जबकि मैन्युअल रूप से असाइन किए गए ग्लाइकन से जुड़े आयनों को हरे रंग में दर्शाया जाता है। ग्लाइकन को ग्लाइकन के लिए प्रतीक नामकरण का उपयोग करके एनोटेट किया गया है, जिसमें हेक्सएनएसी को एक वर्ग के रूप में दर्शाया गया है, हेक्स को एक सर्कल के रूप में दर्शाया गया है, और एटिपिकल मोनोसेकेराइड्स को ट्रेपोज़ॉइड्स में निरूपित ग्लाइकन के द्रव्यमान के साथ ट्रेपोज़ॉइड्स के रूप में दर्शाया गया है। संक्षिप्त नाम: MS/MS = अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: खुले बनाम ग्लाइकन-केंद्रित खोज का उपयोग करके एसिनेटोबैक्टर बौमनी के उपभेदों में पहचाने गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स की तुलना। (A-C) हाइपरस्कोर की तुलना और D1279779, ACICU, और AB307-0294 के भीतर PSM असाइनमेंट की संख्या खुले और ग्लाइकन-केंद्रित खोज का उपयोग कर। (D-F) D1279779, ACICU, और AB307-0294 के लिए खुले और ग्लाइकन-केंद्रित खोजों का उपयोग करके एक ही पेप्टाइड अनुक्रम को असाइन किए गए व्यक्तिगत MS2 ईवेंट की तुलना। संक्षिप्त नाम: PSM = पेप्टाइड-वर्णक्रमीय मैच। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

A. baumannii उपभेदों Uniprot Proteome आईडी
AB307-0294 15 UP000006924
ACICU 47,48 UP000008839
D1279779 49 UP000011860

तालिका 1. स्ट्रेन और यूनिप्रोट प्रोटिओम आईडी इस अध्ययन के भीतर उपयोग किए जाते हैं।

बफ़र नाम बफर संरचना /
बफर A* 18.2 MΩ H2O में 2% एसिटोनिट्राइल, 0.1% ट्राइफ्लुरोएसिटिक एसिड / पीएच 1.0
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, और 2 mM KH2PO4 / pH 7.4
न्यूनीकरण 100 mM Tris 2-carboxyethyl फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड, 400 mM 2-Chloroacetamide में 1 M Tris / pH 7.5
SDB-RPS स्टेज टिप क्षालन बफर 80% एसिटोनिट्राइल / पीएच 11 में 5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड
SDB-RPS स्टेज टिप equlibration बफर 30% मेथनॉल, 1% ट्राइफ्लुरोएसिटिक एसिड, 18.2 MΩ H2O / pH 1.0 में
SDB-RPS स्टेज टिप equlibration/ 90% आइसोप्रोपेनॉल, 1% ट्राइफ्लुरोएसिटिक एसिड / पीएच 1.0
SDB-RPS स्टेज टिप वॉश बफ़र 18.2 MΩH 2O / pH 1.0 में 1% ट्राइफ्लुरोएसिटिक एसिड
SDC लाइसिस बफर 100 mM Tris / pH 8.5 में 4% SDC
ZIC-HILIC क्षालन बफर 18.2 MΩH 2O /pH 1.0 में 0.1% ट्राइफ्लुरोएसिटिक एसिड
ZIC-HILIC लोडिंग/ 80% एसिटोनिट्राइल, 18.2 MΩH 2O / pH 1.0 में 1% ट्राइफ्लुरोएसिटिक एसिड
ZIC-HILIC तैयारी बफर 18.2 MΩH 2O / pH 7.0 में 95% एसिटोनिट्राइल

तालिका 2: इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले बफ़र्स की संरचना।

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Discussion

खुला खोज अज्ञात संशोधनों की पहचान के लिए एक प्रभावी और व्यवस्थित विधि है। जबकि बैक्टीरियल प्रोटिओम नमूनों के भीतर अज्ञात ग्लाइकन की पहचान पारंपरिक रूप से एक समय लेने वाली और तकनीकी रूप से विशिष्ट उपक्रम रही है, MSfragger21,41 और Byonic31,38 जैसे उपकरणों के हाल के विकास अब पेप्टाइड्स से जुड़े संभावित ग्लाइकन के रूप में आगे के लक्षण वर्णन के लिए डेल्टा द्रव्यमान की त्वरित और प्रभावी पहचान को सक्षम करते हैं। मानक और ग्लाइकोपेप्टाइड-समृद्ध प्रोटिओम नमूनों दोनों की खुली खोज संभावित ग्लाइकोपेप्टाइड्स की पहचान कर सकती है (चित्रा 1)। कई बैक्टीरियल प्रणालियों के प्रोटिओम के भीतर ग्लाइकोपेप्टाइड्स की समानता और बहुतायत ग्लाइकोपेप्टाइड संवर्धन 6 के बिना इन संशोधनों का सीधा पता लगाना संभव बनातीहै। हालांकि ग्लाइकोपेप्टाइड संवर्धन दृष्टिकोण आमतौर पर अभी भी कई ग्लाइकोसिलेशन सिस्टम70 के लिए गैर-एनरिचमेंट-आधारित तरीकों से आगे निकलते हैं, यह उल्लेखनीय है कि सभी ग्लाइकन71,72 को समृद्ध करने के लिए समान रूप से सक्षम नहीं हैं। किसी दिए गए जैविक नमूने के लिए खुली खोज का उपयोग करके ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं की पहचान करने के लिए सबसे उपयुक्त दृष्टिकोण का निर्धारण करते समय इस तथ्य पर विचार किया जाना चाहिए।

जबकि खुली खोज प्रभावी रूप से एक नमूने के भीतर एक उच्च आवृत्ति पर देखे गए ग्लाइकन की पहचान करती है, यह ग्लाइकोसिलेशन घटनाओं की पहचान करने में अप्रभावी रहती है जो शायद ही कभी डेटासेट के भीतर होती हैं। व्यावहारिक शब्दों में, ग्लाइकन के एक अद्वितीय डेल्टा द्रव्यमान की पहचान करने के लिए, एक समान डेल्टा द्रव्यमान के साथ कम से कम 10 पीएसएम नमूनों के भीतर मौजूद होना चाहिए। यह न्यूनतम आवृत्ति एक संभावित ग्लाइकन को पृष्ठभूमि डेल्टा द्रव्यमान असाइनमेंट (चित्रा 3) के ऊपर अलग करने योग्य होने की अनुमति देती है। हालांकि यह मानदंड आमतौर पर ग्लाइकोसिलेशन के लिए कई सब्सट्रेट को लक्षित करने वाली सामान्य ग्लाइकोसिलेशन प्रणालियों द्वारा संतुष्ट होता है, सिस्टम जहां ग्लाइकोसिलेशन के लिए एक ही प्रोटीन को लक्षित किया जाता है, इस दृष्टिकोण के लिए कम अनुकूल हो सकता है। जैसा कि एमएस उपकरणों की गति और संवेदनशीलता में सुधार होता है, यह संभावना है कि यह तेजी से कम बहुतायत ग्लाइकोपेप्टाइड आबादी के मूल्यांकन को सक्षम करेगा, जो बदले में, खुले खोज दृष्टिकोणों की प्रभावशीलता को बढ़ाएगा, बशर्ते पर्याप्त गुणवत्ता स्पेक्ट्रा दुर्लभ / कम प्रचुर मात्रा में ग्लाइकोफॉर्म के लिए उत्पन्न किया जा सके।

जबकि एमएस उपन्यास ग्लाइकन की प्रभावी पहचान को सक्षम बनाता है, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह अंतर्दृष्टि अकेले शायद ही कभी ग्लाइकोपेप्टाइड्स / ग्लाइकन का एक पूर्ण संरचनात्मक लक्षण वर्णन प्रदान करती है, एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसे उपकरण अभी भी पूर्ण ग्लाइकन लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण हैं। जैसा कि यहां देखा गया है, एमएस ने पहले ए. बौमनी एसीआईसीयू और एबी 307-029464,65 के पृथक कैप्सूल से एनएमआर का उपयोग करके निर्धारित के-इकाइयों की पूरक पुष्टि प्रदान की। हालांकि, D1279779 में पहचाने गए प्रमुख ग्लाइकन के लिए, इस ग्लाइकन के भीतर मोनोसेकेराइड के परिष्कृत वर्गों के बारे में केवल जानकारी एमएस के साथ असाइन करने योग्य थी, जो लिंकेज प्रकारों या इन चीनी इकाइयों के स्टीरियोकेमिस्ट्री के बारे में कोई जानकारी प्रदान नहीं करती थी (चित्रा 4)। जैसा कि नए एमएस विखंडन विधियां अधिक व्यापक रूप से उपलब्ध हो जाती हैं, जैसे कि पराबैंगनी फोटोडिसोसिएशन73,74, ग्लाइकोपेप्टाइड्स का अधिक विस्तृत संरचनात्मक लक्षण वर्णन संभव हो सकता है। हालांकि, वर्तमान इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ लिंकेज या स्टीरियोकेमिस्ट्री जानकारी का अनुमान लगाते समय देखभाल की जानी चाहिए। इन विचारों के अलावा, हाल ही में खुले खोज75 के लिए FDR-आधारित नियंत्रणों की उपयुक्तता के बारे में प्रश्न उठाए गए हैं। इस प्रकार, जबकि खुली खोज एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है, ये विचार अकेले खुली खोज जानकारी के आधार पर ग्लाइकन असाइनमेंट की व्याख्या में देखभाल करने की आवश्यकता को उजागर करते हैं।

जबकि यह काम दर्शाता है कि खुली खोज बैक्टीरियल ग्लाइकोसिलेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले ग्लाइकन की असुरक्षित पहचान के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण है, अकेले खुली खोज नमूनों के भीतर निहित सभी ग्लाइकोपेप्टाइड्स के केवल एक सबसेट तक पहुंच प्रदान करती है। ग्लाइकन की लैबिल प्रकृति के कारण, ग्लाइकोपेप्टाइड पीएसएम में आमतौर पर ग्लाइकन से जुड़े टुकड़ों की एक विविध श्रृंखला होती है, जो यदि इसके लिए जिम्मेदार नहीं है, तो पीएसएम के स्कोरिंग पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ेगा। इस मुद्दे को दूर करने और ग्लाइकोपेप्टाइड्स की अधिक गहराई से पहचान करने की अनुमति देने के लिए, खुली खोज के माध्यम से प्राप्त ग्लाइकन जानकारी का उपयोग बाद में ग्लाइकन-केंद्रित खोजों (चित्रा 2 बी) को सूचित करने के लिए किया जा सकता है। इस तरह, ग्लाइकन से जुड़े टुकड़ों के मैनुअल निर्धारण के साथ युग्मित खुली खोज का उपयोग नमूनों के भीतर असाइन किए गए ग्लाइकोपेप्टाइड्स की गुणवत्ता और मात्रा में सुधार करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 5)। यद्यपि ग्लाइकोपेप्टाइड खोज मापदंडों का शोधन मैन्युअल रूप से उपकरणों के वर्तमान संस्करणों के साथ किया जाता है, जैसे कि MSfragger, यह संभावना है कि जैसे-जैसे क्षेत्र परिपक्व होता है, इन चरणों को स्वचालित तरीके से किया जाएगा। अध्ययनों ने पहले से ही विशिष्ट पीटीएम69 से जुड़े कम आणविक वजन आयनों को दोहराने की पहचान करने के लिए कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है, साथ ही साथ ऑक्सोनियम-आयनों की पहचान करने और अज्ञात ग्लाइकोपेप्टाइड्स76 से जुड़े वाई-आयन द्रव्यमान को दोहराने की रणनीतियों का प्रदर्शन किया है। इस प्रकार, यह संभावना है कि इन चरणों को FragPipe जैसे उपकरणों के नए पुनरावृत्तियों में शामिल किया जाएगा, जिससे बैक्टीरिया और यूकेरियोटिक नमूनों के भीतर पहले से अज्ञात ग्लाइकोसिलेशन की घटनाओं की पहचान करना और भी आसान हो जाएगा।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

N.E.S. एक ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद भविष्य फैलोशिप (FT200100270) और एक ARC डिस्कवरी परियोजना अनुदान (DP210100362) द्वारा समर्थित है। हम एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन तक पहुंच के लिए Bio21 आणविक विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी संस्थान की मेलबोर्न मास स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रोटिओमिक्स सुविधा को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 G Kel-F Hub point style 3 Hamilton company hanc90514
2-Chloroacetamide Sigma Aldrich Pty Ltd C0267-100G
Acetonitrile Sigma Aldrich Pty Ltd 34851-4L
Ammonium hydroxide (28%) Sigma Aldrich Pty Ltd 338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A Pierce 23228
BCA Protein Assay Reagent B Pierce 23224
C8 Empore SPE Sigma Aldrich Pty Ltd 66882-U An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 5.33002
Isopropanol Sigma Aldrich Pty Ltd 650447-2.5L
Methanol Fisher Chemical M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) Sigma Aldrich Pty Ltd 66886-U An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate Sigma Aldrich Pty Ltd D6750-100G
ThermoMixer C Eppendorf 2232000083
trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride Sigma Aldrich Pty Ltd C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich Pty Ltd 252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture Promega V5073
Vacuum concentrator Labconco 7810040
ZIC-HILIC material Merck 1504580001 Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

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<em>Acinetobacter baumannii</em> O-linked Glycopeptides की पहचान के लिए ओपन सर्च-आधारित दृष्टिकोण का अनुप्रयोग
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Lewis, J. M., Coulon, P. M. L., McDaniels, T. A., Scott, N. E. The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides. J. Vis. Exp. (177), e63242, doi:10.3791/63242 (2021).

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