Summary
开放式搜索能够鉴定用先前未知的聚糖组合物修饰的糖肽。在本文中，提出了一种简化的方法，用于进行开放搜索和随后以聚糖为重点的糖肽搜索，用于使用 鲍曼不动杆菌 作为模型的细菌样品。
Abstract
蛋白质糖基化越来越被认为是细菌生物体内的常见修饰，有助于原核生理学和致病物种的最佳感染性。因此，人们对表征细菌糖基化的兴趣越来越大，并且需要高通量分析工具来识别这些事件。虽然自下而上的蛋白质组学很容易产生丰富的糖肽数据，但在原核生物物种中观察到的聚糖的广度和多样性使得细菌糖基化事件的鉴定极具挑战性。
传统上，在细菌蛋白质组学数据集中手动测定聚糖组成，使得这在很大程度上是一种定制的分析，仅限于特定领域的专家。最近，基于开放式搜索的方法已成为识别未知修饰的强大替代方案。通过分析在肽序列上观察到的独特修饰的频率，开放式搜索技术允许鉴定复杂样品中附着在肽上的常见聚糖。本文介绍了用于解释和分析糖蛋白组学数据的简化工作流程，演示了如何在不事先了解聚糖组合物的情况下使用开放式搜索技术来鉴定细菌糖肽。
使用这种方法，可以快速鉴定样品中的糖肽以了解糖基化差异。使用 鲍曼不动杆菌 作为模型，这些方法能够比较菌株之间的聚糖组成并鉴定新的糖蛋白。综上所述，这项工作证明了开放式数据库搜索技术在鉴定细菌糖基化方面的多功能性，使这些高度多样化的糖蛋白组的表征比以往任何时候都更容易。
Introduction
蛋白质糖基化是将碳水化合物附着在蛋白质分子上的过程，是自然界中最常见的翻译后修饰（PTMs）之一1，2。在生命的所有领域，一系列复杂的机器已经进化出来，致力于产生糖蛋白，影响无数的细胞功能1，3，4，5。虽然蛋白质糖基化发生在一系列氨基酸6，7上， 但N-连接和 O-链接糖基化事件是自然界中观察到的两种主要形式。 N-连锁糖基化涉及聚糖连接到天冬酰胺（Asn）残基的氮原子上，而在 O-连锁糖基化中，聚糖连接到丝氨酸（Ser），苏氨酸（Thr）或酪氨酸（Tyr）残基7的氧原子上。尽管糖基化系统所针对的残基相似，但附着在蛋白质上的聚糖内部的差异导致糖基化是自然界中发现的化学多样性最高的PTM类。
虽然真核糖基化系统具有聚糖多样性，但这些系统通常被限制使用的独特碳水化合物的数量。由此产生的多样性源于这些碳水化合物如何排列成聚糖8，9，10，11，12。相比之下，细菌和古菌物种具有几乎无限的聚糖多样性，因为这些系统内产生的独特糖阵列2，10，13，14，15，16，17。在生命领域观察到的聚糖多样性的这些差异代表了糖基化事件的表征和鉴定的重大分析挑战。对于真核糖基化，预测聚糖组成的能力促进了对糖生物学日益增长的兴趣;然而，细菌糖基化的情况并非如此，它仍然在很大程度上局限于由专业实验室进行研究。随着质谱（MS）仪器在生物科学中的可及性增加，基于MS的方法现在是糖蛋白组学分析的主要方法。
MS已成为表征糖基化的典型工具，现在通常使用自上而下和自下而上的方法来表征糖蛋白6。虽然自上而下的蛋白质组学用于评估特定蛋白质的全局糖基化模式18，19，但自下而上的方法用于实现糖肽的聚糖特异性表征，即使来自复杂的混合物6，20，21，22，23。对于糖肽的分析，信息片段化信息的产生对于糖基化事件的表征至关重要24，25。现在，仪器上通常可以使用一系列碎片化方法，包括基于共振离子阱的碰撞诱导解离（IT-CID），光束型碰撞诱导解离（CID）和电子转移解离（ETD）。每种方法在糖肽分析方面具有不同的优点和缺点25，26，在过去的十年中，在应用这些片段化方法分析糖基化方面取得了重大进展6，20。然而，对于细菌糖基化分析，关键限制不是片段糖肽的能力，而是无法预测样品中潜在的聚糖组成。在这些系统中，多种细菌聚糖的未知性质限制了糖肽的鉴定，即使使用以糖基化为重点的搜索工具现在在真核糖肽的分析中也很常见，例如O-Pair27，GlycopeptideGraphMS28和GlycReSoft29。为了克服这个问题，需要一种替代的搜索方法，使用开放搜索工具成为研究细菌糖基化30的强大方法。
开放搜索，也称为盲或通配符搜索，允许识别具有未知或意外PTMs21，30，31，32的肽。开放搜索利用各种计算技术，包括精选修改搜索、多步数据库搜索或宽质量容忍搜索33、34、35、36、37。尽管开放搜索具有巨大的潜力，但与限制搜索相比，其使用通常受到分析时间的显着增加和未修饰肽检测灵敏度损失的阻碍31，32。未修饰肽光谱匹配（PSM）检测的减少是与这些技术相关的假阳性PSM率增加的结果，这需要增加严格的过滤以保持所需的错误发现率（FDR）33，34，35，36，37.最近，已经出现了几种工具，可以显着提高开放搜索的可访问性，包括Byonic31，38，Open-pFind39，ANN-SoLo40和MSFragger21，41。这些工具通过显著缩短分析时间并实施处理异质聚糖组合物的方法，能够可靠地鉴定糖基化事件。
本文提出了一种通过开放搜索鉴定细菌糖肽的简化方法，以革兰氏阴性院内病原体鲍曼不动杆菌为模型。鲍曼尼具有保守的O-连接糖基化系统，负责修饰多种蛋白质底物，称为PglL蛋白质糖基化系统42，43，44。虽然类似的蛋白质是菌株之间糖基化的目标，但由于用于蛋白质糖基化的聚糖的生物合成来自胶囊位点（称为K-位点）44，45，46，PglL糖基化系统是高度可变的。这导致来自单个或有限聚合K单元的多种聚糖（也称为K单元）被添加到蛋白质底物30，44，46中。在这项工作中，使用开放搜索工具MSfragger，在软件FragPipe中，用于鉴定鲍曼氏菌菌株中的聚糖。通过结合开放搜索和手动管理，可以进行“聚糖重点搜索”，以进一步改善细菌糖肽的鉴定。总之，这种多步骤鉴定方法能够在没有丰富经验的新型糖基化事件表征方面鉴定糖肽。
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Protocol
注意：细菌糖肽样品的制备和分析可分为四个部分（图1）。对于这项研究，评估了三种测序 鲍曼氏菌菌株的糖基化（表1）。这些菌株中的每一种的蛋白质组FASTA数据库都可以通过Uniprot访问。有关此协议中使用的缓冲液的组成，请参阅 表 2 。
1. 蛋白质组学分析用蛋白质样品的制备
- 分离感兴趣的蛋白质组样品
- 如果使用全细胞，请确保细胞已用磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）洗涤，以除去培养基中存在的潜在蛋白质污染物。洗涤后快速冷冻全细胞，并将其储存在-80°C直至需要。
- 如果使用分馏样品（如膜制剂），请确保所使用的试剂不会干扰下游液相色谱MS（LC-MS）分析50。
- 如果已使用过十二烷基硫酸钠 （SDS）、Triton X-100、NP-40 或月桂酰肌氨酸等洗涤剂，请使用丙酮沉淀、SP3 样品制备方法51 或商用蛋白质组学净化柱（如 S-traps52）除去这些洗涤剂。或者，用MS相容或可去除的洗涤剂（例如脱氧胆酸钠（SDC）或辛基吡喃葡萄糖苷）代替不相容的洗涤剂。
- 确保所有用于样品制备的塑料器皿和玻璃器皿均未经过高压灭菌。高压灭菌的玻璃器皿和塑料通常被小分子量化合物（例如聚合物）严重污染，这些化合物在MS中很容易检测到。
- 全细胞样品的增溶
- 将〜10mg洗涤的速冻细胞重悬于200μL新鲜制备的脱氧胆酸钠裂解缓冲液（SDC裂解缓冲液：4%SDC在100mM Tris中，pH 8.5）。
注意：蛋白酶抑制剂可以添加到SDC裂解缓冲液中以限制蛋白质降解。 - 将样品在95°C下摇匀（在热混合器上为2000rpm）煮沸10分钟，然后在冰上放置10分钟。重复此过程两次，以确保样品的高效裂解和溶解。
注意：此时样品可以在-80°C下长期储存。 如果储存，在进一步处理之前，通过在95°C下加热来重新溶解。
- 将〜10mg洗涤的速冻细胞重悬于200μL新鲜制备的脱氧胆酸钠裂解缓冲液（SDC裂解缓冲液：4%SDC在100mM Tris中，pH 8.5）。
- 使用比辛可宁酸（BCA）蛋白测定53定量样品蛋白质浓度。将样品储存在冰上，同时进行定量以限制蛋白质降解。
注意：对于总蛋白质组分析，20-100μg蛋白质对于纳米LC-MS来说绰绰有余，每次分析通常需要不到2μg的蛋白质酶切。过量肽的制备允许重复分析或进一步分馏，如果需要深度蛋白质组学覆盖。对于使用亲水相互作用色谱（HILIC）的基于糖肽富集的分析，需要100-500μg蛋白质。 - 减少和烷基化样品。
- 向样品中加入1/10th 体积的10倍还原/烷基化缓冲液（100mM Tris 2-羧乙基膦盐酸盐;400mM 2-氯乙酰胺在1 M Tris中，pH 8.5）的体积，最终浓度为1x，并将样品在黑暗中在45°C下孵育30分钟，并以1，500rpm振荡。
注意：在添加到样品之前，请检查10x还原/烷基化缓冲液的pH值，以确保pH值约为7.0-8.0，因为较低的pH值会导致SDC沉淀。
- 向样品中加入1/10th 体积的10倍还原/烷基化缓冲液（100mM Tris 2-羧乙基膦盐酸盐;400mM 2-氯乙酰胺在1 M Tris中，pH 8.5）的体积，最终浓度为1x，并将样品在黑暗中在45°C下孵育30分钟，并以1，500rpm振荡。
- 短暂地旋转样品并加入蛋白酶胰蛋白酶/ Lys-C（〜10μL，重悬于100mM Tris中，pH 8.5），使最终蛋白酶：蛋白质比为1：100。将消化物在37°C下孵育过夜，以1，500rpm（长达18小时）振荡。为确保蛋白质完全消化，请使用胰蛋白酶/Lys-C 蛋白酶：蛋白质比例为 1：50 至 1：200。
- 淬火通过向样品中加入1.25体积的100%异丙醇来消化。涡旋样品1分钟以混合并短暂旋转它们。
注意：样品可以储存在-20°C下，以便以后进一步处理。 - 通过加入0.115体积的10%三氟乙酸（TFA;终浓度〜1%TFA）来酸化样品，涡旋样品，并短暂旋转它们。
2. 蛋白质组样品的处理
- 蛋白质组样品的肽纯化
- 如前所述54，为每个样品制备一个苯乙烯基苯反相磺酸盐（SDB-RPS）停止和去提取（阶段）尖端。
- 根据经验，为了结合50μg肽，使用钝针（14G）从47mm2 SDB-RPS膜上切除三个SDB-RPS光盘。对于较大的肽量，请相应地增加椎间盘的数量。
- 在使用SDB-RPS Stage Tips之前，通过依次添加至少十个床体积的以下缓冲液来制备吸头，并通过离心（25°C，3分钟，500× g）或通过使用注射器轻轻施加压力将缓冲液推过色谱柱来使缓冲液通过柱旋转。
- 用150μL100%乙腈润湿吸头。
- 用150μL30%甲醇，1%TFA在18.2 MΩH 2O中洗涤尖端。
- 用150μL90%异丙醇，1%TFA与18.2 MΩH 2O平衡平衡吸头。
- 通过离心（25°C，3分钟，500× g）或通过使用注射器轻轻施加压力，将样品（含有50%异丙醇，1%TFA）加载到SDB-RPS载物台吸头上。
- 通过离心（25°C，3分钟，500× g）或通过使用注射器轻轻施加压力，用以下缓冲液洗涤SDB-RPS级吸头。
注意：额外的洗涤剂或替代缓冲液可用于去除非肽污染物，例如使用乙酸乙酯代替异丙醇55。- 用150μL90%异丙醇，1%TFA洗涤尖端。
- 用150μL 1%TFA在18.2 MΩ H2O中洗涤尖端。
- 通过离心或使用注射器轻轻施加压力，用150μL5%氢氧化铵在80%乙腈中洗脱SDB-RPS阶段尖端中的肽。将样品收集在单独的试管中。
注意：在通风橱内使用之前，立即在塑料容器中用80%乙腈制备5%氢氧化铵。 - 通过在25°C下真空离心干燥洗脱的肽。
注意：如果进行HILIC富集，此时可以去除1-10%的肽洗脱物，干燥并用作总蛋白质组输入对照。
- 如前所述54，为每个样品制备一个苯乙烯基苯反相磺酸盐（SDB-RPS）停止和去提取（阶段）尖端。
- 糖肽样品的富集
- 准备两性离子亲水相互作用液相色谱（ZIC-HILIC）阶段提示，如前所述54，56。
- 简而言之，使用钝针（14 G）从47 mm2 C 8膜上切下一个C8圆盘，然后将圆盘包装到P200尖端中以形成熔块。通过使用注射器轻轻施加压力，将约5mm的ZIC-HILIC材料重悬于50%乙腈，50%18.2 MΩ H2O中，加入到熔块上。
- 在使用 ZIC-HILIC 载物台吸头之前，通过依次添加以下缓冲液并使用注射器轻轻施加压力来调理树脂。
注意：为确保ZIC-HILIC树脂表面伪水层的完整性（需要富集糖肽），树脂必须始终保持湿润。洗涤树脂时，始终在树脂上方留下约10μL溶剂，并确保洗涤/样品直接移液到该残留溶剂中。- 用20床体积（200μL）的ZIC-HILIC洗脱缓冲液（0.1%TFA在18.2 MΩ H2O中）平衡树脂。
- 用20床体积（200μL）的ZIC-HILIC制备缓冲液（95%乙腈在18.2 MΩ H2O中）洗涤树脂。
- 用20床体积（200μL）的ZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液（80%乙腈，1%TFA与18.2 MΩ H2O平衡）洗涤树脂。
- 将干燥的消化样品（从步骤2.1.6开始）重悬于ZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液中至终浓度为4μg/ μL（例如，对于200μg肽，重悬于50μLZIC-HILIC上样/洗涤缓冲液中）。短暂涡旋1分钟以确保样品重悬，并在25°C下在2，000× g 下旋转1分钟。
- 将重悬的肽样品上样到条件化的ZIC-HILIC色谱柱上。
- 使用注射器轻轻施加压力，用 20 床体积 （200 μL） 的 ZIC-HILIC 上样/洗涤缓冲液（总共 60 床体积洗涤）洗涤三次。
- 用20床体积（200μL）的ZIC-HILIC洗脱缓冲液洗脱糖肽通过使用注射器轻轻施加压力进入1.5mL管中，然后通过在25°C下真空离心干燥洗脱液。
- 准备两性离子亲水相互作用液相色谱（ZIC-HILIC）阶段提示，如前所述54，56。
3. 蛋白组/富含糖肽的样品的LC-MS
- 将样品重悬于缓冲液A*（2%乙腈，0.1%TFA）中至终浓度为1μg/ μL（例如，对于50μg肽，重悬于50μL缓冲液A *）。
- 将样品装载到与MS偶联的HPLC / UPLC上，以实现糖肽的分离和鉴定。
注：色谱柱参数，包括内径、长度、流速、色谱树脂类型和所需的肽注射量，应针对要使用的分析设置和梯度长度进行优化;有关如何优化分析设置的示例，请参见57。 - 监控生成的MS数据的收集，确保使用所需的参数收集数据。
注意：对于成分分析，CID片段化就足够了。由于在糖肽中加入聚糖，通常观察到糖肽离子具有比未糖基化肽更高的 m / z 和更低的电荷密度。为了确保这些离子是可观测的，允许MS1质量范围从400到2，000 m / z。 - 使用CID选择片段离子，确保收集含有对聚糖表征重要的氧离子的低 m / z 片段离子。
注意：使用CID的糖肽的片段化受肽和聚糖序列的影响，以及片段化过程中施加的能量25，58，59。虽然可以使用一系列不同的碰撞能量，但分割糖肽的最佳策略是使用阶梯式碰撞能量，结合使用多种碰撞能量25，59，60。 - 如果可用，请使用替代的片段化方法，例如用于位点定位的ETD，或IT-CID以帮助测定聚糖组成。
注意：这两种片段化方法对于成分分析都不是必需的，但可以收集以进一步询问感兴趣的糖肽。
4. 蛋白质组/富含糖肽的样品分析
- 预过滤数据文件以启用在 FragPipe 中进行搜索
- 如果在数据集中采集了 ETD 或 IT-CID 扫描，请在使用 FragPipe 进行搜索之前，使用 MSConvert61 从数据文件中筛选这些扫描事件。
注意：对于下面概述的开放搜索参数，只需要波束型CID数据。
- 如果在数据集中采集了 ETD 或 IT-CID 扫描，请在使用 FragPipe 进行搜索之前，使用 MSConvert61 从数据文件中筛选这些扫描事件。
- 在 FragPipe 中执行开放搜索
- 打开 FragPipe，然后单击 工作流 选项卡。在工作流下拉菜单中，选择“ 打开 搜索”选项，然后单击“ 添加文件 ”以将要搜索的数据文件导入 FragPipe（图 2A）。
- 单击数据库选项卡，然后单击下载启动下载管理器。这允许使用 Uniprot 蛋白质组 ID 从 Uniprot 下载蛋白质组数据库。单击下载管理器中的“添加诱饵和污染物”选项，将诱饵和污染物蛋白质合并到数据库中。
- 有关更严格的 FDR 阈值，请单击“ 验证 ”选项卡，然后将 “筛选器和报告” 值从 0.01 修改为 所需的 FDR。
注意：默认的FragPipe设置将确保蛋白质水平的FDR为1%。 - 单击 MSfragger 选项卡。在 峰值匹配 框中，将 前驱体质量公差 从默认的500 Da增加到 2，000 Da ，以允许识别大型修饰（图2A）。
- 单击 运行 选项卡并定义 FragPipe 输出的位置。单击“ 运行 ”按钮开始搜索。
- 使用跨数据集识别的PSM（包含在FragPipe的psm.tsv输出中），通过绘制数据集中观察到的δ质量的频率来识别潜在的聚糖（图3）。使用可通过 PRIDE 加入 PXD027820 访问的 R 脚本，从 MSfragger 输出创建增量质量图。
注意：在这些脚本中对开放搜索结果进行最少的后处理，因为这些脚本的主要目的是帮助可视化增量质量配置文件。重要的是，仅观察丰富的δ质量并不能证明修饰是潜在的聚糖，因为将δ质量指定为聚糖需要进一步分析相应的MS2事件。 - 为了能够在样品中表征糖肽，请专注于高置信度δ质量鉴定，对应于具有高超分数的分配。
- 为了帮助评估糖肽谱，请使用肽注释工具，例如交互式肽光谱注释器63，它可以在光谱中分配肽相关离子，从而允许手动鉴定聚糖相关离子（图4）。
注意：在这里提供的数据集中，>30的超评分被认为是高分，因为这些得分对应于所有已鉴定的糖肽的前50%内的得分（图5）。
- 为了帮助评估糖肽谱，请使用肽注释工具，例如交互式肽光谱注释器63，它可以在光谱中分配肽相关离子，从而允许手动鉴定聚糖相关离子（图4）。
- 通过分配高置信度糖肽，鉴定通常观察到的聚糖相关离子（图4）以改善糖肽的鉴定。
注意：通过在搜索中加入聚糖相关离子，称为聚糖聚焦搜索，可以提高糖肽分配的质量。- 单击 FragPipe 的 MSfragger 选项卡，将观察到的聚糖的确定的增量质量合并到 变量修饰 和 质量偏移 部分。通过在 “变量修改 ”和“ 质量偏移” 部分中键入值来添加这些质量，并用 / 分隔单个质量。将这些聚糖的聚糖相关片段团添加到MSFragger的 糖/Labile mods 部分。
注： 图2B 概述了以聚糖为重点搜索 鲍曼 氏菌菌株AB307-0294所需的关键信息。
- 单击 FragPipe 的 MSfragger 选项卡，将观察到的聚糖的确定的增量质量合并到 变量修饰 和 质量偏移 部分。通过在 “变量修改 ”和“ 质量偏移” 部分中键入值来添加这些质量，并用 / 分隔单个质量。将这些聚糖的聚糖相关片段团添加到MSFragger的 糖/Labile mods 部分。
- 将与蛋白质组学研究相关的所有MS数据上传到集中式蛋白质组学存储库，例如PRIDE或MASSIVE存储库。
注意：与本研究相关的所有数据都已存入PRIDE蛋白质组学存储库，可以通过PRIDE加入：PXD027820进行访问。
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Representative Results
为了说明开放搜索细菌糖肽分析的效用，评估了鲍曼氏菌-AB307-0294，ACICU和D1279779-3株中O-连接聚糖的化学多样性。O-连接的糖蛋白组在鲍曼氏菌菌株之间是高度可变的，因为用于糖基化的聚糖来自高度可变的胶囊位点44，45，46。这种化学多样性使鲍曼氏菌成为开放式搜索研究的理想模型系统。虽然以前没有评估过这三种菌株的糖蛋白组，但其中两种菌株AB307-029464和ACICU65的胶囊结构是已知的，D1279779的胶囊尚未阐明。
与AB307-0294的胶囊一致，AB307-0294的开放搜索显示两个显性δ质量，对应于648.25 Da和692.28 Da（图3A）。这些质量与Russo等人先前确定的胶囊结构相匹配，-β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA，其中QuiNAc4NR残基对应于2，4-二氨基-2，4，6-三脱氧基葡萄糖，用3-OH-丁酸盐或乙酰基64修饰。类似地，ACICU胶囊已知由四糖K单元组成，先前被鉴定为Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Galp-NAc-，对应于预测质量为843.31 Da65。这种胶囊结构与ACICU数据中最常观察到的δ质量一致（图3B）。最后，对菌株D1279779的开放搜索分析显示存在与203.08，794.31和1588.62 Da一致的多个δ质量（图3C）。虽然质量203.08与单个HexNAc残基的质量一致，但794.31和1588.62对应于未知的修饰。应该注意的是，质量1588.62正好是794.31的两倍，这表明这些肽用聚糖K单位二聚体装饰，正如先前在其他不动杆菌糖蛋白组30，44，46中观察到的那样。
增量质量图提供了一种快速有效的方法来评估样品中观察到的修饰的频率。然而，对于复杂的修饰，例如聚糖，仅存在δ质量并不能提供定义聚糖确切组成的信息。为了帮助测定聚糖组成，可以使用分配给特定增量质量的PSM的MS / MS数据。通过关注高置信度糖肽分配（在对应于具有高超分数的PSM的MSFragger中），手动分析可用于进一步表征菌株用于蛋白质糖基化的聚糖。应该注意的是，高置信度肽分配通常包含强大的聚糖信息，允许基于Y离子测定聚糖组成。该信息可用于鉴定聚糖保持附着在肽上的相应片段，以及可用于分配聚糖66的B和氧相关离子。关于如何分配聚糖组合物的详细指南之前已经概述过，建议读者参考Harvey等人67。使用诸如交互式肽光谱注释器63之类的工具，可以很容易地识别肽相关离子，使用户能够确定附着在肽上的聚糖的特性。
使用交互式肽光谱注释器，评估了在这三 个鲍曼 氏杆菌样品中鉴定出的糖肽，揭示了潜在的聚糖相关离子。考虑AB307-0294糖肽SAGDQAASDIATATDNASAK的MS / MS光谱，用聚糖648.25和692.28 Da装饰（图4A，B）;在相似的片段化条件下，聚糖相关离子高度相似，但质量偏移了44.02 Da.分析这些PSM中的聚糖离子可以确认观察到的这些糖肽的δ质量对应于含有四种不同碳水化合物的三糖：dHexNAcNAc（228 Da），dHexNAcNBu（272 Da），HexNAcA（217 Da）和HexNAc（203 Da）。应该注意的是，在分配聚糖片段时，使用CID片段化时，多种单糖容易失水。这可以在ACICU的聚糖中看到，其中单糖Pse5Ac7Ac（316 Da）导致两个突出的聚糖相关片段的产生：MH + 299.12和317.13，质量差异对应于水的质量（18.01 Da）（图4C）。
此外，在分析细菌聚糖时，通常观察到与真核生物中未观察到的糖相对应的意外单糖团块。在D1279779的糖肽PSM中可以看到这方面的一个例子，其中对最常见的δ质量794.31 Da的分析揭示了存在一种不寻常的单糖dHexNAc（187 Da，观察为188.09的MH + ， 图4D），这在 A. baumannii O-linked聚糖44中已经观察到。虽然高质量精度的测量和聚糖作为从肽骨架中丢失的不稳定修饰的特征行为可以帮助确定聚糖的潜在化学组成，但建议尽量减少对MS数据的过度解释。如果特定糖的立体化学或聚糖的连锁信息未知，则最佳做法是使用结构激动剂分配，包括按其特定类别引用单糖。这方面的一个例子是将203.08 Da残基称为 N-乙酰基己糖胺（HexNAc），并避免分配链接类型。如果需要，建议使用其他技术来定义未知修饰的确切化学特性，例如使用核磁共振（NMR）。
虽然开放式搜索方法可以快速鉴定修饰的肽，但重要的是要注意，这种搜索方法可以忽略数据集中潜在的糖肽。在开放搜索中，糖肽可能由于多种原因而无法被识别，包括肽片段化信息不足或由于MS2事件中存在多个未分配的离子而对分配的肽进行惩罚。后者对于细菌糖肽PSM尤其如此，因为这些光谱可以包含默认情况下未考虑的开放搜索参数的聚糖相关片段。由于不匹配的特征会对PSM的评分产生不利影响，因此最小化MS / MS光谱中不匹配的离子可以鉴定由于FDR控制的最小评分阈值而最初被排除的糖肽。为了克服这一限制，从开放搜索中定义的肿块（图3）和手动定义的聚糖相关离子（图4）可以合并到搜索参数中以改善糖肽的鉴定。重要的是要注意，这些聚糖相关离子可以根据聚糖的 从头 测定，常见氧离子44，68的先验知识或使用可以捕获光谱内重复发生的离子的工具（例如SPectral Immonium离子检测工具69，76）手动鉴定。
为了证明这一点，通过开放搜索分析鉴定出的大量非典型聚糖片段被纳入MSFragger的搜索参数中，并进行了聚糖聚焦搜索（菌株AB307-0294的聚糖聚焦设置如图2B所示）。应该注意的是，当同时搜索多种聚糖时，在选择Y离子和诊断肿块时应小心，以确保它们准确反映与每个δ质量相关的碎片离子。虽然对于Y和相互排斥的诊断肿块的组合，例如AB307-0294的648.25和692.28聚糖的片段（图4A，B），这可能并不总是可能的，但聚糖的搜索仍然是可能的，尽管这可能会影响搜索结果的稳健性。以聚糖为重点的检索导致在所有三种鲍曼氏菌菌株中发现的糖肽PSM总数显着增加，对应于ACICU增加37%，AB307-0294增加117%，D1279779增加363%（图5A-C）。对于单个MS事件，包含聚糖特异性信息通常会导致观察到的高分内增加，尽管这种增加是高度聚糖依赖性的（图5D，E）。因此，通过使用通过开放搜索揭示的聚糖质量来细化搜索参数，并随后将手动策划的聚糖片段信息合并到靶向搜索中，可以获得样品中糖肽的更详细的分析。
图1：细菌糖肽制备和分析的关键步骤概述。 细菌糖肽的成功鉴定取决于含有糖肽的高质量样品的产生。然后通过LC-MS分析含糖肽的样品，随后，使用开放式搜索方法基于独特的δ质量鉴定潜在的糖肽。使用手动管理，这些δ质量可以被识别为聚糖。最后，为了提高糖肽的鉴定，聚糖信息可以被纳入以聚糖为重点的数据库搜索中。缩写：LC-MS =液相色谱与质谱耦合;OD = 光密度;SDB-RPS = 苯乙烯二乙烯基苯反相磺酸盐;ZIC-HILIC = 两性离子亲水相互作用液相色谱;PSM = 肽光谱匹配;CID = 碰撞诱导的解离;ETD = 电子转移解离。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：如何在 FragPipe 中启用开放式搜索和聚糖搜索的概述。（A） 通过在 FragPipe 的“工作流”选项卡中加载“打开工作流”，可以启用开放式搜索。为了能够识别大小大于500 Da的聚糖，将前体质量耐受窗口增加到2，000 Da. （B）以聚糖为重点的非典型聚糖搜索需要在MSFragger选项卡中输入聚糖信息，以定义修饰的预期质量（在可变修饰和质量偏移部分），与这些聚糖相关的Y离子（在糖/不稳定的Y离子质量列表中） 部分），以及低质量聚糖片段离子（进入糖/不稳定部分的诊断片段质量列表）。请点击此处查看此图的大图。
图3：鲍曼不动杆菌3株（AB307-0294，ACICU和D1279779）的开放搜索结果的增量质量图。 与胶囊位点的多样性一致，每个鲍曼氏菌菌株都具有独特的δ质量特征，其显着的修饰大于140 Da，用观察到的δ质量表示。（A）在AB307-0294三角形质量图中，质量648.25和692.28对应于与-β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-一致的修饰，其中QuiNAc4NR用3-OH-丁酸盐或乙酰基64修饰。（B）在ACICU三角洲质量图中，质量203.08和843.31对应于HexNAc和Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc的修饰，分别为65。（C） 在 D1279779 三角形质量图中，质量 203.08、794.31 和 1588.62 对应于 HexNAc、HexNAc-217-187-187 和 HexNAc-217-187-187 的二聚体。在图4中手动评估和确认的δ质量是用*表示的聚糖。请点击此处查看此图的大图。
图4：在三种鲍曼不动杆菌菌株中观察到的δ质量的MS / MS表征。（一、二） AB307-0294，（C）ACICU和（D）D1279779。交互式肽光谱注释器辅助的代表性糖肽注释光谱。对于每个光谱，肽片段离子以蓝色和红色表示，而手动分配的聚糖相关离子以绿色表示。聚糖已使用聚糖的符号命名法进行注释，其中HexNAc表示为正方形，Hex表示为圆形，非典型单糖表示为梯形，聚糖的质量表示为梯形。缩写：MS/MS = 串联质谱。请点击此处查看此图的大图。
图5：使用开放与聚糖聚焦搜索在鲍曼不动杆菌菌株中鉴定的糖肽的比较。 （A-C）使用开放和聚糖聚焦搜索比较 D1279779、ACICU 和 AB307-0294 中的超分数和 PSM 分配数。（D-F）使用D1279779，ACICU和AB307-0294的开放和聚糖聚焦搜索来比较分配给相同肽序列的单个MS2事件。缩写：PSM = 肽-光谱匹配。请点击此处查看此图的大图。
| 鲍曼尼 株 | 单克隆蛋白 ID |
| AB307-0294 15 | UP000006924 |
| ACICU 47，48 | UP000008839 |
| D1279779 49 | UP000011860 |
表 1.本研究中使用的菌株和Uniprot蛋白质组ID。
| 缓冲区名称 | 缓冲液成分/pH值 | |
| 缓冲区 A* | 2% 乙腈，18.2 MΩ H 2O，0.1% 三氟乙酸 / pH 1.0 | |
| 美国公共广播公司 | 137 mM 氯化钠、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4 和 2 mM KH2PO4 / pH 7.4 | |
| 还原/烷基化缓冲液 | 100 mM Tris 2-羧乙基膦盐酸盐， 400 mM 2-氯乙酰胺 1 M Tris / pH 7.5 | |
| SDB-RPS 台尖洗脱缓冲液 | 5%氢氧化铵在80%乙腈中/ pH 11 | |
| SDB-RPS 载物台头均衡缓冲液 | 30%甲醇，1%三氟乙酸，在18.2 MΩ H2O / pH 1.0 | |
| SDB-RPS 载物台头均衡/清洗缓冲液 | 90%异丙醇，1%三氟乙酸/pH 1.0 | |
| SDB-RPS 台尖清洗缓冲液 | 1%三氟乙酸在18.2 MΩ H2O / pH 1.0 | |
| SDC 裂解缓冲液 | 4% SDC，100 mM 三倍/pH 8.5 | |
| ZIC-HILIC 洗脱缓冲液 | 0.1% 三氟乙酸，18.2 MΩ H2O /pH 1.0 | |
| ZIC-HILIC 上样/清洗缓冲液 | 80% 乙腈，1% 三氟乙酸，18.2 MΩ H2O / pH 1.0 | |
| 锡克-希利克制备缓冲液 | 95% 乙腈，18.2 MΩ H2O / pH 7.0 | |
表2：本研究中使用的缓冲液的组成。
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Discussion
开放式搜索是识别未知修饰的有效和系统的方法。虽然在细菌蛋白质组样品中鉴定未知聚糖传统上是一项耗时且技术上专业化的工作，但最近开发的工具如MSfragger21，41 和Byonic31，38 现在能够快速有效地鉴定δ团块，以进一步表征为附着在肽上的潜在聚糖。对标准和富含糖肽的蛋白质组样品进行开放搜索可以鉴定潜在的糖肽（图1）。糖肽在许多细菌系统的蛋白质组内的共性和丰度使得在没有糖肽富集的情况下直接检测这些修饰成为可能6。尽管对于许多糖基化系统70，糖肽富集方法通常仍优于非基于浓缩的方法，但值得注意的是，并非所有聚糖都同样适合富集71，72。在确定使用给定生物样品的开放搜索来鉴定糖基化事件的最合适方法时，应考虑这一事实。
虽然开放式搜索可以有效地识别在样品中以高频率观察到的聚糖，但它在识别数据集中很少发生的糖基化事件方面仍然无效。实际上，要鉴定聚糖的唯一δ质量，样品中必须存在至少10个具有相同δ质量的PSM。这个最小频率允许潜在的聚糖在背景增量质量分配之上被区分（图3）。虽然靶向多个底物进行糖基化的一般糖基化系统通常满足这一标准，但靶向单个蛋白质用于糖基化的系统可能不太适合这种方法。随着MS仪器的速度和灵敏度的提高，这可能越来越多地能够评估低丰度糖肽群体，这反过来又会增强开放搜索方法的有效性，前提是可以为稀有/低丰度糖型生成足够的质量谱。
虽然MS能够有效鉴定新型聚糖，但重要的是要注意，仅凭这种见解很少提供糖肽/聚糖的完整结构表征，NMR光谱等工具对于完整的聚糖表征仍然至关重要。如这里所观察到的，MS提供了先前使用NMR从 鲍曼氏杆菌 ACICU和AB307-029464，65的分离胶囊中测定的K单位的补充确认。然而，对于在D1279779中鉴定的主要聚糖，只有关于该聚糖内单糖的推定类别的信息是可分配的，MS没有提供有关这些糖单元的连锁类型或立体化学的信息（图4）。随着新的MS片段化方法变得越来越广泛，例如紫外光解离73，74，糖肽的结构表征可能是可能的。然而，在与当前仪器推断连锁或立体化学信息时应小心。除了这些考虑因素之外，最近还提出了关于基于FDR的控制措施是否适合开放搜索75的问题。因此，虽然开放式搜索是一种强大的方法，但这些考虑因素突出表明，在仅基于开放式搜索信息的解释聚糖分配时需要小心。
虽然这项工作表明，开放式搜索是无监督鉴定用于细菌糖基化的聚糖的有效方法，但仅开放搜索仅提供对样品中所有糖肽的子集的访问。由于聚糖的不稳定性质，糖肽PSM通常含有多种聚糖相关片段，如果不加以解释，将对PSM的评分产生不利影响。为了克服这个问题并允许更深入地鉴定糖肽，通过开放搜索获得的聚糖信息随后可用于为聚糖聚焦搜索提供信息（图2B）。通过这种方式，开放式搜索，加上手动测定聚糖相关片段，可用于改善样品中分配的糖肽的质量和数量（图5）。尽管糖肽搜索参数的细化是使用当前版本的工具（例如MSfragger）手动进行的，但随着该领域的成熟，这些步骤可能会以自动化的方式完成。研究已经证明了鉴定与特定PTMs69相关的重复低分子量离子的计算方法，以及鉴定与未知糖肽相关的氧离子和重复Y离子质量的策略76。因此，这些步骤很可能会被整合到FragPipe等工具的新迭代中，从而更容易识别细菌和真核样品中以前未知的糖基化事件。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
N.E.S.由澳大利亚研究委员会未来奖学金（FT200100270）和ARC发现项目赠款（DP210100362）提供支持。我们感谢Bio21分子科学和生物技术研究所的墨尔本质谱和蛋白质组学设施对MS仪器的使用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 G Kel-F Hub point style 3 | Hamilton company | hanc90514 | |
| 2-Chloroacetamide | Sigma Aldrich Pty Ltd | C0267-100G | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich Pty Ltd | 34851-4L | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 338818-100ML | |
| BCA Protein Assay Reagent A | Pierce | 23228 | |
| BCA Protein Assay Reagent B | Pierce | 23224 | |
| C8 Empore SPE | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66882-U | An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Formic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 5.33002 | |
| Isopropanol | Sigma Aldrich Pty Ltd | 650447-2.5L | |
| Methanol | Fisher Chemical | M/4058/17 | |
| SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66886-U | An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich Pty Ltd | D6750-100G | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 2232000083 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 302031-10X1ML | |
| Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | C4706-2G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich Pty Ltd | 252859-500G | |
| Trypsin/Lys-C protease mixture | Promega | V5073 | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810040 | |
| ZIC-HILIC material | Merck | 1504580001 | Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin |
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