Summary
Открытый поиск позволяет идентифицировать гликопептиды, украшенные ранее неизвестными гликанными композициями. В этой статье представлен упрощенный подход к проведению открытого поиска и последующего поиска гликопептидов, ориентированных на гликикан, для бактериальных образцов с использованием Acinetobacter baumannii в качестве модели.
Abstract
Белковое гликозилирование все чаще признается в качестве общей модификации в бактериальных организмах, способствуя прокариотической физиологии и оптимальной инфекционности патогенных видов. В связи с этим растет интерес к характеристике бактериального гликозилирования и потребность в высокопроизводительных аналитических инструментах для выявления этих событий. Хотя протеомика снизу вверх легко позволяет генерировать богатые данные о гликопептидах, широта и разнообразие гликанов, наблюдаемых у видов прокариот, делают идентификацию событий бактериального гликозилирования чрезвычайно сложной.
Традиционно ручное определение составов гликанов в наборах бактериальных протеомных данных делало этот анализ в значительной степени индивидуальным, ограниченным отраслевыми экспертами. В последнее время открытые поисковые подходы стали мощной альтернативой для выявления неизвестных модификаций. Анализируя частоту уникальных модификаций, наблюдаемых на пептидных последовательностях, открытые методы поиска позволяют идентифицировать общие гликаны, прикрепленные к пептидам в сложных образцах. В этой статье представлен оптимизированный рабочий процесс для интерпретации и анализа гликопротеомных данных, демонстрирующий, как открытые методы поиска могут быть использованы для идентификации бактериальных гликопептидов без предварительного знания составов гликанов.
Используя этот подход, гликопептиды в образцах могут быть быстро идентифицированы для понимания различий гликозилирования. Используя Acinetobacter baumannii в качестве модели, эти подходы позволяют сравнивать гликановые композиции между штаммами и идентифицировать новые гликопротеины. Взятые вместе, эта работа демонстрирует универсальность открытых методов поиска в базе данных для идентификации бактериального гликозилирования, что делает характеристику этих очень разнообразных гликопротеомов проще, чем когда-либо прежде.
Introduction
Белковое гликозилирование, процесс присоединения углеводов к белковым молекулам, является одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций (ПТМ) в природе 1,2. Во всех областях жизни развился ряд сложных механизмов, предназначенных для генерации гликопротеинов, которые влияют на множество клеточных функций 1,3,4,5. В то время как гликозилирование белка происходит на диапазоне аминокислот 6,7, N-связанные и O-связанные события гликозилирования являются двумя доминирующими формами, наблюдаемыми в природе. N-связанное гликозилирование включает присоединение гликанов к атому азота остатков аспарагина (Asn), в то время как при O-связанном гликозилировании гликокислоты присоединяются к атому кислорода остатков серина (Ser), треонина (Thr) или тирозина (Tyr)7. Несмотря на сходство в остатках, на которые нацелены системы гликозилирования, различия в гликанах, прикрепленных к белкам, приводят к тому, что гликозилирование является наиболее химически разнообразным классом ПТМ, обнаруженных в природе.
В то время как системы эукариотического гликозилирования обладают гликанцевым разнообразием, эти системы, как правило, ограничены в количестве используемых уникальных углеводов. Полученное разнообразие связано с тем, как эти углеводы распределены вгликаны 8,9,10,11,12. Напротив, бактериальные и архейные виды обладают практически неограниченным разнообразием гликанов из-за огромного количества уникальных сахаров, образующихся в этих системах 2,10,13,14,15,16,17. Эти различия в разнообразии гликанов, наблюдаемые в разных областях жизни, представляют собой значительную аналитическую проблему для характеристики и идентификации событий гликозилирования. Для эукариотического гликозилирования способность предвидеть гликовые композиции способствовала росту интереса к гликобиологии; тем не менее, то же самое не относится к бактериальному гликозилированию, которое по-прежнему в значительной степени ограничено изучением специализированными лабораториями. Поскольку доступность приборов масс-спектрометрии (МС) возросла в биологических науках, подходы, основанные на МС, в настоящее время являются основным методом гликопротеомного анализа.
РС стал квинтэссенцией инструмента для характеристики гликозилирования, причем как нисходящий, так и восходящий подходы в настоящее время широко используются для характеристики гликопротеинов6. В то время как нисходящая протеомика используется для оценки глобальных паттернов гликозилирования специфических белков 18,19, подходы «снизу вверх» используются для обеспечения гликан-специфической характеристики гликопептидов даже из сложных смесей 6,20,21,22,23. Для анализа гликопептидов генерация информативной информации о фрагментации имеет важное значение для характеристики событий гликозилирования24,25. В настоящее время на приборах обычно доступен ряд подходов к фрагментации, включая диссоциацию, вызванную столкновением на основе резонансной ионной ловушки (IT-CID), диссоциацию, вызванную столкновением пучка (CID), и диссоциацию переноса электронов (ETD). Каждый подход обладает различными сильными и слабыми сторонами для анализа гликопептидов25,26, со значительным прогрессом за последнее десятилетие в применении этих подходов к фрагментации для анализа гликозилирования 6,20. Однако для анализа бактериального гликозилирования критическим ограничением была не способность фрагментировать гликопептиды, а скорее неспособность предсказать потенциальные составы гликанов в образцах. В этих системах неизвестная природа разнообразных бактериальных гликанов ограничивает идентификацию гликопептидов, даже с помощью инструментов поиска, ориентированных на гликозилирование, которые в настоящее время являются обычным явлением для анализа эукариотических гликопептидов, таких как O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 и GlycReSoft29. Чтобы преодолеть эту проблему, требуется альтернативный метод поиска с использованием открытых поисковых инструментов, возникающих в качестве мощного подхода к изучению бактериального гликозилирования30.
Открытый поиск, также известный как слепой или подстановочный поиск, позволяет идентифицировать пептиды с неизвестными или неожиданными PTM 21,30,31,32. Открытый поиск использует различные вычислительные методы, включая кураторский поиск модификаций, многошаговый поиск по базе данных или широкомасштабный толерантный поиск 33,34,35,36,37. Хотя открытый поиск имеет большой потенциал, его использование, как правило, затрудняется значительным увеличением времени анализа и потерей чувствительности обнаружения немодифицированных пептидов по сравнению с ограниченными поисками31,32. Снижение обнаружения немодифицированных пептидно-спектральных совпадений (PSM) является результатом увеличения частоты ложноположительных PSM, связанных с этими методами, что требует усиленной строгой фильтрации для поддержания желаемых показателей ложного обнаружения (FDR)33,34,35,36,37 . В последнее время стало доступно несколько инструментов, которые значительно улучшают доступность открытого поиска, в том числе Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 и MSFragger21,41. Эти инструменты позволяют надежно идентифицировать события гликозилирования за счет значительного сокращения времени анализа и реализации подходов к обработке гетерогенных гликановых композиций.
В данной статье представлен упрощенный метод идентификации бактериальных гликопептидов путем открытого поиска с использованием в качестве модели грамотрицательного внутрибольничного патогена Acinetobacter baumannii. A. baumannii обладает сохраненной O-связанной системой гликозилирования, ответственной за модификацию нескольких белковых субстратов, известной как система гликозилирования белка PglL 42,43,44. В то время как подобные белки нацелены на гликозилирование между штаммами, система гликозилирования PglL сильно варьируется из-за биосинтеза гликана, используемого для гликозилирования белка, полученного из локуса капсулы (известного как K-локус)44,45,46. Это приводит к тому, что различные гликаны (также известные как K-единица), полученные из одиночных или ограниченных полимеризованных K-единиц, добавляются к белковым субстратам 30,44,46. В рамках этой работы использование инструмента открытого поиска MSfragger в программном обеспечении FragPipe используется для идентификации гликанов в штаммах A. baumannii. Сочетая открытый поиск и ручное курирование, можно предпринять «гликано-ориентированные поиски» для дальнейшего улучшения идентификации бактериальных гликопептидов. В совокупности этот многоступенчатый подход к идентификации позволяет идентифицировать гликопептиды без обширного опыта в характеристике новых событий гликозилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка и анализ образцов бактериальных гликопептидов можно разделить на четыре раздела (рисунок 1). Для этого исследования оценивали гликозилирование трех секвенированных штаммов A. baumannii (таблица 1). Базы данных Proteome FASTA каждого из этих штаммов доступны через Uniprot. Состав буферов, используемых в этом протоколе, приведен в таблице 2 .
1. Подготовка белковых образцов к протеомному анализу
- Выделение интересующих образцов протеомов
- При использовании целых клеток убедитесь, что клетки были промыты фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления потенциальных белковых загрязнителей, присутствующих в среде. Заморозьте целые ячейки после промывки и храните их при -80 °C до тех пор, пока это потребуется.
- Если используются фракционированные образцы (например, мембранные препараты), убедитесь, что используемые реагенты не будут мешать последующему анализу жидкой хроматографии MS (LC-MS)50.
- Если были использованы моющие средства, такие как додецилсульфат натрия (SDS), тритон X-100, NP-40 или лауроилсаркозин, удалите эти моющие средства с использованием осаждения ацетона, методов пробоподготовки SP351 или коммерческих протеомных очистных колонн, таких как S-ловушки52. Альтернативно, замените несовместимые моющие средства MS-совместимым или съемным моющим средством, таким как дезоксихолат натрия (SDC) или октилглюкопиранозид.
- Убедитесь, что вся пластиковая и стеклянная посуда, используемая для подготовки образцов, не была автоклавирована. Автоклавная стеклянная посуда и пластмассы, как правило, сильно загрязнены соединениями с малой молекулярной массой, такими как полимеры, которые легко обнаруживаются в РС.
- Солюбилизация цельноклеточных образцов
- Повторное суспендирование ~10 мг промытых, замороженных клеток в 200 мкл свежеприготовленного буфера лизиса дезоксихолата натрия (буфер лизиса SDC: 4% SDC в 100 мМ Tris, рН 8,5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибиторы протеазы могут быть добавлены в буфер лизиса SDC для ограничения деградации белка. - Варить образцы в течение 10 мин при 95 °C с встряхиванием (2000 об/мин на термомиксе), а затем оставить на льду на 10 мин. Повторите этот процесс дважды, чтобы обеспечить эффективный лизис и солюбилизацию образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в течение длительного времени при -80 °C. При хранении повторно растворяют нагреванием при 95 °C перед дальнейшей обработкой.
- Повторное суспендирование ~10 мг промытых, замороженных клеток в 200 мкл свежеприготовленного буфера лизиса дезоксихолата натрия (буфер лизиса SDC: 4% SDC в 100 мМ Tris, рН 8,5).
- Количественная оценка концентрации белка в образце с использованием анализа белка бицинхониновой кислоты (BCA)53. Храните образцы на льду, проводя количественную оценку для ограничения деградации белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для общего анализа протеома 20-100 мкг белка более чем достаточно для нано LC-MS, который обычно требует менее 2 мкг переваривания белка на анализ. Получение избыточного пептида позволяет проводить повторный анализ или дальнейшее фракционирование, если требуется глубокое протеомное покрытие. Для анализа на основе обогащения гликопептидами с использованием гидрофильной хроматографии взаимодействия (HILIC) требуется 100-500 мкг белка. - Восстанавливают и алкилатные образцы.
- Добавляют 1/10 объема10-кратного восстановительного/алкилирующего буфера (100 мМ Tris 2-карбоксиэтилфосфин гидрохлорида; 400 мМ 2-хлорацетамида в 1 М Трис, рН 8,5) в образцы для окончательной концентрации 1x и инкубируют образцы в темноте в течение 30 мин при 45°С с встряхиванием при 1 500 об/мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте рН 10-кратного буфера восстановления/алкилирования, чтобы обеспечить рН приблизительно 7,0-8,0 перед добавлением в образцы, так как более низкий рН приведет к осаждению SDC.
- Добавляют 1/10 объема10-кратного восстановительного/алкилирующего буфера (100 мМ Tris 2-карбоксиэтилфосфин гидрохлорида; 400 мМ 2-хлорацетамида в 1 М Трис, рН 8,5) в образцы для окончательной концентрации 1x и инкубируют образцы в темноте в течение 30 мин при 45°С с встряхиванием при 1 500 об/мин.
- Кратковременно раскрутите образцы и добавьте протеазы Trypsin/Lys-C (~10 мкл, повторно суспендированные в 100 мМ Tris, рН 8,5) для конечного соотношения протеаза:белок 1:100. Высиживать дигесты в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 1 500 об/мин (до 18 ч). Чтобы обеспечить полное переваривание белка, используйте протеазу Трипсин / Lys-C протеазу : соотношение белка от 1: 50 до 1: 200.
- Гашение переваривается путем добавления 1,25 объемов 100% изопропанола в образцы. Вращайте образцы в течение 1 мин, чтобы перемешать и ненадолго раскрутить их вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при температуре -20 °C для последующей обработки. - Подкисляют образцы, добавляя 0,115 объемов 10% трифторуксусной кислоты (TFA; конечная концентрация ~ 1% TFA), вращают образцы и ненадолго раскручивают их вниз.
2. Обработка образцов протеома
- Пептидная очистка образцов протеома
- Подготовьте один стирендивинилбензол-обратнофазный сульфонат (SDB-RPS) Стоп-энд-гоу-экстракционный (Стадия) Наконечник для каждого образца, как описано ранее54.
- Эмпирически для связывания 50 мкг пептида иссечение трех дисков SDB-RPS из мембраны 47 мм2 SDB-RPS с помощью тупой иглы (14 г). Для больших количеств пептидов увеличьте количество дисков соответственно.
- Перед использованием SDB-RPS Stage Tips подготовьте наконечники, последовательно добавляя не менее десяти объемов слоя следующих буферов и либо вращая буфер через колонну центрифугированием (25 °C, 3 мин, 500 × г), либо проталкивая буфер через колонну, осторожно применяя давление с помощью шприца.
- Смочите кончики 150 мкл 100% ацетонитрила.
- Промыть наконечники 150 мкл 30% метанола, 1% TFA в 18,2 МОмH2O.
- Уравновесьте наконечники 150 мкл 90% изопропанола, 1% TFA сбалансированным с 18,2 МОм H2O.
- Загрузите образцы (содержащие 50% изопропанола, 1% TFA) на наконечники ступеней SDB-RPS путем центрифугирования (25 °C, 3 мин, 500 × г) или осторожного применения давления с помощью шприца.
- Промывайте наконечники ступеней SDB-RPS следующими буферами путем центрифугирования (25 °C, 3 мин, 500 × г) или путем осторожного применения давления с помощью шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные промывки или альтернативные буферы могут быть использованы для удаления непептидных загрязнений, таких как использование этилацетата вместо изопропанола55.- Вымойте наконечники 150 мкл 90% изопропанола, 1% TFA.
- Вымойте наконечники со 150 мкл 1% TFA в 18,2 МОм H2O.
- Элюируют пептиды из SDB-RPS Stage Tips 150 мкл 5% гидроксида аммония в 80% ацетонитриле центрифугированием или мягким давлением с помощью шприца. Соберите образцы в отдельные пробирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 5% гидроксида аммония в 80% ацетонитриле в пластиковом контейнере непосредственно перед использованием в вытяжной вытяжке. - Высушите элюированные пептиды методом вакуумного центрифугирования при 25 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении обогащения HILIC 1-10% пептидных элюатов могут быть удалены в этот момент, высушены и использованы в качестве общего контроля входа протеома.
- Подготовьте один стирендивинилбензол-обратнофазный сульфонат (SDB-RPS) Стоп-энд-гоу-экстракционный (Стадия) Наконечник для каждого образца, как описано ранее54.
- Обогащение образцов гликопептидов
- Подготовьте советы стадии Цвиттерионной гидрофильной взаимодействия жидкостной хроматографии (ZIC-HILIC), как описано ранее54,56.
- Вкратце, вырежьте один диск C8 из мембраны 47 мм2 C8 с помощью тупой иглы (14 G) и упакуйте диск в наконечник P200 для создания фрита. Добавьте приблизительно 5 мм материала ZIC-HILIC, повторно суспендированного в 50% ацетонитриле, 50% 18,2 МОмH2O, на фрит, осторожно применяя давление с помощью шприца.
- Перед использованием наконечников ступени ZIC-HILIC обусловите смолу, последовательно добавляя следующие буферы и осторожно применяя давление с помощью шприца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения целостности псевдоводного слоя на поверхности смолы ZIC-HILIC (необходимой для обогащения гликопептидов) смола должна всегда оставаться влажной. При промывке смолы всегда оставляйте ~ 10 мкл растворителя над смолой и убедитесь, что промывки / образцы пипетированы непосредственно в этот остаточный растворитель.- Уравновешивайте смолу с 20 объемами слоя (200 мкл) буфера элюирования ZIC-HILIC (0,1% TFA в 18,2 МОмH2O).
- Промыть смолу с 20 объемами слоя (200 мкл) буфера препарата ZIC-HILIC (95% ацетонитрила в 18,2 МОмH2O).
- Промывайте смолу с объемом 20 слоев (200 мкл) буфера загрузки/промывки ZIC-HILIC (80% ацетонитрила, 1% TFA сбалансирован с 18,2 МОмH2O).
- Повторное суспендирование высушенных переваренных образцов (со стадии 2.1.6) в буфере загрузки/промывки ZIC-HILIC до конечной концентрации 4 мкг/мкл (например, для 200 мкг пептида, повторное суспендирование в 50 мкл буфера загрузки/промывки ZIC-HILIC). Вихрь кратковременно в течение 1 мин, чтобы обеспечить повторное суспендирование образцов, и вращайтесь вниз в течение 1 мин при 2000 × g при 25 °C.
- Загрузите повторно суспендированный пептидный образец в кондиционированную колонку ZIC-HILIC.
- Промывайте три раза с 20 объемами кровати (200 мкл) буфера загрузки/промывки ZIC-HILIC (всего 60 смывов слоя), осторожно применяя давление с помощью шприца.
- Гликопептиды элюта с объемом 20 слоев (200 мкл) буфера элюирования ZIC-HILIC в трубку объемом 1,5 мл путем осторожного применения давления с помощью шприца, а затем сушки элюата вакуумным центрифугированием при 25 °C.
- Подготовьте советы стадии Цвиттерионной гидрофильной взаимодействия жидкостной хроматографии (ZIC-HILIC), как описано ранее54,56.
3. LC-MS образцов, обогащенных протеомом/гликопептидами
- Повторно суспендировать образцы в буфере А* (2% ацетонитрила, 0,1% ТФА) до конечной концентрации 1 мкг/мкл (например, для 50 мкг пептида, повторное суспендирование в 50 мкл буфера А*).
- Загрузите образцы на ВЭЖХ/UPLC, соединенный с MS, чтобы обеспечить разделение и идентификацию гликопептидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры колонки, включая внутренний диаметр, длину, скорость потока, тип хроматографической смолы и требуемые количества инъекций пептидов, должны быть оптимизированы для аналитической установки и длины градиента, которая будет использоваться; Пример оптимизации аналитических установок см.в пункте 57. - Следите за сбором полученных данных MS, гарантируя, что данные собираются с желаемыми параметрами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для композиционного анализа достаточно фрагментации CID. Из-за добавления гликанов к гликопептидам гликопептидные ионы обычно наблюдаются с более высокой m/z и более низкой плотностью заряда, чем негликозилированные пептиды. Чтобы обеспечить наблюдаемость этих ионов, допустите диапазон масс MS1 от 400 до 2000 м/z. - Фрагмент выделен ионами с использованием CID, обеспечивающих сбор ионов с низким содержанием m/z фрагментов, содержащих ионы оксония, важные для характеристики гликанов.
ПРИМЕЧАНИЕ: На фрагментацию гликопептидов с использованием CID влияют как пептидные, так и гликановые последовательности, а также энергия, затрачиваемая при фрагментации 25,58,59. В то время как может быть использован ряд различных энергий столкновения, оптимальной стратегией фрагментации гликопептидов является использование ступенчатых энергий столкновения, сочетающих использование нескольких энергий столкновения 25,59,60. - Используйте альтернативные методы фрагментации, если таковые имеются, такие как ETD для локализации сайта или IT-CID, чтобы помочь в определении составов гликанов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ни один из этих подходов к фрагментации не является существенным для композиционного анализа, но может быть собран для дальнейшего изучения интересующих гликопептидов.
4. Анализ образцов, обогащенных протеомом/гликопептидами
- Предварительная фильтрация файлов данных для включения поиска во FragPipe
- Если сканирование ETD или IT-CID было получено в наборах данных, отфильтруйте эти события сканирования из файлов данных с помощью MSConvert61 перед поиском с помощью FragPipe.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для параметров открытого поиска, описанных ниже, требуются только данные CID типа луча.
- Если сканирование ETD или IT-CID было получено в наборах данных, отфильтруйте эти события сканирования из файлов данных с помощью MSConvert61 перед поиском с помощью FragPipe.
- Выполнение открытого поиска во FragPipe
- Откройте FragPipe и перейдите на вкладку Рабочий процесс . В раскрывающемся меню рабочего процесса выберите опцию Открыть поиск и нажмите Добавить файлы , чтобы импортировать файлы данных для поиска во FragPipe (рисунок 2A).
- Перейдите на вкладку База данных и запустите диспетчер загрузок, нажав кнопку Загрузить. Это позволяет загружать базы данных протеомов из Uniprot с помощью идентификатора Протеома Uniprot. Выберите опцию Добавить приманки и загрязняющие вещества в диспетчере загрузки , чтобы включить белки приманки и загрязняющие вещества в базы данных.
- Для получения более строгих пороговых значений FDR перейдите на вкладку Проверка и измените значение параметра Фильтр и отчет с 0,01 до требуемого значения FDR.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки FragPipe по умолчанию обеспечат 1% FDR на уровне белка. - Перейдите на вкладку MSfragger . В поле пикового сопоставления увеличьте допуск по массе предшественника с 500 Да по умолчанию до 2 000 Да , чтобы можно было идентифицировать крупные модификации (рисунок 2А).
- Перейдите на вкладку Выполнить и определите расположение выходных данных FragPipe. Нажмите кнопку Выполнить , чтобы начать поиск.
- Используя PSM, идентифицированные в наборах данных (содержащихся в выходах psm.tsv от FragPipe), идентифицируйте потенциальные гликаны, отображая частоту наблюдаемых дельта-масс в наборах данных (рисунок 3). Создавайте графики дельта-массы из выходов MSfragger с помощью скриптов R, доступных через присоединение к PRIDE PXD027820.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная постобработка открытых результатов поиска осуществляется в рамках этих скриптов, так как основная цель этих скриптов - помочь в визуализации профилей дельта-массы. Важно отметить, что наблюдение обильных дельта-масс само по себе не является доказательством того, что модификация является потенциальным гликаном, поскольку присвоение дельта-масс в качестве гликанов требует дальнейшего анализа соответствующих событий MS2. - Чтобы обеспечить характеристику гликопептидов в образцах, сосредоточьтесь на высоконадежной идентификации дельта-массы, соответствующей назначениям с высокими гипероценками.
- Чтобы помочь в оценке спектров гликопептидов, используйте инструменты пептидной аннотации, такие как Интерактивный пептидный спектральный аннотатор63, который позволяет присваивать пептид-ассоциированные ионы в спектрах, позволяя вручную идентифицировать гликан-ассоциированные ионы (рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: В наборах данных, представленных здесь, гипероценки >30 считаются высокими баллами, поскольку они соответствуют баллам в пределах 50% всех идентифицированных гликопептидов (рисунок 5).
- Чтобы помочь в оценке спектров гликопептидов, используйте инструменты пептидной аннотации, такие как Интерактивный пептидный спектральный аннотатор63, который позволяет присваивать пептид-ассоциированные ионы в спектрах, позволяя вручную идентифицировать гликан-ассоциированные ионы (рисунок 4).
- При назначении гликопептидов с высокой степенью достоверности идентифицируйте часто наблюдаемые гликан-ассоциированные ионы (рисунок 4) для улучшения идентификации гликопептидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Путем включения гликаноассоциированных ионов в поиски, известные как поиски, ориентированные на гликаны, качество назначений гликопептидов может быть улучшено.- Перейдите на вкладку MSfragger в FragPipe, включите определенные дельта-массы наблюдаемых гликанов в разделы Переменные модификации и Смещения массы . Добавьте эти массы, введя значения в разделы Изменения переменных и Смещения массы с отдельными массами, разделенными /. Добавьте связанные с гликанами массы фрагментов этих гликанов в раздел Glyco/Labile mods MSFragger.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2B показана ключевая информация, необходимая для гликано-ориентированного поиска штамма A. baumannii AB307-0294.
- Перейдите на вкладку MSfragger в FragPipe, включите определенные дельта-массы наблюдаемых гликанов в разделы Переменные модификации и Смещения массы . Добавьте эти массы, введя значения в разделы Изменения переменных и Смещения массы с отдельными массами, разделенными /. Добавьте связанные с гликанами массы фрагментов этих гликанов в раздел Glyco/Labile mods MSFragger.
- Загрузите все данные о рассеянном склерозе, связанные с протеомными исследованиями, в централизованные протеомные репозитории, такие как репозитории PRIDE или MASSIVE.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные, связанные с этим исследованием, были депонированы в протеомный репозиторий PRIDE и могут быть доступны через присоединение к PRIDE: PXD027820.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать полезность открытого поиска для анализа бактериальных гликопептидов, было оценено химическое разнообразие O-связанных гликанов в трех штаммах A. baumannii-AB307-0294, ACICU и D1279779. O-связанные гликопротеомы сильно варьируются между штаммами A. baumannii, поскольку гликаны, используемые для гликозилирования, получены из высокоизменяемых локусовкапсулы 44,45,46. Это химическое разнообразие делает A. baumannii идеальной модельной системой для открытых поисковых исследований. Хотя гликопротеомы трех штаммов ранее не оценивались, структуры капсул двух из этих штаммов, AB307-029464 и ACICU65, известны, а капсула D1279779 еще не выяснена.
В соответствии с капсулой AB307-0294, открытый поиск AB307-0294 выявил две доминирующие дельта-массы, соответствующие 648,25 Da и 692,28 Da (рисунок 3A). Эти массы соответствуют структурам капсул, ранее определенным Russo et al., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA, где остаток QuiNAc4NR соответствует 2,4-диамино-2,4,6-тридезокси-глюкозе, модифицированной либо 3-OH-бутиратом, либо ацетильной группой64. Аналогичным образом, известно, что капсула ACICU состоит из тетрасахарида K-единицы, ранее идентифицированной как Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Galp-NAc-, что соответствует прогнозируемой массе 843,31 Da65. Эта структура капсулы согласуется с наиболее часто наблюдаемой дельта-массой в данных ACICU (рисунок 3B). Наконец, открытый поисковый анализ штамма D1279779 выявил наличие множественных дельта-масс, согласующихся с 203,08, 794,31 и 1588,62 Da (рисунок 3C). В то время как масса 203,08 согласуется с массой одного остатка HexNAc, 794,31 и 1588,62 соответствуют неизвестным модификациям. Следует отметить, что масса 1588,62 ровно вдвое превышает массу 794,31, предполагая, что эти пептиды украшены гликановыми К-единичными димерами, как это ранее наблюдалось в других гликопротеомах Acinetobacter 30,44,46.
Участки дельта-масс обеспечивают быстрый и эффективный способ оценки частоты наблюдаемых модификаций в образцах. Однако для сложных модификаций, таких как гликаны, наличие дельта-массы само по себе не дает информации для определения точного состава гликана. Чтобы помочь в определении гликановых композиций, можно использовать полученные данные MS/MS PSM, отнесенных к конкретным дельта-массам. Сосредоточив внимание на высоконадежных назначениях гликопептидов (в MSFragger, соответствующих PSM с высокими гипероценками), ручной анализ может быть использован для дальнейшей характеристики гликанов, используемых штаммом для гликозилирования белка. Следует отметить, что высокодостоверные назначения пептидов обычно содержат надежную информацию о гликанах, которая позволяет определять гликановые композиции на основе ионов Y. Эта информация может быть использована для идентификации соответствующих фрагментов, где гликаны остались прикрепленными к пептидам, а также к Ионам, связанным с В и оксонием, полезным для назначения гликанов66. Подробные рекомендации о том, как назначать гликановые композиции, были изложены ранее, и читателям рекомендуется проконсультироваться с Harvey et al.67. Используя такие инструменты, как интерактивный пептидный спектральный аннотатор63, пептид-ассоциированные ионы могут быть легко идентифицированы, что позволяет пользователям определять идентичность гликанов, прикрепленных к пептидам.
С помощью интерактивного пептидного спектрального аннотатора были оценены гликопептиды, идентифицированные в этих трех образцах A. baumannii, что выявило потенциальные гликан-ассоциированные ионы. Рассмотрим спектры MS/MS гликопептида AB307-0294 SAGDQAASDIATATDNASAK, украшенного гликанами 648.25 и 692.28 Da (рисунок 4A,B); при аналогичных условиях фрагментации ионы, связанные с гликаном, очень похожи, но смещены в массе на 44,02 Да. Анализ ионов гликана в этих PSM позволяет подтвердить, что дельта-массы, наблюдаемые для этих гликопептидов, соответствуют трисахаридам, содержащим четыре различных углевода: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) и HexNAc (203 Da). Следует отметить, что при назначении фрагментов гликана множественные моносахариды склонны к потере воды при фрагментации с использованием CID. Это можно увидеть в гликанах ACICU, где моносахарид Pse5Ac7Ac (316 Da) приводит к образованию двух заметных связанных с гликаном фрагментов: MH+ 299.12 и 317.13, разница в массе, соответствующая массе воды (18,01 Da) (рисунок 4C).
Кроме того, при анализе бактериальных гликанов часто наблюдаются неожиданные моносахаридные массы, соответствующие сахарам, не наблюдаемым в эукариотах. Пример этого можно увидеть в гликопептидных PSM D1279779, где анализ наиболее частой дельта-массы 794,31 Da показывает присутствие необычного моносахарида dHexNAc (187 Da, наблюдаемый как MH+ 188,09, рисунок 4D), который ранее наблюдался в A. baumannii O-linked glycans44. В то время как высокая точность измерений массы и характерное поведение гликанов как лабильных модификаций, которые теряются из пептидной основы, могут помочь в определении потенциального химического состава гликанов, целесообразно свести к минимуму чрезмерную интерпретацию данных РС. Если стереохимия конкретных сахаров или информация о связи гликана неизвестны, лучше всего использовать структурно агонистические назначения, включая ссылку на моносахариды по их конкретным классам. Примером этого является ссылка на остатки 203.08 Da как N-ацетилгексозамины (HexNAc) и избегание присвоения типов связей. При необходимости рекомендуется использовать дополнительные методы для определения точных химических идентичностей неизвестной модификации, такие как использование ядерного магнитного резонанса (ЯМР).
Хотя открытые поисковые подходы позволяют быстро идентифицировать модифицированные пептиды, важно отметить, что этот поисковый подход может упускать из виду потенциальные гликопептиды в наборах данных. В рамках открытых поисков гликопептиды могут быть не идентифицированы по нескольким причинам, включая недостаточную информацию о фрагментации пептидов или наказание назначенного пептида из-за присутствия нескольких неназначенных ионов в событии MS2. Последнее особенно актуально для бактериальных гликопептидных PSM, так как эти спектры могут содержать гликаноассоциированные фрагменты, не рассматриваемые по умолчанию параметрами открытого поиска. Поскольку непревзойденные характеристики отрицательно влияют на оценку PSM, минимизация непревзойденных ионов в спектрах MS / MS позволяет идентифицировать гликопептиды, которые были первоначально исключены из-за контролируемых FDR минимальных пороговых значений оценки. Чтобы преодолеть это ограничение, массы, определенные из открытых поисков (рисунок 3), и вручную определенные гликаноассоциированные ионы (рисунок 4) могут быть включены в параметры поиска для улучшения идентификации гликопептидов. Важно отметить, что эти гликаноассоциированные ионы могут быть идентифицированы вручную на основе de novo определения гликана, предварительного знания общих ионов оксония44,68 или использования инструментов, которые могут захватывать повторяющиеся ионы в спектрах, таких как Spectral Immonium Ion Detection tool69,76.
Чтобы продемонстрировать это, массы атипичных фрагментов гликана, идентифицированных с помощью анализа открытого поиска, были включены в параметры поиска в MSFragger, и был проведен гликано-ориентированный поиск (гликано-ориентированные настройки для штамма AB307-0294 показаны на рисунке 2B). Следует отметить, что при совместном поиске нескольких гликанов следует проявлять осторожность при выборе ионов Y и диагностических масс, чтобы они точно отражали фрагменты ионов, связанные с каждой дельта-массой. Хотя это не всегда возможно для комбинаций Y и диагностических масс, которые являются взаимоисключающими, такими как фрагменты 648,25 и 692,28 гликанов AB307-0294 (рисунок 4A, B), поиск, ориентированный на гликаны, все еще возможен, хотя это может повлиять на надежность результатов поиска. Поиски, ориентированные на гликаны, привели к заметному увеличению общего числа гликопептидных PSM, идентифицированных во всех трех штаммах A. baumannii, что соответствует увеличению ACICU на 37%, увеличению AB307-0294 на 117% и увеличению D1279779 на 363% (рисунок 5A-C). Для отдельных событий РС включение гликан-специфической информации обычно приводит к увеличению в пределах наблюдаемой гипероцены, хотя это увеличение сильно зависит от гликана (рисунок 5D, E). Таким образом, путем уточнения параметров поиска с использованием масс гликанов, выявленных в ходе открытого поиска, и последующего включения вручную курируемой информации о фрагментах гликанов в целевые поиски, можно получить более подробный анализ гликопептидов в образцах.
Рисунок 1: Обзор ключевых этапов получения и анализа бактериальных гликопептидов. Успешная идентификация бактериальных гликопептидов зависит от генерации высококачественных образцов, содержащих гликопептиды. Гликопептидсодержащие образцы затем анализируются LC-MS, и впоследствии открытые поисковые подходы используются для идентификации потенциальных гликопептидов на основе уникальных дельта-масс. Используя ручное курирование, эти дельта-массы могут быть идентифицированы как гликаны. Наконец, для улучшения идентификации гликопептидов информация о гликанах может быть включена в поиск по базам данных, ориентированный на гликаны. Сокращения: LC-MS = жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией; OD = оптическая плотность; SDB-RPS = стирендивинилбензол-сульфонат обратной фазы; ZIC-HILIC = жидкостная хроматография с зубчатым гидрофильным взаимодействием; PSM = пептидно-спектральные совпадения; CID = диссоциация, вызванная столкновением; ETD = диссоциация переноса электронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обзор того, как включить открытый поиск и поиск, ориентированный на гликаны, во FragPipe. (A) Открытый поиск можно включить, загрузив Open Workflow на вкладке Workflow fragPipe. Чтобы обеспечить идентификацию гликанов размером более 500 Да, увеличьте окно допуска массы предшественника до 2000 Да. (B) Поиск атипичных гликанов, ориентированный на гликаны, требует ввода информации о гликанах на вкладке MSFragger для определения ожидаемых масс модификаций (в разделах Переменные модификации и Смещения массы ), ионов Y, связанных с этими гликанами (в списке Y-ионных масс Glyco/Labile и маломассивные ионы фрагментов гликана (в список диагностических масс фрагментов раздела Glyco/Labile ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Дельта-массовые графики результатов открытого поиска для трех штаммов Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU и D1279779). В соответствии с разнообразием локусов капсулы, каждый штамм A. baumannii обладает уникальным профилем дельта-массы с заметными модификациями размером более 140 Да, обозначаемыми наблюдаемыми дельта-массами. (A) В пределах участка дельты AB307-0294 массы 648,25 и 692,28 соответствуют модификациям, согласующимся с -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-, где QuiNAc4NR модифицирован либо 3-OH-бутиратной, либо ацетильной группой64. (B) В пределах участка дельты массы ACICU массы 203,08 и 843,31 соответствуют модификациям, согласующимся с HexNAc и Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc, соответственно 65. (C) В пределах участка дельты D1279779 массы 203,08, 794,31 и 1588,62 соответствуют HexNAc, HexNAc-217-187-187 и димеру HexNAc-217-187-187. Дельта-массы, оцененные вручную и подтвержденные на рисунке 4, являются гликанами, обозначаемыми *. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Ms/MS характеристика дельта-масс, наблюдаемая у трех штаммов Acinetobacter baumannii. (А, Б) AB307-0294, (C) ACICU и (D) D1279779. Интерактивные пептидные спектральные аннотаторные аннотированные спектры репрезентативных гликопептидов. Для каждого спектра ионы пептидных фрагментов обозначаются синим и красным цветом, в то время как вручную назначенные гликан-ассоциированные ионы обозначаются зеленым. Гликаны были аннотированы с использованием номенклатуры символов для гликанов с HexNAc, обозначаемым как квадрат, Hex как круг, и атипичными моносахаридами, обозначенными как трапеции с массой гликана, обозначенной в трапециях. Аббревиатура: MS/MS = тандемная масс-спектрометрия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение гликопептидов, идентифицированных у штаммов Acinetobacter baumannii с использованием открытого и гликано-ориентированного поиска. (А-С) Сравнение гипероценок и количества назначений PSM в D1279779, ACICU и AB307-0294 с использованием открытого и гликано-ориентированного поиска. (Д-Ф) Сравнение отдельных событий MS2, назначенных одной и той же пептидной последовательности, с использованием открытых и гликан-ориентированных поисков D1279779, ACICU и AB307-0294. Аббревиатура: PSM = пептидно-спектральное соответствие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| А. Баумании Штаммов | Идентификаторы протеома Юнипрот |
| АБ307-0294 15 | UP000006924 |
| МСТС 47,48 | UP000008839 |
| Д1279779 49 | UP000011860 |
Таблица 1. Штамм и Uniprot Proteome ID, используемые в этом исследовании.
| Имя буфера | Буферный состав / pH | |
| Буфер A* | 2% ацетонитрила в 18,2 МОм H2O, 0,1% трифлуроуксусной кислоты / рН 1,0 | |
| ПБС | 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8 мМ Na2HPO4 и 2 мМ KH2PO4 / pH 7,4 | |
| Буфер восстановления/алкилирования | 100 мМ Tris 2-карбоксиэтилфосфин гидрохлорид, 400 мМ 2-хлорацетамид в 1 М Трис / рН 7,5 | |
| Буфер элюирования SDB-RPS Stage Tip | 5% гидроксид аммония в 80% ацетонитриле / рН 11 | |
| Буфер эквилибрации SDB-RPS Stage Tip | 30% метанола, 1% трифлуроуксусной кислоты, в 18,2 МОм H2O/ pH 1,0 | |
| SDB-RPS буфер эквилибрации/промывки наконечника ступени | 90% изопропанол, 1% трифлуроуксусная кислота / рН 1,0 | |
| SDB-RPS буфер промывки наконечника ступени | 1% трифлуроуксусной кислоты в 18,2 МОм H2O/ pH 1,0 | |
| Буфер лизиса SDC | 4% SDC в 100 мМ Tris / pH 8,5 | |
| Буфер элюирования ZIC-HILIC | 0,1% трифлуроуксусной кислоты в 18,2 МОм H2O/pH 1,0 | |
| Буфер загрузки/промывки ZIC-HILIC | 80% ацетонитрила, 1% трифлуроуксусной кислоты в 18,2 МОм H2O/ pH 1,0 | |
| Буфер подготовки ZIC-HILIC | 95% ацетонитрила в 18,2 МОм H2O/ pH 7,0 | |
Таблица 2: Состав буферов, использованных в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Открытый поиск является эффективным и систематическим методом выявления неизвестных модификаций. В то время как идентификация неизвестных гликанов в образцах бактериального протеома традиционно была трудоемким и технически специализированным мероприятием, последние разработки таких инструментов, как MSfragger21,41 и Byonic31,38, теперь позволяют быстро и эффективно идентифицировать дельта-массы для дальнейшей характеристики в качестве потенциальных гликанов, прикрепленных к пептидам. Открытый поиск как стандартных, так и обогащенных гликопептидами образцов протеома может идентифицировать потенциальные гликопептиды (рисунок 1). Общность и обилие гликопептидов в протеоме многих бактериальных систем делают возможным непосредственное обнаружение этих модификаций без обогащения гликопептидами6. Хотя подходы к обогащению гликопептидами, как правило, по-прежнему превосходят методы, основанные на необогащении, для многих системгликозилирования 70, примечательно, что не все гликаны одинаково поддаются обогащению71,72. Этот факт следует учитывать при определении наиболее подходящего подхода к выявлению событий гликозилирования с использованием открытого поиска данного биологического образца.
Хотя открытый поиск эффективно идентифицирует гликаны, наблюдаемые с высокой частотой в образце, он остается неэффективным для выявления событий гликозилирования, которые редко происходят в наборах данных. С практической точки зрения, для идентификации уникальной дельта-массы гликана в образцах должно присутствовать не менее 10 PSM с идентичной дельта-массой. Эта минимальная частота позволяет потенциальному гликану быть различимым над фоновыми дельта-массами (рисунок 3). Хотя этот критерий обычно удовлетворяется общими системами гликозилирования, нацеленными на несколько субстратов для гликозилирования, системы, в которых один белок нацелен на гликозилирование, могут быть менее восприимчивы к этому подходу. По мере повышения скорости и чувствительности приборов для РС вполне вероятно, что это будет все больше позволять оценивать популяции гликопептидов с более низким содержанием, что, в свою очередь, повысит эффективность открытых поисковых подходов при условии, что могут быть получены достаточные качественные спектры для редких /низкообильных гликоформ.
Хотя MS позволяет эффективно идентифицировать новые гликаны, важно отметить, что одно это понимание редко обеспечивает полную структурную характеристику гликопептидов / гликанов, причем такие инструменты, как ЯМР-спектроскопия, по-прежнему имеют решающее значение для полной характеристики гликана. Как отмечалось здесь, РС обеспечивал дополнительное подтверждение К-единиц, ранее определенных с использованием ЯМР из изолированных капсул A. baumannii ACICU и AB307-029464,65. Однако для основного гликана, идентифицированного в D1279779, только информация о предполагаемых классах моносахаридов в этом гликане была присвоена с РС, не предоставляя никакой информации о типах связей или стереохимии этих сахарных единиц (рисунок 4). По мере того, как новые методы фрагментации РС становятся все более доступными, такие как ультрафиолетовая фотодиссоциация 73,74, может стать возможной более детальная структурная характеристика гликопептидов. Тем не менее, следует проявлять осторожность при выводе связей или стереохимической информации с текущими приборами. В дополнение к этим соображениям в последнее время были подняты вопросы о целесообразности контроля на основе Рузвельта для открытого поиска75. Таким образом, хотя открытый поиск является мощным подходом, эти соображения подчеркивают необходимость осторожности при интерпретации назначений гликанов на основе только открытой поисковой информации.
Хотя эта работа демонстрирует, что открытый поиск является эффективным подходом для неконтролируемой идентификации гликанов, используемых для бактериального гликозилирования, открытый поиск сам по себе обеспечивает доступ только к подмножеству всех гликопептидов, содержащихся в образцах. Из-за лабильной природы гликанов гликопептидные PSM обычно содержат разнообразный диапазон гликан-ассоциированных фрагментов, которые, если их не учитывать, отрицательно влияют на оценку PSM. Чтобы преодолеть эту проблему и обеспечить более глубокую идентификацию гликопептидов, информация о гликанах, полученная в результате открытого поиска, может впоследствии использоваться для информирования о поиске, ориентированном на гликаны (рисунок 2B). Таким образом, открытый поиск в сочетании с ручным определением гликан-ассоциированных фрагментов может быть использован для улучшения качества и количества гликопептидов, назначенных в образцах (рисунок 5). Хотя уточнение параметров поиска гликопептидов осуществляется вручную с помощью современных версий инструментов, таких как MSfragger, вполне вероятно, что по мере созревания месторождения эти шаги будут выполняться автоматизированно. Исследования уже продемонстрировали вычислительные подходы к идентификации повторяющихся низкомолекулярных ионов, связанных с конкретными ПТМ69, а также стратегии идентификации ионов оксония и повторяющихся масс Y-ионов, связанных с неизвестными гликопептидами76. Таким образом, вполне вероятно, что эти шаги будут включены в новые итерации таких инструментов, как FragPipe, что еще больше облегчит идентификацию ранее неизвестных событий гликозилирования в бактериальных и эукариотических образцах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
N.E.S поддерживается Стипендией будущего Австралийского исследовательского совета (FT200100270) и грантом проекта ARC Discovery (DP210100362). Мы благодарим Мельбурнский центр масс-спектрометрии и протеомики Института молекулярной науки и биотехнологии Bio21 за доступ к приборам ms.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 G Kel-F Hub point style 3 | Hamilton company | hanc90514 | |
| 2-Chloroacetamide | Sigma Aldrich Pty Ltd | C0267-100G | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich Pty Ltd | 34851-4L | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 338818-100ML | |
| BCA Protein Assay Reagent A | Pierce | 23228 | |
| BCA Protein Assay Reagent B | Pierce | 23224 | |
| C8 Empore SPE | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66882-U | An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Formic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 5.33002 | |
| Isopropanol | Sigma Aldrich Pty Ltd | 650447-2.5L | |
| Methanol | Fisher Chemical | M/4058/17 | |
| SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66886-U | An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich Pty Ltd | D6750-100G | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 2232000083 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 302031-10X1ML | |
| Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | C4706-2G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich Pty Ltd | 252859-500G | |
| Trypsin/Lys-C protease mixture | Promega | V5073 | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810040 | |
| ZIC-HILIC material | Merck | 1504580001 | Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin |
References
- Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
- Schaffer, C., Messner, P.
- Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
- Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
- Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
- Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
- Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
- Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
- Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
- McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
- Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
- Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
- Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W.
- Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
- Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
- Thomas, D. R., Scott, N. E.
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
- Yu, A., et al.
- Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
- Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
- Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
- Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
- Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
- Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
- Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
- Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
- Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
- Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
- Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
- Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
- Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
- Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
- Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
- Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
- Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
- Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
- Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
- Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
- Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
- HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
- Smith, P. K., et al.
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
- Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
- Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
- Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
- Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
- Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
- Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
- Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
- Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
- Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
- Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
- Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
- Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
- Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
- Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
- Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
- Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
- Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).
