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Biochemistry

Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von Acinetobacter baumannii O-verknüpften Glykopeptiden

Published: November 2, 2021 doi: 10.3791/63242
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Die offene Suche ermöglicht die Identifizierung von Glykopeptiden, die mit bisher unbekannten Glykanzusammensetzungen verziert sind. In diesem Artikel wird ein optimierter Ansatz für die Durchführung einer offenen Suche und anschließende Glykan-fokussierte Glykopeptidsuche für Bakterienproben unter Verwendung von Acinetobacter baumannii als Modell vorgestellt.

Abstract

Die Proteinglykosylierung wird zunehmend als häufige Modifikation in bakteriellen Organismen anerkannt, die zur prokaryotischen Physiologie und optimalen Infektiosität pathogener Spezies beiträgt. Aus diesem Grund steigt das Interesse an der Charakterisierung der bakteriellen Glykosylierung und der Bedarf an Hochdurchsatz-Analysewerkzeugen zur Identifizierung dieser Ereignisse. Obwohl die Bottom-up-Proteomik leicht die Generierung reichhaltiger Glykopeptiddaten ermöglicht, machen die Breite und Vielfalt der in prokaryotischen Spezies beobachteten Glykane die Identifizierung bakterieller Glykosylierungsereignisse äußerst schwierig.

Traditionell machte die manuelle Bestimmung von Glykanzusammensetzungen in bakteriellen Proteomdatensätzen dies zu einer weitgehend maßgeschneiderten Analyse, die auf feldspezifische Experten beschränkt war. In jüngster Zeit haben sich offene suchbasierte Ansätze als leistungsfähige Alternative zur Identifizierung unbekannter Modifikationen herauskristallisiert. Durch die Analyse der Häufigkeit einzigartiger Modifikationen, die an Peptidsequenzen beobachtet wurden, ermöglichen offene Suchtechniken die Identifizierung von gewöhnlichen Glykanen, die an Peptide in komplexen Proben gebunden sind. Dieser Artikel stellt einen optimierten Workflow für die Interpretation und Analyse von glykoproteomischen Daten vor und zeigt, wie offene Suchtechniken verwendet werden können, um bakterielle Glykopeptide ohne Vorkenntnisse der Glykanzusammensetzungen zu identifizieren.

Mit diesem Ansatz können Glykopeptide in Proben schnell identifiziert werden, um Glykosylierungsunterschiede zu verstehen. Am Beispiel von Acinetobacter baumannii ermöglichen diese Ansätze den Vergleich von Glykanzusammensetzungen zwischen Stämmen und die Identifizierung neuartiger Glykoproteine. Zusammengenommen demonstriert diese Arbeit die Vielseitigkeit offener Datenbanksuchtechniken zur Identifizierung der bakteriellen Glykosylierung, wodurch die Charakterisierung dieser sehr unterschiedlichen Glykoproteome einfacher als je zuvor ist.

Introduction

Die Proteinglykosylierung, der Prozess der Bindung von Kohlenhydraten an Proteinmoleküle, ist eine der häufigsten posttranslationalen Modifikationen (PTMs) in der Natur 1,2. In allen Bereichen des Lebens hat sich eine Reihe komplexer Maschinen entwickelt, die sich der Erzeugung von Glykoproteinen widmen, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen beeinflussen 1,3,4,5. Während die Proteinglykosylierung auf einer Reihe von Aminosäuren6,7 auftritt, sind N-verknüpfte und O-verknüpfte Glykosylierungsereignisse zwei dominante Formen, die in der Natur beobachtet werden. Bei der N-verknüpften Glykosylierung werden Glykane an ein Stickstoffatom von Asparaginresten (Asn) gebunden, während bei der O-verknüpften Glykosylierung Glykane an ein Sauerstoffatom aus Serin (Ser), Threonin (Thr) oder Tyrosin (Tyr) -Rückständengebunden sind 7. Trotz der Ähnlichkeiten in den Rückständen, auf die Glykosylierungssysteme abzielen, führen die Unterschiede innerhalb der an Proteine gebundenen Glykane dazu, dass die Glykosylierung die chemisch vielfältigste Klasse von PTMs ist, die in der Natur vorkommen.

Während eukaryotische Glykosylierungssysteme eine Glykandiversität besitzen, sind diese Systeme typischerweise in der Anzahl der verwendeten einzigartigen Kohlenhydrate begrenzt. Die resultierende Vielfalt ergibt sich aus der Art und Weise, wie diese Kohlenhydrate in Glykanen 8,9,10,11,12 angeordnet sind. Im Gegensatz dazu besitzen bakterielle und archaeale Arten aufgrund der schieren Auswahl an einzigartigen Zuckern, die in diesen Systemen erzeugt werden, eine praktisch unbegrenzte Glykanvielfalt 2,10,13,14,15,16,17. Diese Unterschiede in der Glykandiversität, die über Lebensbereiche hinweg beobachtet werden, stellen eine bedeutende analytische Herausforderung für die Charakterisierung und Identifizierung von Glykosylierungsereignissen dar. Für die eukaryotische Glykosylierung hat die Fähigkeit, Glykanzusammensetzungen zu antizipieren, das wachsende Interesse an der Glykobiologie erleichtert; Gleiches gilt jedoch nicht für die bakterielle Glykosylierung, die immer noch weitgehend auf die Untersuchung durch spezialisierte Labors beschränkt ist. Da die Zugänglichkeit von Instrumenten der Massenspektrometrie (MS) in den Biowissenschaften zugenommen hat, sind MS-basierte Ansätze heute die primäre Methode für die glykoproteomische Analyse.

MS hat sich als das wichtigste Werkzeug für die Charakterisierung der Glykosylierung herausgestellt, wobei sowohl Top-down- als auch Bottom-up-Ansätze heute häufig zur Charakterisierung von Glykoproteinenverwendet werden 6. Während Top-down-Proteomik verwendet wird, um globale Glykosylierungsmuster spezifischer Proteine18,19 zu bewerten, werden Bottom-up-Ansätze verwendet, um die glykanspezifische Charakterisierung von Glykopeptiden zu ermöglichen, selbst aus komplexen Mischungen6,20,21,22,23. Für die Analyse von Glykopeptiden ist die Generierung von informativen Fragmentierungsinformationen für die Charakterisierung von Glykosylierungsereignissenessentiell 24,25. Eine Reihe von Fragmentierungsansätzen ist jetzt routinemäßig auf Instrumenten zugänglich, darunter die auf Resonanzionenfallen basierende kollisionsinduzierte Dissoziation (IT-CID), die kollisionsinduzierte Dissoziation vom Strahltyp (CID) und die Elektronentransferdissoziation (ETD). Jeder Ansatz besitzt unterschiedliche Stärken und Schwächen für die Glykopeptidanalyse 25,26, mit signifikanten Fortschritten in den letzten zehn Jahren bei der Anwendung dieser Fragmentierungsansätze zur Analyse der Glykosylierung 6,20. Für die bakterielle Glykosylierungsanalyse war die entscheidende Einschränkung jedoch nicht die Fähigkeit, Glykopeptide zu fragmentieren, sondern die Unfähigkeit, die potenziellen Glykanzusammensetzungen in Proben vorherzusagen. Innerhalb dieser Systeme schränkt die unbekannte Natur verschiedener bakterieller Glykane die Identifizierung von Glykopeptiden ein, selbst mit Glykosylierungs-fokussierten Suchwerkzeugen, die heute für die Analyse eukaryotischer Glykopeptide wie O-Pair27, GlycopeptideGraphMS 28 und GlycReSoft29 üblich sind. Um dieses Problem zu lösen, ist eine alternative Suchmethode erforderlich, wobei sich der Einsatz offener Suchwerkzeuge als leistungsfähiger Ansatz für die Untersuchung der bakteriellen Glykosylierungherausstellt 30.

Die offene Suche, auch Blind- oder Wildcard-Suche genannt, ermöglicht die Identifizierung von Peptiden mit unbekannten oder unerwarteten PTMs 21,30,31,32. Offene Suchen verwenden eine Vielzahl von Berechnungstechniken, einschließlich kuratierter Modifikationssuchen, mehrstufiger Datenbanksuchen oder massentoleranter Suche 33,34,35,36,37. Obwohl die offene Suche ein großes Potenzial hat, wurde ihre Verwendung typischerweise durch die signifikante Zunahme der Analysezeiten und den Verlust der Empfindlichkeit des Nachweises von unmodifizierten Peptiden im Vergleich zu eingeschränkten Suchenbehindert 31,32. Die Abnahme des Nachweises von unmodifizierten Peptid-Spektral-Matches (PSMs) ist ein Ergebnis der erhöhten falsch-positiven PSM-Raten, die mit diesen Techniken verbunden sind, was eine erhöhte strenge Filterung erfordert, um die gewünschten Falscherkennungsraten (FDRs) aufrechtzuerhalten 33,34,35,36,37 . In letzter Zeit sind mehrere Tools verfügbar, die die Zugänglichkeit der offenen Suche erheblich verbessern, darunter Byonic 31,38, Open-pFind 39, ANN-SoLo 40 und MSFragger21,41. Diese Werkzeuge ermöglichen die robuste Identifizierung von Glykosylierungsereignissen, indem sie die Analysezeiten erheblich reduzieren und Ansätze zur Handhabung heterogener Glykanzusammensetzungen implementieren.

Dieser Artikel stellt eine optimierte Methode zur Identifizierung bakterieller Glykopeptide durch offene Suche am Beispiel des gramnegativen nosokomialen Erregers Acinetobacter baumannii vor. A. baumannii besitzt ein konserviertes O-verknüpftes Glykosylierungssystem, das für die Modifikation mehrerer Proteinsubstrate verantwortlich ist, bekannt als das PglL-Proteinglykosylierungssystem42,43,44. Während ähnliche Proteine auf die Glykosylierung zwischen Stämmen abzielen, ist das PglL-Glykosylierungssystem aufgrund der Biosynthese des Glykans, das für die Proteinglykosylierung verwendet wird, sehr variabel, da es vom Kapselort (bekannt als K-Locus) abgeleitet ist44,45,46. Dies führt dazu, dass verschiedene Glykane (auch bekannt als K-Einheit), die aus einzelnen oder begrenzten polymerisierten K-Einheiten abgeleitet sind, zu Proteinsubstraten 30,44,46 hinzugefügt werden. Innerhalb dieser Arbeit wird die Verwendung des offenen Suchwerkzeugs MSfragger innerhalb der Software FragPipe verwendet, um Glykane über A. baumannii-Stämme zu identifizieren. Durch die Kombination von offener Suche und manueller Kuration können "glykanfokussierte Suchen" durchgeführt werden, um die Identifizierung bakterieller Glykopeptide weiter zu verbessern. Zusammen ermöglicht dieser mehrstufige Identifikationsansatz die Identifizierung von Glykopeptiden ohne umfangreiche Erfahrung in der Charakterisierung neuartiger Glykosylierungsereignisse.

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Protocol

HINWEIS: Die Vorbereitung und Analyse von bakteriellen Glykopeptidproben kann in vier Abschnitte unterteilt werden (Abbildung 1). Für diese Studie wurde die Glykosylierung von drei sequenzierten A. baumannii-Stämmen untersucht (Tabelle 1). Proteome FASTA-Datenbanken von jedem dieser Stämme sind über Uniprot zugänglich. Die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Puffer finden Sie in Tabelle 2.

1. Aufbereitung von Proteinproben für die Proteomanalyse

  1. Isolierung von Proteomproben von Interesse
    1. Wenn Sie ganze Zellen verwenden, stellen Sie sicher, dass die Zellen mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) gewaschen wurden, um potenzielle Proteinverunreinigungen in den Medien zu entfernen. Ganze Zellen nach dem Waschen einfrieren und bei -80 °C lagern, bis sie benötigt werden.
    2. Wenn fraktionierte Proben verwendet werden (z. B. Membranpräparate), stellen Sie sicher, dass die verwendeten Reagenzien die nachgeschaltete Flüssigkeitschromatographie-MS-Analyse (LC-MS)50 nicht beeinträchtigen.
    3. Wenn Reinigungsmittel wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, NP-40 oder Lauroylsarcosin verwendet wurden, entfernen Sie diese Reinigungsmittel mit Acetonfällung, SP3-Probenvorbereitungsmethoden51 oder kommerziellen proteomischen Reinigungssäulen wie S-Fallen52. Alternativ können Sie inkompatible Reinigungsmittel durch ein MS-kompatibles oder entfernbares Reinigungsmittel wie Natriumdesoxycholat (SDC) oder Octylglucopyranosid ersetzen.
    4. Stellen Sie sicher, dass alle Kunststoffwaren und Glaswaren, die für die Probenvorbereitung verwendet werden sollen, nicht autoklaviert wurden. Autoklavierte Glaswaren und Kunststoffe sind typischerweise stark mit Verbindungen mit kleinem Molekulargewicht wie Polymeren kontaminiert, die in der MS leicht nachgewiesen werden können.
  2. Solubilisierung von Ganzzellproben
    1. Resuspendieren Sie ~ 10 mg gewaschene, schockgefrorene Zellen in 200 μL frisch zubereitetem Natriumdesoxycholat-Lysepuffer (SDC-Lysepuffer: 4% SDC in 100 mM Tris, pH 8,5).
      HINWEIS: Proteasehemmer können dem SDC-Lysepuffer hinzugefügt werden, um den Proteinabbau zu begrenzen.
    2. Kochen Sie die Proben für 10 min bei 95 °C mit Schütteln (2000 U / min auf einem Thermomixer) und lassen Sie sie dann für 10 min auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um eine effiziente Lyse und Solubilisierung der Proben zu gewährleisten.
      HINWEIS: Proben können an dieser Stelle langfristig bei -80 °C gelagert werden. Bei Lagerung vor der weiteren Verarbeitung durch Erhitzen auf 95 °C resolubilisieren.
  3. Quantifizierung der Probenproteinkonzentrationen mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinassay53. Lagern Sie Proben auf Eis, während Sie eine Quantifizierung durchführen, um den Proteinabbau zu begrenzen.
    HINWEIS: Für die Gesamtproteomanalyse sind 20-100 μg Protein mehr als ausreichend für Nano-LC-MS, die typischerweise weniger als 2 μg Proteinaufschluss pro Analyse erfordert. Die Herstellung von überschüssigem Peptid ermöglicht eine Replikationsanalyse oder eine weitere Fraktionierung, wenn eine tiefe proteomische Abdeckung erforderlich ist. Für die auf Glykopeptidanreicherung basierende Analyse mittels hydrophiler Interaktionschromatographie (HILIC) werden 100-500 μg Protein benötigt.
  4. Proben reduzieren und alkylatieren.
    1. 1/10 des Volumensdes 10-fachen Reduktions-/Alkylierungspuffers (100 mM Tris 2-carboxyethylphosphinhydrochlorid; 400 mM 2-chloracetamid in 1 M Tris, pH 8,5) zu den Proben für eine Endkonzentration von 1x geben und Proben im Dunkeln für 30 min bei 45 °C mit Schütteln bei 1.500 U/min inkubieren.
      HINWEIS: Überprüfen Sie den pH-Wert des 10-fachen Reduktions-/Alkylierungspuffers, um einen pH-Wert von ca. 7,0-8,0 sicherzustellen, bevor Sie den Proben hinzufügen, da ein niedrigerer pH-Wert dazu führt, dass die DEZA ausfällt.
  5. Drehen Sie die Proben kurz nach unten und fügen Sie die Proteasen Trypsin / Lys-C (~ 10 μL, resuspendiert in 100 mM Tris, pH 8,5) für ein endgültiges Protease: Protein-Verhältnis von 1: 100 hinzu. Inkubieren Sie die Digests über Nacht bei 37 °C mit Schütteln bei 1.500 U/min (bis zu 18 h). Um eine vollständige Proteinverdauung zu gewährleisten, verwenden Sie ein Trypsin / Lys-C-Protease: Protein-Verhältnis von 1: 50 bis 1: 200.
  6. Quench Digests durch Zugabe von 1,25 Volumen 100% Isopropanol zu den Proben. Wirbeln Sie die Proben für 1 Minute auf, um sie zu mischen und kurz nach unten zu drehen.
    HINWEIS: Proben können bei -20 °C gelagert werden, um später weiterverarbeitet zu werden.
  7. Ansäuern Sie die Proben durch Zugabe von 0,115 Volumina von 10% Trifluoressigsäure (TFA; Endkonzentration von ~ 1% TFA), wirbeln Sie die Proben ein und drehen Sie sie kurz nach unten.

2. Verarbeitung von Proteomproben

  1. Peptidreinigung von Proteomproben
    1. Bereiten Sie eine Styrol-Vinylbenzol-Umkehrphasensulfonat (SDB-RPS) Stop-and-Go-Extraktion (Stage) Spitze für jede Probe wie zuvor beschriebenvor 54.
      1. Empirisch werden zur Bindung von 50 μg Peptid drei SDB-RPS-Bandscheiben aus einer 47 mm2 SDB-RPS-Membran mit einer stumpfen Nadel (14 G) herausgeschnitten. Für größere Peptidmengen erhöhen Sie die Anzahl der Bandscheiben entsprechend.
    2. Bereiten Sie vor der Verwendung von SDB-RPS Stage Tips die Spitzen vor, indem Sie nacheinander mindestens zehn Bettvolumen der folgenden Puffer hinzufügen und entweder den Puffer durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) durch die Säule drehen oder indem Sie den Puffer durch sanftes Druckanlegen mit einer Spritze durch die Säule drücken.
      1. Befeuchten Sie die Spitzen mit 150 μL 100% Acetonitril.
      2. Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 30% Methanol, 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.
      3. Equilibrieren Sie die Spitzen mit 150 μL 90% Isopropanol, 1% TFA ausgeglichen mit 18,2 MΩ H2O.
    3. Die Proben (mit 50 % Isopropanol, 1 % TFA) werden durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) oder durch sanftes Ausüben von Druck mit einer Spritze auf die SDB-RPS Stage Tips geladen.
    4. Waschen Sie die SDB-RPS Stage Tips mit den folgenden Puffern durch Zentrifugation (25 °C, 3 min, 500 × g) oder durch sanftes Druckaufbringen mit einer Spritze.
      HINWEIS: Zusätzliche Waschungen oder alternative Puffer können verwendet werden, um Nicht-Peptid-Verunreinigungen zu entfernen, wie z. B. die Verwendung von Ethylacetat anstelle von Isopropanol55.
      1. Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 90% Isopropanol, 1% TFA.
      2. Waschen Sie die Spitzen mit 150 μL 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.
    5. Eluieren Sie die Peptide aus den SDB-RPS Stage Tips mit 150 μL 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril durch Zentrifugation oder durch sanftes Druckanlegen mit einer Spritze. Sammeln Sie die Proben in einzelnen Röhrchen.
      HINWEIS: Bereiten Sie 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril in einem Kunststoffbehälter unmittelbar vor der Verwendung in einem Abzug vor.
    6. Die eluierten Peptide werden durch Vakuumzentrifugation bei 25 °C getrocknet.
      HINWEIS: Bei einer HILIC-Anreicherung können an dieser Stelle 1-10% der Peptideluate entfernt, getrocknet und als Gesamtproteom-Eingangskontrollen verwendet werden.
  2. Anreicherung von Glykopeptidproben
    1. Vorbereiten von Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips wie zuvor beschrieben54,56.
      1. Kurz gesagt, entfernen Sie eine C 8-Disc mit einer stumpfen Nadel (14 G) aus einer 47 mm2 C8-Membran und packen Sie die Disc in eine P200-Spitze, um eine Fritte zu erzeugen. Etwa 5 mm ZIC-HILIC-Material, resuspendiert in 50% Acetonitril, 50% 18,2 MΩH2O, auf die Fritte geben, indem Sie vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben.
    2. Bevor Sie ZIC-HILIC Stage Tips verwenden, konditionieren Sie das Harz, indem Sie nacheinander die folgenden Puffer hinzufügen und vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben.
      HINWEIS: Um die Integrität der Pseudowasserschicht auf der Oberfläche des ZIC-HILIC-Harzes (erforderlich zur Anreicherung von Glykopeptiden) zu gewährleisten, muss das Harz immer nass bleiben. Lassen Sie beim Waschen des Harzes immer ~ 10 μL Lösungsmittel über dem Harz und stellen Sie sicher, dass die Waschungen / Proben direkt in dieses Restlösungsmittel pipettiert werden.
      1. Das Harz wird mit 20 Bettvolumina (200 μL) ZIC-HILIC-Elutionspuffer (0,1 % TFA in 18,2 MΩ H2O) ausgeglichen.
      2. Waschen Sie das Harz mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Zubereitungspuffer (95% Acetonitril in 18,2 MΩ H2O).
      3. Waschen Sie das Harz mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer (80% Acetonitril, 1% TFA ausgeglichen mit 18,2 MΩ H2O).
    3. Die getrockneten verdauten Proben (ab Schritt 2.1.6) im ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer auf eine Endkonzentration von 4 μg/μL resuspendieren (z. B. für 200 μg Peptid in 50 μL ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer). Wirbeln Sie kurz für 1 Minute vor, um sicherzustellen, dass die Proben resuspendiert sind, und drehen Sie sie für 1 Minute bei 2.000 × g bei 25 ° C nach unten.
    4. Laden Sie die resuspendierte Peptidprobe auf eine konditionierte ZIC-HILIC-Säule.
      1. Dreimal waschen Sie mit 20 Bettvolumen (200 μL) ZIC-HILIC-Lade-/Waschpuffer (für insgesamt 60 Bettvolumenwäschen), indem Sie vorsichtig Druck mit einer Spritze ausüben.
      2. Elute Glykopeptide mit 20 Bettvolumina (200 μL) ZIC-HILIC-Elutionspuffer werden durch sanftes Druckanlassen mit einer Spritze in ein 1,5-ml-Röhrchen umgewandelt und anschließend das Eluat durch Vakuumzentrifugation bei 25 °C trocknen.

3. LC-MS von Proteom/Glykopeptid-angereicherten Proben

  1. Resuspendieren Sie die Proben in Puffer A* (2% Acetonitril, 0,1% TFA) auf eine Endkonzentration von 1 μg/μL (z. B. für 50 μg Peptid in 50 μL Puffer A*).
  2. Laden Sie die Proben auf eine HPLC/UPLC, die mit einer MS gekoppelt ist, um die Trennung und Identifizierung von Glykopeptiden zu ermöglichen.
    HINWEIS: Die Säulenparameter, einschließlich Innendurchmesser, Länge, Durchflussraten, Art des Chromatographieharzes und erforderliche Peptidinjektionsmengen, sollten für den analytischen Aufbau und die zu verwendende Gradientenlänge optimiert werden. Ein Beispiel für die Optimierung analytischer Setups finden Sie unter57.
  3. Überwachen Sie die Erfassung der resultierenden MS-Daten, um sicherzustellen, dass die Daten mit den gewünschten Parametern gesammelt werden.
    HINWEIS: Für die Kompositionsanalyse ist die CID-Fragmentierung ausreichend. Aufgrund der Zugabe von Glykanen zu Glykopeptiden werden Glykopeptidionen typischerweise mit einer höheren m/z und geringerer Ladungsdichte beobachtet als unglykosylierte Peptide. Um sicherzustellen, dass diese Ionen beobachtbar sind, lassen Sie einen MS1-Massenbereich von 400 bis 2.000 m/z zu.
  4. Fragmentieren Sie ausgewählte Ionen mit CID, um die Sammlung von Fragmentionen mit niedrigem m/z-Gehalt zu gewährleisten, die Oxoniumionen enthalten, die für die Charakterisierung von Glykanen wichtig sind.
    HINWEIS: Die Fragmentierung von Glykopeptiden unter Verwendung von CID wird sowohl von der Peptid- als auch von der Glykansequenz sowie von der während der Fragmentierung aufgewendeten Energie beeinflusst 25,58,59. Während eine Reihe verschiedener Kollisionsenergien verwendet werden kann, ist eine optimale Strategie zur Fragmentierung von Glykopeptiden die Verwendung von abgestuften Kollisionsenergien, die die Verwendung mehrerer Kollisionsenergien 25,59,60 kombinieren.
  5. Verwenden Sie alternative Fragmentierungsmethoden, falls verfügbar, z. B. ETD für die Standortlokalisierung oder IT-CID, um die Bestimmung von Glykanzusammensetzungen zu unterstützen.
    HINWEIS: Keiner dieser Fragmentierungsansätze ist für die Zusammensetzungsanalyse unerlässlich, kann jedoch gesammelt werden, um eine weitere Abfrage von Glykopeptiden von Interesse zu ermöglichen.

4. Analyse von Proteom/Glykopeptid-angereicherten Proben

  1. Vorfiltern von Datendateien, um die Suche in FragPipe zu ermöglichen
    1. Wenn ETD- oder IT-CID-Scans innerhalb von Datensätzen erfasst wurden, filtern Sie diese Scanereignisse mit MSConvert61 aus den Datendateien, bevor Sie mit FragPipe suchen.
      HINWEIS: Für die unten beschriebenen offenen Suchparameter sind nur strahlartige CID-Daten erforderlich.
  2. Offene Suchen in FragPipe durchführen
    1. Öffnen Sie FragPipe, und klicken Sie auf die Registerkarte Workflow. Wählen Sie im Pulldown-Menü Workflow die Option Suche öffnen aus, und klicken Sie auf Dateien hinzufügen , um die zu durchsuchenden Datendateien in FragPipe zu importieren (Abbildung 2A).
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Datenbank und starten Sie den Download-Manager, indem Sie auf Herunterladen klicken. Auf diese Weise können Proteomdatenbanken mit einer Uniprot Proteome-ID von Uniprot heruntergeladen werden. Klicken Sie im Download-Manager auf die Option Lockvögel und Verunreinigungen hinzufügen, um Lockvögel und Schadstoffproteine in Datenbanken zu integrieren.
    3. Für strengere FDR-Schwellenwerte klicken Sie auf die Registerkarte Validierung , und ändern Sie den Filter- und Berichtswert von 0,01 in den erforderlichen FDR.
      HINWEIS: Die Standardeinstellungen für FragPipe gewährleisten einen FDR von 1% auf Proteinebene.
    4. Klicken Sie auf die Registerkarte MSfragger . Erhöhen Sie im Feld Peak-Übereinstimmung die Massentoleranz des Vorläufers von den Standardwerten 500 Da auf 2.000 Da, um die Identifizierung großer Modifikationen zu ermöglichen (Abbildung 2A).
    5. Klicken Sie auf die Registerkarte Ausführen und definieren Sie die Position der Ausgaben von FragPipe. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen , um die Suche zu starten.
  3. Identifizieren Sie unter Verwendung der PSMs, die in Datensätzen identifiziert wurden (die in den psm.tsv-Ausgaben von FragPipe enthalten sind), potenzielle Glykane, indem Sie die Häufigkeit der beobachteten Deltamassen in Datensätzen aufzeichnen (Abbildung 3). Erstellen Sie Delta-Massenplots aus MSfragger-Ausgaben mit den R-Skripten, auf die über den PRIDE-Beitritt PXD027820 zugegriffen werden kann.
    HINWEIS: Innerhalb dieser Skripte wird nur eine minimale Nachbearbeitung der offenen Suchergebnisse durchgeführt, da der Hauptzweck dieser Skripte darin besteht, die Visualisierung von Delta-Massenprofilen zu unterstützen. Wichtig ist, dass die Beobachtung von reichlich vorhandenen Deltamassen allein kein Beweis dafür ist, dass eine Modifikation ein potenzielles Glykan ist, da die Zuweisung von Deltamassen als Glykane eine weitere Analyse der entsprechenden MS2-Ereignisse erfordert.
  4. Um die Charakterisierung von Glykopeptiden innerhalb von Proben zu ermöglichen, konzentrieren Sie sich auf Delta-Massenidentifikationen mit hoher Zuverlässigkeit, die Zuweisungen mit hohen Hyperscores entsprechen.
    1. Um bei der Beurteilung von Glykopeptidspektren zu helfen, verwenden Sie Peptidannotationswerkzeuge wie den Interactive Peptide Spectral Annotator63, der die Zuordnung von peptidassoziierten Ionen innerhalb von Spektren ermöglicht und die manuelle Identifizierung der Glykan-assoziierten Ionen ermöglicht (Abbildung 4).
      HINWEIS: Innerhalb der hier vorgestellten Datensätze gelten Hyperscores von >30 als High Scoring, da diese Scores innerhalb der oberen 50% aller identifizierten Glykopeptide entsprechen (Abbildung 5).
  5. Identifizieren Sie bei hochsicheren Glykopeptiden die häufig beobachteten Glykan-assoziierten Ionen (Abbildung 4), um die Identifizierung von Glykopeptiden zu verbessern.
    HINWEIS: Durch die Einbeziehung von Glykan-assoziierten Ionen in Suchanfragen, die als Glykan-fokussierte Suchen bekannt sind, kann die Qualität der Glykopeptid-Zuweisungen verbessert werden.
    1. Klicken Sie auf die Registerkarte MSfragger von FragPipe, und integrieren Sie die ermittelten Deltamassen der beobachteten Glykane in die Abschnitte Variable modifications und Mass Offsets . Fügen Sie diese Massen hinzu, indem Sie Werte in die Abschnitte Variable modifications und Mass Offsets eingeben, wobei einzelne Massen durch ein / getrennt sind. Fügen Sie die Glykan-assoziierten Fragmentmassen dieser Glykane in den Glyco/Labile Mods-Abschnitt von MSFragger hinzu.
      HINWEIS: Abbildung 2B zeigt die wichtigsten Informationen, die für eine glykanfokussierte Suche des A. baumannii-Stammes AB307-0294 erforderlich sind.
  6. Laden Sie alle MS-Daten, die mit Proteomik-Studien verknüpft sind, in zentralisierte Proteomic-Repositories wie die PRIDE- oder MASSIVE-Repositories hoch.
    HINWEIS: Alle mit dieser Studie verbundenen Daten wurden im proteomischen PRIDE-Repository hinterlegt und können über den PRIDE-Beitritt abgerufen werden: PXD027820.

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Representative Results

Um den Nutzen der offenen Suche nach bakterieller Glykopeptidanalyse zu veranschaulichen, wurde die chemische Vielfalt von O-verknüpften Glykanen innerhalb von drei Stämmen von A. baumannii-AB307-0294, ACICU und D1279779-bewertet. Die O-verknüpften Glykoproteome sind zwischen den Stämmen von A. baumannii sehr variabel, da die für die Glykosylierung verwendeten Glykane von den hochvariablen Kapselloci44,45,46 abgeleitet sind. Diese chemische Vielfalt macht A. baumannii zu einem idealen Modellsystem für offene Suchstudien. Während die Glykoproteome der drei Stämme bisher nicht untersucht wurden, sind die Kapselstrukturen von zwei dieser Stämme, AB307-029464 und ACICU65, bekannt, wobei die Kapsel von D1279779 noch aufgeklärt werden muss.

In Übereinstimmung mit der Kapsel von AB307-0294 ergab die offene Suche nach AB307-0294 zwei dominante Deltamassen, die 648,25 Da und 692,28 Da entsprechen (Abbildung 3A). Diese Massen entsprechen den zuvor von Russo et al., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA bestimmten Kapselstrukturen, wobei der QuiNAc4NR-Rest 2,4-Diamino-2,4,6-tridesoxy-glukose entspricht, modifiziert entweder mit 3-OH-butyrat oder einer Acetylgruppe64. In ähnlicher Weise ist bekannt, dass die ACICU-Kapsel aus einer Tetrasaccharid-K-Einheit besteht, die zuvor als Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Galp-NAc- identifiziert wurde, was einer vorhergesagten Masse von 843,31 Da65 entspricht. Diese Kapselstruktur stimmt mit der am häufigsten beobachteten Deltamasse in den ACICU-Daten überein (Abbildung 3B). Schließlich ergab die offene Suchanalyse des Stammes D1279779 das Vorhandensein mehrerer Deltamassen, die mit 203,08, 794,31 und 1588,62 Da übereinstimmen (Abbildung 3C). Während die Masse 203,08 mit der eines einzelnen HexNAc-Rests übereinstimmt, entsprechen 794,31 und 1588,62 unbekannten Modifikationen. Es sollte beachtet werden, dass die Masse 1588,62 genau doppelt so hoch ist wie die von 794,31, was darauf hindeutet, dass diese Peptide mit Glykan-K-Einheitsdimeren dekoriert sind, wie dies zuvor in anderen Acinetobacter-Glykoproteomen30,44,46 beobachtet wurde.

Delta-Massendiagramme bieten eine schnelle und effektive Möglichkeit, die Häufigkeit der beobachteten Modifikationen innerhalb von Proben zu bewerten. Bei komplexen Modifikationen, wie Glykanen, liefert das Vorhandensein einer Deltamasse allein jedoch nicht die Information, um die genaue Zusammensetzung eines Glykans zu definieren. Zur Unterstützung bei der Bestimmung von Glykanzusammensetzungen können die resultierenden MS/MS-Daten von PSMs, die bestimmten Deltamassen zugeordnet sind, verwendet werden. Durch die Fokussierung auf hochsichere Glykopeptid-Zuweisungen (in MSFragger entsprechend PSMs mit hohen Hyperscores) kann die manuelle Analyse verwendet werden, um die Glykane, die von einem Stamm für die Proteinglykosylierung verwendet werden, weiter zu charakterisieren. Es sollte beachtet werden, dass hochkonfidenzierte Peptidzuweisungen typischerweise robuste Glykaninformationen enthalten, die die Bestimmung von Glykanzusammensetzungen basierend auf Y-Ionen ermöglichen. Diese Information kann verwendet werden, um die entsprechenden Fragmente zu identifizieren, in denen die Glykane an Peptide gebunden geblieben sind, sowie an B- und Oxonium-verwandte Ionen, die für die Zuordnung von Glykanen66 nützlich sind. Detaillierte Richtlinien zur Zuweisung von Glykanzusammensetzungen wurden zuvor skizziert, und den Lesern wird empfohlen, Harvey et al.67 zu konsultieren. Mit Werkzeugen wie dem Interactive Peptide Spectral Annotator63 können peptidassoziierte Ionen leicht identifiziert werden, so dass Benutzer die Identität der an Peptide gebundenen Glykane bestimmen können.

Mit dem Interactive Peptide Spectral Annotator wurden Glykopeptide, die in diesen drei A. baumannii-Proben identifiziert wurden, bewertet, wobei potenzielle Glykan-assoziierte Ionen aufgedeckt wurden. Betrachten wir die MS/MS-Spektren des AB307-0294-Glykopeptids SAGDQAASDIATATDNASAK, dekoriert mit den Glykanen 648,25 und 692,28 Da (Abbildung 4A,B); Unter ähnlichen Fragmentierungsbedingungen sind die Glykan-verwandten Ionen sehr ähnlich, verschieben sich jedoch um 44,02 Da. Die Analyse der Glykanionen in diesen PSMs ermöglicht die Bestätigung, dass die für diese Glykopeptide beobachteten Deltamassen Trisacchariden entsprechen, die vier verschiedene Kohlenhydrate enthalten: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) und HexNAc (203 Da). Es sollte beachtet werden, dass bei der Zuweisung von Glykanfragmenten mehrere Monosaccharide anfällig für den Verlust von Wasser sind, wenn sie mit CID fragmentiert werden. Dies zeigt sich im Glykan von ACICU, wo das Monosaccharid Pse5Ac7Ac (316 Da) zur Erzeugung von zwei prominenten Glykan-bezogenen Fragmenten führt: MH+ 299,12 und 317,13, wobei der Massenunterschied der Wassermasse (18,01 Da) entspricht (Abbildung 4C).

Darüber hinaus ist es bei der Analyse bakterieller Glykane üblich, unerwartete Monosaccharidmassen zu beobachten, die Zuckern entsprechen, die in Eukaryoten nicht beobachtet werden. Ein Beispiel hierfür ist in den Glykopeptid-PSMs von D1279779 zu sehen, wo die Analyse der häufigsten Deltamasse 794,31 Da das Vorhandensein eines ungewöhnlichen Monosaccharids dHexNAc (187 Da, beobachtet als MH+ von 188,09, Abbildung 4D) zeigt, das zuvor in A. baumannii O-verknüpften Glykanen44 beobachtet wurde. Während Messungen mit hoher Massengenauigkeit und das charakteristische Verhalten von Glykanen als labile Modifikationen, die aus dem Peptidrückgrat verloren gehen, bei der Bestimmung potenzieller chemischer Zusammensetzungen von Glykanen helfen können, ist es ratsam, die Überinterpretation von MS-Daten zu minimieren. Wenn die Stereochemie bestimmter Zucker oder die Bindungsinformation eines Glykans unbekannt ist, ist es eine bewährte Methode, strukturell agonistische Zuordnungen zu verwenden, einschließlich der Bezugnahme auf Monosaccharide nach ihren spezifischen Klassen. Ein Beispiel hierfür ist die Bezugnahme auf 203.08-Da-Reste als N-Acetylhexosamine (HexNAc) und die Vermeidung der Zuordnung von Bindungstypen. Bei Bedarf wird empfohlen, zusätzliche Techniken zu verwenden, um die genauen chemischen Identitäten einer unbekannten Modifikation zu definieren, z. B. die Verwendung der Kernspinresonanz (NMR).

Während offene Suchansätze die schnelle Identifizierung modifizierter Peptide ermöglichen, ist es wichtig zu beachten, dass dieser Suchansatz potenzielle Glykopeptide in Datensätzen übersehen kann. Innerhalb offener Suchen können Glykopeptide aus verschiedenen Gründen nicht identifiziert werden, einschließlich unzureichender Peptidfragmentierungsinformationen oder Bestrafung des zugewiesenen Peptids aufgrund des Vorhandenseins mehrerer nicht zugewiesener Ionen innerhalb des MS2-Ereignisses. Letzteres gilt insbesondere für bakterielle Glykopeptid-PSMs, da diese Spektren Glykan-assoziierte Fragmente enthalten können, die standardmäßig offene Suchparameter nicht berücksichtigt werden. Da sich unübertroffene Merkmale negativ auf das Scoring von PSMs auswirken, ermöglicht die Minimierung unübertroffener Ionen innerhalb von MS/MS-Spektren die Identifizierung von Glykopeptiden, die ursprünglich aufgrund der FDR-kontrollierten minimalen Score-Schwellenwerte ausgeschlossen waren. Um diese Einschränkung zu überwinden, können die aus den offenen Suchen definierten Massen (Abbildung 3) und die manuell definierten Glykan-assoziierten Ionen (Abbildung 4) in Suchparameter integriert werden, um die Identifizierung von Glykopeptiden zu verbessern. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Glykan-assoziierten Ionen manuell identifiziert werden können, basierend auf der De-novo-Bestimmung des Glykans, Vorkenntnissen über gängige Oxoniumionen44,68 oder der Verwendung von Werkzeugen, die wiederkehrende Ionen in Spektren einfangen können, wie das SPectral Immonium Ion Detection Tool 69,76.

Um dies zu demonstrieren, wurden die Massen atypischer Glykanfragmente, die durch offene Suchanalyse identifiziert wurden, in die Suchparameter in MSFragger einbezogen und eine glykanfokussierte Suche durchgeführt (die glykanfokussierten Einstellungen für den Stamm AB307-0294 sind in Abbildung 2B dargestellt). Es sollte beachtet werden, dass, wenn mehrere Glykane zusammen durchsucht werden, bei der Auswahl von Y-Ionen und diagnostischen Massen darauf geachtet werden sollte, dass sie die Fragmentionen, die mit jeder Deltamasse verbunden sind, genau widerspiegeln. Während dies für Kombinationen von Y- und diagnostischen Massen, die sich gegenseitig ausschließen, wie die Fragmente der Glykane 648,25 und 692,28 von AB307-0294 (Abbildung 4A,B), nicht immer möglich ist, ist eine glykanfokussierte Suche dennoch möglich, auch wenn dies die Robustheit der Suchergebnisse beeinträchtigen kann. Glykan-fokussierte Suchen führten zu einem bemerkenswerten Anstieg der Gesamtzahl der Glykopeptid-PSMs, die in allen drei A. baumannii-Stämmen identifiziert wurden, was einem Anstieg von 37% bei ACICU, einem Anstieg von 117% bei AB307-0294 und einem Anstieg von 363% bei D1279779 entspricht (Abbildung 5A-C). Bei einzelnen MS-Ereignissen führt die Einbeziehung glykanspezifischer Informationen typischerweise zu einem Anstieg innerhalb des beobachteten Hyperscores, obwohl dieser Anstieg stark glykanabhängig ist (Abbildung 5D,E). Durch die Verfeinerung der Suchparameter unter Verwendung der Massen von Glykanen, die durch offene Suche aufgedeckt wurden, und die anschließende Einbeziehung manuell kuratierter Glykanfragmentinformationen in gezielte Suchen, kann eine detailliertere Analyse von Glykopeptiden in Proben erhalten werden.

Figure 1
Abbildung 1: Überblick über die wichtigsten Schritte bei der Herstellung und Analyse bakterieller Glykopeptide. Die erfolgreiche Identifizierung bakterieller Glykopeptide hängt von der Erzeugung hochwertiger Proben ab, die Glykopeptide enthalten. Glykopeptid-haltige Proben werden dann mit LC-MS analysiert, und anschließend werden offene Suchansätze verwendet, um potenzielle Glykopeptide basierend auf einzigartigen Deltamassen zu identifizieren. Durch manuelle Kuration können diese Deltamassen als Glykane identifiziert werden. Um die Identifizierung von Glykopeptiden zu verbessern, können Glykaninformationen in Glykan-fokussierte Datenbanksuchen integriert werden. Abkürzungen: LC-MS = Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Massenspektrometrie; OD = optische Dichte; SDB-RPS = Styrol-Vinylbenzol-Umkehrphasensulfonat; ZIC-HILIC = Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography; PSMs = Peptid-Spektral-Matches; CID = Kollisionsinduzierte Dissoziation; ETD = Elektronentransferdissoziation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Übersicht über die Aktivierung der offenen Suche und der auf Glykan fokussierten Suche in FragPipe. (A) Die offene Suche kann aktiviert werden, indem der offene Workflow in die Registerkarte Workflow von FragPipe geladen wird. Um die Identifizierung von Glykanen mit einer Größe von mehr als 500 Da zu ermöglichen, erhöhen Sie das Vorläufer-Massentoleranzfenster auf 2.000 Da. (B) Glykan-fokussierte Suchen nach atypischen Glykanen erfordern die Eingabe von Glykaninformationen auf der Registerkarte MSFragger , um die erwarteten Massen der Modifikationen (in den Abschnitten Variable modifications und Mass Offsets ) zu definieren, die Y-Ionen, die mit diesen Glykanen assoziiert sind (in der Y-Ionenmassenliste des Glykos/Labilen). B. und die massearmen Glykanfragmentionen (in die Liste der diagnostischen Fragmentmassen des Abschnitts Glyko/Labile ). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Delta-Massendiagramme mit offenen Suchergebnissen für die drei Stämme von Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU und D1279779). In Übereinstimmung mit der Vielfalt der Kapselloci besitzt jeder A. baumannii-Stamm ein einzigartiges Delta-Massenprofil mit prominenten Modifikationen von mehr als 140 Da Größe, die durch die beobachteten Deltamassen gekennzeichnet sind. (A) Innerhalb des Deltamassendiagramms AB307-0294 entsprechen die Massen 648,25 und 692,28 Modifikationen, die mit -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA- übereinstimmen, wobei der QuiNAc4NR entweder mit einer 3-OH-Butyrat- oder Acetylgruppe64 modifiziert ist. (B) Innerhalb des ACICU-Delta-Massendiagramms entsprechen die Massen 203,08 und 843,31 Modifikationen, die mit HexNAc und Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc bzw.65 übereinstimmen. (C) Innerhalb des Delta-Massendiagramms D1279779 entsprechen die Massen 203.08, 794.31 und 1588.62 HexNAc, HexNAc-217-187-187 und einem Dimer von HexNAc-217-187-187. Deltamassen, die in Abbildung 4 manuell bewertet und bestätigt wurden, sind Glykane, die mit * gekennzeichnet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: MS/MS-Charakterisierung von Deltamassen, die bei den drei Stämmen von Acinetobacter baumannii beobachtet wurden. (A, B)  AB307-0294, (C) ACICU und (D) D1279779. Interactive Peptide Spectral Annotator-assisted annotated spectra of representative glycopeptides. Für jedes Spektrum werden die Peptidfragmentionen blau und rot bezeichnet, während die manuell zugewiesenen Glykan-assoziierten Ionen grün gekennzeichnet sind. Glykane wurden unter Verwendung der Symbolnomenklatur für Glykane mit HexNAc als Quadrat, Hex als Kreis und atypischen Monosacchariden, die als Trapeze bezeichnet werden, mit der Masse des Glykans, die in den Trapezen angegeben sind, annotiert. Abkürzung: MS/MS = Tandem-Massenspektrometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Vergleich von Glykopeptiden, die über Stämme von Acinetobacter baumannii identifiziert wurden, unter Verwendung von offener vs. glykanfokussierter Suche. (A-C) Vergleich von Hyperscores und Anzahl der PSM-Zuordnungen innerhalb von D1279779, ACICU und AB307-0294 unter Verwendung von offener und glykanfokussierter Suche. (D-F) Vergleich einzelner MS2-Ereignisse, die derselben Peptidsequenz zugeordnet sind, unter Verwendung offener und glykanfokussierter Suchen nach D1279779, ACICU und AB307-0294. Abkürzung: PSM = peptide-spectral match. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

A. baumannii Stämme Uniprot-Proteom-IDs
AB307-0294 15 UP000006924
ACICU 47,48 UP000008839
D1279779 49 UP000011860

Tabelle 1. Stamm- und Uniprot-Proteom-IDs, die in dieser Studie verwendet wurden.

Puffername Pufferzusammensetzung / pH-Wert
Puffer A* 2% Acetonitril in 18,2 MΩ H2O, 0,1% Triflurosigsäure / pH 1,0
PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 und 2 mM KH2PO 4 / pH7,4
Reduktions-/Alkylierungspuffer 100 mM Tris2-carboxyethylphosphinhydrochlorid, 400 mM2-Chloracetamid in 1 M Tris/pH 7,5
SDB-RPS Stage Tip Elutionspuffer 5% Ammoniumhydroxid in 80% Acetonitril / pH 11
SDB-RPS Stage Tip Equlibrationspuffer 30% Methanol, 1% Triflurosigsäure, in 18,2 MΩ H2O / pH 1,0
SDB-RPS Stage Tip Gleichgewichts-/Waschpuffer 90% Isopropanol, 1% Triflurosigsäure / pH 1,0
SDB-RPS Stage Tip Waschpuffer 1% Triflurosigsäure in 18,2 MΩ H2O / pH 1,0
SDC-Lysepuffer 4% SDC in 100 mM Tris / pH 8,5
ZIC-HILIC Elutionspuffer 0,1% Triflurosigsäure in 18,2 MΩ H2O /pH 1,0
ZIC-HILIC Lade-/Waschpuffer 80% Acetonitril, 1% Triflurosigsäure in 18,2 MΩ H2O / pH 1,0
ZIC-HILIC Aufbereitungspuffer 95% Acetonitril in 18,2 MΩ H2O / pH 7,0

Tabelle 2: Zusammensetzung der in dieser Studie verwendeten Puffer.

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Discussion

Open Search ist eine effektive und systematische Methode zur Identifizierung unbekannter Modifikationen. Während die Identifizierung unbekannter Glykane in bakteriellen Proteomproben traditionell ein zeitaufwendiges und technisch spezialisiertes Unterfangen war, ermöglichen die jüngsten Entwicklungen von Werkzeugen wie MSfragger 21,41 und Byonic 31,38 nun die schnelle und effektive Identifizierung von Deltamassen zur weiteren Charakterisierung als potenzielle Glykane, die an Peptide gebunden sind. Die offene Suche nach Standard- und Glykopeptid-angereicherten Proteomproben kann potenzielle Glykopeptide identifizieren (Abbildung 1). Die Gemeinsamkeit und Häufigkeit von Glykopeptiden innerhalb des Proteoms vieler bakterieller Systeme ermöglicht den direkten Nachweis dieser Modifikationen ohne Glykopeptidanreicherung6. Obwohl Glykopeptid-Anreicherungsanreicherungsansätze in der Regel immer noch nicht-anreicherungsbasierte Methoden für viele Glykosylierungssystemeübertreffen 70, ist es bemerkenswert, dass nicht alle Glykane gleichermaßen für eine Anreicherung geeignet sind71,72. Diese Tatsache sollte bei der Bestimmung des am besten geeigneten Ansatzes zur Identifizierung von Glykosylierungsereignissen durch offene Suche nach einer bestimmten biologischen Probe berücksichtigt werden.

Während die offene Suche effektiv Glykane identifiziert, die in einer Probe mit hoher Frequenz beobachtet werden, bleibt sie bei der Identifizierung von Glykosylierungsereignissen, die selten in Datensätzen auftreten, unwirksam. Damit eine eindeutige Deltamasse eines Glykans identifiziert werden kann, müssen in den Proben mindestens 10 PSM mit einer identischen Deltamasse vorhanden sein. Diese Mindestfrequenz ermöglicht es, ein potenzielles Glykan über Hintergrund-Delta-Massenzuweisungen zu unterscheiden (Abbildung 3). Während dieses Kriterium typischerweise von allgemeinen Glykosylierungssystemen erfüllt wird, die auf mehrere Substrate für die Glykosylierung abzielen, sind Systeme, bei denen ein einzelnes Protein für die Glykosylierung bestimmt ist, für diesen Ansatz möglicherweise weniger geeignet. Da sich die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit von MS-Instrumenten verbessert, ist es wahrscheinlich, dass dies zunehmend die Bewertung von Glykopeptidpopulationen mit geringerer Häufigkeit ermöglichen wird, was wiederum die Wirksamkeit von offenen Suchansätzen verbessern wird, vorausgesetzt, es können ausreichende Qualitätsspektren für seltene/niedrig vorkommende Glykoformen erzeugt werden.

Während MS die effektive Identifizierung neuartiger Glykane ermöglicht, ist es wichtig zu beachten, dass diese Erkenntnis allein selten eine vollständige strukturelle Charakterisierung von Glykopeptiden / Glykanen liefert, wobei Werkzeuge wie die NMR-Spektroskopie für die vollständige Glykancharakterisierung immer noch entscheidend sind. Wie hier beobachtet, lieferte MS eine ergänzende Bestätigung von K-Einheiten, die zuvor mittels NMR aus isolierten Kapseln von A. baumannii ACICU und AB307-029464,65 bestimmt wurden. Für das in D1279779 identifizierte Hauptglykan waren jedoch nur Informationen über die mutmaßlichen Klassen von Monosacchariden innerhalb dieses Glykans zuordenbar, wobei MS keine Informationen über die Bindungstypen oder die Stereochemie dieser Zuckereinheiten lieferte (Abbildung 4). Da neue MS-Fragmentierungsmethoden wie die ultraviolette Photodissoziation73,74 immer weiter verbreitet sind, kann eine detailliertere strukturelle Charakterisierung von Glykopeptiden möglich sein. Bei der Ableitung von Verknüpfungen oder stereochemischen Informationen mit aktuellen Instrumenten ist jedoch Vorsicht geboten. Zusätzlich zu diesen Überlegungen wurden in letzter Zeit Fragen zur Angemessenheit FDR-basierter Kontrollen für die offene Suche75 aufgeworfen. Während die offene Suche ein leistungsfähiger Ansatz ist, unterstreichen diese Überlegungen die Notwendigkeit, bei der Interpretation von Glykanzuweisungen allein auf der Grundlage offener Suchinformationen vorsichtig zu sein.

Während diese Arbeit zeigt, dass die offene Suche ein effektiver Ansatz für die unüberwachte Identifizierung von Glykanen ist, die für die bakterielle Glykosylierung verwendet werden, bietet die offene Suche allein nur Zugang zu einer Teilmenge aller in Proben enthaltenen Glykopeptide. Aufgrund der labilen Natur von Glykanen enthalten Glykopeptid-PSMs typischerweise eine Vielzahl von Glykan-assoziierten Fragmenten, die, wenn sie nicht berücksichtigt werden, das Scoring von PSMs negativ beeinflussen. Um dieses Problem zu überwinden und eine tiefergehende Identifizierung von Glykopeptiden zu ermöglichen, können die durch offene Suche erhaltenen Glykaninformationen anschließend verwendet werden, um glykanfokussierte Suchen zu informieren (Abbildung 2B). Auf diese Weise kann die offene Suche, gepaart mit der manuellen Bestimmung von Glykan-assoziierten Fragmenten, verwendet werden, um die Qualität und Quantität der in Proben zugewiesenen Glykopeptide zu verbessern (Abbildung 5). Obwohl die Verfeinerung der Glykopeptid-Suchparameter manuell mit aktuellen Versionen von Tools wie MSfragger durchgeführt wird, ist es wahrscheinlich, dass diese Schritte automatisiert durchgeführt werden, wenn das Feld reift. Studien haben bereits computergestützte Ansätze zur Identifizierung sich wiederholender niedermolekularer Ionen in Verbindung mit spezifischen PTMs69 sowie Strategien zur Identifizierung von Oxonium-Ionen und sich wiederholenden Y-Ionenmassen in Verbindung mit unbekannten Glykopeptidengezeigt 76. Daher ist es wahrscheinlich, dass diese Schritte in neue Iterationen von Werkzeugen wie FragPipe integriert werden, was es noch einfacher macht, bisher unbekannte Glykosylierungsereignisse in bakteriellen und eukaryotischen Proben zu identifizieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

N.E.S wird durch ein Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) und ein ARC Discovery Project Grant (DP210100362) unterstützt. Wir danken der Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility des Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute für den Zugang zu MS-Instrumenten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 G Kel-F Hub point style 3 Hamilton company hanc90514
2-Chloroacetamide Sigma Aldrich Pty Ltd C0267-100G
Acetonitrile Sigma Aldrich Pty Ltd 34851-4L
Ammonium hydroxide (28%) Sigma Aldrich Pty Ltd 338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A Pierce 23228
BCA Protein Assay Reagent B Pierce 23224
C8 Empore SPE Sigma Aldrich Pty Ltd 66882-U An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 5.33002
Isopropanol Sigma Aldrich Pty Ltd 650447-2.5L
Methanol Fisher Chemical M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) Sigma Aldrich Pty Ltd 66886-U An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate Sigma Aldrich Pty Ltd D6750-100G
ThermoMixer C Eppendorf 2232000083
trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride Sigma Aldrich Pty Ltd C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich Pty Ltd 252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture Promega V5073
Vacuum concentrator Labconco 7810040
ZIC-HILIC material Merck 1504580001 Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

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Biochemie Heft 177 Glykosylierung,Acinetobacter baumannii Offene Suche Posttranslationale Modifikationen Proteomik
Die Anwendung offener suchbasierter Ansätze zur Identifizierung von <em>Acinetobacter baumannii</em> O-verknüpften Glykopeptiden
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Lewis, J. M., Coulon, P. M. L.,… More

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L., McDaniels, T. A., Scott, N. E. The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides. J. Vis. Exp. (177), e63242, doi:10.3791/63242 (2021).

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