Summary
Open zoeken maakt de identificatie van glycopeptiden versierd met voorheen onbekende glycaansamenstellingen mogelijk. In dit artikel wordt een gestroomlijnde aanpak voor het uitvoeren van open zoekopdrachten en daaropvolgende glycaangerichte glycopeptide-zoekopdrachten gepresenteerd voor bacteriële monsters met behulp van Acinetobacter baumannii als model.
Abstract
Eiwitglycosylatie wordt steeds meer erkend als een veel voorkomende modificatie binnen bacteriële organismen, die bijdraagt aan prokaryote fysiologie en optimale infectiviteit van pathogene soorten. Hierdoor is er een toenemende interesse in het karakteriseren van bacteriële glycosylatie en een behoefte aan analytische hulpmiddelen met hoge doorvoer om deze gebeurtenissen te identificeren. Hoewel bottom-up proteomics gemakkelijk de generatie van rijke glycopeptidegegevens mogelijk maakt, maken de breedte en diversiteit van glycanen waargenomen in prokaryote soorten de identificatie van bacteriële glycosylatiegebeurtenissen uiterst uitdagend.
Traditioneel maakte de handmatige bepaling van glycaansamenstellingen in bacteriële proteomische datasets dit een grotendeels op maat gemaakte analyse die beperkt was tot veldspecifieke experts. Onlangs zijn op open zoeken gebaseerde benaderingen naar voren gekomen als een krachtig alternatief voor de identificatie van onbekende wijzigingen. Door de frequentie van unieke modificaties die op peptidesequenties worden waargenomen te analyseren, maken open zoektechnieken de identificatie mogelijk van gemeenschappelijke glycanen die aan peptiden zijn bevestigd in complexe monsters. Dit artikel presenteert een gestroomlijnde workflow voor de interpretatie en analyse van glycoproteomische gegevens, die aantoont hoe open zoektechnieken kunnen worden gebruikt om bacteriële glycopeptiden te identificeren zonder voorafgaande kennis van de glycaansamenstellingen.
Met behulp van deze aanpak kunnen glycopeptiden in monsters snel worden geïdentificeerd om glycosylatieverschillen te begrijpen. Met behulp van Acinetobacter baumannii als model, maken deze benaderingen de vergelijking van glycaansamenstellingen tussen stammen en de identificatie van nieuwe glycoproteïnen mogelijk. Alles bij elkaar toont dit werk de veelzijdigheid van open database-zoektechnieken voor de identificatie van bacteriële glycosylatie, waardoor de karakterisering van deze zeer diverse glycoproteïnen eenvoudiger dan ooit tevoren is.
Introduction
Eiwitglycosylatie, het proces van het hechten van koolhydraten aan eiwitmoleculen, is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties (PTM's) in de natuur 1,2. In alle domeinen van het leven is een reeks complexe machines geëvolueerd die zijn gewijd aan het genereren van glycoproteïnen die een groot aantal cellulaire functies beïnvloeden 1,3,4,5. Terwijl eiwitglycosylatie optreedt op een reeks aminozuren 6,7, zijn N-gebonden en O-gebonden glycosylatiegebeurtenissen twee dominante vormen die in de natuur worden waargenomen. N-gebonden glycosylering omvat de hechting van glycanen aan een stikstofatoom van asparagine (Asn) residuen, terwijl bij O-gebonden glycosylatie glycanen worden bevestigd aan een zuurstofatoom van serine (Ser), threonine (Thr) of tyrosine (Tyr) residuen7. Ondanks de overeenkomsten in residuen die het doelwit zijn van glycosylatiesystemen, resulteren de verschillen in de glycanen die aan eiwitten zijn gehecht, ertoe dat glycosylatie de meest chemisch diverse klasse ptm's is die in de natuur wordt aangetroffen.
Hoewel eukaryote glycosylatiesystemen glycaandiversiteit bezitten, zijn deze systemen meestal beperkt in het aantal gebruikte unieke koolhydraten. De resulterende diversiteit komt voort uit hoe deze koolhydraten zijn gerangschikt in glycanen 8,9,10,11,12. Daarentegen bezitten bacteriële en archaeale soorten vrijwel onbeperkte glycaandiversiteit vanwege de enorme reeks unieke suikers die binnen deze systemen worden gegenereerd 2,10,13,14,15,16,17. Deze verschillen in de glycaandiversiteit waargenomen tussen domeinen van het leven vormen een belangrijke analytische uitdaging voor de karakterisering en identificatie van glycosylatiegebeurtenissen. Voor eukaryote glycosylatie heeft het vermogen om te anticiperen op glycaansamenstellingen de groeiende interesse in glycobiologie vergemakkelijkt; hetzelfde geldt echter niet voor bacteriële glycosylatie, die nog steeds grotendeels beperkt is tot studie door gespecialiseerde laboratoria. Naarmate de toegankelijkheid van massaspectrometrie (MS) instrumentatie in de biowetenschappen is toegenomen, zijn ms-gebaseerde benaderingen nu de primaire methode voor glycoproteomische analyse.
MS is naar voren gekomen als het ultieme hulpmiddel voor de karakterisering van glycosylatie, met zowel top-down als bottom-up benaderingen die nu vaak worden gebruikt om glycoproteïnen te karakteriseren6. Terwijl top-down proteomics wordt gebruikt om globale glycosylatiepatronen van specifieke eiwitten te beoordelen18,19, worden bottom-up benaderingen gebruikt om de glycaanspecifieke karakterisering van glycopeptiden mogelijk te maken, zelfs uit complexe mengsels 6,20,21,22,23. Voor de analyse van glycopeptiden is het genereren van informatieve fragmentatie-informatie essentieel voor de karakterisering van glycosylatiegebeurtenissen24,25. Een reeks fragmentatiebenaderingen is nu routinematig toegankelijk op instrumenten, waaronder resonantie-ionenval-gebaseerde collision-induced dissociation (IT-CID), beam-type collision-induced dissociation (CID) en electron transfer dissociation (ETD). Elke benadering heeft verschillende sterke en zwakke punten voor glycopeptide-analyse25,26, met aanzienlijke vooruitgang in het afgelopen decennium bij het toepassen van deze fragmentatiebenaderingen om glycosylatie te analyseren 6,20. Voor bacteriële glycosylatieanalyse was de kritische beperking echter niet het vermogen om glycopeptiden te fragmenteren, maar eerder het onvermogen om de potentiële glycaansamenstellingen in monsters te voorspellen. Binnen deze systemen beperkt de onbekende aard van diverse bacteriële glycanen de identificatie van glycopeptiden, zelfs met glycosylatiegerichte zoekhulpmiddelen die nu gemeengoed zijn voor de analyse van eukaryote glycopeptiden, zoals O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 en GlycReSoft29. Om dit probleem op te lossen, is een alternatieve zoekmethode vereist, waarbij het gebruik van open zoekhulpmiddelen naar voren komt als een krachtige benadering voor de studie van bacteriële glycosylatie30.
Open zoeken, ook bekend als blind of wildcard zoeken, maakt de identificatie van peptiden met onbekende of onverwachte PTM's 21,30,31,32 mogelijk. Open zoekopdrachten maken gebruik van een verscheidenheid aan computationele technieken, waaronder samengestelde wijzigingszoekopdrachten, zoekopdrachten met meerdere stappendatabases of breed-massatolerant zoeken 33,34,35,36,37. Hoewel open zoeken een groot potentieel heeft, wordt het gebruik ervan meestal belemmerd door de aanzienlijke toename van analysetijden en verlies in gevoeligheid van de detectie van ongewijzigde peptiden in vergelijking met beperkte zoekopdrachten 31,32. De afname van de detectie van ongewijzigde peptide-spectrale matches (PSM's) is een gevolg van de verhoogde fout-positieve PSM-snelheden geassocieerd met deze technieken, die een verhoogde strenge filtering vereisen om de gewenste false discovery rates (FDR's) te behouden33,34,35,36,37 . Onlangs zijn er verschillende tools beschikbaar gekomen die de toegankelijkheid van open zoeken aanzienlijk verbeteren, waaronder Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 en MSFragger21,41. Deze tools maken de robuuste identificatie van glycosylatiegebeurtenissen mogelijk door de analysetijden aanzienlijk te verkorten en benaderingen te implementeren om heterogene glycaansamenstellingen te verwerken.
Dit artikel presenteert een gestroomlijnde methode voor de identificatie van bacteriële glycopeptiden door open zoeken, met behulp van de Gram-negatieve nosocomiale pathogeen, Acinetobacter baumannii, als model. A. baumannii bezit een geconserveerd O-gebonden glycosyleringssysteem dat verantwoordelijk is voor de modificatie van meerdere eiwitsubstraten, bekend als het PglL-eiwitglycosyleringssysteem 42,43,44. Hoewel vergelijkbare eiwitten gericht zijn op glycosylering tussen stammen, is het PglL-glycosyleringssysteem zeer variabel vanwege de biosynthese van het glycaan dat wordt gebruikt voor eiwitglycosylatie en wordt afgeleid van de capsulelocus (bekend als de K-locus)44,45,46. Dit resulteert in diverse glycanen (ook bekend als een K-eenheid), afgeleid van enkele of beperkte gepolymeriseerde K-eenheden, die worden toegevoegd aan eiwitsubstraten 30,44,46. Binnen dit werk wordt het gebruik van de open zoekfunctie, MSfragger, binnen de software FragPipe, gebruikt om glycanen over A. baumannii-stammen te identificeren. Door open zoeken en handmatige curatie te combineren, kunnen "glycaangerichte zoekopdrachten" worden uitgevoerd om de identificatie van bacteriële glycopeptiden verder te verbeteren. Samen maakt deze meerstapsidentificatiebenadering de identificatie van glycopeptiden mogelijk zonder uitgebreide ervaring in de karakterisering van nieuwe glycosylatiegebeurtenissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De bereiding en analyse van bacteriële glycopeptidemonsters kan worden onderverdeeld in vier secties (figuur 1). Voor dit onderzoek werd de glycosylatie van drie gesequencede A. baumannii-stammen beoordeeld (tabel 1). Proteome FASTA-databases van elk van deze stammen zijn toegankelijk via Uniprot. Raadpleeg tabel 2 voor de samenstelling van de buffers die in dit protocol worden gebruikt.
1. Voorbereiding van eiwitmonsters voor proteomische analyse
- Isolatie van proteoommonsters van belang
- Als u hele cellen gebruikt, zorg er dan voor dat de cellen zijn gewassen met een fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om potentiële eiwitverontreinigingen in de media te verwijderen. Vries hele cellen na het wassen in en bewaar ze bij -80 °C totdat ze nodig zijn.
- Als gefractioneerde monsters worden gebruikt (zoals membraanpreparaten), zorg er dan voor dat de gebruikte reagentia de downstream liquid chromatography MS (LC-MS)-analyse niet verstoren50.
- Als detergentia, zoals natriumdodecylodeylsulfaat (SDS), Triton X-100, NP-40 of lauroylsarcosine, zijn gebruikt, verwijder deze detergentia dan met acetonprecipitatie, SP3-monstervoorbereidingsmethoden51 of commerciële proteomische reinigingskolommen zoals S-traps52. U kunt ook incompatibele detergentia vervangen door een MS-compatibel of verwijderbaar reinigingsmiddel zoals natriumdeoxycholaat (SDC) of octylglucopyranoside.
- Zorg ervoor dat al het plastic en glaswerk dat voor de monstervoorbereiding wordt gebruikt, niet is geautoclaveerd. Geautoclaveerd glaswerk en kunststoffen zijn meestal zwaar verontreinigd met verbindingen met een klein molecuulgewicht, zoals polymeren, die gemakkelijk worden gedetecteerd in de MS.
- Oplosbaarheid van hele celmonsters
- Resuspend ~ 10 mg gewassen, vastgevroren cellen in 200 μL vers bereid natriumdeoxycholaatlysisbuffer (SDC-lysisbuffer: 4% SDC in 100 mM Tris, pH 8,5).
OPMERKING: Proteaseremmers kunnen worden toegevoegd aan de SDC-lysisbuffer om eiwitafbraak te beperken. - Kook de monsters gedurende 10 minuten bij 95 °C met schudden (2000 rpm op een thermomixer) en laat vervolgens 10 minuten op ijs staan. Herhaal dit proces twee keer om een efficiënte lysis en oplosbaarheid van de monsters te garanderen.
OPMERKING: Monsters kunnen op dit punt langdurig worden bewaard bij -80 °C. Indien opgeslagen, repareer door verhitting bij 95 °C voordat u verder wordt verwerkt.
- Resuspend ~ 10 mg gewassen, vastgevroren cellen in 200 μL vers bereid natriumdeoxycholaatlysisbuffer (SDC-lysisbuffer: 4% SDC in 100 mM Tris, pH 8,5).
- Kwantificeer de eiwitconcentraties van het monster met behulp van een bicinchoninezuur (BCA) eiwittest53. Bewaar monsters op ijs terwijl u kwantificeert om eiwitafbraak te beperken.
OPMERKING: Voor totale proteoomanalyse is 20-100 μg eiwit meer dan voldoende voor nano-LC-MS, waarvoor doorgaans minder dan 2 μg eiwitvertering per analyse nodig is. De bereiding van overtollig peptide maakt replicatieanalyse of verdere fractionering mogelijk als diepe proteomische dekking vereist is. Voor op glycopeptideverrijking gebaseerde analyse met behulp van hydrofiele interactiechromatografie (HILIC) is 100-500 μg eiwit vereist. - Verminder en alkylaatmonsters.
- Voeg 1/10e het volume van 10x reductie/alkyleringsbuffer (100 mM Tris 2-carboxyethylfosfinehydrochloride; 400 mM 2-chlooracetamide in 1 M Tris, pH 8,5) toe aan monsters voor een eindconcentratie van 1x en incubeer monsters in het donker gedurende 30 minuten bij 45 °C met schudden bij 1.500 tpm.
OPMERKING: Controleer de pH van de 10x reductie-/alkyleringsbuffer om een pH van ongeveer 7,0-8,0 te garanderen voordat u deze aan de monsters toevoegt, omdat een lagere pH ervoor zorgt dat de SDC neerslaat.
- Voeg 1/10e het volume van 10x reductie/alkyleringsbuffer (100 mM Tris 2-carboxyethylfosfinehydrochloride; 400 mM 2-chlooracetamide in 1 M Tris, pH 8,5) toe aan monsters voor een eindconcentratie van 1x en incubeer monsters in het donker gedurende 30 minuten bij 45 °C met schudden bij 1.500 tpm.
- Draai de monsters kort af en voeg de proteasen Trypsin/Lys-C (~10 μL, geresuspendeerd in 100 mM Tris, pH 8,5) toe voor een uiteindelijke protease:eiwitverhouding van 1:100. Incubeer de digesten een nacht bij 37 °C met schudden bij 1.500 tpm (tot 18 uur). Gebruik voor een volledige eiwitvertering een Trypsine/Lys-C protease:eiwitverhouding van 1:50 tot 1:200.
- Blus digesten door 1,25 volumes 100% isopropanol aan de monsters toe te voegen. Draai de monsters gedurende 1 minuut om te mengen en draai ze kort af.
OPMERKING: Monsters kunnen worden bewaard bij -20 °C om later verder te worden verwerkt. - Verzuur de monsters door 0,115 volumes 10% trifluorazijnzuur (TFA; eindconcentratie van ~1% TFA) toe te voegen, vortex de monsters en draai ze kort af.
2. Verwerking van proteoommonsters
- Peptide-opschoning van proteoommonsters
- Bereid één styrenedivinylbenzeen-omgekeerde-fase sulfonaat (SDB-RPS) Stop-and-go-extractie (Stage) Tip voor elk monster zoals eerder beschreven54.
- Empirisch, voor het binden van 50 μg peptide, verwijder drie SDB-RPS-schijven uit een 47 mm2 SDB-RPS-membraan met behulp van een stompe naald (14 G). Voor grotere hoeveelheden peptiden, verhoog het aantal schijven dienovereenkomstig.
- Voordat u SDB-RPS Stage Tips gebruikt, bereidt u de tips voor door achtereenvolgens ten minste tien bedvolumes van de volgende buffers toe te voegen en de buffer door de kolom te draaien door middel van centrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) of door de buffer door de kolom te duwen door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.
- Maak de uiteinden nat met 150 μL 100% acetonitril.
- Was de uiteinden met 150 μL 30% methanol, 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.
- Breng de uiteinden in evenwicht met 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA gebalanceerd met 18,2 MΩ H2O.
- Laad de monsters (die 50% isopropanol, 1% TFA bevatten) op de SDB-RPS Stage Tips door centrifugeren (25 °C, 3 min, 500 × g) of door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.
- Was de SDB-RPS Stage Tips met de volgende buffers door centrifugeren (25 °C, 3 min, 500 × g) of door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.
OPMERKING: Extra wasbeurten of alternatieve buffers kunnen worden gebruikt om niet-peptideverontreinigingen te verwijderen, zoals het gebruik van ethylacetaat in plaats van isopropanol55.- Was de tips met 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA.
- Was de uiteinden met 150 μL 1% TFA in 18,2 MΩ H2O.
- Eluteer de peptiden uit de SDB-RPS Stage Tips met 150 μL 5% ammoniumhydroxide in 80% acetonitril door centrifugeren of door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit. Verzamel de monsters in afzonderlijke buizen.
OPMERKING: Bereid 5% ammoniumhydroxide in 80% acetonitril in een plastic container onmiddellijk voor gebruik in een zuurkast. - Droog de geëlueerde peptiden door vacuümcentrifugeren bij 25 °C.
OPMERKING: Als HILIC-verrijking wordt uitgevoerd, kan 1-10% van de peptide-eluaten op dit punt worden verwijderd, gedroogd en gebruikt als totale proteoominvoercontroles.
- Bereid één styrenedivinylbenzeen-omgekeerde-fase sulfonaat (SDB-RPS) Stop-and-go-extractie (Stage) Tip voor elk monster zoals eerder beschreven54.
- Verrijking van glycopeptidemonsters
- Bereid Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips voor zoals eerder beschreven54,56.
- Snijd kort een C8-schijf uit een 47 mm2 C8-membraan met behulp van een stompe naald (14 G) en verpak de schijf in een P200-punt om een frit te maken. Voeg ongeveer 5 mm ZIC-HILIC-materiaal, geresuspendeerd in 50% acetonitril, 50% 18,2 MΩ H2O, toe aan de friet door voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een spuit.
- Voordat u ZIC-HILIC Stage Tips gebruikt, conditioneert u de hars door achtereenvolgens de volgende buffers toe te voegen en voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.
OPMERKING: Om de integriteit van de pseudo-waterlaag op het oppervlak van de ZIC-HILIC-hars (nodig om glycopeptiden te verrijken) te waarborgen, moet de hars altijd nat blijven. Laat bij het wassen van de hars altijd ~10 μL oplosmiddel boven de hars en zorg ervoor dat de wasbeurten/monsters direct in dit resterende oplosmiddel worden gepipetteerd.- Breng de hars in evenwicht met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC-elutiebuffer (0,1% TFA in 18,2 MΩ H2O).
- Was de hars met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC-bereidingsbuffer (95% acetonitril in 18,2 MΩ H2O).
- Was de hars met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC laad-/wasbuffer (80% acetonitril, 1% TFA gebalanceerd met 18,2 MΩ H2O).
- Resuspend de gedroogde verteerde monsters (vanaf stap 2.1.6) in ZIC-HILIC laad-/wasbuffer tot een eindconcentratie van 4 μg/μL (bv. voor 200 μg peptide, geresuspendeerd in 50 μL ZIC-HILIC laad-/wasbuffer). Vortex kort gedurende 1 minuut om ervoor te zorgen dat de monsters opnieuw worden gesuspendeerd en draai gedurende 1 minuut bij 2.000 × g bij 25 °C.
- Laad het geresuspendeerde peptidemonster op een geconditioneerde ZIC-HILIC-kolom.
- Was driemaal met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC laad-/wasbuffer (voor 60 bedvolumes in totaal) door voorzichtig druk uit te oefenen met een spuit.
- Elute glycopeptiden met 20 bedvolumes (200 μL) ZIC-HILIC elutiebuffer in een buis van 1,5 ml door voorzichtig druk uit te oefenen met behulp van een spuit en droog het eluaat vervolgens door vacuümcentrifugeren bij 25 °C.
- Bereid Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips voor zoals eerder beschreven54,56.
3. LC-MS van proteoom/glycopeptide-verrijkte monsters
- Resuspend de monsters in Buffer A* (2% acetonitril, 0,1% TFA) tot een eindconcentratie van 1 μg/μL (bijvoorbeeld voor 50 μg peptide, resuspend in 50 μL Buffer A*).
- Laad de monsters op een HPLC/UPLC gekoppeld aan een MS om de scheiding en identificatie van glycopeptiden mogelijk te maken.
OPMERKING: De kolomparameters, waaronder binnendiameter, lengte, stroomsnelheden, type chromatografiehars en vereiste peptide-injectiehoeveelheden, moeten worden geoptimaliseerd voor de analytische opstelling en de te gebruiken gradiëntlengte; voor een voorbeeld van het optimaliseren van analytische opstellingen, zie57. - Controleer de verzameling van de resulterende MS-gegevens en zorg ervoor dat de gegevens worden verzameld met de gewenste parameters.
OPMERKING: Voor de samenstellingsanalyse is de fragmentatie van de CID voldoende. Vanwege de toevoeging van glycanen aan glycopeptiden worden glycopeptide-ionen meestal waargenomen met een hogere m / z en lagere ladingsdichtheid dan unglycosylated peptiden. Om ervoor te zorgen dat deze ionen waarneembaar zijn, moet u een MS1-massabereik van 400 tot 2.000 m / z toestaan. - Fragment geselecteerde ionen met behulp van CID, waardoor de verzameling van lage m / z-fragmentionen die oxoniumionen bevatten die belangrijk zijn voor de karakterisering van glycanen, wordt gewaarborgd.
OPMERKING: Fragmentatie van glycopeptiden met behulp van CID wordt beïnvloed door zowel de peptide- als glycaansequenties, evenals de energie die wordt toegepast tijdens fragmentatie 25,58,59. Hoewel een reeks verschillende botsingsenergieën kan worden gebruikt, is een optimale strategie voor het fragmenteren van glycopeptiden het gebruik van getrapte botsingsenergieën die het gebruik van meerdere botsingsenergieën combineren 25,59,60. - Gebruik alternatieve fragmentatiemethoden, indien beschikbaar, zoals ETD voor locatielokalisatie of IT-CID om te helpen bij het bepalen van glycaansamenstellingen.
OPMERKING: Geen van deze fragmentatiebenaderingen zijn essentieel voor samenstellingsanalyse, maar kunnen worden verzameld om verdere ondervraging van glycopeptiden van belang mogelijk te maken.
4. Analyse van met proteoom/glycopeptide verrijkte monsters
- Gegevensbestanden vooraf filteren om zoeken in FragPipe mogelijk te maken
- Als ETD- of IT-CID-scans zijn verkregen in gegevenssets, filtert u deze scangebeurtenissen uit de gegevensbestanden met MSConvert61 voordat u met FragPipe gaat zoeken.
OPMERKING: Voor de hieronder beschreven parameters voor open zoeken zijn alleen CID-gegevens van het straaltype vereist.
- Als ETD- of IT-CID-scans zijn verkregen in gegevenssets, filtert u deze scangebeurtenissen uit de gegevensbestanden met MSConvert61 voordat u met FragPipe gaat zoeken.
- Open zoekopdrachten uitvoeren in FragPipe
- Open FragPipe en klik op het tabblad Workflow . Selecteer in het vervolgkeuzemenu workflow de optie Zoekopdracht openen en klik op Bestanden toevoegen om de gegevensbestanden te importeren die moeten worden doorzocht in FragPipe (afbeelding 2A).
- Klik op het tabblad Database en start de downloadmanager door op Downloaden te klikken. Hierdoor kunnen proteoomdatabases worden gedownload van Uniprot met behulp van een Uniprot Proteome ID. Klik op de optie Lokmiddelen en verontreinigingen toevoegen in de downloadmanager om lok- en verontreinigingseiwitten in databases op te nemen.
- Voor strengere FDR-drempels klikt u op het tabblad Validatie en wijzigt u de filter- en rapportwaarde van 0,01 naar de vereiste FDR.
OPMERKING: De standaard FragPipe-instellingen zorgen voor een FDR van 1% op eiwitniveau. - Klik op het tabblad MSfragger . Verhoog in het vak Piekmatching de massatolerantie voor precursoren van de standaard 500 Da naar 2.000 Da om grote wijzigingen te kunnen identificeren (figuur 2A).
- Klik op het tabblad Uitvoeren en definieer de locatie van de uitgangen van FragPipe. Klik op de knop Uitvoeren om de zoekopdracht te starten.
- Met behulp van de PSM's die zijn geïdentificeerd in datasets (opgenomen in de psm.tsv-uitgangen van FragPipe), identificeert u potentiële glycanen door de frequentie van waargenomen deltamassa's in datasets uit te zetten (figuur 3). Maak deltamassaplots van MSfragger-uitgangen met behulp van de R-scripts die toegankelijk zijn via PRIDE-toetreding PXD027820.
OPMERKING: Minimale nabewerking van de open zoekresultaten wordt uitgevoerd binnen deze scripts, omdat het belangrijkste doel van deze scripts is om te helpen bij de visualisatie van deltamassaprofielen. Belangrijk is dat de waarneming van overvloedige deltamassa's alleen geen bewijs is dat een modificatie een potentiële glycaan is, omdat het toewijzen van deltamassa's als glycanen verdere analyse van de overeenkomstige MS2-gebeurtenissen vereist. - Om de karakterisering van glycopeptiden in monsters mogelijk te maken, richt u zich op deltamassa-identificaties met een hoge betrouwbaarheid, overeenkomend met toewijzingen met hoge hyperscores.
- Om te helpen bij het beoordelen van glycopeptidespectra, gebruikt u peptide-annotatietools, zoals de Interactive Peptide Spectral Annotator63, die de toewijzing van peptide-geassocieerde ionen binnen spectra mogelijk maakt, waardoor de handmatige identificatie van de glycaan-geassocieerde ionen mogelijk is (figuur 4).
OPMERKING: Binnen de hier gepresenteerde datasets worden hyperscores van >30 als hoge scores beschouwd, omdat deze overeenkomen met scores binnen de top 50% van alle geïdentificeerde glycopeptiden (figuur 5).
- Om te helpen bij het beoordelen van glycopeptidespectra, gebruikt u peptide-annotatietools, zoals de Interactive Peptide Spectral Annotator63, die de toewijzing van peptide-geassocieerde ionen binnen spectra mogelijk maakt, waardoor de handmatige identificatie van de glycaan-geassocieerde ionen mogelijk is (figuur 4).
- Met hoog-betrouwbaarheid glycopeptiden toegewezen, identificeer vaak waargenomen glycaan-geassocieerde ionen (figuur 4) om de identificatie van glycopeptiden te verbeteren.
OPMERKING: Door glycaan-geassocieerde ionen op te nemen in zoekopdrachten, bekend als glycaangerichte zoekopdrachten, kan de kwaliteit van glycopeptide-toewijzingen worden verbeterd.- Klik op het tabblad MSfragger van FragPipe en neem de vastgestelde deltamassa's van de waargenomen glycanen op in de secties Variabele wijzigingen en Massaverschuivingen . Voeg deze massa's toe door waarden te typen in de secties Variabele wijzigingen en Massaverschuivingen met afzonderlijke massa's gescheiden door een /. Voeg de glycaan-geassocieerde fragmentmassa's van deze glycanen toe aan de Glyco / Labile mods-sectie van MSFragger.
OPMERKING: Figuur 2B geeft een overzicht van de belangrijkste informatie die nodig is voor een glycaangerichte zoektocht naar de A. baumannii-stam AB307-0294.
- Klik op het tabblad MSfragger van FragPipe en neem de vastgestelde deltamassa's van de waargenomen glycanen op in de secties Variabele wijzigingen en Massaverschuivingen . Voeg deze massa's toe door waarden te typen in de secties Variabele wijzigingen en Massaverschuivingen met afzonderlijke massa's gescheiden door een /. Voeg de glycaan-geassocieerde fragmentmassa's van deze glycanen toe aan de Glyco / Labile mods-sectie van MSFragger.
- Upload alle MS-gegevens die verband houden met proteomische studies naar gecentraliseerde proteomische repositories zoals de PRIDE of MASSIVE repositories.
OPMERKING: Alle gegevens in verband met deze studie zijn gedeponeerd in de PRIDE proteomische repository en zijn toegankelijk via de PRIDE-toetreding: PXD027820.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om het nut van open zoeken naar bacteriële glycopeptide-analyse te illustreren, werd de chemische diversiteit van O-gebonden glycanen binnen drie stammen van A. baumannii-AB307-0294, ACICU en D1279779-beoordeeld. De O-gebonden glycoproteïnen zijn zeer variabel tussen A. baumannii-stammen, omdat de glycanen die worden gebruikt voor glycosylering zijn afgeleid van de zeer variabele capsule loci 44,45,46. Deze chemische diversiteit maakt A. baumannii een ideaal modelsysteem voor open zoekstudies. Hoewel de glycoproteïnen van de drie stammen niet eerder zijn beoordeeld, zijn de capsulestructuren van twee van deze stammen, AB307-029464 en ACICU65, bekend, waarbij de capsule van D1279779 nog moet worden opgehelderd.
In overeenstemming met de capsule AB307-0294 onthulde open zoeken van AB307-0294 twee dominante deltamassa's, overeenkomend met 648,25 Da en 692,28 Da (figuur 3A). Deze massa's komen overeen met de capsulestructuren die eerder zijn bepaald door Russo et al., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA, waarbij het QuiNAc4NR-residu overeenkomt met 2,4-diamino-2,4,6-trideoxy-glucose, gemodificeerd met 3-OH-butyraat of een acetylgroep64. Evenzo is bekend dat de ACICU-capsule bestaat uit een tetrasaccharide K-eenheid, eerder geïdentificeerd als Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc-, overeenkomend met een voorspelde massa van 843,31 Da65. Deze capsulestructuur is consistent met de meest waargenomen deltamassa binnen de ACICU-gegevens (figuur 3B). Ten slotte onthulde een open zoekanalyse van de stam D1279779 de aanwezigheid van meerdere deltamassa's in overeenstemming met 203,08, 794,31 en 1588,62 Da (figuur 3C). Hoewel de massa 203,08 consistent is met die van een enkel HexNAc-residu, komen 794,31 en 1588,62 overeen met onbekende wijzigingen. Opgemerkt moet worden dat de massa 1588,62 precies het dubbele is van die van 794,31, wat suggereert dat deze peptiden zijn versierd met glycaan K-eenheid dimeren, zoals eerder is waargenomen in andere Acinetobacter glycoproteïnen 30,44,46.
Delta-massaplots bieden een snelle en effectieve manier om de frequentie van waargenomen modificaties in monsters te beoordelen. Voor complexe modificaties, zoals glycanen, levert de aanwezigheid van een deltamassa alleen echter niet de informatie op om de exacte samenstelling van een glycaan te definiëren. Om te helpen bij het bepalen van glycaansamenstellingen kunnen de resulterende MS/MS-gegevens van PSM's die zijn toegewezen aan specifieke deltamassa's worden gebruikt. Door zich te concentreren op glycopeptide-toewijzingen met een hoge betrouwbaarheid (in MSFragger overeenkomend met PSM's met hoge hyperscores), kan handmatige analyse worden gebruikt om de glycanen die worden gebruikt door een stam voor eiwitglycosylatie verder te karakteriseren. Opgemerkt moet worden dat peptidetoewijzingen met een hoge betrouwbaarheid doorgaans robuuste glycaaninformatie bevatten die de bepaling van glycaansamenstellingen op basis van Y-ionen mogelijk maakt. Deze informatie kan worden gebruikt om de overeenkomstige fragmenten te identificeren waar de glycanen zijn blijven hechten aan peptiden, evenals aan B- en oxoniumgerelateerde ionen die nuttig zijn voor de toewijzing van glycanen66. Gedetailleerde richtlijnen voor het toewijzen van glycaansamenstellingen zijn eerder geschetst en lezers worden aanbevolen harvey et al.67 te raadplegen. Met behulp van hulpmiddelen zoals de Interactive Peptide Spectral Annotator63 kunnen peptide-geassocieerde ionen gemakkelijk worden geïdentificeerd, waardoor gebruikers de identiteit van de glycanen die aan peptiden zijn bevestigd, kunnen bepalen.
Met behulp van de Interactive Peptide Spectral Annotator werden glycopeptiden geïdentificeerd in deze drie A. baumannii-monsters beoordeeld, waarbij potentiële glycaan-geassocieerde ionen werden onthuld. Overweeg de MS / MS-spectra van het AB307-0294 glycopeptide SAGDQAASDIATATDNASAK, versierd met de glycanen 648.25 en 692.28 Da (figuur 4A, B); onder vergelijkbare fragmentatieomstandigheden lijken de glycaangerelateerde ionen sterk op elkaar, maar verschuiven ze in massa met 44,02 Da. Analyse van de glycaanionen in deze PSM's maakt bevestiging mogelijk dat de deltamassa's die voor deze glycopeptiden worden waargenomen, overeenkomen met trisacchariden die vier verschillende koolhydraten bevatten: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) en HexNAc (203 Da). Opgemerkt moet worden dat bij het toewijzen van glycaanfragmenten meerdere monosacchariden vatbaar zijn voor het verliezen van water wanneer ze worden gefragmenteerd met behulp van CID. Dit is te zien in de glycaan van ACICU, waar de monosacharide Pse5Ac7Ac (316 Da) leidt tot de generatie van twee prominente glycaan-gerelateerde fragmenten: MH + 299.12 en 317.13, het verschil in massa dat overeenkomt met de massa van water (18.01 Da) (Figuur 4C).
Bovendien is het bij het analyseren van bacteriële glycanen gebruikelijk om onverwachte monosaccharidemassa's waar te nemen die overeenkomen met suikers die niet in eukaryoten worden waargenomen. Een voorbeeld hiervan is te zien in de glycopeptide PSM's van D1279779, waar analyse van de meest frequente deltamassa 794,31 Da de aanwezigheid onthult van een ongewone monosaccharide dHexNAc (187 Da, waargenomen als een MH + van 188,09, figuur 4D), die eerder is waargenomen in A. baumannii O-gebonden glycanen44. Hoewel metingen met hoge massanauwkeurigheid en het karakteristieke gedrag van glycanen als labiele modificaties, die verloren gaan van de peptide-ruggengraat, kunnen helpen bij het bepalen van potentiële chemische samenstellingen van glycanen, is het raadzaam om de overinterpretatie van MS-gegevens te minimaliseren. Als stereochemie van specifieke suikers of de koppelingsinformatie van een glycaan onbekend is, is het de beste praktijk om structureel agonistische toewijzingen te gebruiken, inclusief het verwijzen naar monosacchariden door hun specifieke klassen. Een voorbeeld hiervan is het verwijzen naar 203,08 Da-residuen als N-acetylhexosamines (HexNAc) en het vermijden van de toewijzing van koppelingstypen. Indien nodig wordt aanbevolen om aanvullende technieken te gebruiken om de exacte chemische identiteit van een onbekende modificatie te definiëren, zoals het gebruik van nucleaire magnetische resonantie (NMR).
Hoewel open zoekbenaderingen de snelle identificatie van gemodificeerde peptiden mogelijk maken, is het belangrijk op te merken dat deze zoekbenadering potentiële glycopeptiden in datasets over het hoofd kan zien. Binnen open zoekopdrachten kunnen glycopeptiden om verschillende redenen niet worden geïdentificeerd, waaronder onvoldoende informatie over peptidefragmentatie of bestraffing van het toegewezen peptide vanwege de aanwezigheid van meerdere niet-toegewezen ionen binnen de MS2-gebeurtenis. Dit laatste geldt vooral voor bacteriële glycopeptide PSM's, omdat deze spectra glycaan-geassocieerde fragmenten kunnen bevatten die niet worden beschouwd door standaard open zoekparameters. Aangezien ongeëvenaarde kenmerken een negatieve invloed hebben op de score van PSM's, maakt het minimaliseren van ongeëvenaarde ionen binnen MS / MS-spectra de identificatie mogelijk van glycopeptiden die aanvankelijk werden uitgesloten vanwege de FDR-gecontroleerde minimale scoredrempels. Om deze beperking te overwinnen, kunnen de massa's gedefinieerd uit de open zoekopdrachten (figuur 3) en de handmatig gedefinieerde glycaan-geassocieerde ionen (figuur 4) worden opgenomen in zoekparameters om de identificatie van glycopeptiden te verbeteren. Het is belangrijk op te merken dat deze glycaan-geassocieerde ionen handmatig kunnen worden geïdentificeerd op basis van de novo bepaling van de glycaan, voorkennis van veel voorkomende oxoniumionen44,68, of het gebruik van hulpmiddelen die terugkerende ionen binnen spectra kunnen vangen, zoals de SPectral Immonium Ion Detection tool69,76.
Om dit aan te tonen, werden de massa's atypische glycaanfragmenten geïdentificeerd door open zoekanalyse opgenomen in de zoekparameters in MSFragger en glycaangericht zoeken uitgevoerd (de glycaangerichte instellingen voor de stam AB307-0294 zijn weergegeven in figuur 2B). Opgemerkt moet worden dat wanneer meerdere glycanen samen worden doorzocht, voorzichtigheid moet worden betracht bij de selectie van Y-ionen en diagnostische massa's om ervoor te zorgen dat ze nauwkeurig de fragmentionen weerspiegelen die bij elke deltamassa horen. Hoewel dit niet altijd mogelijk is voor combinaties van Y en diagnostische massa's die elkaar uitsluiten, zoals de fragmenten van de 648.25 en 692.28 glycanen van AB307-0294 (figuur 4A, B), is glycaangericht zoeken nog steeds mogelijk, hoewel dit de robuustheid van de zoekresultaten kan beïnvloeden. Glycan-gerichte zoekopdrachten leidden tot een opmerkelijke toename van het totale aantal glycopeptide PSM's geïdentificeerd in alle drie de A. baumannii stammen, wat overeenkomt met een toename van 37% in ACICU, een toename van 117% in AB307-0294 en een toename van 363% in D1279779 (figuur 5A-C). Voor individuele MS-voorvallen resulteert de opname van glycaanspecifieke informatie doorgaans in een toename binnen de waargenomen hyperscore, hoewel deze toename sterk glycaanafhankelijk is (figuur 5D,E). Dus door de zoekparameters te verfijnen met behulp van de massa's glycanen die door open zoeken worden onthuld en vervolgens handmatig samengestelde glycaanfragmentinformatie op te nemen in gerichte zoekopdrachten, kan een meer gedetailleerde analyse van glycopeptiden in monsters worden verkregen.
Figuur 1: Overzicht van de belangrijkste stappen in de bereiding en analyse van bacteriële glycopeptiden. De succesvolle identificatie van bacteriële glycopeptiden is afhankelijk van het genereren van hoogwaardige monsters die glycopeptiden bevatten. Glycopeptide-bevattende monsters worden vervolgens geanalyseerd door LC-MS en vervolgens worden open zoekbenaderingen gebruikt om potentiële glycopeptiden te identificeren op basis van unieke deltamassa's. Met behulp van handmatige curatie kunnen deze deltamassa's worden geïdentificeerd als glycanen. Ten slotte, om de identificatie van glycopeptiden te verbeteren, kan glycaaninformatie worden opgenomen in glycaangerichte database-zoekopdrachten. Afkortingen: LC-MS = vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie; OD = optische dichtheid; SDB-RPS = styrenedivinylbenzeen-omgekeerde-fase sulfonaat; ZIC-HILIC = Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography; PSM's = peptide-spectrale matches; CID = door botsingen geïnduceerde dissociatie; ETD = elektronoverdrachtdissociatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van het inschakelen van open zoeken en glycaangerichte zoekopdrachten in FragPipe. (A) Open zoeken kan worden ingeschakeld door de Open Workflow te laden op het tabblad Workflow van FragPipe. Om de identificatie van glycanen groter dan 500 Da mogelijk te maken, verhoogt u het venster Precursor massatolerantie tot 2.000 Da. (B) Glycaan-gerichte zoekopdrachten naar atypische glycanen vereisen de invoer van glycaaninformatie in het tabblad MSFragger om de verwachte massa's van de modificaties te definiëren (in de secties Variabele modificaties en Massaverschuivingen ), de Y-ionen geassocieerd met deze glycanen (in de Y Ion Masses-lijst van de Glyco / Labile sectie), en de lage-massa glycaan fragmentionen (in de diagnostische fragment massa's lijst van de Glyco / Labile sectie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Deltamassaplots met open zoekresultaten voor de drie stammen van Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU en D1279779). In overeenstemming met de diversiteit van de capsule loci, bezit elke A. baumannii-stam een uniek deltamassaprofiel met prominente wijzigingen van meer dan 140 Da in grootte, aangegeven door de waargenomen deltamassa's. (A) Binnen de DELTAMASSA VAN AB307-0294 komen de massa's 648,25 en 692,28 overeen met wijzigingen die overeenkomen met -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-, waarbij de QuiNAc4NR wordt gewijzigd met een 3-OH-butyraat of acetylgroep64. (B) Binnen de ACICU-deltamassaplot komen de massa's 203.08 en 843.31 overeen met modificaties die overeenkomen met HexNAc en Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc, respectievelijk65. (C) Binnen de D1279779 deltamassaplot komen de massa's 203.08, 794.31 en 1588.62 overeen met HexNAc, HexNAc-217-187-187 en een dimeer van HexNAc-217-187-187. Deltamassa's die handmatig zijn beoordeeld en bevestigd in figuur 4 als glycanen aangeduid met *. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: MS/MS-karakterisering van deltamassa's waargenomen over de drie stammen van Acinetobacter baumannii. (A, B) AB307-0294, (C) ACICU en (D) D1279779. Interactieve Peptide Spectral Annotator-geassisteerde geannoteerde spectra van representatieve glycopeptiden. Voor elk spectrum worden de peptidefragmentionen aangeduid in blauw en rood, terwijl de handmatig toegewezen glycaan-geassocieerde ionen in groen worden aangegeven. Glycanen zijn geannoteerd met behulp van de symboolnomenclatuur voor glycanen met HexNAc aangeduid als een vierkant, Hex als een cirkel en atypische monosacchariden aangeduid als trapezoïden met de massa van de glycaan aangeduid in de trapezoïden. Afkorting: MS/MS = tandem massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van glycopeptiden geïdentificeerd tussen stammen van Acinetobacter baumannii met behulp van open versus glycaan-gerichte zoekopdrachten. (A-C) Vergelijking van hyperscores en het aantal PSM-toewijzingen binnen D1279779, ACICU en AB307-0294 met behulp van open en glycaangericht zoeken. (D-F) Vergelijking van individuele MS2-gebeurtenissen die aan dezelfde peptidesequentie zijn toegewezen met behulp van open en glycaangerichte zoekopdrachten voor D1279779, ACICU en AB307-0294. Afkorting: PSM = peptide-spectrale match. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| A. Baumannii Stammen | Uniprot Proteome ID's |
| AB 307-0294 15 | UP000006924 |
| ACICU 47,48 | UP000008839 |
| D1279779 49 | UP000011860 |
Tabel 1. Strain en Uniprot Proteome ID's gebruikt binnen deze studie.
| Buffernaam | Buffersamenstelling / pH | |
| Buffer A* | 2% acetonitril in 18,2 MΩ H2O, 0,1% trifluro-azijnzuur / pH 1,0 | |
| PBS | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 en 2 mM KH2PO4 / pH 7,4 | |
| Reductie/alkyleringsbuffer | 100 mM Tris 2-carboxyethyl fosfine hydrochloride, 400 mM 2-Chloroacetamide in 1 M Tris / pH 7,5 | |
| SDB-RPS Stage Tip elutie buffer | 5% ammoniumhydroxide in 80% acetonitril / pH 11 | |
| SDB-RPS Stage Tip equlibratie buffer | 30% methanol, 1% trifluro-azijnzuur, in 18,2 MΩ H2O / pH 1,0 | |
| SDB-RPS Stage Tip equlibratie/wasbuffer | 90% isopropanol, 1% trifluro-azijnzuur / pH 1,0 | |
| SDB-RPS Stage Tip wasbuffer | 1% trifluro-azijnzuur in 18,2 MΩ H2O / pH 1,0 | |
| SDC lysis buffer | 4% SDC in 100 mM Tris / pH 8,5 | |
| ZIC-HILIC elutiebuffer | 0,1% trifluro-azijnzuur in 18,2 MΩ H2O /pH 1,0 | |
| ZIC-HILIC laad-/wasbuffer | 80% acetonitril, 1% trifluro-azijnzuur in 18,2 MΩ H2O / pH 1,0 | |
| ZIC-HILIC voorbereidingsbuffer | 95% acetonitril in 18,2 MΩ H2O / pH 7,0 | |
Tabel 2: Samenstelling van de in dit onderzoek gebruikte buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Open searching is een effectieve en systematische methode voor het identificeren van onbekende modificaties. Hoewel de identificatie van onbekende glycanen in bacteriële proteoommonsters van oudsher een tijdrovende en technisch gespecialiseerde onderneming is, maken de recente ontwikkelingen van hulpmiddelen zoals MSfragger 21,41 en Byonic31,38 nu de snelle en effectieve identificatie van deltamassa's mogelijk voor verdere karakterisering als potentiële glycanen die aan peptiden zijn bevestigd. Open zoeken naar zowel standaard als glycopeptide-verrijkte proteoommonsters kan potentiële glycopeptiden identificeren (figuur 1). De gemeenschappelijkheid en overvloed aan glycopeptiden in het proteoom van veel bacteriële systemen maken de directe detectie van deze modificaties mogelijk zonder glycopeptideverrijking6. Hoewel glycopeptideverrijkingsbenaderingen meestal nog steeds beter presteren dan niet-op verrijking gebaseerde methoden voor veel glycosylatiesystemen70, is het opmerkelijk dat niet alle glycanen even vatbaar zijn voor verrijking 71,72. Met dit feit moet rekening worden gehouden bij het bepalen van de meest geschikte aanpak voor het identificeren van glycosylatiegebeurtenissen met behulp van open zoeken naar een bepaald biologisch monster.
Hoewel open zoeken effectief glycanen identificeert die met een hoge frequentie in een monster worden waargenomen, blijft het ineffectief bij het identificeren van glycosylatiegebeurtenissen die zelden voorkomen in datasets. In de praktijk moeten, om een unieke deltamassa van een glycaan te kunnen identificeren, ten minste 10 PSM's met een identieke deltamassa in monsters aanwezig zijn. Deze minimumfrequentie maakt het mogelijk om een potentiële glycaan te onderscheiden boven achtergrond deltamassa-toewijzingen (figuur 3). Hoewel aan dit criterium doorgaans wordt voldaan door algemene glycosylatiesystemen die zich richten op meerdere substraten voor glycosylering, kunnen systemen waarbij een enkel eiwit is gericht op glycosylering minder vatbaar zijn voor deze aanpak. Naarmate de snelheid en gevoeligheid van MS-instrumenten verbeteren, is het waarschijnlijk dat dit in toenemende mate de beoordeling van glycopeptidepopulaties met een lagere abundantie mogelijk zal maken, wat op zijn beurt de effectiviteit van open zoekbenaderingen zal verbeteren, op voorwaarde dat voldoende kwaliteitsspectra kunnen worden gegenereerd voor zeldzame / laag overvloedige glycovormen.
Hoewel MS de effectieve identificatie van nieuwe glycanen mogelijk maakt, is het belangrijk op te merken dat dit inzicht alleen zelden een volledige structurele karakterisering van glycopeptiden / glycanen biedt, waarbij hulpmiddelen zoals NMR-spectroscopie nog steeds van cruciaal belang zijn voor volledige glycaankarakterisering. Zoals hier waargenomen, gaf MS aanvullende bevestiging van K-eenheden die eerder waren bepaald met NMR uit geïsoleerde capsules van A. baumannii ACICU en AB307-029464,65. Voor de belangrijkste glycaan die in D1279779 werd geïdentificeerd, was echter alleen informatie over de vermeende klassen van monosachariden in deze glycaan toewijsbaar, waarbij MS geen informatie gaf over de koppelingstypen of de stereochemie van deze suikereenheden (figuur 4). Naarmate nieuwe MS-fragmentatiemethoden op grotere schaal beschikbaar worden, zoals ultraviolette fotodissociatie73,74, kan een meer gedetailleerde structurele karakterisering van glycopeptiden mogelijk zijn. Er moet echter voorzichtig worden omgegaan met het afleiden van koppelingen of stereochemische informatie met de huidige instrumentatie. Naast deze overwegingen zijn er onlangs vragen gesteld over de geschiktheid van op FDR gebaseerde controles voor open zoeken75. Hoewel open zoeken dus een krachtige benadering is, benadrukken deze overwegingen de noodzaak om zorg te besteden aan de interpretatie van glycaanopdrachten op basis van alleen open zoekinformatie.
Hoewel dit werk aantoont dat open zoeken een effectieve benadering is voor de ongecontroleerde identificatie van glycanen die worden gebruikt voor bacteriële glycosylatie, biedt open zoeken alleen toegang tot slechts een subset van alle glycopeptiden in monsters. Vanwege de labiele aard van glycanen bevatten glycopeptide PSM's meestal een breed scala aan glycaan-geassocieerde fragmenten die, indien niet in aanmerking genomen, de score van PSM's nadelig zullen beïnvloeden. Om dit probleem op te lossen en een meer diepgaande identificatie van glycopeptiden mogelijk te maken, kan de glycaaninformatie die wordt verkregen door open zoeken vervolgens worden gebruikt om glycaangerichte zoekopdrachten te informeren (figuur 2B). Op deze manier kan open zoeken, in combinatie met de handmatige bepaling van glycaan-geassocieerde fragmenten, worden gebruikt om de kwaliteit en kwantiteit van glycopeptiden toegewezen in monsters te verbeteren (figuur 5). Hoewel de verfijning van glycopeptide-zoekparameters handmatig wordt uitgevoerd met de huidige versies van tools, zoals MSfragger, is het waarschijnlijk dat naarmate het veld volwassen wordt, deze stappen op een geautomatiseerde manier zullen worden uitgevoerd. Studies hebben al computationele benaderingen aangetoond om herhalende ionen met een laag molecuulgewicht geassocieerd met specifieke PTM's69 te identificeren, evenals strategieën om oxoniumionen en herhalende Y-ionenmassa's geassocieerd met onbekende glycopeptiden te identificeren76. Het is dus waarschijnlijk dat deze stappen zullen worden opgenomen in nieuwe iteraties van hulpmiddelen zoals FragPipe, waardoor het nog gemakkelijker wordt om voorheen onbekende glycosylatiegebeurtenissen in bacteriële en eukaryote monsters te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
N.E.S wordt ondersteund door een Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) en een ARC Discovery Project Grant (DP210100362). We bedanken de Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility van het Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute voor toegang tot MS-instrumentatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 G Kel-F Hub point style 3 | Hamilton company | hanc90514 | |
| 2-Chloroacetamide | Sigma Aldrich Pty Ltd | C0267-100G | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich Pty Ltd | 34851-4L | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 338818-100ML | |
| BCA Protein Assay Reagent A | Pierce | 23228 | |
| BCA Protein Assay Reagent B | Pierce | 23224 | |
| C8 Empore SPE | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66882-U | An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Formic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 5.33002 | |
| Isopropanol | Sigma Aldrich Pty Ltd | 650447-2.5L | |
| Methanol | Fisher Chemical | M/4058/17 | |
| SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66886-U | An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich Pty Ltd | D6750-100G | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 2232000083 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 302031-10X1ML | |
| Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | C4706-2G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich Pty Ltd | 252859-500G | |
| Trypsin/Lys-C protease mixture | Promega | V5073 | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810040 | |
| ZIC-HILIC material | Merck | 1504580001 | Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin |
References
- Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
- Schaffer, C., Messner, P.
- Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
- Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
- Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
- Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
- Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
- Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
- Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
- McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
- Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
- Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
- Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W.
- Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
- Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
- Thomas, D. R., Scott, N. E.
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
- Yu, A., et al.
- Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
- Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
- Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
- Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
- Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
- Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
- Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
- Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
- Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
- Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
- Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
- Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
- Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
- Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
- Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
- Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
- Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
- Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
- Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
- Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
- Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
- HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
- Smith, P. K., et al.
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
- Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
- Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
- Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
- Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
- Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
- Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
- Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
- Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
- Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
- Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
- Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
- Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
- Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
- Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
- Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
- Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
- Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).
