Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

تطبيق النهج القائمة على البحث المفتوح لتحديد الجليكوببتيدات المرتبطة ب Acinetobacter baumannii O

Published: November 2, 2021 doi: 10.3791/63242
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

يتيح البحث المفتوح تحديد الببتيدات السكرية المزينة بتركيبات جليكان غير معروفة سابقا. ضمن هذه المقالة ، يتم تقديم نهج مبسط لإجراء البحث المفتوح وعمليات البحث اللاحقة عن الجليكوببتيد التي تركز على الجليكوبتيد للعينات البكتيرية باستخدام Acinetobacter baumannii كنموذج.

Abstract

يتم التعرف بشكل متزايد على غليكوزيل البروتين كتعديل شائع داخل الكائنات الحية البكتيرية ، مما يساهم في فسيولوجيا بدائية النواة والعدوى المثلى للأنواع المسببة للأمراض. ونتيجة لذلك ، هناك اهتمام متزايد بتوصيف الجليكوزيل البكتيري والحاجة إلى أدوات تحليلية عالية الإنتاجية لتحديد هذه الأحداث. على الرغم من أن البروتيوميات من أسفل إلى أعلى تمكن بسهولة من توليد بيانات غليكوببتيد غنية ، فإن اتساع وتنوع الجليكان الذي لوحظ في الأنواع بدائية النواة يجعل تحديد أحداث الجليكوزيل البكتيرية أمرا صعبا للغاية.

تقليديا ، جعل التحديد اليدوي لتركيبات الجليكان داخل مجموعات البيانات البروتينية البكتيرية هذا تحليلا مخصصا إلى حد كبير يقتصر على خبراء ميدانيين محددين. في الآونة الأخيرة ، ظهرت النهج القائمة على البحث المفتوح كبديل قوي لتحديد التعديلات غير المعروفة. من خلال تحليل تواتر التعديلات الفريدة التي لوحظت على تسلسل الببتيد ، تسمح تقنيات البحث المفتوحة بتحديد الجليكان الشائع المرتبط بالببتيدات داخل عينات معقدة. تقدم هذه المقالة سير عمل مبسط لتفسير وتحليل بيانات glycoproteomic ، مما يوضح كيف يمكن استخدام تقنيات البحث المفتوح لتحديد الببتيدات السكرية البكتيرية دون معرفة مسبقة بتركيبات الجليكان.

باستخدام هذا النهج ، يمكن تحديد الببتيدات السكرية داخل العينات بسرعة لفهم الاختلافات في الغليكوزيل. باستخدام Acinetobacter baumannii كنموذج ، تمكن هذه الأساليب من مقارنة تركيبات الجليكان بين السلالات وتحديد البروتينات السكرية الجديدة. يوضح هذا العمل مجتمعا تنوع تقنيات البحث في قواعد البيانات المفتوحة لتحديد الغليكوزيل البكتيري ، مما يجعل توصيف هذه الجليكوبروتينات شديدة التنوع أسهل من أي وقت مضى.

Introduction

غليكوزيل البروتين ، عملية ربط الكربوهيدرات بجزيئات البروتين ، هي واحدة من أكثر التعديلات ما بعد الانتقالية شيوعا (PTMs) في الطبيعة 1,2. في جميع مجالات الحياة ، تطورت مجموعة من الآلات المعقدة المخصصة لتوليد البروتينات السكرية التي تؤثر على عدد لا يحصى من الوظائف الخلوية1،3،4،5. في حين أن غليكوزيل البروتين يحدث على مجموعة من الأحماض الأمينية 6,7 ، فإن أحداث الجليكوزيل المرتبطة ب N و O هما شكلان مهيمنان لوحظا في الطبيعة. يتضمن الغليكوزيل المرتبط ب N ربط الجليكان بذرة نيتروجين من بقايا الأسباراجين (Asn) ، بينما في الغليكوزيل المرتبط ب O ، يتم ربط الجليكان بذرة أكسجين من بقايا سيرين (Ser) أو ثريونين (Thr) أو التيروزين (Tyr)7. على الرغم من أوجه التشابه في المخلفات التي تستهدفها أنظمة الجليكوزيل ، فإن الاختلافات داخل الجليكان المرتبطة بالبروتينات تؤدي إلى كون الجليكوزيل هو الفئة الأكثر تنوعا كيميائيا من PTMs الموجودة في الطبيعة.

في حين أن أنظمة الجليكوزيل حقيقية النواة تمتلك تنوع الجليكان ، فإن هذه الأنظمة عادة ما تكون مقيدة في عدد الكربوهيدرات الفريدة المستخدمة. ينبع التنوع الناتج من كيفية ترتيب هذه الكربوهيدرات في جليكان8،9،10،11،12. في المقابل ، تمتلك الأنواع البكتيرية والقديمة تنوعا غير محدود تقريبا من الجليكان بسبب المجموعة الهائلة من السكريات الفريدة المتولدة داخل هذه الأنظمة2،10،13،14،15،16،17. تمثل هذه الاختلافات في تنوع الجليكان الذي لوحظ عبر مجالات الحياة تحديا تحليليا كبيرا لتوصيف وتحديد أحداث الغليكوزيل. بالنسبة للغليكوزيل حقيقي النواة ، فإن القدرة على توقع تركيبات الجليكان قد سهلت الاهتمام المتزايد بعلم الأحياء السكرية. ومع ذلك ، فإن الشيء نفسه لا ينطبق على الجليكوزيل البكتيري ، الذي لا يزال مقتصرا إلى حد كبير على الدراسة من قبل المختبرات المتخصصة. مع زيادة إمكانية الوصول إلى أجهزة قياس الطيف الكتلي (MS) في العلوم البيولوجية ، أصبحت النهج القائمة على MS الآن الطريقة الأساسية لتحليل glycoproteomic.

برز مرض التصلب العصبي المتعدد كأداة مثالية لتوصيف الجليكوزيل، مع استخدام كل من النهج من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى الآن بشكل شائع لتوصيف البروتينات السكرية6. في حين يتم استخدام البروتيوميات من أعلى إلى أسفل لتقييم أنماط الغليكوزيل العالمية لبروتينات محددة18,19 ، يتم استخدام النهج من أسفل إلى أعلى لتمكين التوصيف الخاص بالجليكان من glycopeptides ، حتى من المخاليط المعقدة6,20,21,22,23. لتحليل glycopeptides ، يعد توليد معلومات التجزئة الإعلامية ضروريا لتوصيف أحداث glycosylation24,25. ويمكن الآن الوصول إلى مجموعة من نهج التجزئة بشكل روتيني على الأدوات، بما في ذلك التفكك الناجم عن التصادم القائم على مصيدة أيون الرنين (IT-CID)، والتفكك الناجم عن التصادم من نوع الحزمة (CID)، وتفكك نقل الإلكترون (ETD). يمتلك كل نهج نقاط قوة وضعف مختلفة لتحليل الجليكوببتيد 25,26 ، مع تقدم كبير خلال العقد الماضي في تطبيق نهج التجزئة هذه لتحليل الغليكوزيل 6,20. ومع ذلك ، بالنسبة لتحليل الغليكوزيل البكتيري ، لم يكن القيد الحرج هو القدرة على تفتيت الجليكوببتيدات ولكن بالأحرى عدم القدرة على التنبؤ بتركيبات الجليكان المحتملة داخل العينات. داخل هذه الأنظمة ، تحد الطبيعة غير المعروفة للجليكان البكتيري المتنوع من تحديد الجليكوببتيدات ، حتى مع أدوات البحث التي تركز على الغليكوزيل الشائعة الآن لتحليل الجليكوببتيدات حقيقية النواة ، مثل O-Pair27 و GlycopeptideGraphMS28 و GlycReSoft29. للتغلب على هذه المشكلة ، هناك حاجة إلى طريقة بحث بديلة ، مع استخدام أدوات البحث المفتوحة الناشئة كنهج قوي لدراسة الغليكوزيل البكتيري30.

يسمح البحث المفتوح ، المعروف أيضا باسم البحث الأعمى أو بحرف البدل ، بتحديد الببتيدات ذات PTMs 21,30,31,32 غير المعروفة أو غير المتوقعة. تستخدم عمليات البحث المفتوحة مجموعة متنوعة من التقنيات الحسابية ، بما في ذلك عمليات البحث عن التعديل المنسق ، أو عمليات البحث في قاعدة البيانات متعددة الخطوات ، أو البحث المتسامح على نطاق واسع33،34،35،36،37. على الرغم من أن البحث المفتوح ينطوي على إمكانات كبيرة ، إلا أن استخدامه عادة ما يعوقه الزيادة الكبيرة في أوقات التحليل وفقدان حساسية الكشف عن الببتيدات غير المعدلة مقارنة بعمليات البحث المقيدة31,32. الانخفاض في الكشف عن التطابقات الطيفية الببتيد غير المعدلة (PSMs) هو نتيجة لزيادة معدلات PSM الإيجابية الكاذبة المرتبطة بهذه التقنيات ، الأمر الذي يتطلب زيادة التصفية الصارمة للحفاظ على معدلات الاكتشاف الخاطئ المطلوبة (FDRs) 33،34،35،36،37 . في الآونة الأخيرة ، أصبحت العديد من الأدوات المتاحة تعمل على تحسين إمكانية الوصول إلى البحث المفتوح بشكل كبير ، بما في ذلك Byonic 31,38 و Open-pFind 39 و ANN-SoLo 40 و MSFragger21,41. تمكن هذه الأدوات من التحديد القوي لأحداث الغليكوزيل من خلال تقليل أوقات التحليل بشكل كبير وتنفيذ نهج للتعامل مع تركيبات الجليكان غير المتجانسة.

تقدم هذه المقالة طريقة مبسطة لتحديد الببتيدات السكرية البكتيرية عن طريق البحث المفتوح ، باستخدام مسببات الأمراض في المستشفيات سالبة الجرام ، Acinetobacter baumannii ، كنموذج. يمتلك A. baumannii نظام جليكوزيل مرتبط ب O محفوظ مسؤول عن تعديل ركائز البروتين المتعددة ، والمعروف باسم نظام غليكوزيل البروتين PglL42,43,44. في حين يتم استهداف بروتينات مماثلة للغليكوزيل بين السلالات ، فإن نظام غليكوزيل PglL متغير للغاية بسبب التخليق الحيوي للجليكان المستخدم في غليكوزيل البروتين المشتق من موضع الكبسولة (المعروف باسم K-locus) 44،45،46. ينتج عن ذلك جليكان متنوع (يعرف أيضا باسم وحدة K) ، مشتقة من وحدات K المبلمرة المفردة أو المحدودة ، التي تضاف إلى ركائز البروتين 30,44,46. ضمن هذا العمل ، يتم استخدام أداة البحث المفتوحة ، MSfragger ، داخل برنامج FragPipe ، لتحديد الجليكان عبر سلالات A. baumannii. من خلال الجمع بين البحث المفتوح والتنظيم اليدوي ، يمكن إجراء "عمليات بحث تركز على الجليكان" لزيادة تحسين تحديد الببتيدات البكتيرية. معا ، يتيح نهج تحديد الهوية متعدد الخطوات هذا تحديد الجليكوببتيدات دون خبرة واسعة في توصيف أحداث الجليكوزيل الجديدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يمكن تقسيم إعداد وتحليل عينات الجليكوببتيد البكتيرية إلى أربعة أقسام (الشكل 1). بالنسبة لهذه الدراسة ، تم تقييم غليكوزيل ثلاث سلالات A. baumannii متسلسلة (الجدول 1). يمكن الوصول إلى قواعد بيانات Proteome FASTA لكل من هذه السلالات عبر Uniprot. ارجع إلى الجدول 2 لمعرفة تكوين المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. إعداد عينات البروتين للتحليل البروتيني

  1. عزل عينات البروتيوم ذات الأهمية
    1. في حالة استخدام خلايا كاملة، تأكد من غسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإزالة ملوثات البروتين المحتملة الموجودة في الوسائط. قم بتجميد الخلايا الكاملة بعد غسلها وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
    2. إذا تم استخدام عينات مجزأة (مثل مستحضرات الغشاء) ، فتأكد من أن الكواشف المستخدمة لن تتداخل مع تحليل الكروماتوغرافيا السائلة MS (LC-MS)50.
    3. إذا تم استخدام المنظفات ، مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أو Triton X-100 أو NP-40 أو lauroylsarcosine ، فقم بإزالة هذه المنظفات باستخدام هطول الأمطار الأسيتون ، أو طرق تحضير عينات SP351 ، أو أعمدة التنظيف البروتيني التجارية مثل S-traps52. بدلا من ذلك ، استبدل المنظفات غير المتوافقة بمنظف متوافق مع MS أو قابل للإزالة مثل ديوكسيكولات الصوديوم (SDC) أو أوكتيل غلوكوبيرانوسيد.
    4. تأكد من أن جميع الأواني البلاستيكية والأواني الزجاجية التي سيتم استخدامها لإعداد العينات لم يتم تعقيمها. عادة ما تكون الأواني الزجاجية والبلاستيكية المعقمة ملوثة بشدة بمركبات صغيرة الوزن الجزيئي ، مثل البوليمرات ، والتي يتم اكتشافها بسهولة داخل MS.
  2. ذوبان عينات الخلايا الكاملة
    1. أعد تعليق ~ 10 ملغ من الخلايا المغسولة والمجمدة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل ديوكسيكولات الصوديوم المحضر حديثا (مخزن SDC المخزن المؤقت: 4٪ SDC في 100 mM Tris، الرقم الهيدروجيني 8.5).
      ملاحظة: يمكن إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني إلى مخزن SDC المخزن المؤقت للتحلل للحد من تدهور البروتين.
    2. تغلي العينات لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية مع الاهتزاز (2000 دورة في الدقيقة على خلاط حراري) ، ثم تترك على الجليد لمدة 10 دقائق. كرر هذه العملية مرتين لضمان التحلل الفعال وذوبان العينات.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات على المدى الطويل في هذه المرحلة عند -80 درجة مئوية. إذا تم تخزينه ، فقم بإعادة الذوبان عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية قبل مزيد من المعالجة.
  3. حدد تركيزات بروتين العينة باستخدام فحص بروتين حمض البيتشينكونينيك (BCA)53. تخزين العينات على الجليد أثناء إجراء تحديد كمي للحد من تدهور البروتين.
    ملاحظة: بالنسبة لتحليل البروتيوم الكلي ، فإن 20-100 ميكروغرام من البروتين أكثر من كاف ل nano LC-MS ، والذي يتطلب عادة أقل من 2 ميكروغرام من هضم البروتين لكل تحليل. يسمح تحضير الببتيد الزائد بتحليل التكرار أو المزيد من التجزئة إذا كانت هناك حاجة إلى تغطية بروتينية عميقة. للتحليل القائم على إثراء جليكوببتيد باستخدام كروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء (HILIC) ، يلزم 100-500 ميكروغرام من البروتين.
  4. تقليل عينات الألكلة والألكلية.
    1. أضف 1/10عشر حجم المخزن المؤقت للاختزال / الألكلة 10x (100 mM Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride ؛ 400 mM 2-chloroacetamide في 1 M Tris ، الرقم الهيدروجيني 8.5) إلى عينات للتركيز النهائي ل 1x واحتضان العينات في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 45 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 1500 دورة في الدقيقة.
      ملاحظة: تحقق من الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت للتقليل / الألكلة 10x لضمان درجة الحموضة من 7.0-8.0 تقريبا قبل الإضافة إلى العينات ، حيث سيؤدي انخفاض الرقم الهيدروجيني إلى ترسيب SDC.
  5. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة وأضف البروتياز Trypsin / Lys-C (~ 10 ميكرولتر ، أعيد تعليقه في 100 mM Tris ، الرقم الهيدروجيني 8.5) للحصول على نسبة بروتين أولية نهائية تبلغ 1: 100. احتضن الهضمات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 1500 دورة في الدقيقة (حتى 18 ساعة). لضمان الهضم الكامل للبروتين ، استخدم نسبة بروتين Trypsin / Lys-C: من 1:50 إلى 1:200.
  6. إخماد الهضم عن طريق إضافة 1.25 حجم من الأيزوبروبانول 100٪ إلى العينات. دوامة العينات لمدة 1 دقيقة لخلط وتدور لفترة وجيزة لأسفل.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية لتتم معالجتها لاحقا بشكل أكبر.
  7. تحمض العينات عن طريق إضافة 0.115 حجم من 10٪ من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA ؛ التركيز النهائي ل ~ 1٪ TFA) ، دوامة العينات ، وتدويرها لفترة وجيزة.

2. معالجة عينات البروتيوم

  1. تنظيف الببتيد من عينات البروتيوم
    1. قم بإعداد طرف واحد من سلفونات الستايرين ديفينيل بنزين ذات الطور العكسي (SDB-RPS) للتوقف والاستخراج (المرحلة) لكل عينة كما هو موضح سابقا54.
      1. تجريبيا ، لربط 50 ميكروغرام من الببتيد ، اقتطع ثلاثة أقراص SDB-RPS من غشاء 47 مم2 SDB-RPS باستخدام إبرة حادة (14 G). بالنسبة لكميات الببتيد الأكبر ، قم بزيادة عدد الأقراص وفقا لذلك.
    2. قبل استخدام SDB-RPS Stage Tips، قم بإعداد النصائح عن طريق إضافة عشرة أحجام أسرة على الأقل من المخازن المؤقتة التالية بالتتابع وإما تدوير المخزن المؤقت عبر العمود عن طريق الطرد المركزي (25 درجة مئوية، 3 دقائق، 500 × جم) أو عن طريق دفع المخزن المؤقت عبر العمود عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة.
      1. بلل الأطراف ب 150 ميكرولتر من الأسيتونيتريل 100٪.
      2. اغسل النصائح ب 150 ميكرولتر من 30٪ ميثانول ، 1٪ TFA في 18.2 MΩ H2O.
      3. قم بموازنة الأطراف مع 150 ميكرولتر من 90٪ isopropanol ، 1٪ TFA متوازنة مع 18.2 MΩ H2O.
    3. قم بتحميل العينات (التي تحتوي على 50٪ من الأيزوبروبانول ، 1٪ TFA) على أطراف مرحلة SDB-RPS عن طريق الطرد المركزي (25 درجة مئوية ، 3 دقائق ، 500 × جم) أو عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة.
    4. اغسل أطراف المرحلة SDB-RPS باستخدام المخازن المؤقتة التالية عن طريق الطرد المركزي (25 درجة مئوية ، 3 دقائق ، 500 × جم) أو عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة.
      ملاحظة: يمكن استخدام غسولات إضافية أو مخازن مؤقتة بديلة لإزالة الملوثات غير الببتيد، مثل استخدام خلات الإيثيل بدلا من الأيزوبروبانول55.
      1. اغسل الأطراف ب 150 ميكرولتر من 90٪ إيزوبروبانول ، 1٪ TFA.
      2. اغسل النصائح ب 150 ميكرولتر من 1٪ TFA في 18.2 MΩ H2O.
    5. قم بالتخلص من الببتيدات من نصائح المرحلة SDB-RPS مع 150 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم بنسبة 5٪ في 80٪ من الأسيتونيتريل عن طريق الطرد المركزي أو عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة. جمع العينات في أنابيب فردية.
      ملاحظة: تحضير 5٪ هيدروكسيد الأمونيوم في 80٪ الأسيتونيتريل في حاوية بلاستيكية مباشرة قبل الاستخدام داخل غطاء الدخان.
    6. جفف الببتيدات المطفأة عن طريق الطرد المركزي بالتفريغ عند 25 درجة مئوية.
      ملاحظة: في حالة إجراء إثراء HILIC ، يمكن إزالة 1-10٪ من الببتيد في هذه المرحلة ، وتجفيفه ، واستخدامه كعناصر تحكم في إدخال البروتين الكلي.
  2. إثراء عينات غليكوببتيد
    1. قم بإعداد نصائح مرحلة الكروماتوغرافيا السائلة للتفاعل الزويتيريونيكي المحب للماء (ZIC-HILIC) كما هو موضح سابقا54,56.
      1. باختصار ، قم باستئصال قرص C 8 واحد من غشاء 47 مم2 C8 باستخدام إبرة حادة (14 G) وقم بتعبئة القرص في طرف P200 لإنشاء فريت. أضف ما يقرب من 5 مم من مادة ZIC-HILIC ، المعاد تعليقها في 50٪ من الأسيتونيتريل ، و 50٪ 18.2 MΩ H2O ، على الفريت عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة.
    2. قبل استخدام ZIC-HILIC Stage Tips، قم بتكييف الراتنج عن طريق إضافة المخازن المؤقتة التالية بالتتابع والضغط بلطف باستخدام حقنة.
      ملاحظة: لضمان سلامة طبقة الماء الزائفة على سطح راتنج ZIC-HILIC (المطلوب لإثراء الجليكوببتيدات) ، يجب أن يظل الراتنج رطبا دائما. عند غسل الراتنج ، اترك دائما ~ 10 ميكرولتر من المذيب فوق الراتنج وتأكد من أن الغسلات / العينات يتم ماصها مباشرة في هذا المذيب المتبقي.
      1. قم بموازنة الراتنج مع 20 وحدة تخزين (200 ميكرولتر) من المخزن المؤقت للإزالة ZIC-HILIC (0.1٪ TFA في 18.2 MΩ H2O).
      2. اغسل الراتنج ب 20 وحدة تخزين (200 ميكرولتر) من المخزن المؤقت لإعداد ZIC-HILIC (95٪ من الأسيتونيتريل في 18.2 MΩ H2O).
      3. اغسل الراتنج ب 20 وحدة تخزين (200 ميكرولتر) من مخزن ZIC-HILIC العازل للتحميل / الغسيل (80٪ أسيتونيتريل ، 1٪ TFA متوازن مع 18.2 MΩ H2O).
    3. أعد تعليق العينات المهضومة المجففة (من الخطوة 2.1.6) في مخزن ZIC-HILIC العازل للتحميل/الغسيل إلى تركيز نهائي قدره 4 ميكروغرام/ميكرولتر (على سبيل المثال، بالنسبة ل 200 ميكروغرام من الببتيد، أعد التعليق في 50 ميكرولتر من مخزن ZIC-HILIC المؤقت/الغسيل المؤقت). دوامة لفترة وجيزة لمدة 1 دقيقة لضمان إنعاش العينات، وتدور لأسفل لمدة 1 دقيقة عند 2000 × غرام عند 25 درجة مئوية.
    4. قم بتحميل عينة الببتيد المعاد تعليقها على عمود ZIC-HILIC مشروط.
      1. اغسل ثلاث مرات باستخدام 20 وحدة تخزين (200 ميكرولتر) من مخزن ZIC-HILIC المؤقت للتحميل / الغسيل (لإجمالي حجم الغسيل 60 سريرا) عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة.
      2. قم بإخراج جليكوببتيدات مع 20 وحدة تخزين (200 ميكرولتر) من مخزن ZIC-HILIC المؤقت في أنبوب 1.5 مل عن طريق الضغط بلطف باستخدام حقنة ثم تجفيف اللوات عن طريق الطرد المركزي الفراغي عند 25 درجة مئوية.

3. LC-MS من العينات المخصب بالبروتيوم / غليكوببتيد

  1. أعد تعليق العينات في المخزن المؤقت A* (2٪ أسيتونيتريل ، 0.1٪ TFA) إلى تركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / ميكرولتر (على سبيل المثال ، بالنسبة ل 50 ميكروغرام من الببتيد ، أعيد تعليقها في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت A *).
  2. قم بتحميل العينات على HPLC / UPLC مقترنا ب MS لتمكين فصل وتحديد الببتيدات السكرية.
    ملاحظة: ينبغي تحسين بارامترات العمود، بما في ذلك القطر الداخلي، والطول، ومعدلات التدفق، ونوع راتنج الكروماتوغرافيا، وكميات حقن الببتيد المطلوبة، من أجل استخدام الإعداد التحليلي وطول التدرج؛ للحصول على مثال على كيفية إجراء تحسين الإعدادات التحليلية ، انظر57.
  3. راقب جمع بيانات MS الناتجة لضمان جمع البيانات باستخدام المعلمات المطلوبة.
    ملاحظة: بالنسبة للتحليل التركيبي، يكفي تجزئة إدارة البحث الجنائي. بسبب إضافة الجليكان إلى الجليكوببتيدات ، عادة ما يتم ملاحظة أيونات الجليكوببتيد بكثافة شحن أعلى من m/z وكثافة شحن أقل من الببتيدات غير الغليكوزيلية. لضمان إمكانية ملاحظة هذه الأيونات، اسمح بنطاق كتلة MS1 من 400 إلى 2000 m/z.
  4. تجزئة الأيونات المختارة باستخدام CID ، مما يضمن جمع أيونات شظايا m / z منخفضة تحتوي على أيونات الأوكونيوم المهمة لتوصيف الجلايكان.
    ملاحظة: يتأثر تفتيت الجليكوببتيدات باستخدام CID بكل من تسلسل الببتيد والجليكان ، وكذلك الطاقة المطبقة أثناء التجزئة25،58،59. في حين يمكن استخدام مجموعة من طاقات التصادم المختلفة ، فإن الاستراتيجية المثلى لتفتيت الجليكوببتيدات هي استخدام طاقات التصادم المتدرجة التي تجمع بين استخدام طاقات التصادم المتعددة25،59،60.
  5. استخدم طرق تجزئة بديلة ، إن وجدت ، مثل ETD لتوطين الموقع ، أو IT-CID للمساعدة في تحديد تركيبات الجليكان.
    ملاحظة: لا يعد أي من نهجي التجزئة هذين ضروريين للتحليل التركيبي، ومع ذلك يمكن جمعهما لتمكين المزيد من الاستجواب للجليكوببتيدات ذات الأهمية.

4. تحليل العينات الغنية بالبروتينات / الجليكوببتيد

  1. التصفية المسبقة لملفات البيانات لتمكين البحث في FragPipe
    1. إذا تم الحصول على عمليات فحص ETD أو IT-CID ضمن مجموعات البيانات، فقم بتصفية أحداث الفحص هذه من ملفات البيانات باستخدام MSConvert61 قبل البحث باستخدام FragPipe.
      ملاحظة: بالنسبة لمعلمات البحث المفتوحة الموضحة أدناه، لا يلزم سوى بيانات CID من نوع الحزمة.
  2. إجراء عمليات بحث مفتوحة في FragPipe
    1. افتح FragPipe وانقر فوق علامة التبويب سير العمل . في القائمة المنسدلة سير العمل، حدد الخيار فتح البحث، وانقر فوق إضافة ملفات لاستيراد ملفات البيانات المراد البحث عنها في FragPipe (الشكل 2A).
    2. انقر فوق علامة التبويب قاعدة البيانات وقم بتشغيل مدير التنزيل بالنقر فوق تنزيل. يسمح ذلك بتنزيل قواعد بيانات البروتينات من Uniprot باستخدام معرف Uniprot Proteome. انقر فوق الخيار إضافة خداع وملوثات داخل مدير التنزيل لدمج البروتينات المخادعة والملوثة في قواعد البيانات.
    3. للحصول على عتبات FDR أكثر صرامة، انقر فوق علامة التبويب التحقق من الصحة وقم بتعديل قيمة التصفية والتقرير من 0.01 إلى FDR المطلوب.
      ملاحظة: ستضمن إعدادات FragPipe الافتراضية FDR بنسبة 1٪ على مستوى البروتين.
    4. انقر فوق علامة التبويب MSfragger. داخل مربع مطابقة الذروة، قم بزيادة التسامح مع كتلة السلائف من 500 Da الافتراضي إلى 2000 Da للسماح بتحديد التعديلات الكبيرة (الشكل 2A).
    5. انقر فوق علامة التبويب تشغيل وحدد موقع مخرجات FragPipe. انقر فوق الزر تشغيل لبدء البحث.
  3. باستخدام PSMs المحددة عبر مجموعات البيانات (الموجودة ضمن مخرجات psm.tsv من FragPipe) ، حدد الجليكان المحتمل عن طريق رسم تردد كتل دلتا المرصودة داخل مجموعات البيانات (الشكل 3). قم بإنشاء مخططات كتلة دلتا من مخرجات MSfragger باستخدام البرامج النصية R التي يمكن الوصول إليها عبر الانضمام إلى PRIDE PXD027820.
    ملاحظة: يتم إجراء الحد الأدنى من المعالجة اللاحقة لنتائج البحث المفتوحة داخل هذه البرامج النصية ، حيث أن الغرض الرئيسي من هذه البرامج النصية هو المساعدة في تصور ملفات تعريف كتلة دلتا. الأهم من ذلك ، أن مراقبة كتل دلتا الوفيرة وحدها ليست دليلا على أن التعديل هو جليكان محتمل ، لأن تعيين كتل دلتا كجليكان يتطلب مزيدا من التحليل لأحداث MS2 المقابلة.
  4. لتمكين توصيف الجليكوببتيدات داخل العينات، ركز على تحديد كتلة دلتا عالية الثقة، المقابلة للمهام ذات الدرجات الفائقة العالية.
    1. للمساعدة في تقييم أطياف الجليكوببتيد، استخدم أدوات التعليق التوضيحي للببتيد، مثل الشرح الطيفي التفاعلي للببتيد63، الذي يمكن من تعيين الأيونات المرتبطة بالببتيد داخل الأطياف، مما يسمح بالتحديد اليدوي للأيونات المرتبطة بالجليكان (الشكل 4).
      ملاحظة: ضمن مجموعات البيانات المعروضة هنا، تعتبر الدرجات الفائقة >30 درجات عالية، لأنها تتوافق مع الدرجات ضمن أعلى 50٪ من جميع الببتيدات السكرية المحددة (الشكل 5).
  5. مع تعيين جليكوببتيدات عالية الثقة ، حدد الأيونات المرتبطة بالغليكان التي تمت ملاحظتها بشكل شائع (الشكل 4) لتحسين تحديد الببتيدات السكرية.
    ملاحظة: من خلال دمج الأيونات المرتبطة بالغليكين في عمليات البحث، والمعروفة باسم عمليات البحث التي تركز على الجليكان، يمكن تحسين جودة تعيينات الجليكوببتيد.
    1. انقر فوق علامة التبويب MSfragger في FragPipe ، وقم بدمج كتل دلتا المحددة للجليكان المرصود في أقسام التعديلات المتغيرة وإزاحات الكتلة. أضف هذه الكتل عن طريق كتابة القيم في قسمي التعديلات المتغيرة وإزاحات الكتلة مع كتل فردية مفصولة ب /. أضف كتل الشظايا المرتبطة بالجليكان من هذه الجليكان إلى قسم تعديلات Glyco / Labile في MSFragger.
      ملاحظة: يوضح الشكل 2B المعلومات الأساسية المطلوبة للبحث الذي يركز على الجليكان لسلالة A. baumannii AB307-0294.
  6. قم بتحميل جميع بيانات MS المرتبطة بالدراسات البروتينية إلى مستودعات Proteomic المركزية مثل مستودعات PRIDE أو MASSIVE .
    ملاحظة: تم إيداع جميع البيانات المرتبطة بهذه الدراسة في مستودع PRIDE البروتيني ويمكن الوصول إليها عبر الانضمام إلى PRIDE : PXD027820.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوضيح فائدة البحث المفتوح عن تحليل الجليكوببتيد البكتيري ، تم تقييم التنوع الكيميائي للجليكان المرتبط ب O داخل ثلاث سلالات من A. baumannii-AB307-0294 و ACICU و D1279779-. الجليكوبروتيومات المرتبطة ب O متغيرة للغاية بين سلالات A. baumannii حيث يتم اشتقاق الجليكان المستخدم في الغليكوزيل من مواقع الكبسولة المتغيرة للغاية44,45,46. هذا التنوع الكيميائي يجعل A. baumannii نظاما نموذجيا مثاليا لدراسات البحث المفتوح. في حين أن glycoproteomes من السلالات الثلاث لم يتم تقييمها من قبل ، فإن هياكل الكبسولة لاثنين من هذه السلالات ، AB307-029464 و ACICU65 ، معروفة ، مع كبسولة D1279779 لم يتم توضيحها بعد.

واتساقا مع كبسولة AB307-0294، كشف البحث المفتوح عن AB307-0294 عن كتلتين دلتا مهيمنتين، تقابلان 648.25 دا و692.28 دا (الشكل 3 ألف). تتطابق هذه الكتل مع هياكل الكبسولة التي حددها سابقا روسو وآخرون ، -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA ، حيث تتوافق بقايا QuiNAc4NR مع 2,4-diamino-2,4,6-trideoxy-glucose ، معدلة إما ب 3-OH-butyrate أو مجموعة أسيتيل64. وبالمثل ، من المعروف أن كبسولة ACICU تتكون من وحدة K-k-رباعية السكاريد ، التي تم تحديدها سابقا باسم Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc-، المقابلة لكتلة متوقعة تبلغ 843.31 Da65. وتتفق بنية الكبسولة هذه مع كتلة دلتا الأكثر شيوعا في بيانات ACICU (الشكل 3B). وأخيرا، كشف تحليل البحث المفتوح للسلالة D1279779 عن وجود كتل دلتا متعددة تتفق مع 203.08 و794.31 و1588.62 Da (الشكل 3C). في حين أن الكتلة 203.08 تتفق مع كتلة بقايا سداسية واحدة ، فإن 794.31 و 1588.62 يتوافقان مع تعديلات غير معروفة. تجدر الإشارة إلى أن الكتلة 1588.62 هي بالضبط ضعف الكتلة 794.31 ، مما يشير إلى أن هذه الببتيدات مزينة بدايمرات وحدة K الغليكان ، كما لوحظ سابقا في Acinetobacter glycoproteomes الأخرى 30,44,46.

توفر مخططات كتلة دلتا طريقة سريعة وفعالة لتقييم تواتر التعديلات المرصودة داخل العينات. ومع ذلك ، بالنسبة للتعديلات المعقدة ، مثل الجليكان ، فإن وجود كتلة دلتا وحدها لا يوفر المعلومات اللازمة لتحديد التركيب الدقيق للجليكان. للمساعدة في تحديد تركيبات الجليكان ، يمكن استخدام بيانات MS / MS الناتجة عن PSMs المخصصة لكتل دلتا محددة. من خلال التركيز على مهام غليكوببتيد عالية الثقة (في MSFragger المقابلة ل PSMs ذات الدرجات الفائقة العالية) ، يمكن استخدام التحليل اليدوي لزيادة توصيف الجليكان المستخدم بواسطة سلالة غليكوزيل البروتين. تجدر الإشارة إلى أن تعيينات الببتيد عالية الثقة تحتوي عادة على معلومات جليكان قوية تسمح بتحديد تركيبات الجليكان على أساس أيونات Y. يمكن استخدام هذه المعلومات لتحديد الشظايا المقابلة حيث ظلت الجليكان مرتبطة بالببتيدات ، وكذلك بالأيونات المرتبطة بالأوكسونيوم B والأوكسونيوم المفيدة لتعيين الجليكان66. وقد سبق تحديد مبادئ توجيهية مفصلة بشأن كيفية تعيين تركيبات غليكان، ويوصى القراء بالرجوع إلى هارفي وآخرون 67. باستخدام أدوات مثل الشرح الطيفي التفاعلي للببتيد63 ، يمكن بسهولة تحديد الأيونات المرتبطة بالببتيد ، مما يسمح للمستخدمين بتحديد هوية الجليكان المرتبطة بالببتيدات.

باستخدام الشرح الطيفي التفاعلي للببتيد ، تم تقييم الببتيدات السكرية التي تم تحديدها عبر عينات A. baumannii الثلاث هذه ، مما كشف عن أيونات محتملة مرتبطة بالجليكان. النظر في أطياف MS / MS من AB307-0294 glycopeptide SAGDQAASDIATATDNASAK ، المزينة بالجليكان 648.25 و 692.28 Da (الشكل 4A ، B) ؛ في ظل ظروف تجزئة مماثلة ، تكون الأيونات المرتبطة بالجليكان متشابهة للغاية ، ومع ذلك فإن التحول في الكتلة بمقدار 44.02 Da. يتيح تحليل أيونات الجليكان داخل PSMs هذه تأكيد أن كتل دلتا التي لوحظت لهذه السكريات تتوافق مع السكريات الثلاثية التي تحتوي على أربعة كربوهيدرات مختلفة: dHexNAcNAc (228 Da) ، dHexNAcNBu (272 Da) ، HexNAcA (217 Da) ، و HexNAc (203 Da). تجدر الإشارة إلى أنه عند تعيين شظايا غليكان ، تكون السكريات الأحادية المتعددة عرضة لفقدان الماء عند تجزئتها باستخدام CID. يمكن ملاحظة ذلك في غليكان ACICU ، حيث يؤدي السكريات الأحادية Pse5Ac7Ac (316 Da) إلى توليد شظيتين بارزتين مرتبطتين بالجليكان: MH + 299.12 و 317.13 ، الفرق في الكتلة المقابلة لكتلة الماء (18.01 Da) (الشكل 4C).

بالإضافة إلى ذلك ، عند تحليل الجليكان البكتيري ، من الشائع ملاحظة كتل أحادية السكاريد غير متوقعة تتوافق مع السكريات التي لم يتم ملاحظتها داخل حقيقيات النوى. يمكن رؤية مثال على ذلك داخل PSMs غليكوببتيد D1279779 ، حيث يكشف تحليل كتلة دلتا الأكثر شيوعا 794.31 Da عن وجود السكريات الأحادية غير العادية dHexNAc (187 Da ، لوحظ على أنها MH + من 188.09 ، الشكل 4D) ، والتي لوحظت سابقا داخل جليكان A. baumannii O المرتبط44. في حين أن قياسات دقة الكتلة العالية والسلوك المميز للجليكان كتعديلات لابيلة ، والتي يتم فقدانها من العمود الفقري للببتيد ، يمكن أن تساعد في تحديد التركيبات الكيميائية المحتملة للجليكان ، فمن المستحسن تقليل الإفراط في تفسير بيانات مرض التصلب العصبي المتعدد. إذا كانت الكيمياء المجسمة لسكريات معينة أو معلومات الارتباط الخاصة بالجليكان غير معروفة ، فمن الأفضل استخدام المهام المؤلمة هيكليا ، بما في ذلك الإشارة إلى السكريات الأحادية حسب فئاتها المحددة. ومن الأمثلة على ذلك الإشارة إلى بقايا 203.08 دا على أنها N-acetylhexosamines (HexNAc) وتجنب تعيين أنواع الروابط. وإذا لزم الأمر، يوصى باستخدام تقنيات إضافية لتحديد الهويات الكيميائية الدقيقة لتعديل غير معروف، مثل استخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR).

في حين أن نهج البحث المفتوح تمكن من التحديد السريع للببتيدات المعدلة ، فمن المهم ملاحظة أن نهج البحث هذا يمكن أن يتجاهل الببتيدات السكرية المحتملة داخل مجموعات البيانات. ضمن عمليات البحث المفتوحة ، يمكن أن تفشل تحديد glycopeptides لعدة أسباب ، بما في ذلك عدم كفاية معلومات تجزئة الببتيد أو معاقبة الببتيد المعين بسبب وجود أيونات متعددة غير معينة داخل حدث MS2. هذا الأخير ينطبق بشكل خاص على PSMs غليكوببتيد البكتيرية ، حيث يمكن أن تحتوي هذه الأطياف على شظايا مرتبطة بالجليكان لا تعتبر افتراضيا معلمات البحث المفتوح. وبما أن السمات التي لا مثيل لها تؤثر سلبا على تسجيل PSMs، فإن تقليل الأيونات غير المتطابقة داخل أطياف MS/MS يمكن من تحديد الببتيدات السكرية التي تم استبعادها في البداية بسبب الحد الأدنى من عتبات الدرجات التي تسيطر عليها FDR. للتغلب على هذا القيد ، يمكن دمج الكتل المحددة من عمليات البحث المفتوحة (الشكل 3) والأيونات المرتبطة بالجليكان المحددة يدويا (الشكل 4) في معلمات البحث لتحسين تحديد الببتيدات السكرية. من المهم ملاحظة أنه يمكن تحديد هذه الأيونات المرتبطة بالجليكان يدويا بناء على تحديد الجليكان من جديد ، أو المعرفة المسبقة بأيونات الأوكونيوم الشائعة44,68 ، أو استخدام الأدوات التي يمكنها التقاط الأيونات المتكررة داخل الأطياف ، مثل أداة الكشف عن أيون الأمونيوم SPectral69,76.

ولإثبات ذلك، تم دمج كتل شظايا الغليكان غير النمطية التي تم تحديدها من خلال تحليل البحث المفتوح في معلمات البحث في MSFragger ، وتم إجراء بحث يركز على الجليكان (الإعدادات التي تركز على الجليكان للسلالة AB307-0294 موضحة في الشكل 2B). وتجدر الإشارة إلى أنه عندما يتم البحث عن جليكان متعددة معا، ينبغي توخي الحذر في اختيار أيون Y والكتل التشخيصية للتأكد من أنها تعكس بدقة أيونات الشظايا المرتبطة بكل كتلة دلتا. في حين أن هذا قد لا يكون ممكنا دائما لمجموعات من Y والكتل التشخيصية التي يستبعد بعضها البعض ، مثل شظايا الجليكان 648.25 و 692.28 من AB307-0294 (الشكل 4A ، B) ، لا يزال البحث الذي يركز على الجلايكان ممكنا ، على الرغم من أن هذا قد يؤثر على متانة نتائج البحث. أدت عمليات البحث التي تركز على الجلايكان إلى زيادة ملحوظة في العدد الإجمالي ل glycopeptide PSMs المحددة عبر جميع سلالات A. baumannii الثلاث ، المقابلة لزيادة بنسبة 37٪ في ACICU ، وزيادة بنسبة 117٪ في AB307-0294 ، وزيادة بنسبة 363٪ في D1279779 (الشكل 5A-C). بالنسبة لأحداث التصلب المتعدد الفردية، يؤدي إدراج معلومات خاصة بالغليان عادة إلى زيادة ضمن الدرجة الفائقة الملحوظة، على الرغم من أن هذه الزيادة تعتمد بشكل كبير على الجليكان (الشكل 5D,E). وبالتالي ، من خلال تحسين معلمات البحث باستخدام كتل الجليكان التي تم الكشف عنها من خلال البحث المفتوح وبالتالي دمج معلومات جزء الجليكان المنسقة يدويا في عمليات البحث المستهدفة ، يمكن الحصول على تحليل أكثر تفصيلا للجليكوببتيدات داخل العينات.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة على الخطوات الرئيسية في إعداد وتحليل الجليكوببتيدات البكتيرية. يعتمد التحديد الناجح للجليكوببتيدات البكتيرية على توليد عينات عالية الجودة تحتوي على جليكوببتيدات. ثم يتم تحليل العينات المحتوية على جليكوببتيد بواسطة LC-MS ، وبعد ذلك ، يتم استخدام أساليب البحث المفتوحة لتحديد الجليكوببتيدات المحتملة بناء على كتل دلتا الفريدة. باستخدام التنظيم اليدوي ، يمكن تحديد كتل دلتا هذه على أنها جليكان. أخيرا ، لتحسين تحديد الجليكوببتيدات ، يمكن دمج معلومات الجليكان في عمليات البحث في قواعد البيانات التي تركز على الجليكان. الاختصارات: LC-MS = كروماتوغرافيا سائلة مقترنة بقياس الطيف الكتلي. OD = الكثافة البصرية; SDB-RPS = سلفونات ستيرينديفينيل بنزين ذات مرحلة عكسية. ZIC-HILIC = كروماتوغرافيا سائلة للتفاعل المحب للماء Zwitterionic ؛ PSMs = التطابقات الطيفية الببتيد; CID = التفكك الناجم عن التصادم ؛ ETD = تفكك نقل الإلكترون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: نظرة عامة على كيفية تمكين البحث المفتوح وعمليات البحث التي تركز على الجليكان في FragPipe. (أ) يمكن تمكين البحث المفتوح عن طريق تحميل سير العمل المفتوح ضمن علامة التبويب سير العمل في FragPipe. لتمكين تحديد الجليكان الأكبر من 500 دا في الحجم ، قم بزيادة نافذة تحمل كتلة السلائف إلى 2000 دا. (ب) تتطلب عمليات البحث التي تركز على الجلايكان عن الجليكان غير النمطي إدخال معلومات الجليكان في علامة التبويب MSFragger لتحديد الكتل المتوقعة للتعديلات (في أقسام التعديلات المتغيرة وإزاحة الكتلة ) ، وأيونات Y المرتبطة بهذه الجليكان (في قائمة كتل Y الأيونية في Glyco / Labile القسم)، وأيونات شظايا الجليكان منخفضة الكتلة (في قائمة كتل الشظايا التشخيصية في قسم جليكو / لابيل ). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مخططات دلتا الكتلية لنتائج البحث المفتوحة للسلالات الثلاث من Acinetobacter baumannii (AB307-0294 و ACICU و D1279779). تمشيا مع تنوع مواقع الكبسولة ، تمتلك كل سلالة A. baumannii ملفا فريدا لكتلة دلتا مع تعديلات بارزة يزيد حجمها عن 140 دا ، والتي تشير إليها كتل دلتا المرصودة. (أ) داخل مخطط كتلة دلتا AB307-0294 ، تتوافق الكتلتان 648.25 و 692.28 مع التعديلات المتسقة مع -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-، حيث يتم تعديل QuiNAc4NR إما مع مجموعة 3-OH-butyrate أو acetyl64. (ب) داخل مخطط كتلة دلتا ACICU ، تتوافق الكتلتان 203.08 و 843.31 مع التعديلات المتسقة مع HexNAc و Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc ، على التوالي65. (C) داخل مخطط كتلة دلتا D1279779 ، تتوافق الكتل 203.08 و 794.31 و 1588.62 مع HexNAc و HexNAc-217-187-187 و dimer من HexNAc-217-187-187. تم تقييم كتل دلتا يدويا وتأكيدها في الشكل 4 على أنها جليكان يشار إليها ب *. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: توصيف MS/MS لكتل دلتا التي لوحظت عبر السلالات الثلاث من Acinetobacter baumannii. (أ، ب)  AB307-0294 و (C) ACICU و (D) D1279779. الأطياف المشروحة التفاعلية بمساعدة المشروح بمساعدة الببتيد من الجليكوببتيدات التمثيلية. لكل طيف ، يتم الإشارة إلى أيونات شظايا الببتيد باللونين الأزرق والأحمر ، في حين يتم الإشارة إلى الأيونات المرتبطة بالجليكان المعينة يدويا باللون الأخضر. تم شرح الجليكان باستخدام تسمية الرمز للجليكان مع سداسي NAc يشار إليه كمربع ، و Hex كدائرة ، والسكريات الأحادية غير النمطية التي يشار إليها على أنها شبه منحرف مع كتلة الجلايكان المشار إليها في شبه المنحرف. اختصار: MS / MS = قياس الطيف الكتلي الترادف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقارنة بين الببتيدات السكرية التي تم تحديدها عبر سلالات Acinetobacter baumannii باستخدام البحث المفتوح مقابل البحث الذي يركز على الجليكان. (أ-ج) مقارنة بين الدرجات الفائقة وعدد مهام PSM داخل D1279779 و ACICU و AB307-0294 باستخدام البحث المفتوح والتركيز على الجليكان. (مد إلى واو) مقارنة أحداث MS2 الفردية المعينة لنفس تسلسل الببتيد باستخدام عمليات البحث المفتوحة التي تركز على الجليكان ل D1279779 و ACICU و AB307-0294. اختصار: PSM = التطابق الطيفي بين الببتيد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أ. باوماني سلالات Uniprot Proteome IDs
AB307-0294 15 UP000006924
أسيكو 47,48 UP000008839
D1279779 49 UP000011860

الجدول 1. معرفات الإجهاد و Uniprot Proteome المستخدمة في هذه الدراسة.

اسم المخزن المؤقت تكوين المخزن المؤقت / الرقم الهيدروجيني
المخزن المؤقت A* 2٪ الأسيتونيتريل في 18.2 MΩ H2O ، 0.1٪ حمض ثلاثي فلورواسيتيك / درجة الحموضة 1.0
برنامج تلفزيوني 137 ملليمتر كلوريد الصوديوم، 2.7 ملم كيلو كلوريد، 8 ملليمتر Na 2HPO 4، و 2 ملليمتر KH2PO 4 / الرقم الهيدروجيني7.4
المخزن المؤقت للتخفيض/الألكلة 100 ملليمتر تريس 2-كاربوكسيثيل فوسفين هيدروكلوريد، 400 مللي متر 2-كلورواسيتاميد في 1 م تريس / درجة الحموضة 7.5
SDB-RPS المرحلة تلميح المخزن المؤقت 5٪ هيدروكسيد الأمونيوم في 80٪ الأسيتونيتريل / الرقم الهيدروجيني 11
SDB-RPS المرحلة تلميح الموازنة المكافئة 30٪ ميثانول ، 1٪ حمض ثلاثي فلوروأسيتيك ، في 18.2 MΩ H2O / pH 1.0
SDB-RPS المرحلة تلميح التكافؤ / الغسيل المخزن المؤقت 90٪ أيزوبروبانول ، 1٪ حمض ثلاثي فلورواسيتيك / درجة الحموضة 1.0
SDB-RPS المرحلة تلميح غسل المخزن المؤقت 1٪ حمض ثلاثي فلورواسيتيك في 18.2 MΩ H2O / الرقم الهيدروجيني 1.0
المخزن المؤقت لتحلل SDC 4٪ SDC في 100 mM Tris / الرقم الهيدروجيني 8.5
ZIC-HILIC المخزن المؤقت للتخليص 0.1٪ حمض ثلاثي فلورواسيتيك في 18.2 MΩ H2O / pH 1.0
ZIC-HILIC تحميل / غسل المخزن المؤقت 80٪ أسيتونيتريل ، 1٪ حمض ثلاثي فلورواسيتيك في 18.2 MΩ H2O / pH 1.0
عازل إعداد ZIC-HILIC 95٪ الأسيتونيتريل في 18.2 MΩ H2O / الرقم الهيدروجيني 7.0

الجدول 2: تكوين المخازن المؤقتة المستخدمة في هذه الدراسة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البحث المفتوح هو طريقة فعالة ومنهجية لتحديد التعديلات غير المعروفة. في حين أن تحديد الجليكان غير المعروف داخل عينات البروتيوم البكتيرية كان تقليديا مهمة مستهلكة للوقت ومتخصصة تقنيا ، فإن التطورات الأخيرة لأدوات مثل MSfragger 21,41 و Byonic31,38 تمكن الآن من تحديد كتل دلتا بسرعة وفعالية لمزيد من التوصيف كجليكان محتمل مرتبط بالببتيدات. يمكن للبحث المفتوح لكل من عينات البروتيوم القياسية والمخصب بالجليكوببتيد تحديد الببتيدات السكرية المحتملة (الشكل 1). إن القواسم المشتركة ووفرة الببتيدات السكرية داخل البروتيوم في العديد من الأنظمة البكتيرية تجعل الكشف المباشر عن هذه التعديلات ممكنا دون إثراء جليكوببتيد6. على الرغم من أن نهج تخصيب غليكوببتيد لا تزال عادة تتفوق على الطرق غير القائمة على التخصيب للعديد من أنظمة الجليكوزيل70 ، فمن الجدير بالذكر أنه ليس كل الجلايكان قابلة على قدم المساواة للتخصيب71,72. وينبغي النظر في هذه الحقيقة عند تحديد النهج الأنسب لتحديد أحداث الغليكوزيل باستخدام البحث المفتوح عن عينة بيولوجية معينة.

في حين أن البحث المفتوح يحدد بشكل فعال الجليكان الذي لوحظ بتردد عال داخل العينة، فإنه لا يزال غير فعال في تحديد أحداث الغليكوزيل التي نادرا ما تحدث داخل مجموعات البيانات. من الناحية العملية ، من أجل تحديد كتلة دلتا فريدة من نوعها من الجليكان ، يجب أن يكون هناك ما لا يقل عن 10 PSMs مع كتلة دلتا متطابقة داخل العينات. يسمح هذا الحد الأدنى من التردد بتمييز الجليكان المحتمل فوق تعيينات كتلة دلتا الخلفية (الشكل 3). في حين أن هذا المعيار يتم استيفاؤه عادة من خلال أنظمة الغليكوزيل العامة التي تستهدف ركائز متعددة للغليكوزيل ، فإن الأنظمة التي يستهدف فيها بروتين واحد للغليكوزيل قد تكون أقل قابلية لهذا النهج. ومع تحسن سرعة وحساسية أجهزة التصلب المتعدد، من المرجح أن يمكن ذلك بشكل متزايد من تقييم مجموعات الغليكوببتيد الأقل وفرة، مما سيعزز بدوره فعالية نهج البحث المفتوح، شريطة أن يتسنى توليد أطياف نوعية كافية للجليكوفورمات النادرة/المنخفضة الوفرة.

في حين أن مرض التصلب العصبي المتعدد يمكن من التحديد الفعال للجليكان الجديد، فمن المهم أن نلاحظ أن هذه البصيرة وحدها نادرا ما توفر توصيفا هيكليا كاملا للجليكوببتيدات / الجليكانات، مع أدوات مثل التحليل الطيفي NMR لا تزال حاسمة لتوصيف الجليكان الكامل. وكما لوحظ هنا، قدم التصلب المتعدد تأكيدا تكميليا للوحدات K التي سبق تحديدها باستخدام الرنين المغناطيسي النووي من كبسولات معزولة من A. baumannii ACICU وAB307-029464,65. ومع ذلك ، بالنسبة للجليكان الرئيسي المحدد في D1279779 ، كانت المعلومات فقط حول الفئات المفترضة من السكريات الأحادية داخل هذا الغليكان قابلة للتعيين مع MS لا تقدم أي معلومات حول أنواع الارتباط أو الكيمياء المجسمة لوحدات السكر هذه (الشكل 4). مع توفر طرق تجزئة MS الجديدة على نطاق أوسع ، مثل التفكك الضوئي فوق البنفسجي73,74 ، قد يكون من الممكن إجراء توصيف هيكلي أكثر تفصيلا للجليكوببتيدات. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند استنتاج الروابط أو معلومات الكيمياء المجسمة مع الأجهزة الحالية. وبالإضافة إلى هذه الاعتبارات، أثيرت مؤخرا أسئلة بشأن مدى ملاءمة الضوابط القائمة على جمهورية ألمانيا الاتحادية للبحث المفتوح75. وبالتالي ، في حين أن البحث المفتوح هو نهج قوي ، فإن هذه الاعتبارات تسلط الضوء على الحاجة إلى توخي الحذر في تفسير مهام الجليكان استنادا إلى معلومات البحث المفتوح وحدها.

في حين يوضح هذا العمل أن البحث المفتوح هو نهج فعال لتحديد الجليكان غير الخاضع للإشراف المستخدم في الغليكوزيل البكتيري ، فإن البحث المفتوح وحده يوفر الوصول إلى مجموعة فرعية فقط من جميع الجليكوببتيدات الموجودة داخل العينات. نظرا للطبيعة اللامعة للجليكان ، فإن PSMs غليكوببتيد عادة ما تحتوي على مجموعة متنوعة من الشظايا المرتبطة بالجليكان والتي ، إذا لم يتم حسابها ، ستؤثر سلبا على تسجيل PSMs. للتغلب على هذه المشكلة والسماح بتحديد أكثر تعمقا للجليكوببتيدات ، يمكن استخدام معلومات الجليكان التي تم الحصول عليها من خلال البحث المفتوح لاحقا لإبلاغ عمليات البحث التي تركز على الجلايكان (الشكل 2B). وبهذه الطريقة ، يمكن استخدام البحث المفتوح ، إلى جانب التحديد اليدوي للشظايا المرتبطة بالجليكان ، لتحسين نوعية وكمية الببتيدات السكرية المخصصة داخل العينات (الشكل 5). على الرغم من أن تحسين معلمات البحث عن glycopeptide يتم يدويا باستخدام الإصدارات الحالية من الأدوات ، مثل MSfragger ، فمن المحتمل أنه مع نضوج الحقل ، سيتم تنفيذ هذه الخطوات بطريقة آلية. وقد أظهرت الدراسات بالفعل مناهج حسابية لتحديد الأيونات المتكررة منخفضة الوزن الجزيئي المرتبطة ب PTMs69 المحددة ، وكذلك استراتيجيات لتحديد أيونات الأوكونيوم وتكرار كتل Y-ion المرتبطة ب glycopeptides76 غير المعروفة. وبالتالي ، من المحتمل أن يتم دمج هذه الخطوات في تكرارات جديدة لأدوات مثل FragPipe ، مما يجعل من الأسهل تحديد أحداث الجليكوزيل غير المعروفة سابقا داخل العينات البكتيرية وحقيقية النواة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يتم دعم N.E.S من خلال زمالة المستقبل لمجلس البحوث الأسترالي (FT200100270) ومنحة مشروع اكتشاف ARC (DP210100362). نشكر مرفق ملبورن لقياس الطيف الكتلي والبروتينات التابع لمعهد Bio21 للعلوم الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية على الوصول إلى أجهزة التصلب المتعدد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 G Kel-F Hub point style 3 Hamilton company hanc90514
2-Chloroacetamide Sigma Aldrich Pty Ltd C0267-100G
Acetonitrile Sigma Aldrich Pty Ltd 34851-4L
Ammonium hydroxide (28%) Sigma Aldrich Pty Ltd 338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A Pierce 23228
BCA Protein Assay Reagent B Pierce 23224
C8 Empore SPE Sigma Aldrich Pty Ltd 66882-U An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 5.33002
Isopropanol Sigma Aldrich Pty Ltd 650447-2.5L
Methanol Fisher Chemical M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) Sigma Aldrich Pty Ltd 66886-U An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate Sigma Aldrich Pty Ltd D6750-100G
ThermoMixer C Eppendorf 2232000083
trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride Sigma Aldrich Pty Ltd C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich Pty Ltd 252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture Promega V5073
Vacuum concentrator Labconco 7810040
ZIC-HILIC material Merck 1504580001 Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
  4. Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
  5. Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
  7. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
  8. Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
  9. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
  10. Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
  11. Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
  12. McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
  13. Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
  14. Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
  15. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
  16. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Reviews Microbiology. 3 (3), 225-237 (2005).
  17. Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
  18. Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
  19. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
  20. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: growing up fast. Current Opinion in Structural Biology. 68, 18-25 (2020).
  21. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  22. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
  23. Yu, A., et al. Advances in mass spectrometry-based glycoproteomics. Electrophoresis. 39 (24), 3104-3122 (2018).
  24. Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
  25. Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
  26. Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
  27. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  28. Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
  29. Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
  30. Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
  31. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
  32. Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
  33. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
  34. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  35. Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
  36. Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
  37. Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
  38. Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
  39. Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
  40. Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
  41. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  42. Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
  43. Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
  44. Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
  45. Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
  46. Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
  47. Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
  48. Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
  49. Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
  50. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  51. Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
  52. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  53. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  54. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  55. Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
  56. Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
  57. Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
  58. Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
  59. Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  60. Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
  61. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  62. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
  63. Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
  64. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
  65. Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
  66. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
  67. Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
  68. Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
  69. Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
  70. Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
  71. Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
  72. Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
  73. Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
  74. Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
  75. Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
  76. Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 177 ، الغليكوزيل ، Acinetobacter baumannii ، البحث المفتوح ، تعديلات ما بعد الترجمة ، البروتيوميات
تطبيق النهج القائمة على البحث المفتوح لتحديد الجليكوببتيدات المرتبطة <em>ب Acinetobacter baumannii</em> O
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L.,… More

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L., McDaniels, T. A., Scott, N. E. The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides. J. Vis. Exp. (177), e63242, doi:10.3791/63242 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter