Summary
该协议描述了在锥虫感染期间生成代谢物分布的3D模型的步骤，包括样品收集，代谢物提取，液相色谱 - 串联质谱数据采集概述，3D模型生成，最后是数据可视化。
Abstract
致病向性和疾病向性是指被病原菌选择性定植或破坏的组织位置，导致局部疾病症状。人类感染性锥虫寄生虫包括 克氏锥虫， 恰加斯病的病原体; 布鲁氏锥虫， 昏睡病的致病因子;和 利什曼原虫 物种，利什曼病的病原体。它们共同影响了全球2000万人。这些寄生虫表现出特定的倾向性：心脏、食道、 结肠（克氏锥虫 ）、脂肪组织、胰腺、皮肤、循环系统和中枢神经系统（ 布鲁氏原 虫）、皮肤（皮肤）利 什曼原虫 菌株、肝脏、脾脏和骨髓（内脏 利什曼原虫 菌株）。因此，空间视角对于了解锥虫病的发病机制至关重要。化学制图可生成 通过 液相色谱-质谱法生成的小分子丰度的 3D 可视化，并与微生物学和免疫学参数进行比较。该协议展示了如何应用化学制图来研究锥虫感染期间的致病过程，从系统组织采样和代谢物提取开始，然后是液相色谱串联质谱数据采集，最后生成代谢物分布的3D图。该方法可用于多种研究问题，如 克氏锥虫、布鲁氏锥虫 或 利什曼原虫 组织定植的营养需求，感染部位的免疫代谢，以及局部组织代谢紊乱与临床疾病症状的关系，从而全面了解锥虫病的发病机制。
Introduction
锥虫寄生虫由 利什曼原虫、非洲锥虫 （布鲁氏锥虫）和美洲锥虫（克氏锥虫）组成。 利什曼原虫 可引起利什曼病，包括自愈和自限性局限性局限性皮肤利什曼病、口腔、鼻子和喉咙粘膜组织受损的皮肤粘膜利什曼病，以及内脏利什曼病伴寄生虫向内脏器官，引起发热和肝脾肿大1，2。 布鲁氏锥虫 引起非洲人类锥虫病（HAT），也称为昏睡病，主要在非洲国家报告3。临床体征和症状包括肝脾肿大、发热、头痛、肌肉骨骼疼痛、淋巴结肿大以及当寄生虫局限于血液和淋巴管时血淋巴期贫血。随后是脑膜脑炎期，寄生虫局限于中枢神经系统并引起睡眠障碍，行为改变，最终致命的昏迷4。 克氏锥虫 引起恰加斯病，在美洲流行。感染个体经历初始急性期，通常无症状，伴有广泛的寄生虫向性。约10%-30%的感染者在数十年的感染后出现慢性期症状，其特征是巨食管、巨结肠和心血管并发症5，6。
代谢组学研究小分子物种（50-1，500 Da），包括来自初级或次级代谢的生物化合物和外部衍生的化合物，如药物或食物衍生分子。在宿主 - 病原体相互作用的背景下，代谢组学可以探索感染对宿主代谢物环境的影响，这对于获得病原体对宿主的影响至关重要。它还可以评估病原体对宿主营养和免疫环境的适应性7，8，9。质谱（MS）和核磁共振（NMR）光谱是用于鉴定，量化和表征代谢物的常见代谢组学工具。这种"组学"方法也可以应用于生物标志物的发现和药物开发10，11。
鉴于锥虫寄生虫的特定组织趋向性，空间代谢组学分析可以对它们引起的疾病的发病机制有深刻的了解。绘制代谢物的空间分布图显示，代谢物局部受小鼠心脏组织中慢性 克氏锥虫 感染和小鼠胃肠道急性和长期 克氏锥虫 感染的影响6，12，13。具体而言，3D化学制图显示，慢性 克氏锥虫感染小鼠的心脏组织中寄生虫持久性与代谢改变之间存在脱节。代谢在心脏的下部和顶端段受到最紊乱，与恰加斯病症状（心尖动脉瘤）的部位相匹配。在特定心脏部位受到感染干扰并与疾病严重程度相关的代谢物家族包括酰基肉碱和甘油磷软糖碱12，13，14。在胃肠道中，持续的代谢改变与恰加斯病症状的部位一致：食道和结肠。相反，在与恰加斯病症状无关的部位（例如小肠）的新陈代谢会重新正常化。局部受胃肠道感染干扰的代谢物包括酰基肉碱、甘油磷脂、犬尿氨酸、色氨酸和胆酸。此外，这些分析能够确定对恰加斯病耐受性的新代谢机制6。将这些方法应用于皮肤利什曼病的研究揭示了病变部位的显着代谢扰动，但也揭示了病变邻近的宏观健康组织中的特定代谢变化。例如，病变部位的谷氨酰胺被耗尽，而 m/z （质荷比）200-299、400-499、500-599和600-699的甘油磷软糖在病变部位显著增加。PC （O-34：1） 仅在病变邻近部位升高15。
本手稿的目的是演示生成应用于锥虫寄生虫感染模型的代谢物分布3D模型（"化学制图"）所需的步骤（图1）。这种方法建立在代谢组学和代谢组学数据处理背景下的几个关键进展之上，特别是开发'ili软件，可以轻松地将代谢组学数据绘制到3D模型上16。
Protocol
所有描述的动物实验都得到了俄克拉荷马大学或加州大学圣地亚哥分校机构动物护理和使用委员会的批准。处理传染性物质的所有步骤均在生物安全柜（II类，A2型）内进行，并符合当地法规。
1. 组织收集
- 感染适当的锥虫感染动物模型，一般为小鼠或仓鼠。
注意：锥虫感染的小鼠模型种类繁多，具体取决于要产生的所需症状，疾病进展速度，疾病严重程度等。用户可以在方便的时候进行选择。- 对于皮肤利什曼病感染模型，皮下在脚垫中或皮内在耳朵中感染15。
- 对于内脏利什曼病感染模型，静脉内感染1，17。
- 对于恰加斯病和昏睡病感染模型，腹腔内感染6，12，18，19。根据寄生虫菌株和计划的时间点确定要使用的寄生虫剂量。
- 规划剖面位置。
- 计划生成每个切片至少10毫克组织的切片。最好使用30-50毫克。
- 对于恰加斯病感染模型，计划系统地收集心脏和胃肠道段。
- 对于皮肤利什曼病感染模型，收集病变组织和病变邻近样本。
- 对于内脏利什曼病感染模型，计划收集脾脏和多个肝叶。其他组织部位（如脂肪组织）也可能感兴趣。
注意：来自受感染动物的样本必须根据适当的、机构批准的生物安全协议进行处理。这通常涉及个人防护装备（PPE）要求，并且只能打开管子并在生物安全柜内收集样本（II类，A2型）。
- 标记和称重管以进行均质化。
- 使用适合可用均质系统的管型。对于 TissueLyser，使用 2 mL 微量离心管。
- 在所需的感染时间点使用机构IACUC批准的异氟醚过量或根据IACUC批准的方案对小鼠实施安乐死。
- 按计划系统地切除组织，每管一段。
- 请记住用提取溶剂（本方案中为50%甲醇）洗涤样品收集设备。
- 保持管盖打开，立即在液氮中快速冷冻样品。
注意：在进入管子的任何液氮完全蒸发之前，不要关闭管子，以防止管子随着氮气的膨胀而爆炸。采取适当的步骤确保皮肤不会接触到液氮（使用冷冻手套和镊子固定管子）。戴上安全面罩。 - 将试管储存在干冰上，直到收集了所有所需的样品。
- 暂停点：将样品储存在-80°C，直到准备进行提取。
- 称量试管以确定组织样品重量。在电子表格中录制。
- 在称量过程中保持样品冷冻：将试管放在干冰上，快速称重，立即放回干冰上。称量时不要让样品解冻。
2. 代谢物提取
注：始终只能使用LC-MS级液体和试剂。此方法改编自 Reference20。
- 使用专用玻璃器皿，在1升玻璃瓶中制备所有提取溶剂（LC-MS级H2O，LC-MS级甲醇，加注4μM磺胺吡啶嗪，LC-MS级二氯甲烷：甲醇加注2μM磺胺吡啶肼）。
注：应根据样品重量计算制备的体积，考虑到每50毫克样品500μL水，每50毫克样品中加4μM磺胺吡啶的甲醇和1，000μL预冷的二氯甲烷：甲醇每50mg样品中掺有2μM磺胺吡啶，将计算体积增加10%，以允许移液不准确。将提取溶剂储存在4°C下至少过夜以预冷。 - 按照下面提到的步骤对组织样品进行水基均质化。
- 使用微珠分配器将一个5mm不锈钢珠子（见 材料表）加入每个含有组织样品的2 mL微量离心管中。将管子放在冰上。
- 制作一个含有LC-MS级H2O的空白管，该管将经历所有步骤并用作提取坯料。使用样品提取的平均 H2O 体积。将冷藏的LC-MS级H2 O添加到冷冻组织样品中。
- 通过使用在步骤1.7中计算的样品重量，加入500μL水/ 50mg样品，使水体积与组织重量正常化。
注意：如果处理生物危害性样品，请继续遵循适当的、机构批准的生物安全协议。这通常涉及对个人防护装备（PPE）的要求，并且仅在生物安全柜（II类，A2型）内打开管。
- 通过使用在步骤1.7中计算的样品重量，加入500μL水/ 50mg样品，使水体积与组织重量正常化。
- 使用组织均质器以25 Hz的速度匀浆样品3分钟（见 材料表）。
- 紧紧关闭试管，以避免在加工过程中溢出试剂。
- 收集约1/10的均质体积，用于DNA提取，qPCR，基于蛋白质的分析或其他分析（如果需要）。如果要在不同的日期进行DNA提取实验，则在微量离心管或96孔板（取决于收集的体积）中储存在-80°C下长达6个月。更长的存储持续时间可能是可能的，但尚未经过测试。
- 如参考文献13所述，使用任何标准的商用哺乳动物DNA提取试剂盒（见材料表）从组织中进行DNA提取。量化DNA产量并将提取的DNA储存在-20°C。 qPCR的可接受DNA数量和质量甚至在3年后就被观察到了。
注意：该步骤可以在代谢物提取的后续一天对冷冻匀浆进行。 - 按照参考文献13中所述，使用180 ng提取的DNA进行qPCR。
注意：这可以在前一天收集的DNA上进行，并在-20°C下冷冻。- 在克氏锥虫感染研究的情况下，使用以下引物：ASTCGGCTGATCGTTTTCGA和AATTCCTCCAAGCGAGGA来量化寄生虫水平21和以下引物以归一化为宿主DNA水平：TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA和CAGCAAGCATCTAGGCACTTAGACCCC22（见材料表）。
注意：推荐的qPCR循环如下：在95°C下变性10分钟;在95°C下进行40次循环30秒，然后在58°C下进行60秒，最后在72°C下进行60秒。根据需要对可用的热循环仪执行熔化曲线分析。使用ΔΔCt方法23 处理数据，以获得采样点之间的相对寄生虫负荷。绝对定量可以通过将样品衍生的ΔΔCt值与从已知数量的寄生虫生成的标准曲线进行比较来获得，这些寄生虫被刺入未感染的组织样品中，并按照步骤2.2至2.2.4.1进行提取。
- 在克氏锥虫感染研究的情况下，使用以下引物：ASTCGGCTGATCGTTTTCGA和AATTCCTCCAAGCGAGGA来量化寄生虫水平21和以下引物以归一化为宿主DNA水平：TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA和CAGCAAGCATCTAGGCACTTAGACCCC22（见材料表）。
- 使用多重细胞因子试剂盒或标准商业ELISA试剂盒（见 材料表）对免疫应答进行基于蛋白质的表征，如参考文献13 中所述，对储存的匀浆进行表征。
- 如参考文献13所述，使用任何标准的商用哺乳动物DNA提取试剂盒（见材料表）从组织中进行DNA提取。量化DNA产量并将提取的DNA储存在-20°C。 qPCR的可接受DNA数量和质量甚至在3年后就被观察到了。
- 节省至少一半的500μL均质化体积用于代谢物提取。
- 进行水性代谢物提取。
注：溶剂选择可根据目标代谢物的化学性质进行调整。- 将冰冷的LC-MS级甲醇加入4μM磺胺毒死蜱匀浆中，以达到50%甲醇的最终浓度和2μM磺胺毒死蜱在水中。
注意：甲醇易燃且危险。使用适当的安全程序，包括在通风橱或生物安全柜内处理。 - 在组织均质机中以25 Hz的速度匀浆样品3分钟。将样品在4°C下以16，000× g 离心10分钟。
- 将等体积的上清液收集到96孔板中。选择与所有样品中甲醇+水的最小体积相匹配的体积。这是水性分数。
- 在-80°C下留出任何剩余的水性匀浆上清液作为备用。
- 在收集上清液时将固体残留物保持在冰上。
- 干燥水性提取上清液直至干燥（〜3小时或过夜）。使用最大速度，无需加热。
- 将干燥的96孔板在-80°C下冷冻。
- 将冰冷的LC-MS级甲醇加入4μM磺胺毒死蜱匀浆中，以达到50%甲醇的最终浓度和2μM磺胺毒死蜱在水中。
- 进行有机代谢物提取。
注：溶剂选择可根据目标代谢物的化学性质进行调整。- 每50mg预冷的二氯甲烷样品加入1，000μL：甲醇加注2μM磺胺吡啶嗪到步骤2.3.4的固体残留物中。
注意：处理溶剂时，请使用适当的安全程序，包括在具有良好流速的通风橱内处理。 - 在组织均质机中以25 Hz的速度匀浆样品5分钟。将样品在4°C下以16，000× g 离心10分钟。
- 将等体积的上清液收集到96孔板中。选择与所有样品中最小体积的二氯甲烷：甲醇相匹配的体积。这是有机部分。
- 将沉淀储存在-80°C作为备用。将剩余的有机提取物储存在-80°C作为备用。将有机提取物在通风橱中风干过夜。
- 将干燥的96孔板在-80°C下冷冻。
- 每50mg预冷的二氯甲烷样品加入1，000μL：甲醇加注2μM磺胺吡啶嗪到步骤2.3.4的固体残留物中。
3. 液相色谱-质谱数据采集
- 将水和有机提取物重悬到60μL50%甲醇+ 2μM磺胺二甲氧嘧啶中，并混合。超声处理10分钟;然后，离心10分钟并将上清液转移到干净的96孔板中。使用无区域板密封进行密封，并将板放入LC自动进样器中。
注意：处理溶剂时，请使用适当的安全程序，包括在具有良好流速的通风橱内处理。 - 将适当的流动相连接到LC系统（见 材料表）。
注意：对于正模反相LC，作者推荐LC-MS级H2O + 0.1%甲酸作为流动相A，LC-MS级乙腈+ 0.1%甲酸作为流动相B，流速为0.5 mL / min，LC梯度为7.5 min。推荐的梯度步长如参考文献6中所述：0-1分钟，2%B;1-2.5分钟，线性增加至98%B;2.5-4.5分钟，保持在98%B;4.5-5.5 min，线性下降到2%B;5.5-7.5分钟，保持在2%B。 - 确保仪器清洁。在正负模式下校准MS。
- 根据仪器执行 MS 性能评估。
- 创建 MS 运行序列。
- 从稀释系列中的2个空白，2个标准品（6个混合物）和5个混合质控品（QC）开始，从2μL进样体积开始，逐步增加到30μL进样体积。
- 随机化示例顺序。
- 每 12 个样本后，运行一个空白，然后运行一个池化 QC。
- 连接 C8 LC 色谱柱（粒径 1.7 μm，孔径 100 Å，长度 50 x 2.1 mm x 内径）并监测泄漏和过大背压。根据仪器标准操作程序修复问题。
- 启动 MS 运行序列并收集与数据相关的 LC-MS/MS 数据。
注：对于 Q-Exactive Plus MS 仪器，在正模式下使用加热电喷雾电离和与数据相关的 MS2 采集（前 5 名），MS1 的分辨率为 70，000，MS2 的分辨率为 17，500，MS1 的 AGC 目标为 1E6，MS2 为 2E5，MS1 的最大 IT 为 100 ms，MS1 的扫描范围为 100-1500 m/z ， 和 1 m/z 的 MS2 隔离窗口。将护套气体设置为 35，辅助气体设置为 10，扫描气体设置为 0，喷雾电压设置为 3.8 kV，毛细管温度设置为 320 °C，S 透镜射频水平设置为 50，辅助气体温度设置为 350 °C。- 验证数据质量：检查初始空白（确认缺少主要峰）、标准（确认是否存在预期峰和对称峰形）和质量控制（确认是否存在预期峰、峰形和预期峰强度）。
- 在运行序列期间定期监视 MS 运行。
- 运行完成后，检查数据中是否有任何未命中的注入或其他错误。
- 按照制造商的建议存放LC列。取出样品并将其储存在-80°C。
- 将原始数据上传到数据存储库。
注：建议使用MassIVE（massive.ucsd.edu）来启用代谢物注释的分子网络下游链接24，25。
4. 液相色谱-质谱数据处理
- 使用 MSConvert26 将 Raw 文件转换为打开格式（.mzXML 或 .mzML）。
- 将原始数据和 mzXML 或 mzML 数据上传到数据存储库。
- 生成要素表。有多种工具可以做到这一点（MZmine，MS-DIAL，openMS，XCMS等27，28，29，30）。
注意：建议使用MZmine，因为它是免费的，开源的，并且可以在MSconvert后直接导入mzXML文件，具有用于处理数据和监控参数选择影响的图形用户界面选项，并且可以直接导出到GNPS进行分子网络24。
注：请遵循刀具文档并使用适合可用仪器的参数。其他详细信息也可以在参考31中找到。- 以.csv格式导出要素表。
5.3D 模型生成
- 手绘3D模型从头开始，按照下面提到的步骤进行缩放。
- 拍摄感兴趣的器官的照片。
- 在下面提到的SketchUp软件中执行以下操作（请参阅 材质表）。
- 删除软件打开时显示的默认男性图片。
- 单击" 文件>导入 "以导入感兴趣器官的图片。
- 单击" 线条" 工具，然后选择" 手绘 "选项。使用铅笔工具跟踪和绘制感兴趣器官的轮廓。确保通过一直绘制回起点来关闭线条。成功关闭线条后，绘制区域将自动显示为阴影。
- 选择" 推/拉 "工具，然后在着色区域上向上拉，将绘图从 2D 转换为 3D。
- 删除管风琴图片：选择" 橡皮擦 "按钮，然后右键单击图片并选择" 擦除"。
- 以 .dae 格式导出文件： 文件>导出> 3D 模型。
- 按照下面提到的步骤提高模型的真实性。
- 将模型导入 MeshLab 软件（请参阅 材质表）：打开 MeshLab 并选择 "文件">"导入网格"。选择在上一步中生成的 .dae 模型。将弹出 一个"预打开选项" 菜单。选择 "确定"。
- 在顶部菜单中选择线框。然后，选择：>重新划分网格、简化和重建>细分曲面：中点"的过滤器。将所有值保留为默认值，然后选择"应用"两次。目视检查模型的线框视图，以确保其已精细网格化。关闭弹出式菜单。
- 以 .stl 格式导出模型："文件>"将网格导出为"，然后在"文件类型"下拉菜单中选择"STL 文件格式（*.stl）"。点击保存。在下一个弹出菜单中选择"确定"。
- 打开 网格混合器 软件（请参见 材料表）。单击 导入 （+） 按钮。选择在上一步生成的 .stl 文件。使用 "雕刻>画笔>拖动 和 雕刻>画笔>"充气 "工具拉出需要倒圆角的模型曲面。
- 模型具有所需外观后，将其保存为 .stl 格式： 文件>导出"。根据需要命名文件，然后在保存类型下拉菜单中选择 STL 二进制格式 （*.stl）。点击 保存。如果出现弹出菜单，请单击" 继续"。
6.'伊利剧情生成
- 获取 3D 模型中与采样点对应的位置的坐标。
- 在 MeshLab 软件中打开步骤 5.1.3.5 中的 3D 模型：文件>导入网格。选择在步骤 5.1.3.5 中生成的模型。在"打开后处理"弹出窗口中单击"确定"。
- 要获取每个采样点的 x、y 和 z 坐标：选择 PickPoints 工具，然后以 3D 模型曲面上间隔有规律的间隔单击鼠标右键。选择所有所需的坐标后，单击"表单"弹出窗口中最上面的"保存"按钮。
注意：这将以 .pp 文件格式导出坐标。此文件可以在电子表格软件中打开。 - 在电子表格软件中：打开在步骤 6.1.2 中生成的 .pp 文件。使用 "数据>文本到>分隔的列"来调整数据显示。单击" 下一步"，然后选择" 空间"，然后单击" 完成"。
- 重新格式化，以便只有数值保留在电子表格单元格中，方法是选择 "主页">"查找并选择">替换"。在"查找内容"框中，输入：y="。将"替换为"框留空。单击" 全部替换"，然后单击 "确定"。对 x=" 和 z=" 以及 " /> 重复此步骤。值现在已准备好执行步骤 6.2。
- 创建 'ili 特征表。此方法改编自参考文献 16。
- 在电子表格软件中，构建要素表。行对应于每个位置，列对应于数据。
注意：第一列必须是位置名称（样本名称），后跟在步骤 6.1.2（带有列标题 x、y、z）中获得的采样点的 x、y 和 z 坐标。第五列的标题必须为"半径"。 - 将适当的元数据和代谢物特征丰度粘贴到后续电子表格列中。
- 在"半径"列中，输入要在模型上可视化的采样点的所需大小。根据经验确定半径值：输入 1 作为默认值，然后在步骤 6.3 中评估是否需要调整半径或坐标。以.csv格式保存文件（"文件>另存为"），然后在下拉菜单中选择 "CSV（逗号分隔）（*.csv） "。根据需要命名文件。点击 保存。
- 在电子表格软件中，构建要素表。行对应于每个位置，列对应于数据。
- 在'ili（16开发的软件）中打开数据。
- 打开"ili"网站（ili.embl.de）。选择" 曲面"。将创建的 3D 模型拖放到浏览器窗口中。将创建的要素表拖放到同一浏览器窗口中。
- 使用右下角的图例将所需的数据列投影到 3D 模型上。确保在步骤6.2.1中选择的斑点和半径与采样点匹配。如有必要，请调整要素表中的值，或在 MeshLab 中选择其他坐标（请参阅步骤 6.1.2）。
注意：还可以通过选择" 点">"边框不透明度 "并将滑块设置为其最大值来改进可视化效果。 - 连续选择每个数据列以评估该代谢物特征在3D模型上的分布。
注意：这种方法也可用于仅可视化感兴趣的特定代谢物特征，例如，p<0.05或感染和未感染样品之间有一定倍变化的特征，如外部统计分析工具所确定的那样。可视化功能也可以通过机器学习方法（如随机森林）在'ili之外进行选择。
- 按照下面提到的步骤执行线性/日志数据可视化。
- 使用页面右上角的映射选项卡，在比例下拉菜单中选择线性或对数。
- 如果可视化多个要素，则为所有图设置相同的比例。
注意：网站会自动选择要显示的每个数据列的最小值和最大值。 - 要手动设置缩放，请取消选择 "自动最小值/最大值 "选项，然后输入所需的缩放比例。现在，所有数据都将以相同的比例显示。
- 更改数据的色阶（灰度、蓝白红等）。
- 使用"色彩 映射" 下拉菜单中的"映射"菜单中将色阶更改为所需的配 色 方案。确保所选配色方案是色盲友好的。
- 要更改 3D 模型的颜色或背景颜色，请使用 3D 菜单下的" 颜色 "和" 背景 "选项。
- 通过取消选中 3D 菜单下的" 显示原点 "框来隐藏 3D 轴。
- 使用截图工具或快捷键 Crtl + S（适用于 Windows 或 Linux）和
+ S（在 OS X 上）截图来保存图像。
+ S（在 OS X 上）截图来保存图像。Representative Results
获得的代谢物特征的数量取决于分析的组织类型和数据处理参数。例如，该协议已被用于分析 克氏锥虫感染对克氏锥虫 感染小鼠模型中胃肠道代谢组的空间影响。 在先前的工作中，男性C3H / HeJ在腹腔内注射1，000 CL + luc T. cruzi 寄生虫32，6。动物在感染后12或89天被安乐死，并按照本方案所述对胃肠道的13个连续部分进行化学制图分析。该分析产生了包含5，502个特征的特征表，然后使用此协议中描述的步骤将其可视化为3D。这种方法能够可视化在高寄生虫负荷位点（犬尿氨酸， 图2B 与寄生虫负荷， 图2A）处高的个体动物的代谢物特征，具有跨组织区域不同分布的代谢物（谷氨酰胺， 图2C）以及小肠和大肠中具有可比水平的代谢物特征（LPE 16：0 图2D).选择犬尿氨酸进行可视化，因为它与炎症的已知关系以及先前关于犬尿氨酸衍生代谢物调节克氏锥虫 负荷能力的出版物33。基于森林的随机机器学习模型先前揭示了犬尿氨酸水平与感染状态之间的关联6。根据先前的出版物，选择谷氨酰胺进行可视化，证明 体外 谷氨酰胺可用性与 克氏锥虫 药物敏感性之间的关系34。使用逻辑回归证实了差分分布，p < 0.05。在目视检查数据后选择LPE 16：0，以发现在组织部位以可比水平发现的代谢物特征。
图 1：协议概述。 插图是用 BioRender.com 创作的。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：化学制图分析。 雄性C3H / HeJ小鼠腹腔内注射1，000个CL + luc T. cruzi 寄生虫32。在感染后12或89天对动物实施安乐死，并系统地收集和切除胃肠道（步骤1）6。如步骤2中提取代谢物并通过LC-MS / MS进行分析.3D使用SketchUp软件进行模型生成（步骤5），并像步骤6一样以3D形式绘制数据。（A）寄生虫在感染后12天在特定小鼠中的分布。（B）犬尿氨酸代谢物分布在同一只小鼠中，感染后12天。（C）感染后89天，受感染小鼠的平均谷氨酰胺分布。（D）与小肠和结肠中的A和B相同的小鼠中 ，m / z 454.292保留时间2.929分钟的水平相当，注释为2-十六烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（LPE 16：0）。样本和数据生成于6. 请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
了解锥虫感染对于指导新药开发和治疗方法至关重要。这种化学制图方法具有独特的优势，可以为代谢与锥虫病发病机制之间的关系提供可操作的见解，从而满足这种转化需求。
在代谢物提取和MS分析过程中，仅建议使用LC-MS级溶剂，以减少背景污染。通常来自石蜡膜和/或其他塑料的聚合物污染3536、37、38必须尽可能避免。特别是绝不能使用Parafilm。这些方面至关重要，因为LC-MS数据质量取决于样品制备和代谢物提取过程中使用的材料。在生成'ili图之前，应确保数据质量。此外，生成这些全面的空间代谢组学图谱需要收集所有相邻的组织样品并从所有收集的样品中提取代谢物，以避免这些图谱中的间隙。因此，应相应地考虑和计划收集程序，代谢物提取和LC-MS分析的后勤以及成本。
可以修改此协议，以多种方式满足用户需求。例如，代谢物提取过程中使用的溶剂的极性和溶解度将影响检测的代谢物39。为了最大限度地提高非靶向化学制图分析中检测到的代谢物特征的多样性，建议将多个提取步骤和溶剂组合在一起。例如，该方法利用二氯甲烷，甲醇和水作为提取溶剂，因为它们能够准确检测非极性和极性分子20，40。然而，这些溶剂并非普遍适用于每个MS实验，研究人员应根据其项目目标选择提取溶剂。同样，可以使用不同的LC-MS / MS条件，例如用正相色谱取代反相色谱。替代色谱柱也可用于反相数据收集，而不是C8色谱，尽管从经验上讲，C8色谱法对组织脂质更可靠，并且具有较低的堵塞频率。从概念上讲，这些协议也可以应用于其他质谱方法，例如气相色谱 - 质谱等。
另一种方法是质谱成像。事实上，与质谱成像方法不同，液相色谱-质谱法本身并不保留空间信息10。化学制图方法通过在项目概念化时、在样品元数据和数据处理步骤中包括采样位置来弥补这一差距。与质谱成像不同，这种化学制图方法的优势在于能够提供可信的注释（代谢组学标准倡议组织1级或2级注释置信度41），这与质谱成像不同，质谱成像的大部分应用仅依赖于准确的质量进行注释。质谱成像将实现细粒度的空间映射，有时甚至下降到单细胞水平，例如，42，43。相比之下，化学制图方法能够对代谢物分布进行大规模的跨器官映射，而无需高度专业化的全动物冷冻切片技能。化学制图为正在开发的许多空间转录组学方法提供了补充证据，例如，44，其优点是专注于"最接近表型的组学层"45。寄生虫负荷定量的替代方法包括在收集样品时测量生物发光6。还可以收集细小的片段，以便进行共聚焦或电子显微镜检查，以评估局部寄生虫负荷和组织损伤。在本方案和先前的出版物中用于细胞因子定量的水匀浆13也可用于定量基于蛋白质的组织损伤标志物。
还有多种方法可以获得适合绘制生成的LC-MS数据的3D模型。除了这里建议的方法外，还可以从各种在线供应商处购买预制的模型。确保使用条款与预期用途相匹配，特别是在发布方面。大型器官的模型可以根据扫描仪指令使用3D扫描仪从头开始生成。诸如MATLAB之类的替代方案可用于生成和可视化用于化学制图的3D模型46，但它们主要在'ili16开发之前实现。MATLAB 是一个数据分析和编程工具套件，提供跨多个领域的各种应用。然而，MATLAB既不是自由的也不是开源的，它需要熟悉MATLAB接口，特别是考虑到MATLAB不是为处理质谱数据而开发的。该方法的替代方案，即SketchUp，Meshlab和'ili，可以自由访问，用户友好，并提供与MATLAB类似的功能用于化学制图目的。
该方法在样品制备和代谢物提取方面是稳健的。在LC-MS数据采集步骤中，通常需要进行故障排除。这超出了本文的范围。读者将阅读有关LC-MS数据采集故障排除的优秀出版物，包括20，47。同样，代谢物注释的复杂性超出了该方法对3D模型生成的关注范围。有关此主题的有用参考资料包括24，25，48，49。
虽然这种方法有效地探索了疾病的发病机制，但这种方法存在局限性，其中一些在任何代谢组学实验中都很常见。其中一个限制是LC-MS特征50的低注释率，这取决于参考光谱库的可用性和质量。另一个限制是，由于RNA保存试剂（如RNAlater）与LC-MS / MS分析的不相容性，该协议不能保留mRNA。然而，蛋白质质量足以用于下游分析，因此可以取代基于mRNA的分析。
感染发病机制的化学制图方法直接反映了细菌、病毒或寄生虫感染如何在器官系统中发展并导致局部疾病。分析这些区域子样本并生成3D模型最终传达了代谢物如何在三维空间中发挥作用，揭示了分子生物学中这些以前未被识别的空间维度。例如，使用该协议将代谢物定位与 克氏锥虫 寄生虫负荷进行比较。结果阐明了病原体与宿主组织之间的关系，也证明了恰加斯病症状进展的代谢动力学6。化学制图方法也已应用于各种主题，例如人与建的环境相互作用51，52，53，人体皮肤46 和肺等器官系统的化学组成54，以及植物代谢和环境相互作用55。未来的应用可能涉及评估局部疾病耐受性和复原力，或锥虫感染以外的模型中局部代谢物水平，病原体向性和疾病向性之间的关系。这种方法还应具有广泛的适用性，以扩展当前的药代动力学方案，以评估局部组织药物水平和药物代谢与整体代谢背景，组织损伤和病原体清除之间的关系。总体而言，化学制图学允许对各种样品类型中的代谢物分布进行独特的探索，其应用包括疾病发病机制，人类健康，人与环境相互作用和微生物动力学。
Disclosures
无需报告利益冲突。
Acknowledgments
Laura-Isobel McCall博士拥有Burroughs Wellcome Fund颁发的传染病发病机制研究员奖。作者还希望感谢NIH奖项编号R21AI148886的支持，俄克拉荷马州呼吸和传染病中心（OCRID）的试点赠款，NIH奖项编号P20GM103648，以及俄克拉荷马大学的启动资金（至LIM）。内容完全是作者的责任，并不一定代表资助者的官方观点。作者还希望感谢该协议中使用的工具的开发人员。在适用的情况下，所有相关出版物均已引用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
| 3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| 96 well plate | Fisher | 3252449 | |
| AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
| ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
| CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
| chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
| cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
| cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
| dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
| dry ice | NA | NA | any brand, as available |
| extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
| flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
| freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
| fume hood | NA | NA | any brand, as available |
| high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
| ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
| ili software | ili.embl.de | NA | |
| isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
| LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
| LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
| LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
| LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
| LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
| liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
| luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
| Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
| MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
| MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
| MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
| p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
| Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
| Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
| real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
| salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
| SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
| specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
| speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
| sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
| sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
| Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
| TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
| tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
| TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
| UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
| ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
| ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
| wet ice | NA | NA | any brand, as available |
| zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |
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