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Immunology and Infection

ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण का अध्ययन करने के लिए रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63255
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1, 1,2,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, 2Laboratories of Molecular Anthropology and Microbiome Research, University of Oklahoma, Norman, 3Department of Anthropology, University of Oklahoma, Norman, 4Department of Microbiology and Plant Biology, University of Oklahoma, Norman
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण के दौरान मेटाबोलाइट वितरण के 3 डी मॉडल को उत्पन्न करने के चरणों का वर्णन करता है, जिसमें नमूना संग्रह, मेटाबोलाइट निष्कर्षण, तरल क्रोमैटोग्राफी-टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण, 3 डी मॉडल पीढ़ी का अवलोकन और अंत में, डेटा विज़ुअलाइज़ेशन शामिल है।

Abstract

रोगज़नक़ ट्रोपिज़्म और रोग ट्रोपिज़्म ऊतक स्थानों को संदर्भित करता है जो रोगजनकों द्वारा चुनिंदा रूप से उपनिवेशित या क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, जिससे स्थानीयकृत रोग के लक्षण होते हैं। मानव-संक्रामक ट्रिपैनोसोमामेटिड परजीवी में ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी शामिल हैं, जो चागस रोग के प्रेरक एजेंट हैं; ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी, नींद की बीमारी का प्रेरक एजेंट; और लीशमैनिया प्रजातियां, लीशमैनियासिस के प्रेरक एजेंट। संयुक्त रूप से, वे दुनिया भर में 20 मिलियन लोगों को प्रभावित करते हैं। ये परजीवी विशिष्ट ट्रोपिज़्म दिखाते हैं: दिल, घुटकी, टी क्रूज़ी के लिए बृहदान्त्र, वसा ऊतक, अग्न्याशय, त्वचा, संचार प्रणाली और टी ब्रूसी के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, डर्मोट्रोपिक लीशमैनिया उपभेदों के लिए त्वचा, और जिगर, प्लीहा, और विसेरोट्रोपिक लीशमैनिया उपभेदों के लिए अस्थि मज्जा। इसलिए ट्रिपैनोसोमाटिड रोग रोगजनन को समझने के लिए एक स्थानिक परिप्रेक्ष्य आवश्यक है। रासायनिक कार्टोग्राफी सूक्ष्मजीवविज्ञानी और प्रतिरक्षाविज्ञानी मापदंडों की तुलना में तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से उत्पन्न छोटे अणु बहुतायत के 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन उत्पन्न करता है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण के दौरान रोगजनक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए रासायनिक कार्टोग्राफी को कैसे लागू किया जा सकता है, जो व्यवस्थित ऊतक नमूनाकरण और मेटाबोलाइट निष्कर्षण से शुरू होता है, इसके बाद तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा अधिग्रहण होता है, और मेटाबोलाइट वितरण के 3 डी मानचित्रों की पीढ़ी के साथ समापन होता है। इस विधि का उपयोग कई शोध प्रश्नों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि टी क्रूज़ी, टी ब्रूसी, या लीशमैनिया द्वारा ऊतक उपनिवेशीकरण के लिए पोषक तत्वों की आवश्यकताएं, संक्रमण की साइटों पर इम्यूनोमेटाबोलिज्म, और स्थानीय ऊतक चयापचय गड़बड़ी और नैदानिक रोग के लक्षणों के बीच संबंध, जिससे ट्रिपैनोसोमाटिड रोग रोगजनन में व्यापक अंतर्दृष्टि होती है।

Introduction

ट्रिपैनोसोमाटिड परजीवी में लीशमैनिया प्रजातियां, अफ्रीकी ट्रिपैनोसोम (ट्रिपैनोसोमा ब्रूसी), और अमेरिकी ट्रिपैनोसोमस (ट्रिपैनोसोमा क्रूजी) शामिल हैं। लीशमैनिया प्रोटोजोआ लीशमैनियासिस का कारण बनता है, जिसमें आत्म-उपचार और आत्म-सीमित स्थानीयकृत स्थानीयकृत लीशमैनियासिस, म्यूकोक्यूटेनियस लीशमैनियासिस शामिल है जिसमें मुंह, नाक और गले के म्यूकोसल ऊतक क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, और आंतों के अंगों के लिए परजीवी ट्रोपिज्म के साथ आंत ों की लीशमैनियासिस बुखार और हेपेटोस्प्लेनोमेगाली 1,2 का कारण बनती है। टी ब्रूसी मानव अफ्रीकी ट्रिपैनोसोमियासिस (एचएटी) का कारण बनता है, जिसे नींद की बीमारी के रूप में भी जाना जाता है, मुख्य रूप से अफ्रीकी देशों में रिपोर्ट किया गया है। नैदानिक संकेतों और लक्षणों में हेपेटोस्प्लेनोमेगाली, बुखार, सिरदर्द, मस्कुलोस्केलेटल दर्द, लिम्फैडेनोपैथी, और हीमो-लसीका चरण में एनीमिया शामिल हैं जब परजीवी रक्तप्रवाह और लसीका के लिए स्थानीयकृत होते हैं। इसके बाद मेनिंगो-एन्सेफेलिटिक चरण होता है, जहां परजीवी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए स्थानीयकृत होते हैं और नींद की गड़बड़ी, व्यवहार परिवर्तन और अंततः घातक कोमास 4 का कारण बनते हैं। T. cruzi Chagas रोग का कारण बनता है, अमेरिका में स्थानिक. संक्रमित व्यक्ति एक प्रारंभिक तीव्र चरण का अनुभव करते हैं, आमतौर पर स्पर्शोन्मुख, व्यापक परजीवी ट्रोपिज़्म के साथ। लगभग 10% -30% संक्रमित व्यक्तियों को संक्रमण के दशकों के बाद पुरानी अवस्था के लक्षणों का अनुभव होता है, जो मेगाओसोफेगस, मेगाकोलन और हृदय संबंधी जटिलताओं की विशेषता है5,6।

मेटाबोलोमिक्स छोटे आणविक प्रजातियों (50-1,500 डीए) का अध्ययन करता है, जिसमें प्राथमिक या माध्यमिक चयापचय से जैविक यौगिक और बाहरी रूप से व्युत्पन्न यौगिक जैसे दवाएं या खाद्य-व्युत्पन्न अणु शामिल हैं। मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन के संदर्भ में, मेटाबोलोमिक्स मेजबान मेटाबोलाइट वातावरण पर संक्रमण के प्रभाव का पता लगा सकता है, जो मेजबान पर रोगज़नक़ के प्रभाव तक पहुंचने में महत्वपूर्ण है। यह मेजबान पोषण और प्रतिरक्षाविज्ञानी वातावरण के लिए रोगज़नक़ अनुकूलन का भी आकलन कर सकता है7,8,9। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी सामान्य मेटाबोलोमिक्स उपकरण हैं जिनका उपयोग चयापचयों की पहचान, मात्रा निर्धारित और विशेषता के लिए किया जाता है। इस "ओमिक्स" दृष्टिकोण को बायोमार्कर खोज और दवा विकास 10,11 पर भी लागू किया जा सकता है।

ट्रिपैनोसोमाटिड परजीवी के विशिष्ट ऊतक ट्रोपिज्म को देखते हुए, स्थानिक मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण उन बीमारियों के रोगजनन में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि को सक्षम कर सकते हैं जो वे पैदा करते हैं। मेटाबोलाइट्स के स्थानिक वितरण का मानचित्रण करने से पता चला कि माउस हृदय ऊतक में क्रोनिक ट्रिपैनोसोमा क्रूजी संक्रमण और माउस गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में तीव्र और दीर्घकालिक ट्रिपैनोसोमा क्रूजी संक्रमण से स्थानीय रूप से प्रभावित मेटाबोलाइट्स 6,12,13। विशेष रूप से, 3 डी रासायनिक कार्टोग्राफी ने क्रोनिक रूप से ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी-संक्रमित चूहों के दिल के ऊतकों में परजीवी दृढ़ता और चयापचय परिवर्तनों के बीच एक डिस्कनेक्ट का प्रदर्शन किया। चयापचय हृदय के निचले और एपिकल खंडों में सबसे अधिक परेशान था, जो चागस रोग के लक्षणों (कार्डियक एपिकल एन्यूरिज्म) की साइटों के साथ मेल खाता था। मेटाबोलाइट परिवारों को विशिष्ट कार्डियक साइटों पर संक्रमण से परेशान किया जाता है और रोग की गंभीरता से संबंधित है, जिसमें एसाइलकार्निटाइन और ग्लिसरोफॉस्फोकोलिन्स 12,13,14 शामिल हैं। जठरांत्र संबंधी मार्ग में, लगातार चयापचय परिवर्तन चागास रोग के लक्षणों की साइटों के साथ सहमत होते हैं: अन्नप्रणाली और बृहदान्त्र। इसके विपरीत, चयापचय को उन साइटों पर फिर से सामान्यीकृत किया जाता है जो चागस रोग के लक्षणों से जुड़े नहीं हैं, जैसे कि छोटी आंत। जठरांत्र संबंधी मार्ग में संक्रमण से स्थानीय रूप से परेशान मेटाबोलाइट्स में एसाइलकार्निटाइन, ग्लिसरोफॉस्फोकोलिन, किनुरेनिन, ट्रिप्टोफैन और चोलिक एसिड शामिल हैं। इसके अलावा, इन विश्लेषणों ने चागस रोग 6 के प्रति सहिष्णुता के एक नए चयापचय तंत्र की पहचान को सक्षम किया। त्वचीय लीशमैनियासिस के अध्ययन के लिए इन तरीकों को लागू करने से घाव की साइट पर महत्वपूर्ण चयापचय गड़बड़ी का पता चला, लेकिन घाव-आसन्न, मैक्रोस्कोपिक रूप से स्वस्थ ऊतक में विशिष्ट चयापचय परिवर्तन भी हुए। उदाहरण के लिए, घाव स्थल पर ग्लूटामाइन समाप्त हो गया था, जबकि m / z (द्रव्यमान से चार्ज अनुपात) 200-299, 400-499, 500-599, और 600-699 में ग्लिसरोफॉस्फोकोलाइन्स घाव स्थल पर काफी बढ़ गए थे। पीसी (ओ -34: 1) केवल घाव-आसन्न साइटों 15 पर बढ़ाया गया था।

इस पांडुलिपि का लक्ष्य मेटाबोलाइट वितरण ("रासायनिक कार्टोग्राफी") के 3 डी मॉडल उत्पन्न करने के लिए आवश्यक चरणों को प्रदर्शित करना है, जैसा कि ट्रिपैनोसोमाटिड परजीवी संक्रमण मॉडल (चित्रा 1) पर लागू होता है। यह दृष्टिकोण मेटाबोलोमिक्स और मेटाबोलोमिक्स डेटा प्रोसेसिंग के संदर्भ में कई महत्वपूर्ण प्रगति पर बनाता है, विशेष रूप से 3 डी मॉडल पर मेटाबोलोमिक्स डेटा को आसानी से प्लॉट करने के लिए 'आईएलआई सॉफ्टवेयर' का विकास।

Protocol

वर्णित सभी पशु प्रयोगों को ओक्लाहोमा विश्वविद्यालय या कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय सैन डिएगो संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। संक्रामक सामग्री को संभालने वाले सभी चरणों को जैव सुरक्षा कैबिनेट (कक्षा II, प्रकार A2) के अंदर और स्थानीय नियमों के अनुसार किया गया था।

1. ऊतक संग्रह

  1. उपयुक्त ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण पशु मॉडल, आमतौर पर चूहों या हैम्स्टर को संक्रमित करें।
    नोट: ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण के लिए माउस मॉडल की काफी विविधता है, जो उत्पादित होने वाले वांछित लक्षणों, रोग की प्रगति की गति, बीमारी की गंभीरता, आदि पर निर्भर करती है। उपयोगकर्ता अपनी सुविधानुसार चुन सकते हैं।
    1. त्वचीय लीशमैनियासिस संक्रमण मॉडल के लिए, फुटपैड में चमड़े के नीचे या कान में इंट्राडर्मल रूप से संक्रमित 15।
    2. आंत लीशमैनियासिस संक्रमण मॉडल के लिए, अंतःशिरा रूप से संक्रमित 1,17।
    3. चागस रोग और नींद की बीमारी संक्रमण मॉडल के लिए, इंट्रापेरिटोनियल रूप से 6,12,18,19 को संक्रमित करें। परजीवी तनाव और नियोजित समय बिंदुओं के आधार पर उपयोग करने के लिए परजीवी खुराक निर्धारित करें।
  2. अनुभाग की स्थिति की योजना बनाएँ.
    1. प्रति अनुभाग कम से कम 10 मिलीग्राम ऊतक के साथ वर्गों को उत्पन्न करने की योजना है। 30-50 मिलीग्राम का उपयोग करना सबसे अच्छा है।
    2. चागस रोग संक्रमण मॉडल के लिए, कार्डियक और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल सेगमेंट को व्यवस्थित रूप से इकट्ठा करने की योजना बनाएं।
    3. त्वचीय लीशमैनियासिस संक्रमण मॉडल के लिए, घाव ऊतक और घाव-आसन्न नमूनों को इकट्ठा करें।
    4. आंत लीशमैनियासिस संक्रमण मॉडल के लिए, प्लीहा और कई जिगर लोब एकत्र करने की योजना बनाएं। अतिरिक्त ऊतक साइटें जैसे वसा ऊतक भी एकत्र करने के लिए रुचि की हो सकती हैं।
      सावधानी: संक्रमित जानवरों के नमूनों को उचित, संस्थागत रूप से अनुमोदित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल के तहत संभाला जाना चाहिए। इसमें आम तौर पर व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) आवश्यकताओं को शामिल किया जाएगा और केवल ट्यूबों को खोलना और जैव सुरक्षा कैबिनेट (कक्षा II, प्रकार ए 2) के अंदर नमूने एकत्र करना शामिल होगा।
  3. लेबल और homogenization के लिए ट्यूबों का वजन.
    1. उपलब्ध homogenization प्रणाली के लिए उपयुक्त ट्यूब प्रकार का उपयोग करें। एक TissueLyser के लिए, 2 mL microcentrifuge ट्यूबों का उपयोग करें।
    2. वांछित संक्रमण टाइमपॉइंट्स पर चूहों को आइसोफ्लुरेन ओवरडोज का उपयोग करके Euthanize के रूप में संस्थागत IACUC द्वारा अनुमोदित या IACUC-अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार।
    3. अनुभाग ऊतक व्यवस्थित रूप से योजना के रूप में, प्रति ट्यूब एक अनुभाग के साथ।
    4. निष्कर्षण विलायक (इस प्रोटोकॉल में 50% मेथनॉल) के साथ नमूनों के बीच नमूना संग्रह उपकरण धोने के लिए याद रखें।
  4. ट्यूब ढक्कन खुला रखते हुए, तुरंत तरल नाइट्रोजन में फ्रीज नमूनों को स्नैप करें।
    चेतावनी: ट्यूबों को तब तक बंद न करें जब तक कि ट्यूब में प्रवेश करने वाला कोई भी तरल नाइट्रोजन पूरी तरह से वाष्पित न हो जाए ताकि नाइट्रोजन का विस्तार होने के साथ ट्यूबों को विस्फोट से रोका जा सके। यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त कदम उठाएं कि त्वचा तरल नाइट्रोजन के संपर्क में नहीं आती है (ट्यूबों को पकड़ने के लिए क्रायो दस्ताने और संदंश का उपयोग करें)। एक सुरक्षा चेहरा ढाल पहनें।
  5. सूखी बर्फ पर ट्यूबों को स्टोर करें जब तक कि सभी वांछित नमूने एकत्र नहीं किए जाते हैं।
  6. पॉज पॉइंट: निष्कर्षण करने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
  7. ऊतक नमूना वजन निर्धारित करने के लिए ट्यूबों का वजन करें। किसी स्प्रेडशीट में रिकॉर्ड करें.
    1. वजन प्रक्रिया के दौरान नमूनों को जमे हुए रखें: सूखी बर्फ पर ट्यूब रखें, तेजी से वजन करें, तुरंत सूखी बर्फ पर वापस रखें। वजन करते समय नमूनों को पिघलने की अनुमति न दें।

2. मेटाबोलाइट निष्कर्षण

नोट: केवल एलसी-एमएस ग्रेड तरल पदार्थ और अभिकर्मकों का उपयोग पूरे समय किया जाना चाहिए। इस विधि को Reference20 से अनुकूलित किया गया था।

  1. सभी निष्कर्षण सॉल्वैंट्स (एलसी-एमएस ग्रेड H2O, एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल, sulfachlorpyridazine, एलसी-एमएस ग्रेड डाइक्लोरोमेथेन के 4 μM के साथ spiked: मेथनॉल 2 μM sulfachlorpyridazine के साथ spiked) तैयार करें, समर्पित ग्लासवेयर का उपयोग करके 1 एल ग्लास की बोतलों में।
    नोट: तैयार की जाने वाली मात्रा की गणना नमूना वजन के आधार पर की जानी चाहिए, प्रति 50 मिलीग्राम नमूने में 500 μL पानी पर विचार करते हुए, मेथनॉल के 500 μL को 4 μM sulfachlorpyridazine प्रति 50 mg नमूना और 1,000 μL प्रीचिल्ड डाइक्लोरोमेथेन के साथ स्पाइक किया जाना चाहिए: मेथनॉल को सल्फाक्लोरपाइरिडाज़िन के 2 μM प्रति 50 मिलीग्राम नमूने के साथ स्पाइक किया जाना चाहिए, जिससे गणना की गई मात्रा में 10% की वृद्धि होती है ताकि पिपेटिंग के लिए अनुमति दी जा सके। स्टोर निष्कर्षण विलायक पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम रात भर पूर्व ठंडा करने के लिए.
  2. नीचे उल्लिखित चरणों के अनुसार ऊतक के नमूनों का जल-आधारित समरूपता करें।
    1. एक मनका डिस्पेंसर का उपयोग करके ऊतक के नमूनों वाले 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए एक 5 मिमी स्टेनलेस स्टील मनका ( सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें।
    2. एलसी-एमएस ग्रेड एच 2 ओ युक्त एक खाली ट्यूब बनाएं जो सभी चरणों के माध्यम से जाएगा और निष्कर्षण रिक्त के रूप में काम करेगा। नमूना निष्कर्षण से औसत H2O वॉल्यूम का उपयोग करें। जमे हुए ऊतक के नमूनों के लिए ठंडा एलसी-एमएस ग्रेड H2O जोड़ें।
      1. चरण 1.7 पर गणना किए गए नमूना वजन का उपयोग करके 500 μL पानी / 50 मिलीग्राम नमूना जोड़कर ऊतक वजन के लिए पानी की मात्रा को सामान्य करें।
        सावधानी: यदि biohazardous नमूनों को संभालने, उचित, संस्थागत रूप से अनुमोदित जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए जारी रखें। इसमें आम तौर पर व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) और केवल जैव सुरक्षा कैबिनेट (कक्षा II, प्रकार ए 2) के अंदर ट्यूब खोलने के लिए आवश्यकताएं शामिल होंगी।
    3. एक ऊतक homogenizer का उपयोग कर 3 मिनट के लिए 25 हर्ट्ज की गति पर homogenize नमूने ( सामग्री की तालिका देखें).
      1. प्रसंस्करण के दौरान अभिकर्मकों को फैलाने से बचने के लिए ट्यूबों को कसकर बंद करें।
    4. डीएनए निष्कर्षण, qPCR, प्रोटीन-आधारित विश्लेषण, या अन्य विश्लेषण (यदि वांछित हो) के लिए समरूपता मात्रा का लगभग 1/10 वां हिस्सा एकत्र करें। एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब या 96-वेल प्लेट (एकत्र की गई मात्रा के आधार पर) में -80 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक स्टोर करें, यदि डीएनए निष्कर्षण प्रयोगों को एक अलग दिन पर किया जाना है। लंबे समय तक संग्रहण अवधि संभव हो सकती है लेकिन परीक्षण नहीं किया गया है।
      1. स्तनधारी डीएनए निष्कर्षण के लिए किसी भी मानक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके डीएनए निष्कर्षण करें (देखें सामग्री की तालिका) ऊतकों से जैसा कि संदर्भ 13 में वर्णित है। डीएनए उपज को मापें और निकाले गए डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। क्यूपीसीआर के लिए स्वीकार्य डीएनए मात्रा और गुणवत्ता को 3 साल बाद तक भी देखा गया है।
        नोट: यह चरण मेटाबोलाइट निष्कर्षण से बाद के दिन जमे हुए होमोजेनेट पर किया जा सकता है।
      2. QPCR के रूप में संदर्भ 13 में वर्णित, निकाले गए डीएनए के 180 ng का उपयोग कर प्रदर्शन करें।
        नोट: यह पिछले दिन एकत्र किए गए डीएनए पर किया जा सकता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए है।
        1. T. cruzi संक्रमण पर अध्ययन के मामले में, निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग करें: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA और AATTCCTCCAAGCAGCGGATA परजीवी स्तर 21 और निम्नलिखित प्राइमरों को डीएनए स्तरों की मेजबानी करने के लिए सामान्य करने के लिए निर्धारित करने के लिए: TCCCTCTCATCAGTTATGGCCCA और CAGCACACATCTATGCACTTAGACCCC22 (सामग्री की तालिका देखें)।
          नोट:: अनुशंसित qPCR चक्र निम्नानुसार हैं: 10 मिनट के लिए 95 °C पर denature; 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर 40 चक्र ों का प्रदर्शन करें, और फिर 60 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, और अंत में 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। उपलब्ध thermocycler के लिए उपयुक्त के रूप में पिघलने वक्र विश्लेषण निष्पादित करें। नमूना साइटों के बीच सापेक्ष परजीवी भार प्राप्त करने के लिए ΠCt method23 का उपयोग करके डेटा संसाधित करें। निरपेक्ष परिमाणीकरण को नमूना-व्युत्पन्न मानों की तुलना परजीवी की ज्ञात मात्रा से उत्पन्न एक मानक वक्र से करके प्राप्त किया जा सकता है, जो असंक्रमित ऊतक नमूनों में स्पाइक किया जाता है, और चरण 2.2 से 2.2.4.1 के रूप में निकाला जाता है।
      3. मल्टीप्लेक्स्ड साइटोकाइन किट या मानक वाणिज्यिक एलिसा किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के प्रोटीन-आधारित लक्षण वर्णन करें, जैसा कि संग्रहीत होमोजेनेट पर संदर्भ 13 में वर्णित है।
    5. मेटाबोलाइट निष्कर्षण के लिए homogenization मात्रा के 500 μL के कम से कम आधे को बचाने के लिए।
  3. जलीय मेटाबोलाइट निष्कर्षण प्रदर्शन करें।
    नोट: विलायक चयन ब्याज के चयापचयों के रासायनिक गुणों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है।
    1. पानी में sulfachlorpyridazine के 2 μM के साथ 50% मेथनॉल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए होमोजेनेट में सल्फाक्लोरपाइरिडाज़िन के 4 μM के साथ बर्फ-ठंडा एलसी-एमएस ग्रेड मेथनॉल स्पाइक्ड जोड़ें।
      सावधानी: मेथनॉल ज्वलनशील और खतरनाक है। उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें, जिसमें एक धुएं के हुड या जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर हैंडलिंग शामिल है।
    2. 3 मिनट के लिए 25 हर्ट्ज की गति पर एक ऊतक homogenizer में homogenize नमूने. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज नमूने।
    3. एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में supernatant की एक समान मात्रा ले लीजिए. मेथनॉल की सबसे छोटी मात्रा से मेल खाने के लिए मात्रा का चयन करें + सभी नमूनों में संयुक्त पानी। यह जलीय अंश है।
      1. एक बैकअप के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर किसी भी शेष जलीय होमोजेनेट supernatant को अलग रखें।
    4. supernatants इकट्ठा करते समय बर्फ पर ठोस अवशेष रखें।
    5. सूखी जलीय निष्कर्षण supernatant जब तक सूखी (~ 3 ज या रात भर). अधिकतम गति का उपयोग करें और कोई हीटिंग नहीं।
    6. -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखे 96-अच्छी तरह से प्लेट को फ्रीज करें।
  4. कार्बनिक मेटाबोलाइट निष्कर्षण प्रदर्शन करें।
    नोट: विलायक चयन ब्याज के चयापचयों के रासायनिक गुणों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है।
    1. Prechilled dichloromethane के नमूने के प्रति 50 मिलीग्राम प्रति 1,000 μL जोड़ें: मेथनॉल कदम 2.3.4 से ठोस अवशेषों के लिए sulfachlorpyridazine के 2 μM के साथ spiked।
      सावधानी: सॉल्वैंट्स को संभालते समय उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें, जिसमें एक अच्छी प्रवाह दर के साथ धुएं के हुड के अंदर हैंडलिंग शामिल है।
    2. 5 मिनट के लिए 25 हर्ट्ज की गति पर एक ऊतक homogenizer में homogenize नमूने. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 x g पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में supernatant की एक समान मात्रा ले लीजिए. डाइक्लोरोमेथेन की सबसे छोटी मात्रा से मेल खाने के लिए वॉल्यूम का चयन करें: मेथनॉल, सभी नमूनों में। यह कार्बनिक अंश है।
    4. एक बैकअप के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर गोली स्टोर करें। एक बैकअप के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष कार्बनिक निकालने को संग्रहीत करें। हवा एक धुएं हुड में कार्बनिक निकालने रात भर सूखी.
    5. -80 डिग्री सेल्सियस पर सूखे 96-अच्छी तरह से प्लेट को फ्रीज करें।

3. एलसी-एमएस डेटा अधिग्रहण

  1. 50% मेथनॉल + 2 μM sulfadimethoxine के 60 μL में जलीय और कार्बनिक अर्क को फिर से निलंबित करें, और गठबंधन करें। 10 मिनट के लिए Sonicate; फिर, 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज और supernatant को एक साफ 96-wellplate में स्थानांतरित करें। ज़ोन-मुक्त प्लेट सील के साथ सील करें और प्लेट को एलसी ऑटोसैम्पलर में रखें।
    सावधानी: सॉल्वैंट्स को संभालते समय उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें, जिसमें एक अच्छी प्रवाह दर के साथ धुएं के हुड के अंदर हैंडलिंग शामिल है।
  2. एलसी सिस्टम के लिए उपयुक्त मोबाइल चरणों को कनेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: सकारात्मक मोड उलट-चरण एलसी के लिए, लेखकों ने एलसी-एमएस-ग्रेड एच 2 ओ + 0.1% फॉर्मिक एसिड को मोबाइल चरण ए और एलसी-एमएस-ग्रेड एसिटोनिट्राइल + 0.1% फॉर्मिक एसिड के रूप में मोबाइल चरण बी के रूप में 0.5 एमएल / मिनट की प्रवाह दर और 7.5 मिनट एलसी ग्रेडिएंट के साथ सलाह दी है। अनुशंसित ग्रेडिएंट चरण संदर्भ 6 में प्रकाशित के रूप में हैं: 0-1 मिनट, 2% बी; 1-2.5 मिनट, 98% बी के लिए रैखिक वृद्धि; 2.5-4.5 मिनट, 98% बी पर पकड़ो; 4.5-5.5 मिनट, रैखिक कमी 2% बी करने के लिए; 5.5-7.5 मिनट, 2% बी पर पकड़ो।
  3. सुनिश्चित करें कि उपकरण साफ है। सकारात्मक और नकारात्मक दोनों मोड में एमएस कैलिब्रेट करें।
  4. साधन के लिए उपयुक्त के रूप में एमएस प्रदर्शन मूल्यांकन निष्पादित करें।
  5. MS रन अनुक्रम बनाएँ।
    1. 2 रिक्त स्थान, 2 मानकों (6-mixes), और 5 pooled गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के साथ एक कमजोर पड़ने श्रृंखला में शुरू करें, इंजेक्शन की मात्रा के 2 μL पर शुरू होता है और 30 μL इंजेक्शन मात्रा के लिए stepwise बढ़ रहा है।
    2. नमूना क्रम यादृच्छिक करें.
    3. प्रत्येक 12 नमूनों के बाद, एक रिक्त चलाएँ, और उसके बाद एक pooled QC।
  6. कनेक्ट C8 एलसी स्तंभ (1.7 μm कण आकार, 100 Å ताकना आकार, 50 x 2.1 मिमी लंबाई x आंतरिक व्यास) और रिसाव और अत्यधिक backpressure के लिए निगरानी. इंस्ट्रूमेंट मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया के अनुसार समस्याओं को ठीक करें।
  7. MS रन अनुक्रम प्रारंभ करें और डेटा-निर्भर LC-MS/MS डेटा एकत्रित करें.
    नोट: एक Q-Exactive प्लस एमएस साधन के लिए, गर्म Electrospray Ionization और डेटा-निर्भर MS2 अधिग्रहण (शीर्ष 5) सकारात्मक मोड में, MS1 के लिए 70,000 और MS2 के लिए 17,500 का एक संकल्प, MS1 के लिए 1E6 का AGC लक्ष्य और MS2 के लिए 2E5, MS1 और MS2 दोनों के लिए 100 ms की अधिकतम IT, MS1 के लिए 100-1500 m/z के लिए स्कैन रेंज, MS1 के लिए 100-1500 m/z तक स्कैन करें, और 1 m/z की MS2 अलगाव खिड़की। म्यान गैस को 35 पर सेट करें, 10 के लिए ऑक्स गैस और 0 पर गैस को स्वीप करें, 3.8 केवी तक वोल्टेज स्प्रे करें, 320 डिग्री सेल्सियस तक केशिका तापमान, 50 तक एस-लेंस आरएफ स्तर, और 350 डिग्री सेल्सियस तक ऑक्स गैस का तापमान।
    1. डेटा की गुणवत्ता को सत्यापित करें: प्रारंभिक रिक्त स्थान की जाँच करें (प्रमुख चोटियों की कमी की पुष्टि करें), मानक (अपेक्षित चोटियों और सममित शिखर आकार की उपस्थिति की पुष्टि करें), और QCs (अपेक्षित चोटियों, चोटी के आकार और अपेक्षित शिखर तीव्रता की उपस्थिति की पुष्टि करें)।
    2. समय-समय पर मॉनिटर एमएस रन अनुक्रम के दौरान चलाएँ।
  8. एक बार जब रन समाप्त हो जाता है, तो किसी भी छूटे हुए इंजेक्शन या अन्य त्रुटियों के लिए डेटा की जांच करें।
  9. निर्माता द्वारा अनुशंसित के रूप में LC स्तंभ संग्रहीत करें। निकालें और -80 °C पर नमूने संग्रहीत करें।
  10. डेटा रिपॉजिटरी में कच्चा डेटा अपलोड करें.
    नोट: Massive (massive.ucsd.edu) मेटाबोलाइट एनोटेशन 24,25 के लिए आणविक नेटवर्किंग के लिए डाउनस्ट्रीम लिंक को सक्षम करने के लिए अनुशंसित है।

4. एलसी-एमएस डेटा प्रसंस्करण

  1. MSConvert26 का उपयोग कर खुले स्वरूप (.mzXML या .mzML) के लिए कच्ची फ़ाइलों को कनवर्ट करें।
    1. डेटा रिपॉजिटरी में कच्चा डेटा और mzXML या mzML डेटा अपलोड करें.
  2. सुविधा तालिका जनरेट करें. ऐसा करने के लिए कई उपकरण हैं (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS, आदि 27,28,29,30)।
    नोट:: MZmine की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह मुफ़्त, खुला स्रोत है, और सीधे MSconvert के बाद mzXML फ़ाइलों को आयात कर सकते हैं, डेटा को संसाधित करने और पैरामीटर चयन के प्रभाव की निगरानी के लिए ग्राफ़िकल उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस विकल्प है, और सीधे आणविक नेटवर्किंग 24 के लिए GNPS को निर्यात कर सकते हैं।
    नोट:: उपकरण दस्तावेज़ का पालन करें और उपलब्ध साधन के लिए उपयुक्त पैरामीटर का उपयोग करें। अतिरिक्त विवरण संदर्भ 31 में भी पाया जा सकता है।
    1. सुविधा तालिका .csv स्वरूप में निर्यात करें.

5.3D मॉडल पीढ़ी

  1. नीचे उल्लिखित चरणों के अनुसार स्केल करने के लिए हाथ से ड्रा 3 डी मॉडल डे नोवो।
    1. ब्याज के अंग की एक तस्वीर ले लो।
    2. स्केचअप सॉफ़्टवेयर में निम्नलिखित निष्पादित करें ( सामग्री की तालिका देखें) जैसा कि नीचे उल्लेख किया गया है।
      1. सॉफ़्टवेयर खुलने पर प्रकट होने वाले किसी व्यक्ति का डिफ़ॉल्ट चित्र हटाएँ.
      2. ब्याज के अंगों की एक तस्वीर आयात करने के लिए फ़ाइल > आयात पर क्लिक करें।
      3. लाइन्स टूल पर क्लिक करें और फ्रीहैंड विकल्प का चयन करें। ब्याज के अंगों की रूपरेखा का पता लगाने और आकर्षित करने के लिए पेंसिल उपकरण का उपयोग करें। प्रारंभिक बिंदु पर वापस सभी तरह से ड्राइंग करके रेखा को बंद करना सुनिश्चित करें। एक बार जब रेखा सफलतापूर्वक बंद हो जाती है, तो खींचा गया क्षेत्र स्वचालित रूप से छायांकित दिखाई देगा।
      4. पुश / पुल टूल का चयन करें और ड्राइंग को 2 डी से 3 डी में बदलने के लिए छायांकित क्षेत्र पर खींचें।
      5. अंग चित्र हटाएँ: इरेज़र बटन का चयन करें, और फिर चित्र पर राइट-क्लिक करें और मिटाएँ का चयन करें।
      6. फ़ाइल को .dae स्वरूप में निर्यात करें: फ़ाइल > निर्यात > 3D मॉडल.
    3. नीचे उल्लिखित चरणों के अनुसार मॉडल के यथार्थवाद में सुधार करें।
      1. MeshLab सॉफ़्टवेयर में मॉडल आयात करें ( सामग्री की तालिका देखें): MeshLab खोलें और मेष आयात > फ़ाइल का चयन करें। पिछले चरण में जनरेट किए गए .dae मॉडल का चयन करें. एक पूर्व-ओपन विकल्प मेनू पॉप अप होगा। ठीक का चयन करें।
      2. शीर्ष मेनू पर वायरफ्रेम का चयन करें। उसके बाद, का चयन करें: Remeshing, सरलीकरण और पुनर्निर्माण > उपखंड सतहों > फ़िल्टर: मध्य बिंदु। सभी मानों को डिफ़ॉल्ट के रूप में छोड़ दें और दो बार लागू करें का चयन करें। नेत्रहीन मॉडल के वायरफ्रेम दृश्य का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह बारीक ग्रिड किया गया है। पॉप-अप मेनू बंद करें.
      3. मॉडल को .stl स्वरूप में निर्यात करें: फ़ाइल > Mesh इस रूप में निर्यात करें, और तब प्रकार ड्रॉपडाउन मेनू में STL फ़ाइल स्वरूप (*.stl) का चयन करें. Save पर क्लिक करें। अगले पॉप-अप मेनू में ठीक का चयन करें।
      4. Meshmixer सॉफ़्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिका देखें). आयात (+) बटन पर क्लिक करें। पिछले चरण में जनरेट की गई .stl फ़ाइल का चयन करें. Sculpt > ब्रश > खींचें और मूर्तिकला > ब्रश > Inflate उपकरण ों का उपयोग करने के लिए मॉडल की सतहों है कि बाहर गोल करने की जरूरत है बाहर खींचने के लिए.
      5. एक बार जब मॉडल में वांछित उपस्थिति होती है, तो इसे .stl प्रारूप में सहेजें: फ़ाइल > निर्यात करें। फ़ाइल को इच्छित के रूप में नाम दें और इस प्रकार में सहेजें ड्रॉपडाउन मेनू में STL बाइनरी स्वरूप (*.stl) का चयन करें. Save पर क्लिक करें। यदि कोई पॉप-अप मेनू दिखाई देता है, तो जारी रखें पर क्लिक करें।

6. 'ili भूखंड पीढ़ी

  1. नमूना साइटों के अनुरूप 3D मॉडल में पदों के लिए निर्देशांक प्राप्त करें।
    1. MeshLab सॉफ़्टवेयर में चरण 5.1.3.5 से 3D मॉडल खोलें: फ़ाइल > आयात मेष. चरण 5.1.3.5 में जनरेट किए गए मॉडल का चयन करें। पोस्ट-ओपन प्रोसेसिंग पॉप-अप विंडो में ठीक पर क्लिक करें।
    2. प्रत्येक नमूना स्थान के लिए x, y, और z निर्देशांक प्राप्त करने के लिए: PickPoints उपकरण का चयन करें, और फिर 3D मॉडल सतह पर नियमित रूप से अंतराल पर राइट-क्लिक करें. एक बार जब सभी वांछित निर्देशांक का चयन कर लिया जाता है, तो फ़ॉर्म पॉप-अप विंडो में शीर्ष-सबसे सहेजें बटन पर क्लिक करें।
      नोट:: यह निर्देशांक .pp फ़ाइल स्वरूप में निर्यात करेगा। इस फ़ाइल को स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में खोला जा सकता है.
    3. स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में: चरण 6.1.2 में जनरेट की गई .pp फ़ाइल खोलें. डेटा > पाठ का उपयोग करके डेटा प्रदर्शन को स्तंभों में समायोजित करें > सीमांकित किया गया है. Next पर क्लिक करें, और फिर स्पेस का चयन करें, और समाप्त पर क्लिक करें।
    4. Reformat ताकि केवल संख्यात्मक मान स्प्रेडशीट कक्षों में होम > ढूँढें और चुनें > बदलें का चयन करके बने रहें. क्या ढूँढें बॉक्स में, दर्ज करें: y=". इससे बदलें बॉक्स को खाली छोड़ दें. सभी को बदलें पर क्लिक करें, और फिर ठीक पर। x =" और z=" के लिए और " /> के लिए दोहराएँ. मान अब चरण 6.2 के लिए तैयार हैं।
  2. 'ili सुविधा तालिका बनाएँ. इस विधि को Reference16 से अनुकूलित किया गया था।
    1. एक स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में, सुविधा तालिका बनाएँ. पंक्तियाँ प्रत्येक स्थिति और स्तंभों से डेटा के अनुरूप होती हैं.
      नोट:: पहले स्तंभ स्थिति नाम (नमूना नाम) होना चाहिए, इसके बाद x, y, और z निर्देशांक चरण 6.1.2 (स्तंभ शीर्ष लेख x, y, z के साथ) पर प्राप्त नमूना धब्बों के द्वारा। पांचवें स्तंभ का शीर्षक "त्रिज्या" होना चाहिए।
    2. बाद के स्प्रेडशीट स्तंभों में उपयुक्त मेटाडेटा और मेटाबोलाइट सुविधा बहुतायत चिपकाएँ.
    3. कॉलम "त्रिज्या" में, मॉडल पर विज़ुअलाइज़ किए जाने वाले नमूना धब्बों का वांछित आकार दर्ज करें। त्रिज्या के लिए मानों को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करें: डिफ़ॉल्ट रूप से 1 दर्ज करें, और फिर मूल्यांकन करें कि क्या त्रिज्या या निर्देशांक को चरण 6.3 में समायोजित करने की आवश्यकता है। फ़ाइल को .csv स्वरूप में सहेजें (फ़ाइल > इस रूप में सहेजें), और तब ड्रॉपडाउन मेनू में CSV (अल्पविराम सीमांकित) (*.csv) का चयन करें. फ़ाइल को इच्छित के रूप में नाम दें. Save पर क्लिक करें।
  3. 'ili( 16 द्वारा विकसित सॉफ्टवेयर) में डेटा खोलें।
    1. 'ili वेबसाइट खोलें (ili.embl.de). Surface चुनें। खींचें और ब्राउज़र विंडो में बनाए गए 3 डी मॉडल ड्रॉप। उसी ब्राउज़र विंडो में बनाई गई सुविधा तालिका को खींचें और छोड़ें.
    2. 3D मॉडल पर इच्छित डेटा स्तंभ प्रोजेक्ट करने के लिए नीचे-दाएँ कोने पर लेजेंड का उपयोग करें. सुनिश्चित करें कि चरण 6.2.1 में चयनित स्पॉट और त्रिज्या नमूना साइटों से मेल खाते हैं। यदि आवश्यक हो, तो सुविधा तालिका में मान समायोजित करें, या MeshLab में अतिरिक्त निर्देशांक चुनें (चरण 6.1.2 देखें)।
      नोट:: विज़ुअलाइज़ेशन भी बॉर्डर अस्पष्टता > स्पॉट का चयन करके और स्लाइडर को इसके अधिकतम मान पर सेट करके बेहतर बनाया जा सकता है।
    3. 3 डी मॉडल पर इस मेटाबोलाइट सुविधा के वितरण का आकलन करने के लिए लगातार प्रत्येक डेटा कॉलम का चयन करें।
      नोट: इस दृष्टिकोण का उपयोग ब्याज की केवल विशिष्ट मेटाबोलाइट विशेषताओं की कल्पना करने के लिए भी किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, पी < 0.05 या संक्रमित और असंक्रमित नमूनों के बीच एक निश्चित गुना परिवर्तन वाले लोग, जैसा कि बाहरी सांख्यिकीय विश्लेषण उपकरणों में निर्धारित किया गया है। विज़ुअलाइज़ करने के लिए सुविधाओं को एक यादृच्छिक वन जैसे मशीन लर्निंग दृष्टिकोण के माध्यम से 'आईएलआई' के बाहर भी चुना जा सकता है।
  4. नीचे दिए गए चरणों के अनुसार रैखिक/लॉग डेटा विज़ुअलाइज़ेशन निष्पादित करें.
    1. पृष्ठ के शीर्ष दाईं ओर मैपिंग टैब का उपयोग करते हुए, स्केल ड्रॉप-डाउन मेनू में रैखिक या लॉगरिदमिक का चयन करें।
    2. एकाधिक सुविधाओं visualizing, तो सभी भूखंडों के लिए एक ही पैमाने पर सेट करें।
      नोट:: वेबसाइट स्वचालित रूप से प्रदर्शित करने के लिए प्रत्येक डेटा स्तंभ के लिए न्यूनतम और अधिकतम चुनता है।
    3. स्केल को मैन्युअल रूप से सेट करने के लिए, स्वत: Min/Max विकल्प का चयन रद्द करें और वांछित स्केलिंग दर्ज करें. सभी डेटा अब एक ही पैमाने के भीतर प्रदर्शित किया जाएगा।
  5. डेटा का रंग स्केल बदलें (ग्रेस्केल, नीला-सफेद-लाल, आदि).
    1. रंग मानचित्र ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग कर मैपिंग मेनू में इच्छित रंग योजना के लिए रंग स्केल परिवर्तित करें। सुनिश्चित करें कि चयनित रंग योजना रंग-अंधा-अनुकूल है।
  6. 3D मॉडल या पृष्ठभूमि रंग का रंग बदलने के लिए, 3D मेनू के अंतर्गत रंग और पृष्ठभूमि विकल्पों का उपयोग करें.
  7. 3D मेनू के अंतर्गत मूल दिखाएँ बॉक्स का चयन रद्द करके 3D अक्ष छुपाएँ.
  8. स्क्रीनशॉटिंग द्वारा छवि को सहेजें, स्निपिंग टूल का उपयोग करके, या शॉर्टकट कुंजी Crtl + S के लिए विंडोज या लिनक्स और Equation 1+ ओएस एक्स पर एस।

Representative Results

प्राप्त मेटाबोलाइट सुविधाओं की संख्या विश्लेषण किए गए ऊतक प्रकार और डेटा प्रसंस्करण मापदंडों पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग टी क्रूज़ी संक्रमण के माउस मॉडल में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट मेटाबोलोम पर टी क्रूज़ी संक्रमण के स्थानिक प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए किया गया है। पहले के काम में, पुरुष C3H / HeJ को 1,000 CL + luc T. cruzi parasites32,6 के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था। जानवरों को संक्रमण के बाद 12 या 89 दिनों के बाद euthanized किया गया था, और जठरांत्र संबंधी मार्ग के 13 सन्निहित खंडों का एक रासायनिक कार्टोग्राफी विश्लेषण इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में किया गया था। इस विश्लेषण ने 5,502 सुविधाओं की एक सुविधा तालिका का नेतृत्व किया, जिसे तब इस प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों का उपयोग करके 3 डी में विज़ुअलाइज़ किया गया था। यह दृष्टिकोण व्यक्तिगत जानवरों में मेटाबोलाइट सुविधाओं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है जो उच्च परजीवी लोड (kynurenine, चित्रा 2B बनाम परजीवी लोड, चित्रा 2A) की साइट पर उच्च हैं, ऊतक क्षेत्रों (ग्लूटामाइन, चित्रा 2 C) और मेटाबोलाइट सुविधाओं में अंतर वितरण के साथ मेटाबोलाइट्स जो छोटी और बड़ी आंतों में तुलनीय स्तरों पर पाए जाते हैं (LPE 16: 0 चित्रा 2D) ). Kynurenine को विज़ुअलाइज़ेशन के लिए चुना गया था क्योंकि सूजन के लिए अपने ज्ञात संबंध और T. cruzi load33 को विनियमित करने के लिए kynurenine-व्युत्पन्न मेटाबोलाइट्स की क्षमता पर पूर्व प्रकाशनों। यादृच्छिक वन-आधारित मशीन लर्निंग मॉडल ने पहले kynurenine के स्तर और संक्रमण की स्थिति 6 के बीच एक संबंध का खुलासा किया था। Glutamine को पिछले प्रकाशनों के आधार पर एक विज़ुअलाइज़ेशन के लिए चुना गया था, जो इन विट्रो ग्लूटामाइन उपलब्धता और टी क्रूज़ी ड्रग संवेदनशीलता 34 के बीच संबंध का प्रदर्शन करता है। विभेदक वितरण लॉजिस्टिक प्रतिगमन, पी < 0.05 का उपयोग कर पुष्टि की गई थी। एलपीई 16: 0 को ऊतक साइटों में तुलनीय स्तरों पर पाए जाने वाले मेटाबोलाइट विशेषताओं की खोज करने के लिए डेटा के दृश्य निरीक्षण के बाद चुना गया था।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल अवलोकन. उदाहरण BioRender.com के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रासायनिक कार्टोग्राफी विश्लेषण। पुरुष C3H / HeJ चूहों को 1,000 CL + luc T. cruzi parasites32 के साथ इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था। जानवरों को संक्रमण के बाद 12 या 89 दिनों के बाद euthanized किया गया था, और जठरांत्र संबंधी मार्ग को एकत्र किया गया था और व्यवस्थित रूप से विभाजित किया गया था (चरण 1)6। मेटाबोलाइट्स को चरण 2 के रूप में निकाला गया था और एलसी-एमएस / एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया था.3D मॉडल पीढ़ी स्केचअप सॉफ़्टवेयर (चरण 5) का उपयोग करके किया गया था, और डेटा को चरण 6 के रूप में 3 डी में प्लॉट किया गया था। (ए) एक विशिष्ट माउस में परजीवी वितरण, संक्रमण के 12 दिनों के बाद। (बी) एक ही माउस में Kynurenine metabolite वितरण, संक्रमण के 12 दिनों के बाद। (सी) संक्रमित चूहों में ग्लूटामाइन वितरण का मतलब है, संक्रमण के 89 दिनों के बाद। (डी) एम / जेड 454.292 प्रतिधारण समय 2.929 मिनट के तुलनीय स्तर, 2-हेक्साडेकैनोयल-एसएन-ग्लिसेरो-3-फॉस्फोएथेनोलामाइन (एलपीई 16: 0) के रूप में एनोटेट किया गया है, एक ही माउस में जैसे कि छोटी आंत और बृहदान्त्र में ए और बी में। नमूने और डेटा में उत्पन्न किए गए थे6. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमणों को समझना उपन्यास दवा विकास और उपचार के दृष्टिकोण का मार्गदर्शन करने के लिए आवश्यक है। यह रासायनिक कार्टोग्राफी विधि विशिष्ट रूप से चयापचय और ट्रिपैनोसोमाटिड रोग रोगजनन के बीच संबंधों में कार्रवाई योग्य अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए तैयार है, इस प्रकार इस ट्रांसलेशनल आवश्यकता को संबोधित करती है।

पृष्ठभूमि संदूषण को कम करने के लिए मेटाबोलाइट निष्कर्षण और एमएस विश्लेषण के दौरान केवल एलसी-एमएस ग्रेड सॉल्वैंट्स की सिफारिश की जाती है। बहुलक संदूषण 35, आमतौर पर पैराफिन फिल्म और / या अन्य प्लास्टिक 36,37,38 से व्युत्पन्न, जहां संभव हो, से बचा जाना चाहिए। पैराफिल्म, विशेष रूप से, कभी भी उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। ये पहलू महत्वपूर्ण हैं क्योंकि एलसी-एमएस डेटा की गुणवत्ता नमूना तैयारी और मेटाबोलाइट निष्कर्षण के दौरान उपयोग की जाने वाली सामग्रियों पर निर्भर करती है। 'ili भूखंडों' उत्पन्न करने से पहले डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित की जानी चाहिए। इसके अलावा, इन व्यापक स्थानिक मेटाबोलोमिक्स मानचित्रों को उत्पन्न करने के लिए इन मानचित्रों में अंतराल से बचने के लिए सभी एकत्र किए गए नमूनों से सभी आसन्न ऊतक नमूनों और मेटाबोलाइट निष्कर्षण के संग्रह की आवश्यकता होती है। संग्रह प्रक्रियाओं, मेटाबोलाइट निष्कर्षण और एलसी-एमएस विश्लेषण के रसद, और लागत इस प्रकार विचार किया जाना चाहिए और तदनुसार योजना बनाई जानी चाहिए।

इस प्रोटोकॉल को कई तरीकों से उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मेटाबोलाइट निष्कर्षण के दौरान उपयोग किए जाने वाले सॉल्वैंट्स की ध्रुवीयता और घुलनशीलता प्रभावित करेगी कि मेटाबोलाइट्स का पता लगाया जाता है39। untargeted रासायनिक कार्टोग्राफी विश्लेषण के लिए पता लगाया मेटाबोलाइट सुविधाओं की विविधता को अधिकतम करने के लिए, कई निष्कर्षण चरणों और सॉल्वैंट्स के संयोजन की सिफारिश की है। उदाहरण के लिए, यह विधि निष्कर्षण सॉल्वैंट्स के रूप में डाइक्लोरोमेथेन, मेथनॉल और पानी का उपयोग करती है क्योंकि वे गैर-ध्रुवीय और ध्रुवीय अणुओं का सटीक पता लगाने में सक्षम बनाते हैं20,40। हालांकि, ये सॉल्वैंट्स प्रत्येक एमएस प्रयोग के लिए सार्वभौमिक रूप से उपयुक्त नहीं हैं, और शोधकर्ताओं को अपनी परियोजना के लक्ष्यों के आधार पर निष्कर्षण सॉल्वैंट्स का चयन करना चाहिए। इसी तरह, विभिन्न एलसी-एमएस / एमएस स्थितियों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि सामान्य चरण क्रोमैटोग्राफी के साथ उलट-चरण क्रोमैटोग्राफी को बदलना। वैकल्पिक स्तंभों का उपयोग C8 क्रोमैटोग्राफी के बजाय रिवर्स-फेज डेटा संग्रह के लिए भी किया जा सकता है, हालांकि अनुभवजन्य रूप से, C8 क्रोमैटोग्राफी ऊतक लिपिड के लिए अधिक मजबूत है और इसमें कम क्लॉगिंग आवृत्ति होती है। वैचारिक रूप से, इन प्रोटोकॉल को अन्य मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों जैसे गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री, आदि पर भी लागू किया जा सकता है।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग है। दरअसल, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग दृष्टिकोण के विपरीत, तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्वाभाविक रूप से स्थानिक जानकारी को संरक्षित नहीं करता है10। रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण परियोजना अवधारणा के समय, नमूना मेटाडेटा में, और डेटा प्रसंस्करण चरणों में नमूना स्थान को शामिल करके इस अंतर को पाटते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के विपरीत, इस रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण की एक ताकत, आत्मविश्वास एनोटेशन (मेटाबोलोमिक्स स्टैंडर्ड्स इनिशिएटिव लेवल 1 या स्तर 2 एनोटेशन कॉन्फिडेंस 41) प्रदान करने की क्षमता है, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग के विपरीत जहां अधिकांश एप्लिकेशन केवल एनोटेशन के लिए सटीक द्रव्यमान पर भरोसा करते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग ठीक-ठाक स्थानिक मानचित्रण को सक्षम करेगी, कभी-कभी एकल-सेल स्तर तक नीचे, उदाहरण के लिए, 42,43। इसके विपरीत, रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण मेटाबोलाइट वितरण के बड़े पैमाने पर क्रॉस-ऑर्गन मैपिंग को अत्यधिक विशिष्ट पूरे-पशु क्रायोसेक्शनिंग कौशल की आवश्यकता के बिना सक्षम करते हैं। रासायनिक कार्टोग्राफी विकसित किए जा रहे कई स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोणों के पूरक सबूत प्रदान करती है, उदाहरण के लिए, 44, 'फेनोटाइप के निकटतम ओमिक्स परत' 45 पर ध्यान केंद्रित करने के लाभ के साथ। परजीवी भार परिमाणीकरण के लिए वैकल्पिक तरीकों में नमूना संग्रह 6 के समय बायोल्यूमिनेसेंस को मापना शामिल है। स्थानीयकृत परजीवी बोझ और ऊतक क्षति का आकलन करने के लिए कॉन्फोकल या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को सक्षम करने के लिए ठीक खंडों को भी एकत्र किया जा सकता है। पानी homogenate, जो इस प्रोटोकॉल और पूर्व प्रकाशन13 में साइटोकाइन परिमाणीकरण के लिए उपयोग किया जाता है, का उपयोग ऊतक क्षति के प्रोटीन-आधारित मार्करों को मापने के लिए भी किया जा सकता है।

परिणामी एलसी-एमएस डेटा को प्लॉट करने के लिए उपयुक्त 3 डी मॉडल प्राप्त करने के कई तरीके भी हैं। यहां सुझाई गई विधि के अलावा, मॉडल को विभिन्न ऑनलाइन विक्रेताओं से पूर्व-निर्मित खरीदा जा सकता है। सुनिश्चित करें कि उपयोग की शर्तें इच्छित उपयोग के साथ मेल खाती हैं, विशेष रूप से प्रकाशन से संबंधित। स्कैनर निर्देशों के अनुसार 3 डी स्कैनर का उपयोग करके बड़े अंगों के लिए मॉडल डे नोवो उत्पन्न किए जा सकते हैं। MATLAB जैसे विकल्प रासायनिक कार्टोग्राफी 46 के लिए 3 डी मॉडल उत्पन्न करने और विज़ुअलाइज़ करने के लिए मौजूद हैं, लेकिन उन्हें मुख्य रूप से 'ili16' के विकास से पहले लागू किया गया था। MATLAB एक डेटा विश्लेषण और प्रोग्रामिंग टूल सूट है जो कई क्षेत्रों में विभिन्न प्रकार के अनुप्रयोगों की पेशकश करता है। हालांकि, MATLAB न तो मुफ़्त है और न ही ओपन-सोर्स है, और इसके लिए MATLAB इंटरफेस के साथ परिचित होने की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से MATLAB पर विचार करना मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा को संसाधित करने के लिए विकसित नहीं किया गया था। इस प्रस्तावित विधि के विकल्प, अर्थात्, स्केचअप, मेस्लैब, और 'इली, स्वतंत्र रूप से सुलभ, उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं, और रासायनिक कार्टोग्राफी उद्देश्यों के लिए MATLAB के समान कार्य प्रदान करते हैं।

यह विधि नमूना तैयारी और मेटाबोलाइट निष्कर्षण के बारे में मजबूत है। समस्या निवारण सबसे अधिक बार LC-MS डेटा अधिग्रहण चरण पर आवश्यक है। यह इस लेख के दायरे से परे है। पाठकों को एलसी-एमएस डेटा अधिग्रहण समस्या निवारण पर उत्कृष्ट प्रकाशनों के लिए निर्देशित किया जाता है, जिसमें 20,47 शामिल हैं। इसी तरह, मेटाबोलाइट एनोटेशन की जटिलताएं 3 डी मॉडल पीढ़ी पर इस विधि के ध्यान के दायरे से परे हैं। इस विषय पर उपयोगी संदर्भों में 24,25,48,49 शामिल हैं।

जबकि यह विधि प्रभावी रूप से रोग रोगजनन की पड़ताल करती है, इस दृष्टिकोण की सीमाएं हैं, जिनमें से कुछ किसी भी मेटाबोलोमिक्स प्रयोग में आम हैं। ऐसी ही एक सीमा एलसी-एमएस फीचर्स 50 की कम एनोटेशन दर है, जो संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालयों की उपलब्धता और गुणवत्ता पर निर्भर है। एक और सीमा यह है कि यह प्रोटोकॉल आरएनए संरक्षण अभिकर्मकों की असंगतता के कारण एमआरएनए को संरक्षित नहीं करता है जैसे कि एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ आरएनएलेटर। हालांकि, प्रोटीन की गुणवत्ता डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त है और इस प्रकार एमआरएनए-आधारित विश्लेषणों को प्रतिस्थापित कर सकती है।

संक्रमण रोगजनन के लिए एक रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण सीधे दर्शाता है कि जीवाणु, वायरल, या परजीवी संक्रमण अंग प्रणालियों में कैसे विकसित होते हैं और स्थानीयकृत बीमारी का कारण बनते हैं। इन क्षेत्रीय subsamples का विश्लेषण और 3 डी मॉडल उत्पन्न अंततः कैसे मेटाबोलाइट्स तीन आयामी अंतरिक्ष भर में कार्य करता है, आणविक जीव विज्ञान के इन पहले अपरिचित स्थानिक आयामों पर प्रकाश डाला. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, उदाहरण के लिए, मेटाबोलाइट स्थानीयकरण की तुलना ट्रिपैनोसोमा क्रूज़ी परजीवी लोड से की गई थी। परिणामों ने रोगज़नक़ और मेजबान ऊतक के बीच संबंध को स्पष्ट किया और चागस रोग लक्षण प्रगति 6 की चयापचय गतिशीलता का भी प्रदर्शन किया। रासायनिक कार्टोग्राफी विधियों को विभिन्न विषयों पर भी लागू किया गया है, जैसे कि मानव निर्मित पर्यावरण इंटरैक्शन 51,52,53, मानव त्वचा 46 और फेफड़ों जैसे अंग प्रणालियों का रासायनिक मेकअप 54, और पौधे चयापचय और पर्यावरण इंटरैक्शन 55। भविष्य के अनुप्रयोगों में स्थानीयकृत रोग सहिष्णुता और लचीलापन का आकलन करना शामिल हो सकता है, या स्थानीय मेटाबोलाइट स्तरों, रोगज़नक़ ट्रोपिज़्म और ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण से परे मॉडल में रोग ट्रोपिज़्म के बीच संबंध। इस दृष्टिकोण में वर्तमान फार्माकोकाइनेटिक्स प्रोटोकॉल का विस्तार करने के लिए व्यापक प्रयोज्यता भी होनी चाहिए, ताकि स्थानीय ऊतक दवा के स्तर और दवा चयापचय बनाम समग्र चयापचय संदर्भ, ऊतक क्षति और रोगज़नक़ निकासी के बीच संबंधों का आकलन किया जा सके। कुल मिलाकर, रासायनिक कार्टोग्राफी विभिन्न नमूना प्रकारों में मेटाबोलाइट वितरण के अद्वितीय अन्वेषणों की अनुमति देता है, जिसमें रोग रोगजनन, मानव स्वास्थ्य, मानव-पर्यावरण इंटरैक्शन और माइक्रोबियल गतिशीलता सहित अनुप्रयोग शामिल हैं।

Disclosures

रिपोर्ट करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लौरा-इसोबेल McCall, पीएचडी, Burroughs Wellcome फंड से संक्रामक रोग पुरस्कार के रोगजनन में एक जांचकर्ता रखती है। लेखक आगे एनआईएच पुरस्कार संख्या R21AI148886 से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं, ओक्लाहोमा सेंटर फॉर रेस्पिरेटरी एंड इंफेक्शियस डिजीज (ओसीआरआईडी) से एनआईएच पुरस्कार संख्या P20GM103648 के तहत एक पायलट अनुदान, और ओक्लाहोमा विश्वविद्यालय (LIM के लिए) से स्टार्ट-अप फंड। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि फंडर्स के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करे। लेखक भी इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के डेवलपर्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। सभी प्रासंगिक प्रकाशनों को उद्धृत किया गया है, जहां लागू हो।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tubes NA NA any brand, as available
1 L bottle, pyrex NA NA any brand, as available
1 L graduated cylinder, pyrex NA NA any brand, as available
2 mL SafeLock Eppendorf tubes VWR 20901-540 use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) NA NA as appropriate for system under investigation
5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
96 well plate Fisher 3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
analytical balance NA NA any brand, as available
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
biosafety cabinet NA NA class II, type A2; any brand, as available
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
camera NA NA any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol
chemiluminescent-capable imaging system NA NA any system, as available
cotton balls NA NA any brand, as available
cryogloves VWR 97008-208 replace with any brand, as available
dissection scissors NA NA any brand, as available
dry ice NA NA any brand, as available
extra-length forceps NA NA any brand, as available
flammable-grade refrigerator NA NA any brand, as available
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes NA NA any brand, as available
fume hood NA NA any brand, as available
high-resolution mass spectrometer NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)
ice bucket NA NA any brand, as available
ili software ili.embl.de NA
isoflurane Covetrus 29405
large tupperware NA NA any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball
LC-MS grade acetonitrile Fisher Optima A955-4
LC-MS grade dicholoromethane Fisher Optima D151-4
LC-MS grade formic acid Fisher Optima A11750
LC-MS grade methanol Fisher Optima A456-4
LC-MS grade water Fisher Optima W64
liquid chromatography column Phenomenex 00B-4499-AN may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge Phenomenex AJ0-8784 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid nitrogen NA NA any brand, as available
luciferin Goldbio LUCK-1G
MeshLab software https://www.meshlab.net/ NA
Meshmixer software https://www.meshmixer.com/ NA
MS calibrant NA NA appropriate one for available instrument
MS data processing software NA NA multiple options available; authors recommend MZmine
MSConvert software http://proteowizard.sourceforge.net/ NA
Nanodrop ThermoFisher ND-ONE-W other nanodrop models are also suitable
p1000 pipet tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p1000 pipettor NA NA any brand, as available
p20 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p20 pipettor NA NA any brand, as available
p200 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p200 pipettor NA NA any brand, as available
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) NA NA any brand, as available
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) Quansys biosciences 110949MS can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) Zymo D4069 replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available
real-time thermocycler NA NA any brand, as available
salt shaker or tea infuser NA NA any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin
SketchUp software https://www.sketchup.com/ NA
specimen forceps NA NA any brand, as available
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
spreadsheet software https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel NA can replace with other spreadsheet management software, as applicable
sulfachloropyridazine Sigma S9882-100G
sulfadimethoxine Sigma S7007-10G
Sybr green qPCR reaction mix Fisher A25780 can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
tissue homogenizer NA NA any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982
tissue samples NA NA from appropriate infection model
TissueLyser single-bead dispenser Qiagen 69965
UHPLC NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)
ultra-low temperature freezer (-80) NA NA any brand, as available
ultrasonic bath NA NA any system, as available
wet ice NA NA any brand, as available
zone-free sealing film VWR  490007-390

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References

  1. McCall, L. -I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
  2. McCall, L. -I., Zhang, W. -W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
  3. de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
  4. Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clinical Epidemiology. 6, 257-275 (2014).
  5. Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
  6. Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
  7. Parab, A. R., McCall, L. -I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
  8. Lewis, C. M., McCall, L. -I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
  9. Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
  10. Newsom, S. N., McCall, L. -I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
  11. Wishart, D. S., et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 35, Database issue 521-526 (2007).
  12. Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
  13. McCall, L. -I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
  14. Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
  15. Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
  16. Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
  17. McCall, L. -I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
  18. Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
  19. Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
  20. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
  21. Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
  22. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  25. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  26. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  27. Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
  28. Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  31. FBMN with MZmine. , Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021).
  32. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  33. Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
  34. Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
  35. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  36. Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
  37. Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
  38. Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
  39. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  40. Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
  41. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  42. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  43. Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
  44. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  45. Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
  46. Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
  47. Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
  48. Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
  49. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  50. Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
  51. Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
  52. Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
  53. McCall, L. -I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
  54. Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
  55. Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 179 रासायनिक कार्टोग्राफी मेटाबोलाइट वितरण स्थानिक मेटाबोलोमिक्स 3 डी मॉडल तरल क्रोमैटोग्राफी-अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री ट्रिपैनोसोमाटिड्स संक्रमण ट्रोपिज़्म
ट्रिपैनोसोमाटिड संक्रमण का अध्ययन करने के लिए रासायनिक कार्टोग्राफी दृष्टिकोण
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Dean, D. A., Haffner, J. J.,… More

Dean, D. A., Haffner, J. J., Katemauswa, M., McCall, L. I. Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection. J. Vis. Exp. (179), e63255, doi:10.3791/63255 (2022).

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