Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kjemisk kartografi tilnærminger for å studere Trypanosomatid infeksjon

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63255
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1, 1,2,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, 2Laboratories of Molecular Anthropology and Microbiome Research, University of Oklahoma, Norman, 3Department of Anthropology, University of Oklahoma, Norman, 4Department of Microbiology and Plant Biology, University of Oklahoma, Norman
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver trinnene for å generere en 3D-modell av metabolitt distribusjon under trypanosomatid infeksjon, inkludert prøveinnsamling, metabolitt utvinning, en oversikt over flytende kromatografi-tandem masse spektrometri datainnsamling, 3D-modell generasjon, og til slutt, datavisualisering.

Abstract

Patogentropisme og sykdomtropisme refererer til vevsplasseringene selektivt kolonisert eller skadet av patogener, noe som fører til lokaliserte sykdomssymptomer. Humaninfektive trypanosomatid parasitter inkluderer Trypanosoma cruzi, det forårsakende middelet til Chagas sykdom; Trypanosoma brucei, det forårsakende middelet til sovesyke; og Leishmania arter, forårsakende midler av leishmaniasis. I fellesskap påvirker de 20 millioner mennesker over hele kloden. Disse parasittene viser spesifikk tropisme: hjerte, spiserøret, kolon for T. cruzi, fettvev, bukspyttkjertel, hud, sirkulasjonssystem og sentralnervesystem for T. brucei, hud for dermotrope Leishmania-stammer og lever,milt og benmarg for viscerotropiske Leishmania-stammer . Et romlig perspektiv er derfor viktig for å forstå trypanosomatid sykdomspatogenese. Kjemisk kartografi genererer 3D-visualiseringer av små molekyloverflod generert via flytende kromatografi-massespektrometri, sammenlignet med mikrobiologiske og immunologiske parametere. Denne protokollen demonstrerer hvordan kjemisk kartografi kan brukes til å studere patogene prosesser under trypanosomatidinfeksjon, som begynner fra systematisk vevsprøvetaking og metabolittutvinning, etterfulgt av væskekromatografi-tandem massespektrometri datainnsamling, og inngå med generering av 3D-kart over metabolittfordeling. Denne metoden kan brukes til flere forskningsspørsmål, for eksempel næringsbehov for vevskolonisering av T. cruzi, T. brucei eller Leishmania, immunometabolisme på infeksjonssteder, og forholdet mellom lokal vevsmetabolisk perturbasjon og kliniske sykdomssymptomer, noe som fører til omfattende innsikt i trypanosomatid sykdomspatogenese.

Introduction

Trypanosomatid parasitter består av Leishmania arter, afrikanske trypanosomer (Trypanosoma brucei), og amerikanske trypanosomer (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoa forårsaker leishmaniasis, som inkluderer selvhelbredende og selvbegrenset lokalisert kutan leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis der slimhinnen vev i munn, nese og hals blir skadet, og visceral leishmaniasis med parasitttropisme til de viscerale organene forårsaker feber og hepatosplenomegaly1,2. T. brucei forårsaker human afrikansk trypanosomiasis (HAT), også kjent som sovesyke, hovedsakelig rapportert i afrikanske land3. De kliniske tegnene og symptomene inkluderer hepatosplenomegali, feber, hodepine, muskel- og skjelettsmerter, lymfadenopatier og anemi i hemo-lymfatisk stadium når parasitter lokaliserer til blodet og lymfatikk. Dette etterfølges av meningo-encefalittisk stadium, hvor parasitter lokaliserer seg til sentralnervesystemet og forårsaker søvnforstyrrelser, atferdsendring og til slutt dødelig koma4. T. cruzi forårsaker Chagas sykdom, endemisk i Amerika. Infiserte individer opplever en innledende akutt stadium, vanligvis asymptomatisk, med bred parasitttropisme. Omtrent 10% -30% av infiserte individer opplever kroniske stadium symptomer etter flere tiår med infeksjon, preget av megaoøsofagus, megakolon og kardiovaskulære komplikasjoner5,6.

Metabolomics studerer små molekylære arter (50-1500 Da), inkludert biologiske forbindelser fra primær eller sekundær metabolisme og eksternt avledede forbindelser som narkotika eller matavledede molekyler. I sammenheng med vertspatogeninteraksjoner kan metabolomikk utforske virkningen av infeksjon på vertsmetabolittmiljøer, avgjørende for å få tilgang til effekten av patogenet på verten. Den kan også vurdere patogentilpasninger til vertens ernæringsmessige og immunologiske miljø7,8,9. Massespektrometri (MS) og kjernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi er vanlige metabolomics verktøy som brukes til å identifisere, kvantifisere og karakterisere metabolitter. Denne "omics" tilnærmingen kan også brukes på biomarkørfunn og narkotikautvikling10,11.

Gitt den spesifikke vevtropismen av trypanosomatid parasitter, kan romlige metabolomics analyser muliggjøre betydelig innsikt i patogenesen av sykdommene de forårsaker. Kartlegging av romlig distribusjon av metabolitter avslørte metabolitter lokalt påvirket av kronisk Trypanosoma cruzi infeksjon i mus hjertevev og akutt og langsiktig Trypanosoma cruzi infeksjon i musen mage-tarmkanalen6,12,13. Nærmere bestemt viste 3D kjemisk kartografi en frakobling mellom parasitt utholdenhet og metabolske endringer i hjertevevet til kronisk Trypanosoma cruzi-infiserte mus. Metabolisme ble mest forstyrret i nedre og apikale segmenter av hjertet, som samsvarer med steder av Chagas sykdom symptomer (hjerte apikale aneurismer). Metabolittfamilier som er forstyrret av infeksjon på bestemte hjertesteder og korrelert med alvorlighetsgraden av sykdommen, inkluderer acykarnitiner og glyserofosfosforkoliner12,13,14. I mage-tarmkanalen er vedvarende metabolske endringer sammenfallende med steder av Chagas sykdomssymptomer: spiserøret og tykktarmen. I motsetning til dette normaliseres stoffskiftet på steder som ikke er forbundet med Chagas sykdomssymptomer, som tynntarmen. Metabolitter lokalt perturbert av infeksjon i mage-tarmkanalen inkluderer akrylcarnitiner, glyserofosfokoliner, kynurenin, tryptofan og kolsyre. I tillegg gjorde disse analysene det mulig å identifisere en ny metabolsk toleransemekanisme for Chagas sykdom6. Ved å bruke disse metodene på studiet av kutan leishmaniasis avslørte betydelige metabolske perturbasjoner på lesjonens sted, men også spesifikke metabolske endringer i lesjons-tilstøtende, makroskopisk sunt vev. For eksempel ble glutamin utarmet på lesjonsstedet, mens glyserofosfokoliner i m / z (masse til ladeforhold) 200-299, 400-499, 500-599 og 600-699 ble betydelig økt på lesjonsstedet. PC (O-34:1) ble bare økt på lesjon-tilstøtende steder15.

Målet med dette manuskriptet er å demonstrere trinnene som er nødvendige for å generere 3D-modeller av metabolittdistribusjon ("kjemisk kartografi") som anvendt på trypanosomatid parasittinfeksjonsmodeller (figur 1). Denne tilnærmingen bygger på flere kritiske fremskritt i sammenheng med metabolomics og metabolomics databehandling, spesielt utviklingen av 'ili programvare for å plotte metabolomics data på 3D-modeller lett16.

Protocol

Alle dyreforsøk som er beskrevet ble godkjent av University of Oklahoma eller University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committee. Alle trinn håndtering av smittsomt materiale ble utført inne i et biosikkerhetsskap (klasse II, type A2) og i henhold til lokale forskrifter.

1. Vevsinnsamling

  1. Infiser passende trypanosomatid infeksjon dyremodeller, vanligvis mus eller hamstere.
    MERK: Det er et betydelig utvalg av musemodeller for trypanosomatidinfeksjon, avhengig av de ønskede symptomene som skal produseres, hastighet på sykdomsprogresjon, sykdoms alvorlighetsgrad, etc. Brukerne kan velge når det passer dem.
    1. For kutane leishmaniasis infeksjonsmodeller, infisere subkutant i fotputen eller intradermally i øret15.
    2. For viscerale leishmaniasis infeksjonsmodeller, infisere intravenøst1,17.
    3. For Chagas sykdom og sovesyke infeksjon modeller, infisere intraperitoneally6,12,18,19. Bestem parasittdosen som skal brukes basert på parasittstammen og planlagte tidspunkter.
  2. Planlegge seksjoneringsstillinger.
    1. Planlegg å generere seksjoner med minst 10 mg vev per seksjon. Det er best å bruke 30-50 mg.
    2. For Chagas sykdomsinfeksjonsmodeller, planlegg å samle hjerte- og gastrointestinale segmenter systematisk.
    3. For kutane leishmaniasis infeksjonsmodeller, samle lesjonsvev og lesjon-tilstøtende prøver.
    4. For viscerale leishmaniasis infeksjonsmodeller, planlegg å samle milt og flere leverlober. Ytterligere vevssteder som fettvev kan også være av interesse å samle.
      FORSIKTIG: Prøver fra smittede dyr må håndteres i henhold til den aktuelle, institusjonelt godkjente biosikkerhetsprotokollen. Dette vil generelt innebære krav til personlig verneutstyr (PVU) og kun åpne rør og samle prøver inne i et biosikkerhetsskap (klasse II, type A2).
  3. Merk og vei rør for homogenisering.
    1. Bruk rørtypen som passer for det tilgjengelige homogeniseringssystemet. For tissuelyser, bruk 2 ml mikrocentrifuge rør.
    2. Avlive mus ved ønskede infeksjonstidspunkter ved bruk av isofluranoverdose som godkjent av institusjonell IACUC eller i henhold til IACUC-godkjent protokoll.
    3. Seksjonsvev systematisk som planlagt, med en seksjon per rør.
    4. Husk å vaske prøveoppsamlingsutstyr mellom prøver med ekstraksjonsløsningsmiddel (50% metanol i denne protokollen).
  4. Hold rørlokket åpent, trykk straks fryseprøver i flytende nitrogen.
    FORSIKTIG: Ikke lukk rørene før flytende nitrogen som kommer inn i røret, er helt fordampet for å hindre at rør eksploderer etter hvert som nitrogenet ekspanderer. Ta tilstrekkelige skritt for å sikre at huden ikke kommer i kontakt med flytende nitrogen (bruk kryohansker og tang for å holde rørene). Bruk et sikkerhetsskjermskjold.
  5. Oppbevar rørene på tørris til alle de ønskede prøvene er samlet inn.
  6. Pausepunkt: Oppbevar prøver ved -80 °C til de er klare til å ta ekstraksjoner.
  7. Veierør for å bestemme vevsprøvevekten. Spille inn i et regneark.
    1. Hold prøvene frosset under veieprosessen: Hold rørene på tørris, vei raskt, sett tilbake på tørris med en gang. Ikke la prøvene tine under veiing.

2. Metabolitt ekstraksjon

MERK: Bare væsker og reagenser av LC-MS-grad må brukes overalt. Denne metoden ble tilpasset fra Reference20.

  1. Forbered alle ekstraksjonsløsningsmidler (LC-MS grade H2O, LC-MS grade metanol, pigget med 4 μM sulfachlorpyridazine, LC-MS grade dichloromethane: metanol pigget med 2 μM sulfachlorpyridazine) i 1 L glassflasker, ved hjelp av dedikert glass.
    MERK: Volumet som skal tilberedes, bør beregnes basert på prøvevekter, med tanke på 500 μL vann per 50 mg prøve, 500 μL metanol spiked med 4 μM sulfachlorpyridazine per 50 mg prøve og 1000 μL prechilled dichloromethane: metanol pigget med 2 μM sulfachlorpyridazine per 50 mg prøve, øke det beregnede volumet med 10% for å tillate pipettering inacacy. Oppbevar ekstraksjonsløsningsmiddel ved 4 °C minst over natten for å forkjøle.
  2. Utfør vannbasert homogenisering av vevsprøvene i henhold til trinnene som er nevnt nedenfor.
    1. Tilsett en 5 mm perle i rustfritt stål (se Materialtabell) i hvert av de 2 ml mikrosenterrørene som inneholder vevsprøver, ved hjelp av en perledispenser. Hold rørene på is.
    2. Lag et tomt rør som inneholder LC-MS grade H2O som vil gå gjennom alle trinnene og tjene som en ekstraksjon blank. Bruk gjennomsnittlig H2O-volum fra prøveuttrekk. Tilsett kjølt LC-MS grade H2O i de frosne vevsprøvene.
      1. Normaliser vannvolumet til vevsvekt ved å tilsette 500 μL vann / 50 mg prøve, ved hjelp av prøvevektene beregnet ved trinn 1,7.
        FORSIKTIG: Hvis du håndterer biofarlige prøver, må du fortsette å følge den aktuelle, institusjonelt godkjente biosikkerhetsprotokollen. Dette vil generelt innebære krav til personlig verneutstyr (PVU) og åpningsrør bare inne i biosikkerhetsskapet (klasse II, type A2).
    3. Homogeniser prøver med 25 Hz hastighet i 3 minutter ved hjelp av en vevshomogenisator (se Materialtabell).
      1. Lukk rørene tett for å unngå å søle reagensene under behandlingen.
    4. Samle ca. 1/10 av homogeniseringsvolumet for DNA-ekstraksjon, qPCR, proteinbaserte analyser eller andre analyser (om ønskelig). Oppbevares i et mikrosenterrør eller en 96-brønnsplate (avhengig av volumet som samles inn) i opptil 6 måneder ved -80 °C, hvis DNA-ekstraksjonsforsøk skal utføres på en annen dag. Lengre lagringsvarigheter kan være mulig, men har ikke blitt testet.
      1. Utfør DNA-ekstraksjoner ved hjelp av et hvilket som helst standard kommersielt sett for pattedyr-DNA-ekstraksjon (se materialtabell) fra vev som beskrevet i Referanse13. Kvantifisere DNA-utbyttet og lagre det ekstraherte DNA-et ved -20 °C. Akseptabel DNA-kvantitet og kvalitet for qPCR har blitt observert selv opptil 3 år senere.
        MERK: Dette trinnet kan utføres på frossen homogenat på en etterfølgende dag fra metabolittutvinning.
      2. Utfør qPCR som beskrevet i Referanse13, ved hjelp av 180 ng ekstrahert DNA.
        MERK: Dette kan utføres på DNA samlet på en tidligere dag og frosset ved -20 °C.
        1. Ved studier på T. cruzi-infeksjon, bruk følgende primere: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA og AATTCCTCCAAGCAGCGGATA for å kvantifisere parasittnivåer21 og følgende primere for å normalisere for å være vertskap for DNA-nivåer: TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA og CAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22 (se Materialfortegnelse).
          MERK: De anbefalte qPCR-syklusene er som følger: protese ved 95 °C i 10 minutter; utfør 40 sykluser ved 95 °C i 30 s, og deretter 58 °C i 60 s, og til slutt 72 °C i 60 s. Utfør smeltekurveanalyse etter behov for den tilgjengelige termosykleren. Behandle data ved hjelp av ΔΔCt-metoden23 for å oppnå relativ parasittbelastning mellom prøvetakingssteder. Absolutt kvantifisering kan oppnås ved å sammenligne prøveavledede ΔΔCt-verdier med en standardkurve generert fra kjente mengder parasitter, pigget inn i uinfiserte vevsprøver og ekstrahert som i trinn 2,2 til 2,2,4,1.
      3. Utfør proteinbasert karakterisering av immunresponser ved hjelp av multipleksede cytokinsett eller standard kommersielle ELISA-sett (se Materialfortegnelser) som beskrevet i Referanse13 på det lagrede homogenatet.
    5. Spar minst halvparten av 500 μL av homogeniseringsvolumet for metabolittutvinning.
  3. Utfør vandig metabolittutvinning.
    MERK: Valg av løsemiddel kan tilpasses basert på de kjemiske egenskapene til metabolitter av interesse.
    1. Tilsett iskald metanol av LC-MS-klasse med 4 μM sulfachlorpyridazine til homogenatet for å oppnå en endelig konsentrasjon på 50% metanol med 2 μM sulfachlorpyridazine i vann.
      FORSIKTIG: Metanol er brannfarlig og farlig. Bruk passende sikkerhetsprosedyrer, inkludert håndtering inne i en avtrekkshette eller biosikkerhetsskap.
    2. Homogeniser prøver i en vev homogenisator med 25 Hz hastighet i 3 min. Sentrifugeprøver ved 16 000 x g ved 4 °C i 10 minutter.
    3. Samle et likt volum supernatant i en 96-brønnsplate. Velg volumet som samsvarer med det minste volumet av metanol + vann kombinert på tvers av alle prøver. Dette er den vandige brøkdelen.
      1. Sett til side eventuelle gjenværende vandige homogenat supernatant ved -80 °C som sikkerhetskopi.
    4. Hold de faste restene på is mens du samler supernatantene.
    5. Tørk vandig ekstraksjon supernatant til den er tørr (~ 3 timer eller over natten). Bruk maksimal hastighet og ingen oppvarming.
    6. Frys den tørkede 96-brønnsplaten ved -80 °C.
  4. Utfør organisk metabolittutvinning.
    MERK: Valg av løsemiddel kan tilpasses basert på de kjemiske egenskapene til metabolitter av interesse.
    1. Tilsett 1000 μL per 50 mg av prøven av prechilled dichloromethane: metanol pigget med 2 μM sulfachlorpyridazine til faste rester fra trinn 2.3.4.
      FORSIKTIG: Bruk egnede sikkerhetsprosedyrer ved håndtering av løsemidler, inkludert håndtering inne i en avtrekkshette med god gjennomstrømningshastighet.
    2. Homogeniser prøver i en vevshomogenisator med 25 Hz hastighet i 5 minutter. Sentrifuger prøvene ved 16 000 x g ved 4 °C i 10 minutter.
    3. Samle et likt volum supernatant i en 96-brønnsplate. Velg volumet som samsvarer med det minste volumet av dichlorometan: metanol, på tvers av alle prøver. Dette er den organiske brøkdelen.
    4. Oppbevar pelletsen ved -80 °C som en sikkerhetskopi. Oppbevar det gjenværende organiske ekstraktet ved -80 °C som sikkerhetskopi. Lufttørk det organiske avtrekket i en avtrekkshette over natten.
    5. Frys den tørkede 96-brønnsplaten ved -80 °C.

3. LC-MS-datainnsamling

  1. Resuspend vandige og organiske ekstrakter i 60 μL hver av 50% metanol + 2 μM sulfadimethoxine, og kombinere. Soniker i 10 min; Sentrifuger deretter i 10 min og overfør supernatanten til en ren 96-brønnsplate. Tetning med sonefri platetetning og plasser platen i en LC-autosampler.
    FORSIKTIG: Bruk egnede sikkerhetsprosedyrer ved håndtering av løsemidler, inkludert håndtering inne i en avtrekkshette med god gjennomstrømningshastighet.
  2. Koble passende mobilfaser til LC-systemet (se Materialfortegnelse).
    MERK: For positiv modus omvendt fase LC, forfattere anbefaler LC-MS-grade H2O + 0.1% maursyre som mobil fase A og LC-MS-grade acetonitrile + 0,1% maursyre som mobil fase B med en strømningshastighet på 0,5 ml / min og en 7,5 min LC gradient. Anbefalte graderingstrinn er som publisert i Referanse6: 0-1 min, 2 % B; 1-2,5 min, lineær økning til 98% B; 2,5-4,5 min, hold på 98% B; 4,5-5,5 min, lineær reduksjon til 2% B; 5,5-7,5 min, hold på 2% B.
  3. Sørg for at instrumentet er rent. Kalibrer MS i både positiv og negativ modus.
  4. Utfør MS-ytelsesevaluering etter behov for instrumentet.
  5. Opprett MS-kjøresekvens.
    1. Start med 2 emner, 2 standarder (6-blandinger) og 5 samlede kvalitetskontroller (QC) i en fortynningsserie, som begynner på 2 μL injeksjonsvolum og øker trinnvis til 30 μL injeksjonsvolum.
    2. Tilfeldiggjør prøverekkefølgen.
    3. Etter hvert 12 prøver kjører du et tomt, og deretter en samlet QC.
  6. Koble C8 LC-søyle (1,7 μm partikkelstørrelse, 100 Å porestørrelse, 50 x 2,1 mm lengde x innvendig diameter) og overvåk for lekkasjer og overdreven tilbaketrykk. Løs problemer i henhold til instrumentets standard driftsprosedyre.
  7. Start MS-kjøresekvens og samle inn dataavhengige LC-MS/MS-data.
    MERK: For et Q-Exactive Plus MS-instrument, bruk oppvarmet elektrosprayionisering og dataavhengig MS2-anskaffelse (topp 5) i positiv modus, en oppløsning på 70 000 for MS1 og 17 500 for MS2, AGC-mål på 1E6 for MS1 og 2E5 for MS2, maksimal IT på 100 ms for både MS1 og MS2, skanneområde til 100-1500 m/z for MS1, MS1 og MS2-isolasjonsvinduet på 1 m/z. Sett hylsegassen til 35, aUX-gass til 10 og sveip gass til 0, sprayspenning til 3,8 kV, kapillær temperatur til 320 °C, RF-nivå for S-objektiv til 50 og aUX-gasstemperatur til 350 °C.
    1. Kontroller datakvaliteten: Kontroller innledende tomme celler (bekreft mangel på hovedtopper), standarder (bekreft tilstedeværelsen av forventede topper og symmetrisk toppform) og QC-er (bekreft tilstedeværelsen av forventede topper, toppform og forventet toppintensitet).
    2. Overvåk MS-kjøring med jevne mellomrom under kjøresekvensen.
  8. Når kjøringen er fullført, sjekk dataene for eventuelle tapte injeksjoner eller andre feil.
  9. Oppbevar LC-kolonnen som anbefalt av produsenten. Fjern og oppbevar prøver ved -80 °C.
  10. Last opp rådata til datarepositoriet.
    MERK: MassIVE (massive.ucsd.edu) anbefales for å aktivere nedstrømskoblingen til molekylært nettverk for metabolittmerknader24,25.

4. Behandling av LC-MS-data

  1. Konverter RAW-filer til åpent format (.mzXML eller .mzML) ved hjelp av MSConvert26.
    1. Last opp rådata og mzXML- eller mzML-data til datarepositoriet.
  2. Generer funksjonstabell. Det er flere verktøy for å gjøre det (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS, etc.27,28,29,30).
    MERK: MZmine anbefales fordi det er gratis, åpen kildekode, og kan importere mzXML-filer direkte etter MSconvert, har grafiske brukergrensesnittalternativer for behandling av data og overvåking av virkningen av parametervalg, og kan eksportere direkte til GNPS for molekylært nettverk24.
    MERK: Følg verktøydokumentasjonen og bruk parametere som passer for det tilgjengelige instrumentet. Du finner også mer informasjon i Referanse31.
    1. Eksporter funksjonstabell i .csv format.

5.3D modellgenerering

  1. Håndtegn 3D-modellen de novo for å skalere i henhold til trinnene som er nevnt nedenfor.
    1. Ta et bilde av interesseorganet.
    2. Utfør følgende i SketchUp-programvaren (se Materialliste) som nevnt nedenfor.
      1. Slett standardbildet av en mann som vises når programvaren åpnes.
      2. Klikk på Fil > Importer for å importere et bilde av organene av interesse.
      3. Klikk på Linjer-verktøyet og velg Freehand-alternativet . Bruk blyantverktøyet til å spore og tegne konturene av organene av interesse. Pass på at du lukker linjen ved å tegne helt tilbake til startpunktet. Når linjen er lukket, vises det tegnede området automatisk skyggelagt.
      4. Velg Push/Pull-verktøyet og dra opp i det skyggelagte området for å konvertere tegningen fra 2D til 3D.
      5. Slett orgelbildet: Velg Viskelær-knappen , høyreklikk deretter på bildet og velg Slett.
      6. Eksporter filen i DAE-format: Fil > Eksporter > 3D-modell.
    3. Forbedre realismen til modellen i henhold til trinnene som er nevnt nedenfor.
      1. Importer modellen til MeshLab-programvaren (se Tabell over materialer): åpne MeshLab og velg Fil > Importer mesh. Velg DAE-modellen som ble generert i forrige trinn. Det dukker opp en meny for alternativer før åpning . Velg OK.
      2. Velg Trådramme på den øverste menyen. Velg deretter: Filtre > Ressing, Forenkling og rekonstruksjon > Underinndelingsflater: Midtpunkt. La alle verdier være standard, og velg Bruk to ganger. Kontroller trådrammevisningen av modellen visuelt for å sikre at den er fint rutenettet. Lukk hurtigmenyen.
      3. Eksporter modellen i STL-format: Fil > Eksporter netting som, og velg deretter STL-filformat (*.stl) på rullegardinmenyen Filtype . Klikk på Lagre. Velg OK på neste hurtigmeny.
      4. Åpne Meshmixer-programvaren (se Materialfortegnelser). Klikk på Importer (+) -knappen. Velg STL-filen som ble generert i forrige trinn. Bruk sculpt > børster > Dra og skulptur > Børster > Blåse opp verktøy for å trekke ut modellens overflater som må avrundes ut.
      5. Når modellen har ønsket utseende, lagrer du den i .stl-format: Fil > Eksport. Gi filen et navn etter ønske, og velg STL binært format (*.stl) på rullegardinmenyen Filtype. Klikk på Lagre. Hvis en hurtigmeny vises, klikker du på Fortsett.

6. 'ili tomt generasjon

  1. Få koordinater for stillingene i 3D-modellen som tilsvarer prøvetakingsstedene.
    1. Åpne 3D-modellen fra trinn 5.1.3.5 i MeshLab-programvaren : File > Import Mesh. Velg modellen som ble generert i trinn 5.1.3.5. Klikk på OK i popup-vinduet Etter åpning behandling .
    2. Hvis du vil hente x-, y- og z-koordinater for hvert prøvepunkt: Velg PickPoints-verktøyet , og høyreklikk deretter med jevne mellomrom over 3D-modelloverflaten. Når alle de ønskede koordinatene er valgt, klikker du på den øverste Lagre-knappen i popup-vinduet Form .
      MERK: Dette eksporterer koordinatene i PP-filformat. Denne filen kan åpnes i regnearkprogramvare.
    3. I regnearkprogramvare: Åpne PP-filen som ble generert i trinn 6.1.2. Juster datavisning ved hjelp av data > tekst til kolonner > med skilletegn. Klikk neste, og velg deretter Space, og klikk på Fullfør.
    4. Formater på nytt slik at bare numeriske verdier blir værende i regnearkcellene ved å velge Hjem > Søk etter og merk > Erstatt. I Søk etter -boksen skriver du inn: y=". La Erstatt med -boksen være tom. Klikk erstatt alle, og klikk deretter OK. Gjenta for x=" og for z=" og for " />. Verdiene er nå klare for trinn 6.2.
  2. Lag 'ili-funksjonstabellen. Denne metoden ble tilpasset fra Referanse16.
    1. Bygg funksjonstabellen i en regnearkprogramvare. Rader tilsvarer hver plassering og kolonner med data.
      MERK: De første kolonnene må være posisjonsnavnet (eksempelnavn), etterfulgt av x-, y- og z-koordinater for prøveplassene som ble oppnådd i trinn 6.1.2 (med kolonneoverskrifter x, y, z). Den femte kolonnen må ha tittelen "radius".
    2. Lim inn de aktuelle metadataene og metabolittfunksjonen i de påfølgende regnearkkolonnene.
    3. I kolonne "radius" angir du ønsket størrelse på prøvetakingsstedene som skal visualiseres på modellen. Bestemme verdiene for radius empirisk: Angi 1 som standard, og vurder deretter om radius eller koordinater må justeres i trinn 6.3. Lagre filen i .csv format (Fil > Lagre som), og velg deretter CSV (kommadelt) (*.csv) på rullegardinmenyen. Gi filen et navn etter ønske. Klikk på Lagre.
  3. Åpne dataene i 'ili (programvare utviklet av16).
    1. Åpne 'ili-nettstedet (ili.embl.de). Velg Overflate. Dra og slipp den opprettede 3D-modellen i nettleservinduet. Dra og slipp den opprettede funksjonstabellen i samme nettleservindu.
    2. Bruk forklaringen nederst til høyre for å projisere ønsket datakolonne på 3D-modellen. Kontroller at flekkene og radiene som er valgt i trinn 6.2.1, samsvarer med prøvetakingsstedene. Juster om nødvendig verdiene i funksjonstabellen, eller velg flere koordinater i MeshLab (se trinn 6.1.2).
      MERK: Visualisering kan også forbedres ved å velge flekker > kantlinjetetthet og sette glidebryteren til maksimal verdi.
    3. Velg hver datakolonne fortløpende for å vurdere fordelingen av denne metabolittfunksjonen på 3D-modellen.
      MERK: Denne tilnærmingen kan også brukes til å visualisere bare spesifikke metabolittiske egenskaper av interesse, for eksempel de med p < 0,05 eller en viss foldendring mellom infiserte og uinfiserte prøver, som bestemt i eksterne statistiske analyseverktøy. Funksjoner for å visualisere kan også velges utenfor 'ili gjennom maskinlæringsmetoder som en tilfeldig skog.
  4. Utfør lineær/logg datavisualisering i henhold til trinnene som er nevnt nedenfor.
    1. Velg Lineær eller Logaritmisk øverst til høyre på siden ved hjelp av kategorien Tilordning øverst til høyre på siden.
    2. Angi samme skala for alle plott hvis du visualiserer flere funksjoner.
      MERK: Nettstedet velger automatisk minimum og maksimum for hver datakolonne som skal vises.
    3. Hvis du vil angi vekten manuelt, fjerner du merket for Auto Min/Max og angir ønsket skalering. Alle data vil nå vises i samme skala.
  5. Endre fargeskalaen for dataene (gråtone, blå-hvit-rød osv.).
    1. Endre fargeskalaen til ønsket fargevalg på Tilordning -menyen ved hjelp av rullegardinmenyen Fargekart . Kontroller at det valgte fargevalget er fargeblindvennlig.
  6. Hvis du vil endre fargen på 3D-modellen eller bakgrunnsfargen, bruker du alternativene Farge og Bakgrunn på 3D-menyen.
  7. Skjul 3D-akser ved å fjerne merket for Vis Opprinnelse-boksen under 3D-menyen .
  8. Lagre bildet ved å skjermbilde, ved hjelp av utklippsverktøyet eller hurtigtasten Crtl + S for Windows eller Linux og Equation 1+ S på OS X.

Representative Results

Antall metabolittfunksjoner som er oppnådd, avhenger av vevstypen som analyseres og databehandlingsparametere. For eksempel har denne protokollen blitt brukt til å analysere den romlige effekten av T. cruzi infeksjon på mage-tarmkanalen metabolome i en musemodell av T. cruzi infeksjon. I tidligere arbeid ble mannlig C3H / HeJ injisert intraperitonealt med 1000 CL + luc T. cruzi parasitter32,6. Dyr ble avlivet 12 eller 89 dager etter infeksjon, og en kjemisk kartografianalyse av 13 sammenhengende segmenter i mage-tarmkanalen ble utført som beskrevet i denne protokollen. Denne analysen førte til en funksjonstabell med 5502 funksjoner, som deretter ble visualisert til 3D ved hjelp av trinnene som er beskrevet i denne protokollen. Denne tilnærmingen muliggjør visualisering av metabolittfunksjoner hos enkelte dyr som er høye på stedet for høy parasittbelastning (kynurenin, figur 2B vs. parasittbelastning, figur 2A), av metabolitter med differensialfordeling på tvers av vevsregioner (glutamin, figur 2C) og metabolittfunksjoner som finnes på sammenlignbare nivåer på tvers av små og store tarmer (LPE 16:0 Figur 2D ). Kynurenine ble valgt ut til visualisering på grunn av sitt kjente forhold til betennelse og tidligere publikasjoner om kynurenin-avledede metabolitters evne til å regulere T. cruzi load33. Tilfeldige skogbaserte maskinlæringsmodeller hadde tidligere avdekket en sammenheng mellom kynureninnivåer og infeksjonsstatus6. Glutamin ble valgt ut til en visualisering basert på tidligere publikasjoner som viste en sammenheng mellom in vitro glutamin tilgjengelighet og T. cruzi narkotika følsomhet34. Differensialfordeling ble bekreftet ved hjelp av logistisk regresjon, p < 0,05. LPE 16:0 ble valgt etter visuell inspeksjon av dataene for å oppdage metabolittfunksjoner som finnes på sammenlignbare nivåer på tvers av vevssteder.

Figure 1
Figur 1: Protokolloversikt. Illustrasjonen ble laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kjemisk kartografianalyse. Mannlige C3H/HeJ-mus ble injisert intraperitonealt med 1000 CL+luc T. cruzi-parasitter32. Dyr ble euthanized 12 eller 89 dager etter infeksjon, og mage-tarmkanalen ble samlet inn og seksjonert systematisk (trinn 1)6. Metabolitter ble hentet ut som i trinn 2 og analysert av LC-MS/MS.3D modellgenerering ble utført ved hjelp av SketchUp-programvaren (trinn 5), og data ble plottet inn i 3D som i trinn 6. (A) Parasittfordeling i en bestemt mus, 12 dager etter infeksjon. (B) Kynurenine metabolitt distribusjon i samme mus, 12 dager etter infeksjon. (C) Gjennomsnittlig glutaminfordeling på tvers av infiserte mus, 89 dager etter infeksjon. (D) Sammenlignbare nivåer av m/z 454.292 oppbevaringstid 2.929 min, kommentert som 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin (LPE 16:0), i samme mus som i A og B i tynntarmen og tykktarmen. Eksempler og data ble generert i6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Å forstå trypanosomatidinfeksjoner er avgjørende for å veilede nye narkotikautviklings- og behandlingsmetoder. Denne kjemiske kartografimetoden er unikt klar til å gi handlingsrettet innsikt i forholdet mellom metabolisme og trypanosomatid sykdomspatogenese, og dermed adressere dette oversettelsesbehovet.

Bare løsemidler av LC-MS-grad anbefales under metabolittutvinning og MS-analyser, for å redusere bakgrunnsforurensning. Polymer forurensning35, ofte avledet fra parafinfilm og/eller annen plast36,37,38, må unngås der det er mulig. Spesielt Parafilm må aldri brukes. Disse aspektene er avgjørende siden LC-MS-datakvaliteten avhenger av materialene som brukes under prøvepreparering og metabolittutvinning. Datakvaliteten bør sikres før du genererer 'ili-plott. I tillegg krever generering av disse omfattende romlige metabolomiske kartene innsamling av alle tilstøtende vevsprøver og metabolittekstraksjon fra alle innsamlede prøver for å unngå hull i disse kartene. Innsamlingsprosedyrer, logistikk av metabolittutvinning og LC-MS-analyse, og kostnadene bør derfor vurderes og planlegges deretter.

Denne protokollen kan endres for å dekke brukernes behov på flere måter. For eksempel vil polariteten og løseligheten av løsningsmidler som brukes under metabolittutvinning påvirke hvilke metabolitter som oppdages39. For å maksimere mangfoldet av oppdagede metabolittfunksjoner for umålte kjemiske kartografianalyser, anbefales det å kombinere flere ekstraksjonstrinn og løsningsmidler. For eksempel bruker denne metoden dichloromethane, metanol og vann som ekstraksjonsløsningsmidler fordi de muliggjør nøyaktig deteksjon av ikke-polære og polare molekyler20,40. Disse løsningsmidlene er imidlertid ikke universelt egnet for hvert MS-eksperiment, og forskere bør velge ekstraksjonsløsningsmidler basert på målene i prosjektet. På samme måte kan forskjellige LC-MS/MS-betingelser brukes, for eksempel å erstatte omvendt fasekromatografi med normal fasekromatografi. Alternative kolonner kan også brukes til omvendt datainnsamling i stedet for C8-kromatografi, men empirisk er C8-kromatografi mer robust mot vevslipider og har en lavere tilstoppingsfrekvens. Konseptuelt kan disse protokollene også brukes på andre massespektrometrimetoder som gasskromatografi-massespektrometri, etc.

En alternativ tilnærming er massespektrometriavbildning. Faktisk, i motsetning til massespektrometriavbildningsmetoder, bevarer flytende kromatografi-massespektrometri ikke iboende romlig informasjon10. Kjemisk kartografi nærmer seg dette gapet ved å inkludere prøvetakingssted på tidspunktet for prosjektdeualisering, i eksempelmetadataene og ved databehandlingstrinn. En styrke av denne kjemiske kartografi tilnærming, i motsetning til masse spektrometri avbildning, er evnen til å gi sikre merknader (Metabolomics Standards Initiative nivå 1 eller nivå 2 merknad tillit41), i motsetning til masse spektrometri bildebehandling der hoveddelen av applikasjoner stole på nøyaktig masse bare for merknad. Massespektrometriavbildning vil muliggjøre finkornet romlig kartlegging, noen ganger ned til encellet nivå, for eksempel 42,43. I motsetning muliggjør kjemiske kartografi tilnærminger storskala kryssorgankartlegging av metabolittfordeling uten å kreve høyt spesialiserte kryoseksjonsevner for hele dyr. Kjemisk kartografi gir komplementære bevis på de mange romlige transkripsjonsmessige tilnærmingene som utvikles, for eksempel 44, med fordelen av å fokusere på 'omics-laget nærmest fenotypen'45. Alternative metoder for parasittbelastnings kvantifisering inkluderer måling av bioluminescens på tidspunktet for prøveinnsamling6. Fine segmenter kan også samles inn for å muliggjøre konfekt- eller elektronmikroskopi for å vurdere lokalisert parasittbyrde og vevsskade. Vannet homogenat, som brukes til cytokin kvantifisering i denne protokollen og tidligere publikasjoner13, kan også brukes til å kvantifisere proteinbaserte markører av vevsskade.

Det er også flere måter å skaffe 3D-modeller som er egnet til å plotte de resulterende LC-MS-dataene. I tillegg til metoden som foreslås her, kan modeller kjøpes forhåndslagd fra forskjellige online leverandører. Sørg for at bruksvilkårene samsvarer med den tiltenkte bruken, spesielt når det gjelder publisering. Modeller for store organer kan genereres de novo ved hjelp av 3D-skannere i henhold til skannerinstruksjoner. Alternativer som MATLAB eksisterer for å generere og visualisere 3D-modeller for kjemisk kartografi46, men de ble først og fremst implementert før utviklingen av 'ili16. MATLAB er en verktøypakke for dataanalyse og programmering som tilbyr et bredt utvalg av applikasjoner på tvers av mange felt. MATLAB er imidlertid verken gratis eller åpen kildekode, og det krever kjennskap til MATLAB-grensesnitt, spesielt med tanke på at MATLAB ikke ble utviklet for behandling av massespektrometridata. Denne foreslåtte metodens alternativer, nemlig SketchUp, Meshlab og 'ili, er fritt tilgjengelige, brukervennlige og tilbyr lignende funksjoner som MATLAB for kjemiske kartografiformål.

Denne metoden er robust når det gjelder prøvepreparering og metabolittutvinning. Feilsøking er oftest nødvendig på LC-MS-datainnsamlingstrinnet. Dette er utenfor omfanget av denne artikkelen. Leserne er rettet mot utmerkede publikasjoner om feilsøking av LC-MS-datainnsamling, inkludert20,47. På samme måte er kompleksiteten i metabolittmerknad utenfor omfanget av denne metodens fokus på 3D-modellgenerering. Nyttige referanser til dette emnet inkluderer24,25,48,49.

Mens denne metoden effektivt utforsker sykdomspatogenese, er det begrensninger i denne tilnærmingen, hvorav noen er vanlige på tvers av ethvert metabolomics-eksperiment. En slik begrensning er den lave merknadsfrekvensen for LC-MS-funksjoner50, som er avhengig av referansespektralbibliotekenes tilgjengelighet og kvalitet. En annen begrensning er at denne protokollen ikke bevarer mRNA på grunn av inkompatibiliteten til RNA bevaring reagenser som RNAlater med LC-MS / MS analyse. Proteinkvaliteten er imidlertid tilstrekkelig for nedstrømsanalyser og kan dermed erstatte mRNA-baserte analyser.

En kjemisk kartografi tilnærming til infeksjonspatogenese gjenspeiler direkte hvordan bakterielle, virale eller parasittiske infeksjoner utvikler seg i organsystemer og forårsaker lokalisert sykdom. Ved å analysere disse regionale delsamplene og generere 3D-modeller formidler til slutt hvordan metabolitter fungerer på tvers av tredimensjonale rom, og kaster lys over disse tidligere ukjente romlige dimensjonene av molekylærbiologi. Ved hjelp av denne protokollen, for eksempel, metabolitt lokalisering ble sammenlignet med Trypanosoma cruzi parasitt belastning. Resultatene avklarte forholdet mellom patogenet og vertsvevet og viste også den metabolske dynamikken i Chagas sykdom symptomprogresjon6. Kjemiske kartografimetoder har også blitt brukt på ulike emner, for eksempel menneskebygd miljøinteraksjon51,52,53, kjemisk sminke av organsystemer som menneskelig hud46 og lunger54, og plantemetabolisme og miljøinteraksjoner55. Fremtidige anvendelser kan innebære å vurdere lokalisert sykdomstoleranse og motstandskraft, eller forholdet mellom lokale metabolittnivåer, patogentropisme og sykdomstropisme i modeller utover trypanosomatidinfeksjon. Denne tilnærmingen bør også ha bred anvendbarhet for å utvide dagens farmakokinetikkprotokoller, for å vurdere forholdet mellom lokale vevsmedisinnivåer og legemiddelmetabolisme vs. generell metabolsk kontekst, vevsskade og patogenclearance. Samlet sett tillater kjemisk kartografi unike undersøkelser av metabolittdistribusjoner i ulike utvalgstyper, med anvendelser som sykdomspatogenese, menneskers helse, menneske-miljøinteraksjoner og mikrobiell dynamikk.

Disclosures

Ingen interessekonflikter å rapportere.

Acknowledgments

Laura-Isobel McCall, PhD, har en undersøker i Pathogenesis of Infectious Disease Award fra Burroughs Wellcome Fund. Forfatterne ønsker videre å anerkjenne støtte fra NIH-tildelingsnummer R21AI148886, et pilotstipend fra Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) under NIH-tildelingsnummer P20GM103648, og oppstartsmidler fra University of Oklahoma (til LIM). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til finansfolkene. Forfatterne ønsker også å takke utviklerne av verktøyene som brukes i denne protokollen. Alle relevante publikasjoner er sitert, der det er aktuelt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tubes NA NA any brand, as available
1 L bottle, pyrex NA NA any brand, as available
1 L graduated cylinder, pyrex NA NA any brand, as available
2 mL SafeLock Eppendorf tubes VWR 20901-540 use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) NA NA as appropriate for system under investigation
5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
96 well plate Fisher 3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
analytical balance NA NA any brand, as available
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
biosafety cabinet NA NA class II, type A2; any brand, as available
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
camera NA NA any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol
chemiluminescent-capable imaging system NA NA any system, as available
cotton balls NA NA any brand, as available
cryogloves VWR 97008-208 replace with any brand, as available
dissection scissors NA NA any brand, as available
dry ice NA NA any brand, as available
extra-length forceps NA NA any brand, as available
flammable-grade refrigerator NA NA any brand, as available
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes NA NA any brand, as available
fume hood NA NA any brand, as available
high-resolution mass spectrometer NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)
ice bucket NA NA any brand, as available
ili software ili.embl.de NA
isoflurane Covetrus 29405
large tupperware NA NA any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball
LC-MS grade acetonitrile Fisher Optima A955-4
LC-MS grade dicholoromethane Fisher Optima D151-4
LC-MS grade formic acid Fisher Optima A11750
LC-MS grade methanol Fisher Optima A456-4
LC-MS grade water Fisher Optima W64
liquid chromatography column Phenomenex 00B-4499-AN may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge Phenomenex AJ0-8784 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid nitrogen NA NA any brand, as available
luciferin Goldbio LUCK-1G
MeshLab software https://www.meshlab.net/ NA
Meshmixer software https://www.meshmixer.com/ NA
MS calibrant NA NA appropriate one for available instrument
MS data processing software NA NA multiple options available; authors recommend MZmine
MSConvert software http://proteowizard.sourceforge.net/ NA
Nanodrop ThermoFisher ND-ONE-W other nanodrop models are also suitable
p1000 pipet tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p1000 pipettor NA NA any brand, as available
p20 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p20 pipettor NA NA any brand, as available
p200 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p200 pipettor NA NA any brand, as available
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) NA NA any brand, as available
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) Quansys biosciences 110949MS can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) Zymo D4069 replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available
real-time thermocycler NA NA any brand, as available
salt shaker or tea infuser NA NA any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin
SketchUp software https://www.sketchup.com/ NA
specimen forceps NA NA any brand, as available
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
spreadsheet software https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel NA can replace with other spreadsheet management software, as applicable
sulfachloropyridazine Sigma S9882-100G
sulfadimethoxine Sigma S7007-10G
Sybr green qPCR reaction mix Fisher A25780 can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
tissue homogenizer NA NA any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982
tissue samples NA NA from appropriate infection model
TissueLyser single-bead dispenser Qiagen 69965
UHPLC NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)
ultra-low temperature freezer (-80) NA NA any brand, as available
ultrasonic bath NA NA any system, as available
wet ice NA NA any brand, as available
zone-free sealing film VWR  490007-390

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCall, L. -I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
  2. McCall, L. -I., Zhang, W. -W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
  3. de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
  4. Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clinical Epidemiology. 6, 257-275 (2014).
  5. Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
  6. Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
  7. Parab, A. R., McCall, L. -I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
  8. Lewis, C. M., McCall, L. -I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
  9. Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
  10. Newsom, S. N., McCall, L. -I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
  11. Wishart, D. S., et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 35, Database issue 521-526 (2007).
  12. Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
  13. McCall, L. -I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
  14. Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
  15. Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
  16. Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
  17. McCall, L. -I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
  18. Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
  19. Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
  20. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
  21. Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
  22. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  25. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  26. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  27. Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
  28. Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  31. FBMN with MZmine. , Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021).
  32. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  33. Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
  34. Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
  35. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  36. Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
  37. Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
  38. Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
  39. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  40. Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
  41. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  42. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  43. Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
  44. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  45. Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
  46. Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
  47. Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
  48. Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
  49. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  50. Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
  51. Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
  52. Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
  53. McCall, L. -I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
  54. Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
  55. Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 179 Kjemisk kartografi metabolittfordeling romlig metabolomikk 3D-modeller flytende kromatografi-tandem massespektrometri trypanosomatider infeksjon tropisme
Kjemisk kartografi tilnærminger for å studere Trypanosomatid infeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dean, D. A., Haffner, J. J.,… More

Dean, D. A., Haffner, J. J., Katemauswa, M., McCall, L. I. Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection. J. Vis. Exp. (179), e63255, doi:10.3791/63255 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter