Summary
Bu protokol, örnek toplama, metabolit ekstraksiyonu, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi veri toplama, 3D model oluşturma ve son olarak veri görselleştirme dahil olmak üzere trypanosomatid enfeksiyonu sırasında metabolit dağılımının 3D modelini oluşturma adımlarını açıklar.
Abstract
Patojen tromizmi ve hastalık tromizmi, patojenler tarafından seçici olarak kolonize edilen veya hasar gören doku konumlarını ifade eder ve lokalize hastalık semptomlarına yol açmaktadır. İnsan-enfektif tripozomatid parazitleri Arasında Chagas hastalığının etken maddesi olan Trypanosoma cruzi ; Uyku hastalığının etken maddesi olan tripanosoma brucei ; ve Leishmania türleri, leishmaniasis'in etken ajanları. Ortaklaşa, dünya çapında 20 milyon insanı etkiliyorlar. Bu parazitler spesifik tropizm gösterir: kalp, yemek borusu, T. cruzi için kolon, yağ dokusu, pankreas, cilt, dolaşım sistemi ve T. brucei için merkezi sinir sistemi, dermotropik Leishmania suşları için cilt ve visserotropik Leishmania suşları için karaciğer, dalak ve kemik iliği. Bu nedenle tripozosatomatid hastalığı patogenezini anlamak için mekansal bir bakış açısı gereklidir. Kimyasal kartografi, mikrobiyolojik ve immünolojik parametrelere kıyasla sıvı kromatografi-kütle spektrometresi yoluyla üretilen küçük molekül bolluğunun 3D görselleştirmelerini oluşturur. Bu protokol, sistematik doku örnekleme ve metabolit ekstraksiyonundan başlayarak, sistematik doku örneklemesi ve metabolit ekstraksiyonundan başlayarak, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi veri toplama ve metabolit dağılımının 3D haritalarının üretilmesiyle sonuçlanan tripozomatid enfeksiyonu sırasında patojenik süreçleri incelemek için kimyasal kartografinin nasıl uygulanabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, T. cruzi, T. brucei veya Leishmania tarafından doku kolonizasyonu için besin gereksinimleri, enfeksiyon bölgelerinde immünomabolizm ve lokal doku metabolik pertürbasyon ve klinik hastalık semptomları arasındaki ilişki gibi birden fazla araştırma sorusu için kullanılabilir ve tripozomatid hastalığı patogenezine kapsamlı bir şekilde dair kapsamlı bir içgörüye yol açar.
Introduction
Tripozosmatid parazitleri Leishmania türleri, Afrika tripanozomları (Trypanosoma brucei) ve Amerikan tripanozomlarından (Trypanosoma cruzi) oluşur. Leishmania protozoa, kendi kendini iyileştiren ve kendini sınırlayan lokalize kutanöz leishmaniasis, ağız, burun ve boğazın mukozal dokularının zarar gördüğü mukokütanöz leishmaniasis ve ateş ve hepatosplenomegaly'ye neden olan visseral organlarda parazit tromizmi ile visseral leishmaniasis içeren leishmaniasis'e neden olur1,2. T. brucei, çoğunlukla Afrika ülkelerinde bildirilen uyku hastalığı olarak da bilinen İnsan Afrika tripanosomiasisine (HAT) neden olur3. Klinik belirti ve semptomlar hepatatosplenomegali, ateş, baş ağrısı, kas-iskelet sistemi ağrıları, lenfadenopatiler ve parazitlerin kan dolaşımına ve lenfatiklere lokalize olduğu hemo-lenfatik evrede anemiyi içerir. Bunu, parazitlerin merkezi sinir sistemine lokalize olduğu ve uyku bozukluğuna, davranış değişikliğine ve sonunda ölümcül komaya neden olduğu meningo-ensefalitik aşama takip eder4. T. cruzi, Amerika'da endemik olan Chagas hastalığına neden olur. Enfekte bireyler, genellikle asemptomatik, geniş parazit tromizmi ile ilk akut aşamayı yaşarlar. Enfekte bireylerin yaklaşık% 10-30'u, megaofagus, megakolon ve kardiyovasküler komplikasyonlarla karakterize edilen onlarca yıllık enfeksiyondan sonra kronik evre semptomları yaşar5,6.
Metabolomik, birincil veya ikincil metabolizmadan biyolojik bileşikler ve ilaçlar veya gıda kaynaklı moleküller gibi dışarıdan türetilmiş bileşikler de dahil olmak üzere küçük moleküler türleri (50-1.500 Da) inceler. Konak-patojen etkileşimleri bağlamında, metabolomik, patojenin konak üzerindeki etkisine erişimde çok önemli olan enfeksiyonun konak metabolit ortamları üzerindeki etkisini araştırabilir. Ayrıca konak beslenme ve immünolojik ortama patojen adaptasyonlarını değerlendirebilir7,8,9. Kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi metabolitleri tanımlamak, ölçmek ve karakterize etmek için kullanılan yaygın metabolomik araçlardır. Bu "omiks" yaklaşımı biyobelirteç keşfi ve ilaç geliştirme10,11 için de uygulanabilir.
Tripozomatid parazitlerin spesifik doku trompisi göz önüne alındığında, mekansal metabolomik analizler neden oldukları hastalıkların patogenezine dair önemli bir içgörü sağlayabilir. Metabolitlerin mekansal dağılımının haritalandırılması, fare kalp dokusunda kronik Tripanosoma cruzi enfeksiyonundan ve fare gastrointestinal sisteminde akut ve uzun süreli Tripanosoma cruzi enfeksiyonundan lokal olarak etkilenen metabolitleri ortaya çıkardı6,12,13. Özellikle, 3D kimyasal kartografi, kronik olarak Tripanosoma cruzi enfekte farelerin kalp dokusunda parazit kalıcılığı ve metabolik değişiklikler arasında bir kopukluk olduğunu göstermiştir. Metabolizma en çok kalbin alt ve apikal segmentlerinde, Chagas hastalığı semptomları (kardiyak apikal anevrizmalar) ile eşleşerek pertüre edildi. Belirli kardiyak bölgelerde enfeksiyondan etkilenen ve hastalık şiddeti ile ilişkili metabolit aileler arasında acylcarnitines ve gliserofosfokolinler12,13,14 sayıldı. Gastrointestinal sistemde, kalıcı metabolik değişiklikler Chagas hastalığı semptomlarının yerleriyle aynı anda gelir: yemek borusu ve kolon. Buna karşılık, metabolizma ince bağırsak gibi Chagas hastalığı semptomlarıyla ilişkili olmayan yerlerde yeniden normalleştirilir. Gastrointestinal sistemde enfeksiyon nedeniyle lokal olarak rahatsız edilen metabolitler arasında acylcarnitines, gliserofosfokolinler, kynurenine, triptofan ve korlik asit bulunur. Ek olarak, bu analizler Chagas hastalığına karşı yeni bir metabolik tolerans mekanizmasının tanımlanmasını sağladı6. Bu yöntemlerin cutaneöz leishmaniasis çalışmasına uygulanması, lezyon bölgesinde önemli metabolik pertürbasyonlar, aynı zamanda lezyona bitişik, makroskopik olarak sağlıklı dokuda spesifik metabolik değişiklikler ortaya koydu. Örneğin, lezyon bölgesinde glutamin tükenirken, m/z'deki glisefosfosfokolinler (kütle-yük oranı) 200-299, 400-499, 500-599 ve 600-699 lezyon bölgesinde önemli ölçüde artmıştır. PC (O-34:1) sadece lezyona bitişik sitelerde arttırıldı15.
Bu makalenin amacı, tripozomatiid parazit enfeksiyonu modellerine uygulandığı gibi metabolit dağılımının 3D modellerini ("kimyasal kartografi") oluşturmak için gerekli adımları göstermektir (Şekil 1). Bu yaklaşım, metabolomics ve metabolomics veri işleme bağlamında birkaç kritik ilerlemeye, özellikle de metabolomics verilerini kolayca 3D modellere çizmek için 'ili yazılımının geliştirilmesine' dayanmaktadır16.
Protocol
Açıklanan tüm hayvan deneyleri Oklahoma Üniversitesi veya Kaliforniya Üniversitesi San Diego Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Enfeksiyöz malzemeyi işleyen tüm adımlar bir biyogüvenlik kabini içinde (sınıf II, tip A2) ve yerel yönetmeliklere göre gerçekleştirildi.
1. Doku toplama
- Uygun tripozosomatid enfeksiyon hayvan modellerini, genellikle fareleri veya hamsterları enfekte edin.
NOT: Üretilen istenen semptomlara, hastalığın ilerleme hızına, hastalık şiddetine vb. Kullanıcılar kendi rahatlıklarında seçim yapabilirler.- Cutaneous leishmaniasis enfeksiyon modelleri için, ayak altlığında veya kulakta intradermally olarak enfekte15.
- Viseral leishmaniasis enfeksiyon modelleri için intravenöz olarak enfekte edin1,17.
- Chagas hastalığı ve uyku hastalığı enfeksiyon modelleri için intraperitoneally enfekte6,12,18,19. Parazit suşuna ve planlanan zaman noktalarına göre kullanılacak parazit dozunu belirleyin.
- Bölümleme pozisyonlarını planlayın.
- Bölüm başına en az 10 mg doku içeren bölümler oluşturmayı planlayın. 30-50 mg kullanmak en iyisidir.
- Chagas hastalığı enfeksiyon modelleri için, kardiyak ve gastrointestinal segmentleri sistematik olarak toplamayı planlayın.
- Cutanenöz leishmaniasis enfeksiyon modelleri için lezyonel doku ve lezyona bitişik örnekleri toplayın.
- Viseral leishmaniasis enfeksiyon modelleri için dalak ve birden fazla karaciğer lobu toplamayı planlayın. Yağ dokusu gibi ek doku bölgelerinin toplanması da ilgi çekici olabilir.
DİkKAT: Enfekte hayvanlardan alınan numuneler uygun, kurumsal olarak onaylanmış biyogüvenlik protokolü kapsamında ele alınmalıdır. Bu genellikle kişisel koruyucu ekipman (KKD) gereksinimlerini ve sadece tüplerin açılmasını ve biyogüvenlik kabini içinde numunelerin toplanacağını (sınıf II, tip A2) içerecektir.
- Homojenizasyon için etiket ve tartım tüpleri.
- Mevcut homojenizasyon sistemine uygun tüp tipini kullanın. Bir TissueLyser için 2 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanın.
- Kurumsal IACUC tarafından onaylandığı gibi veya IACUC onaylı protokole göre isoflurane aşırı doz kullanarak istenen enfeksiyon zaman noktalarında fareleri ötenazi.
- Bölüm dokusu sistematik olarak planlandığı gibi, tüp başına bir bölüm ile.
- Numune toplama ekipmanlarını ekstraksiyon çözücülü numuneler arasında yıkamayı unutmayın (bu protokolde% 50 metanol).
- Tüp kapağını açık tutun, dondurma örneklerini sıvı nitrojene hemen tutturun.
DİkKAT: Tüpe giren herhangi bir sıvı azot, azot genişledikçe tüplerin patlamasını önlemek için tamamen buharlaşana kadar tüpleri kapatmayın. Cildin sıvı nitrojenle temas etmediğine emin olmak için yeterli adımları atın (tüpleri tutmak için kriyo eldivenleri ve tokmaklar kullanın). Güvenlik yüz siperliği takın. - İstenilen tüm numuneler toplanana kadar tüpleri kuru buz üzerinde saklayın.
- Duraklatma noktası: numuneleri ekstraksiyon yapmaya hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
- Doku numune ağırlığını belirlemek için tüpleri tartın. Elektronik tabloya kaydetme.
- Tartım işlemi sırasında numuneleri donmuş tutun: tüpleri kuru buzda tutun, hızla tartın, hemen kuru buza geri koyun. Tartım yaparken numunelerin çözülmesine izin vermeyin.
2. Metabolit ekstraksiyonu
NOT: Boyunca sadece LC-MS sınıfı sıvılar ve reaktifler kullanılmalıdır. Bu yöntem Reference20'den uyarlanmıştır.
- Özel cam eşyalar kullanarak 1 L cam şişelerde tüm ekstraksiyon çözücülerini (LC-MS sınıfı H2O, LC-MS sınıfı metanol, 4 μM sülfalorpirilazin, LC-MS sınıfı diklorometan ile çivilenmiş) hazırlayın.
NOT: Hazırlanacak hacim numune ağırlıklarına göre hesaplanmalıdır, 50 mg numune başına 500 μL su, 50 mg numune başına 4 μM sülfalorpiridazin ve 1.000 μL önsezili dikloromethane ile çivilenmiş 500 μL metanol: metanol, 50 mg numune başına 2 μM sülfalorpyridazine ile çivilenmiştir, pipetleme yanlışlığına izin vermek için hesaplanan hacmi % 10 artırmak. Ekstraksiyon çözücüsüyü en az bir gecede 4 °C'de saklayın. - Aşağıda belirtilen adımlara göre doku örneklerinin su bazlı homojenizasyonunu gerçekleştirin.
- Boncuk dağıtıcısı kullanarak doku örnekleri içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerinin her birine bir adet 5 mm paslanmaz çelik boncuk ekleyin ( bkz. Malzeme Tablosu). Tüpleri buzda tut.
- Tüm adımlardan geçecek ve bir ekstraksiyon boş olarak hizmet edecek LC-MS sınıfı H2O içeren bir boş tüp yapın. Numune ekstraksiyonlarından ortalama H2O hacmini kullanın. Donmuş doku örneklerine soğutulmuş LC-MS sınıfı H2O ekleyin.
- Adım 1.7'de hesaplanan numune ağırlıklarını kullanarak 500 μL su / 50 mg numune ekleyerek doku ağırlığına su hacmini normalleştirin.
DİkKAT: Biyolojik tehlike numunelerinin işlenmesi durumunda, uygun, kurumsal olarak onaylanmış biyogüvenlik protokolünü takip etmeye devam edin. Bu genellikle kişisel koruyucu ekipman (KKD) ve sadece biyogüvenlik kabininin içindeki (sınıf II, tip A2) tüpleri açma gereksinimlerini içerecektir.
- Adım 1.7'de hesaplanan numune ağırlıklarını kullanarak 500 μL su / 50 mg numune ekleyerek doku ağırlığına su hacmini normalleştirin.
- Örnekleri bir doku homojenizatör kullanarak 3 dakika boyunca 25 Hz hızında homojenize edin (bkz. Malzeme Tablosu).
- İşleme sırasında reaktiflerin dökülmesini önlemek için tüpleri sıkıca kapatın.
- DNA ekstraksiyonu, qPCR, protein bazlı analizler veya diğer analizler için homojenizasyon hacminin yaklaşık 1/10'u toplayın (istenirse). DNA ekstraksiyon deneyleri farklı bir günde yapılacaksa, -80 °C'de 6 aya kadar bir mikrosantrifüj tüpünde veya 96 kuyu plakasında (toplanan hacme bağlı olarak) saklayın. Daha uzun depolama süreleri mümkün olabilir, ancak test edilmiş olmayabilir.
- Referans13'te açıklandığı gibi dokulardan memeli DNA ekstraksiyonu için herhangi bir standart ticari kit kullanarak DNA ekstraksiyonları gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). DNA verimini ölçün ve çıkarılan DNA'yı -20 °C'de saklayın. qPCR için kabul edilebilir DNA miktarı ve kalitesi 3 yıl sonrasına kadar bile gözlenmiştir.
NOT: Bu adım metabolit ekstraksiyonundan sonraki bir günde dondurulmuş homojenat üzerinde gerçekleştirilebilir. - 180 ng ayıklanmış DNA kullanarak Referans13'te açıklandığı gibi qPCR gerçekleştirin.
NOT: Bu, önceki gün toplanan ve -20 °C'de dondurulan DNA üzerinde yapılabilir.- T. cruzi enfeksiyonu ile ilgili çalışmalarda, aşağıdaki astarları kullanın: parazit seviyelerini ölçmek için ASTCGGCTGATCGTTTTCGA ve AATTCCTCCAAGCAGCGGATA21 ve DNA seviyelerine ev sahipliği yapmak için normalleştirmek için aşağıdaki astarlar: TCCCTCATCAGTTTATGGCCCA ve CAGCAAGCATCTATGCACTACCCC22 (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Önerilen qPCR döngüleri aşağıdaki gibidir: 10 dakika boyunca 95 °C'de denature; 30 s için 95 °C'de 40 döngü ve ardından 60 s için 58 °C ve son olarak 60 s için 72 °C döngü gerçekleştirin. Mevcut termosikleyici için uygun şekilde erime eğrisi analizi yapın. Örnekleme bölgeleri arasında göreli parazit yükü elde etmek için ΔΔCt method23'ü kullanarak verileri işleyin. Mutlak niceleme, örnek türetilmiş ΔΔCt değerlerinin bilinen parazit miktarlarından oluşturulan, enfekte olmayan doku örneklerine çivilenen ve 2.2 ila 2.2.4.1 adımlarında olduğu gibi çıkarılan standart bir eğri ile karşılaştırılarak elde edilebilir.
- T. cruzi enfeksiyonu ile ilgili çalışmalarda, aşağıdaki astarları kullanın: parazit seviyelerini ölçmek için ASTCGGCTGATCGTTTTCGA ve AATTCCTCCAAGCAGCGGATA21 ve DNA seviyelerine ev sahipliği yapmak için normalleştirmek için aşağıdaki astarlar: TCCCTCATCAGTTTATGGCCCA ve CAGCAAGCATCTATGCACTACCCC22 (bkz. Malzeme Tablosu).
- Depolanan homojenasyonda Reference13'te açıklandığı gibi çok katlı sitokin kitleri veya standart ticari ELISA kitleri (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak bağışıklık yanıtlarının protein bazlı karakterizasyonunu gerçekleştirin.
- Referans13'te açıklandığı gibi dokulardan memeli DNA ekstraksiyonu için herhangi bir standart ticari kit kullanarak DNA ekstraksiyonları gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). DNA verimini ölçün ve çıkarılan DNA'yı -20 °C'de saklayın. qPCR için kabul edilebilir DNA miktarı ve kalitesi 3 yıl sonrasına kadar bile gözlenmiştir.
- Metabolit ekstraksiyonu için homojenizasyon hacminin 500 μL'lik kısmının en az yarısını kaydedin.
- Sulu metabolit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
NOT: Solvent seçimi, ilgi çekici metabolitlerin kimyasal özelliklerine göre uyarlanabilir.- Suda 2 μM sülfalorpiridazin ile% 50 metanol nihai konsantrasyonu elde etmek için homojenat içine 4 μM sülfalorpirilazin çivilenmiş buz gibi LC-MS sınıfı metanol ekleyin.
DİkKAT: Metanol yanıcı ve tehlikelidir. Duman kaputunun veya biyogüvenlik kabininin içinde kullanım dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürlerini kullanın. - Örnekleri 3 dakika boyunca 25 Hz hızında bir doku homojenizatörinde homojenize edin. 10 dakika boyunca 4 °C'de 16.000 x g'da santrifüj örnekleri.
- 96 kuyu plakasına eşit miktarda süpernatant toplayın. Tüm numunelerde birleştirilen en küçük metanol + su hacmine uyacak hacmi seçin. Bu sulu bir kesir.
- Kalan sulu homojen süpernatantı yedek olarak -80 °C'de bir kenara koyun.
- Süpernatantları toplarken katı kalıntıyı buzda tutun.
- Sulu ekstraksiyon süpernatant kuruyana kadar kurutun (~ 3 saat veya gece). Maksimum hız kullanın ve ısıtma yok.
- Kurutulmuş 96 kuyu plakasını -80 °C'de dondurun.
- Suda 2 μM sülfalorpiridazin ile% 50 metanol nihai konsantrasyonu elde etmek için homojenat içine 4 μM sülfalorpirilazin çivilenmiş buz gibi LC-MS sınıfı metanol ekleyin.
- Organik metabolit ekstraksiyonu gerçekleştirin.
NOT: Solvent seçimi, ilgi çekici metabolitlerin kimyasal özelliklerine göre uyarlanabilir.- Ön-önsezili diklorometan örneğinin 50 mg'ı başına 1.000 μL ekleyin: metanol, 2.3.4 adımından katı kalıntıya 2 μM sülfalorpiridin ile çivilenmiştir.
DİkKAT: Çözücüleri işlerken, iyi bir debiye sahip bir duman davlumbazın içinde kullanım da dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürlerini kullanın. - Örnekleri 5 dakika boyunca 25 Hz hızında bir doku homojenizatörinde homojenize edin. Numuneleri 16.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin.
- 96 kuyu plakasına eşit miktarda süpernatant toplayın. En küçük dikloromethane hacmine uyacak hacmi seçin: tüm örneklerde metanol. Bu organik fraksiyon.
- Peleti yedek olarak -80 °C'de saklayın. Kalan organik özü yedek olarak -80 °C'de saklayın. Organik özü bir gecede duman kaputunda havayla kurulayın.
- Kurutulmuş 96 kuyu plakasını -80 °C'de dondurun.
- Ön-önsezili diklorometan örneğinin 50 mg'ı başına 1.000 μL ekleyin: metanol, 2.3.4 adımından katı kalıntıya 2 μM sülfalorpiridin ile çivilenmiştir.
3. LC-MS veri toplama
- Sulu ve organik özleri% 50 metanol + 2 μM sülfadimethoxine'in her biri 60 μL'ye yeniden atın ve birleştirin. 10 dakika için sonicate; ardından, 10 dakika santrifüj ve süpernatantı temiz bir 96 kuyu plakasına aktarın. Bölge içermeyen plaka contası ile kapatın ve plakayı bir LC otomatik örnekleyiciye yerleştirin.
DİkKAT: Çözücüleri işlerken, iyi bir debiye sahip bir duman davlumbazın içinde kullanım da dahil olmak üzere uygun güvenlik prosedürlerini kullanın. - Uygun mobil aşamaları LC sistemine bağlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Pozitif mod ters fazlı LC için yazarlar, mobil faz A ve LC-MS sınıfı asetonitril olarak LC-MS sınıfı H2O + %0,1 formik asit + 0,5 mL/dk debi ve 7,5 dk LC gradyanı ile mobil faz B olarak %0,1 formik asit önermektedir. Önerilen degrade adımları Referans6'da yayınlandı: 0-1 dk, %2 B; 1-2.5 dk, doğrusal artış% 98 B; 2.5-4.5 dk, %98 B'de tutun; 4.5-5.5 dk, doğrusal düşüş% 2 B; 5.5-7.5 dk, %2 B'de tutun. - Cihazın temiz olduğundan emin olun. MS'i hem pozitif hem de negatif modda kalibre edin.
- MS performans değerlendirmesini cihaz için uygun şekilde gerçekleştirin.
- MS çalışma sırası oluşturun.
- 2 μL enjeksiyon hacminden başlayarak ve adım adım 30 μL enjeksiyon hacmine yükselterek bir seyreltme serisinde 2 boşluk, 2 standart (6 karışım) ve 5 havuzalanmış kalite kontrolü (QC) ile başlayın.
- Örnek sırasını rastgele hale getirmek.
- Her 12 örnekte bir boşluk ve sonra havuza alınan bir QC çalıştırın.
- C8 LC sütununu (1,7 μm partikül boyutu, 100 şgözenek boyutu, 50 x 2,1 mm uzunluk x iç çap) bağlayın ve sızıntılar ve aşırı geri basınç için izleyin. Cihaz standart işletim prosedürüne göre sorunları düzeltin.
- MS çalıştırma sırasını başlatın ve veriye bağımlı LC-MS/MS verilerini toplayın.
NOT: Q-Exactive Plus MS cihazı için, pozitif modda Isıtmalı Elektrospray İyonizasyonu ve veriye bağımlı MS2 alımı (ilk 5) kullanın, MS1 için 70.000 ve MS2 için 17.500 çözünürlük, MS1 için 1E6 ve MS2 için 2E5 AGC Hedefi, hem MS1 hem de MS2 için en fazla 100 MS, MS1 için 100-1500 m/z tarama aralığı, ve MS2 yalıtım penceresi 1 m/z. Kılıf gazını 35'e, aux gazını 10'a ve süpürme gazını 0'a, püskürtme voltajını 3,8 kV'a, kılcal sıcaklığı 320 °C'ye, S-lens RF seviyesini 50'ye ve aux gazı sıcaklığını 350 °C'ye ayarlayın.- Veri kalitesini doğrulayın: ilk boşlukları kontrol edin (ana zirvelerin eksikliğini onaylayın), standartları (beklenen zirvelerin ve simetrik tepe şeklinin varlığını onaylayın) ve QC'ler (beklenen zirvelerin, tepe şeklinin ve beklenen tepe yoğunluğunun varlığını onaylayın).
- Çalışma sırası sırasında MS çalıştırmasını düzenli olarak izleyin.
- Çalıştırma tamamlandıktan sonra, kaçırılan eklemeler veya diğer hatalar için verileri kontrol edin.
- LC sütununu üreticinin önerdiği şekilde saklayın. Numuneleri -80 °C'de çıkarın ve saklayın.
- Ham verileri veri deposuna yükleyin.
NOT: MassIVE (massive.ucsd.edu), metabolit ek açıklamaları için moleküler ağa aşağı akış bağlantısını etkinleştirmek için önerilir24,25.
4. LC-MS veri işleme
- MSConvert26 kullanarak ham dosyaları açık biçime (.mzXML veya .mzML) dönüştürün.
- Ham verileri ve mzXML veya mzML verilerini veri deposuna yükleyin.
- Özellik tablosu oluşturun. Bunu yapmak için birden fazla araç vardır (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS, vb.27,28,29,30).
NOT: MZmine, ücretsiz, açık kaynaklı olduğu ve MSconvert'den sonra mzXML dosyalarını doğrudan içe aktarabildiği, verileri işlemek ve parametre seçiminin etkisini izlemek için grafik kullanıcı arabirimi seçeneklerine sahip olduğu ve moleküler ağ için doğrudan GNPS'ye dışa aktarabildiği için önerilir24.
NOT: Araç belgelerini izleyin ve mevcut cihaza uygun parametreleri kullanın. Ek ayrıntıları Reference31'de de bulabilirsiniz.- Özellik tablosunu .csv biçimde dışa aktar.
5.3D model üretimi
- Aşağıda belirtilen adımlara göre ölçeklemek için 3D model de novo'yu elle çizin.
- İlgi çekici organın fotoğrafını çek.
- SketchUp yazılımında aşağıdakileri gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) aşağıda belirtildiği gibi.
- Yazılım açıldığında görünen bir adamın varsayılan resmini silin.
- İlgi çekici organların resmini içe aktarmak için Dosya > İçe Aktar'a tıklayın.
- Çizgiler aracına tıklayın ve Serbest seçeneğini belirleyin. İlgi çekici organların ana hatlarını izlemek ve çizmek için kalem aracını kullanın. Başlangıç noktasına kadar çizerek çizgiyi kapattığından emin olun. Çizgi başarıyla kapatıldıktan sonra, çizilen alan otomatik olarak gölgeli görünecektir.
- İtme/Çekme aracını seçin ve çizimi 2D'den 3D'ye dönüştürmek için gölgeli alana çekin.
- Organ resmini silme: Silgi düğmesini seçin ve resmi sağ tıklatıp Sil'i seçin.
- Dosyayı .dae biçiminde dışa aktarma: Dosya > > 3B Modeli Dışa Aktar.
- Aşağıda belirtilen adımlara göre modelin gerçekçiliğini artırın.
- Modeli MeshLab yazılımına içe aktarın (bkz. Malzeme Tablosu): MeshLab'ı açın ve Mesh'i İçe Aktar > Dosya'yı seçin. Önceki adımda oluşturulan .dae modelini seçin. Ön Açma Seçenekleri menüsü açılır. Tamam'ı seçin.
- Üst menüden Wireframe'i seçin. Ardından şunları seçin: Remeshing, Basitleştirme ve Rekonstrüksiyon > Filtreler > Alt Bölüm yüzeyleri: Orta Nokta. Tüm değerleri varsayılan olarak bırakın ve uygula'yı iki kez seçin. İnce ızgaralı olduğundan emin olmak için modelin tel kafes görünümünü görsel olarak inceleyin. Açılır menüyü kapatın.
- Modeli .stl biçiminde dışa aktarma: Dosya > Mesh'i Farklı Dışa Aktar ve sonra Dosya Türü açılan menüsünde STL Dosya Biçimi'ni (*.stl) seçin. Kaydet'e tıklayın. Sonraki açılır menüde Tamam'ı seçin.
- Meshmixer yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu). İçeri Aktar (+) düğmesine tıklayın. Önceki adımda oluşturulan .stl dosyasını seçin. Modelin yuvarlanması gereken yüzeylerini çıkarmak için Fırçaları Sürükle ve Şekillendir > Fırçaları > Şişirme araçlarını > Heykel > Fırçaları kullanın.
- Model istenen görünüme sahip olduktan sonra,.stl biçiminde kaydedin: Dosya > Dışa Aktar. Dosyayı istediğiniz gibi adlandırın ve Kayıt türü açılan menüsünde STL İkili Biçimi'ni (*.stl) seçin. Kaydet'e tıklayın. Bir açılır menü görüntülenirse , Devam'ı tıklatın.
6. 'ili arsa üretimi
- Örnekleme alanlarına karşılık gelen 3B modeldeki konumlar için koordinatlar alın.
- MeshLab yazılımında 5.1.3.5 adımından 3B modeli açın: Mesh'i İçe aktarma > dosya. 5.1.3.5 adımında oluşturulan modeli seçin. Açık İşlem Sonrası açılır penceresinde Tamam'ı tıklatın.
- Her örnekleme noktası için x, y ve z koordinatları elde etmek için: PickPoints aracını seçin ve ardından 3B model yüzeyinde düzenli aralıklarla sağ tıklatın. İstenen tüm koordinatlar seçildikten sonra, Form açılır penceresinde en çok Kaydet düğmesine tıklayın.
NOT: Bu koordinatları .pp dosya biçiminde dışa aktaracaktır. Bu dosya elektronik tablo yazılımında açılabilir. - Elektronik tablo yazılımında: 6.1.2 adımında oluşturulan .pp dosyasını açın. Veri > Metni Sütunlara > Sınırlandırılmış'ı kullanarak veri görüntüsünü ayarlayın. İleri'ye tıklayın ve boşluk'u seçin ve Son'a tıklayın.
- Giriş > Bul ve Seç > Değiştir'i seçerek elektronik tablo hücrelerinde yalnızca sayısal değerlerin kalması için yeniden biçimlendir. Neyi bul kutusuna şu girişi girin: y=". Değiştir kutusunu boş bırakın. Tümünü Değiştir'e ve ardından Tamam'a tıklayın. x=" ve z=" ve " /> için yineleyin. Değerler artık 6.2 adımı için hazır.
- 'ili özellik tablosunu yapın. Bu yöntem Reference16'dan uyarlanmıştır.
- Elektronik tablo yazılımında özellik tablosunu oluşturun. Satırlar her konuma karşılık gelir ve sütunlar verilere karşılık gelir.
NOT: İlk sütunlar konum adı (örnek adı), ardından 6.1.2 adımında elde edilen örnekleme noktalarının x, y ve z koordinatları olmalıdır (sütun başlıkları x, y, z ile). Beşinci sütun "radius" olarak adlanmalıdır. - Uygun meta verileri yapıştırın ve sonraki elektronik tablo sütunlarına metabolit özelliği bolluğunu yapıştırın.
- "Radius" sütununa, modelde görselleştirilecek örnekleme noktalarının istenen boyutunu girin. Yarıçap değerlerini ampirik olarak belirleyin: varsayılan olarak 1 girin ve ardından 6.3 adımında yarıçapın veya koordinatların ayarlanması gerekip gerekmediğini değerlendirin. Dosyayı .csv biçimde kaydedin (Dosya > Farklı Kaydet) ve açılan menüden CSV (Virgülle ayrılmış) (*.csv) seçeneğini belirleyin. Dosyayı istediğiniz gibi adlandırın. Kaydet'e tıklayın.
- Elektronik tablo yazılımında özellik tablosunu oluşturun. Satırlar her konuma karşılık gelir ve sütunlar verilere karşılık gelir.
- Verileri 'ili 'de açın (yazılım tarafından geliştirilmiştir16).
- 'ili web sitesini (ili.embl.de) açın. Yüzey'i seçin. Oluşturulan 3B modeli tarayıcı penceresine sürükleyip bırakın. Oluşturulan özellik tablosunu sürükleyip aynı tarayıcı penceresine bırakın.
- İstenen veri sütununu 3B modele yansıtmak için sağ alt köşedeki göstergeyi kullanın. 6.2.1 adımında seçilen noktaların ve yarıçapların örnekleme alanlarında eşleştiklerine emin olun. Gerekirse, özellik tablosundaki değerleri ayarlayın veya MeshLab'da ek koordinatlar seçin (bkz. adım 6.1.2).
NOT: Kenarlık Opaklığı > Noktalar seçilerek ve kaydırıcı maksimum değerine ayarlanarak görselleştirme de geliştirilebilir. - Bu metabolit özelliğinin 3B modeldeki dağılımını değerlendirmek için her veri sütununu ardışık olarak seçin.
NOT: Bu yaklaşım, dış istatistiksel analiz araçlarında belirlendiği gibi, örneğin p < 0.05 veya enfekte ve enfekte olmayan numuneler arasında belirli bir kat değişimi olanlar gibi yalnızca belirli metabolit özelliklerini görselleştirmek için de kullanılabilir. Görselleştirilecek özellikler, rastgele bir orman gibi makine öğrenimi yaklaşımları aracılığıyla 'ili' dışında da seçilebilir.
- Aşağıda belirtilen adımlara göre doğrusal/günlük veri görselleştirmesi gerçekleştirin.
- Sayfanın sağ üst kısmındaki Eşleme sekmesini kullanarak Ölçek açılır menüsünde Doğrusal veya Logaritmik'i seçin.
- Birden çok özelliği görselleştiriyorsanız, tüm çizimler için aynı ölçeği ayarlayın.
NOT: Web sitesi, her veri sütununun görüntülenmesi için en düşük ve maksimum değeri otomatik olarak seçer. - Ölçeği el ile ayarlamak için Otomatik Min/Max seçeneğinin seçimini kaldırın ve istediğiniz ölçeklendirmeyi girin. Tüm veriler artık aynı ölçekte görüntülenecektir.
- Verilerin renk ölçeğini değiştirin (gri tonlamalı, mavi-beyaz-kırmızı vb.).
- Renk Eşlem açılır menüsünü kullanarak renk ölçeğini Eşleme menüsünde istediğiniz renk düzenine değiştirin. Seçili renk düzeninin renk körü dostu olduğundan emin olun.
- 3B modelin rengini veya arka plan rengini değiştirmek için 3B menünün altındaki Renk ve Arka Plan seçeneklerini kullanın.
- 3D menünün altındaki Menşei Göster kutusunun seçimini kaldırarak 3D eksenleri gizleyin.
- Ekran görüntüsü alarak, ekran alıntısı aracını veya Windows veya Linux için Crtl + S kısayol tuşunu ve
OS X'te + S tuşlarını kullanarak görüntüyü kaydedin.
OS X'te + S tuşlarını kullanarak görüntüyü kaydedin.Representative Results
Elde edilen metabolit özelliklerinin sayısı analiz edilen doku tipine ve veri işleme parametrelerine bağlıdır. Örneğin, bu protokol T. cruzi enfeksiyonunun gastrointestinal sistem metabolom üzerindeki mekansal etkisini T. cruzi enfeksiyonunun fare modelinde analiz etmek için kullanılmıştır. Daha önceki çalışmalarda erkek C3H/HeJ intraperitoneally olarak 1.000 CL + luc T. cruzi parazitleri ile enjekte edildi32,6. Hayvanlar enfeksiyondan 12 veya 89 gün sonra ötenaziye tabi tedavasyona tabi tedavasyon edildi ve bu protokolde açıklandığı gibi gastrointestinal sistemin 13 bitişik segmentinin kimyasal kartografi analizi yapıldı. Bu analiz, daha sonra bu protokolde açıklanan adımlar kullanılarak 3D olarak görselleştirilen 5.502 özellikli bir özellik tablosuna yol açtı. Bu yaklaşım, doku bölgeleri arasında diferansiyel dağılımı olan metabolitlerin (glutamin, Şekil 2C) ve ince ve kalın bağırsaklar arasında karşılaştırılabilir seviyelerde bulunan metabolit özelliklerinin yüksek parazit yükü (kynurenine, Şekil 2B ve parazit yükü, Şekil 2A) bölgesinde yüksek olan bireysel hayvanlarda metabolit özelliklerinin görselleştirilmesini sağlar (LPE 16:0 Şekil 2D ). Kynurenine, inflamasyonla bilinen ilişkisi ve kynurenine türevi metabolitlerin T. cruzi yükünü düzenleme yeteneğine ilişkin önceki yayınları nedeniyle görselleştirme için seçildi33. Rastgele orman tabanlı makine öğrenimi modelleri daha önce kynurenine düzeyleri ile enfeksiyon durumu arasında bir ilişki olduğunu ortaya ortaya koydu6. Glutamin, in vitro glutamin mevcudiyeti ile T. cruzi ilaç duyarlılığı arasında bir ilişki olduğunu gösteren önceki yayınlara dayanan bir görselleştirme için seçildi34. Diferansiyel dağılımı lojistik regresyon kullanılarak doğrulandı, s < 0.05. LPE 16:0, doku bölgelerinde karşılaştırılabilir seviyelerde bulunan metabolit özelliklerini keşfetmek için verilerin görsel incelemesinden sonra seçildi.
Şekil 1: Protokole genel bakış. Çizim BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kimyasal kartografi analizi. Erkek C3H/HeJ farelerine intraperitoneal olarak 1.000 CL+luc T. cruzi paraziti enjekte edildi32. Hayvanlar enfeksiyondan 12 veya 89 gün sonra ötenaziye tabi tedavasyon edildi ve gastrointestinal sistem sistematik olarak toplandı ve bölümlere alındı (adım 1)6. Metabolitler adım 2'deki gibi ayıklandı ve LC-MS/MS tarafından analiz edildi.3D model üretimi SketchUp yazılımı (adım 5) kullanılarak gerçekleştirildi ve veriler 6. (A) Belirli bir farede parazit dağılımı, enfeksiyon sonrası 12 gün. (B) Kynurenine metabolit dağılımı aynı farede, enfeksiyon sonrası 12 gün. (C) Enfekte fareler arasında ortalama glutamin dağılımı, enfeksiyon sonrası 89 gün. (D) Karşılaştırılabilir m/z seviyeleri 454.292 tutma süresi 2.929 dk, 2-heksadecanoyl-sn-glisero-3-fosephoethanolamine (LPE 16:0), ince bağırsak ve kolonda A ve B ile aynı farede. Örnekler ve veriler in6 olarak oluşturulmuştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Tripozomatid enfeksiyonlarını anlamak, yeni ilaç geliştirme ve tedavi yaklaşımlarına rehberlik etmek için gereklidir. Bu kimyasal kartografi yöntemi, metabolizma ve tripozomatid hastalığı patogenez arasındaki ilişki hakkında eyleme dönüştürülebilir içgörüler sağlamak ve böylece bu çevirisel ihtiyacı gidermek için benzersiz bir şekilde hazırlanmıştır.
Arka plan kontaminasyonini hafifletmek için metabolit ekstraksiyonu ve MS analizleri sırasında sadece LC-MS sınıfı çözücüler önerilir. Genellikle parafin filmi ve/veya diğer plastiklerden elde edilen polimerik kontaminasyon35'ten mümkün olduğunca kaçınılmalıdır. Özellikle parafilm asla kullanılmamalıdır. LC-MS veri kalitesi numune hazırlama ve metabolit ekstraksiyonu sırasında kullanılan malzemelere bağlı olduğundan bu hususlar çok önemlidir. 'ili çizimleri oluşturulmadan önce veri kalitesi sağlanmalıdır. Ek olarak, bu kapsamlı uzamsal metabolomik haritaların oluşturulması, tüm bitişik doku örneklerinin toplanmasını ve bu haritalardaki boşlukları önlemek için toplanan tüm örneklerden metabolit ekstraksiyonu gerektirir. Toplama prosedürleri, metabolit ekstraksiyon lojistiği ve LC-MS analizi ve maliyetler bu şekilde düşünülmeli ve buna göre planlanmalıdır.
Bu iletişim kuralı, kullanıcı gereksinimlerini birden çok şekilde karşılayacak şekilde değiştirilebilir. Örneğin, metabolit ekstraksiyonu sırasında kullanılan çözücülerin polaritesi ve çözünürlüğü, metabolitlerin tespit edildiği şeyi etkileyecektir39. Hedefsiz kimyasal kartografi analizleri için tespit edilen metabolit özelliklerinin çeşitliliğini en üst düzeye çıkarmak için, birden fazla ekstraksiyon adımı ve çözücülerin birleştirilmesi önerilir. Örneğin, bu yöntem dikloromethane, metanol ve suyu ekstraksiyon çözücüleri olarak kullanır, çünkü kutupsal olmayan ve kutup moleküllerinin doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar20,40. Bununla birlikte, bu çözücüler her MS deneyi için evrensel olarak uygun değildir ve araştırmacılar projelerinin hedeflerine göre ekstraksiyon çözücüleri seçmelidir. Aynı şekilde, ters faz kromatografisini normal faz kromatografisi ile değiştirmek gibi farklı LC-MS/MS koşulları kullanılabilir. Alternatif sütunlar, C8 kromatografisi yerine ters fazlı veri toplama için de kullanılabilir, ancak ampirik olarak, C8 kromatografisi doku lipitlerine karşı daha sağlamdır ve daha düşük tıkanma sıklığına sahiptir. Kavramsal olarak, bu protokoller gaz kromatografisi-kütle spektrometresi gibi diğer kütle spektrometresi yöntemlerine de uygulanabilir.
Alternatif bir yaklaşım kütle spektrometresi görüntülemedir. Nitekim, kütle spektrometresi görüntüleme yaklaşımlarının aksine, sıvı kromatografi-kütle spektrometresi doğal olarak mekansal bilgileri korumaz10. Kimyasal kartografi yaklaşımları, proje kavramsallaştırması anında, örnek meta verilerde ve veri işleme adımlarında örnekleme konumunu dahil ederek bu boşluğu kapatır. Bu kimyasal kartografi yaklaşımının bir gücü, kütle spektrometresi görüntülemenin aksine, uygulamaların büyük kısmının yalnızca ek açıklama için doğru kütleye dayandığı kütle spektrometresi görüntülemenin aksine, kendinden emin ek açıklamalar (Metabolomics Standards Initiative seviye 1 veya seviye 2 ek açıklama güveni41) sağlama yeteneğidir. Kütle spektrometresi görüntüleme, ince taneli uzamsal haritalamayı mümkün kılacak, bazen tek hücre seviyesine kadar, örneğin,42,43. Buna karşılık, kimyasal kartografi yaklaşımları, son derece uzmanlaşmış tam hayvan kriyoseksiyon becerileri gerektirmeden metabolit dağılımının büyük ölçekli çapraz organ haritalanmasını sağlar. Kimyasal kartografi, 'fenotip'45'e en yakın 'omik tabakasına' odaklanma avantajı ile 44 gibi geliştirilmekte olan birçok mekansal transkriptomik yaklaşıma tamamlayıcı kanıt sağlar. Parazit yükü ölçümü için alternatif yöntemler arasında numune toplama anında biyolüminesansı ölçmek yer almaktadır6. Konfokal veya elektron mikroskopisi ile lokalize parazit yükünü ve doku hasarlarını değerlendirmek için ince segmentler de toplanabilir. Bu protokolde ve önceki yayınlarda sitokin nicelemesi için kullanılan su homojenatı, doku hasarının protein bazlı belirteçlerini ölçmek için de kullanılabilir.
Elde edilen LC-MS verilerini çizmeye uygun 3D modeller elde etmenin birden fazla yolu da vardır. Burada önerilen yönteme ek olarak, modeller çeşitli çevrimiçi satıcılardan önceden yapılmış olarak satın alınabilir. Kullanım koşullarının, özellikle yayınla ilgili olarak amaçlanan kullanımla eşleştiğından emin olun. Büyük organlar için modeller, tarayıcı talimatlarına göre 3D tarayıcılar kullanılarak de novo üretilebilir. Matlab gibi alternatifler kimyasal kartografi46 için 3D modeller üretmek ve görselleştirmek için mevcuttur, ancak bunlar öncelikle 'ili16' geliştirilmeden önce uygulanmıştır. MATLAB, birçok alanda çok çeşitli uygulamalar sunan bir veri analizi ve programlama araç paketidir. Bununla birlikte, MATLAB ne özgür ne de açık kaynaklıdır ve matlab'ın kütle spektrometresi verilerini işlemek için geliştirilmediği düşünüldüğünde MATLAB arayüzlerine aşinalık gerektirir. Bu önerilen yöntemin alternatifleri, yani SketchUp, Meshlab ve 'ili, serbestçe erişilebilir, kullanıcı dostudur ve kimyasal kartografi amacıyla MATLAB ile benzer işlevler sunar.
Bu yöntem numune hazırlama ve metabolit ekstraksiyonu ile ilgili sağlamdır. Sorun giderme en sık LC-MS veri toplama adımında gereklidir. Bu, bu makalenin kapsamı dışındadır. Okuyucular, 20,47 de dahil olmak üzere LC-MS veri toplama sorun giderme konusunda mükemmel yayınlara yönlendirilir. Aynı şekilde, metabolit ek açıklamanın karmaşıklıkları, bu yöntemin 3D model üretimine odaklanmasının kapsamı dışındadır. Bu konudaki yararlı referanslar arasında 24.25.48.49 bulunur.
Bu yöntem hastalık patogenezini etkili bir şekilde araştırırken, bazıları herhangi bir metabolomik deneyde yaygın olan bu yaklaşımın sınırlamaları vardır. Bu sınırlamalardan biri, referans spektral kütüphanelerin kullanılabilirliğine ve kalitesine bağlı olarak LC-MS özellikleri50'nin düşük ek açıklama oranıdır. Diğer bir sınırlama, bu protokolün RNAlater gibi RNA koruma reaktiflerinin LC-MS/MS analizi ile uyumsuzluğu nedeniyle mRNA'yı korumamasıdır. Bununla birlikte, protein kalitesi aşağı akış analizleri için yeterlidir ve bu nedenle mRNA tabanlı analizlerin yerini alabilir.
Enfeksiyon patogenezine kimyasal kartografi yaklaşımı, organ sistemlerinde bakteriyel, viral veya parazitik enfeksiyonların nasıl geliştiğini ve lokalize hastalığa neden olduğunu doğrudan yansıtır. Bu bölgesel alt örneklemelerin analizi ve 3D modellerin üretilmesi, metabolitlerin üç boyutlu uzayda nasıl çalıştığını ve moleküler biyolojinin daha önce tanınmayan bu mekansal boyutlarına ışık tutturmaktadır. Bu protokol kullanılarak, örneğin metabolit lokalizasyonu Trypanosoma cruzi parazit yükü ile karşılaştırıldı. Sonuçlar patojen ve konak doku arasındaki ilişkiyi netleştirdi ve ayrıca Chagas hastalığı semptom ilerlemesinin metabolik dinamiklerini gösterdi6. kimyasal kartografi yöntemleri, insan yapımı çevre etkileşimi51,52,53, insan derisi46 ve akciğerler gibi organ sistemlerinin kimyasal makyajı54, bitki metabolizması ve çevre etkileşimleri55 gibi çeşitli konulara da uygulanmıştır. Gelecekteki uygulamalar lokalize hastalık toleransı ve dayanıklılığının veya tripozomatid enfeksiyon dışındaki modellerde lokal metabolit düzeyleri, patojen tropizmi ve hastalık tromizmi arasındaki ilişkinin değerlendirilmesini içerebilir. Bu yaklaşım ayrıca mevcut farmakokinetik protokolleri genişletmek, yerel doku ilaç seviyeleri ve ilaç metabolizması arasındaki ilişkiyi genel metabolik bağlam, doku hasarı ve patojen temizliği ile değerlendirmek için geniş bir uygulanabilirliğe sahip olmalıdır. Genel olarak, kimyasal kartografi, hastalık patogenez, insan sağlığı, insan-çevre etkileşimleri ve mikrobiyal dinamikler gibi uygulamalarla çeşitli örnek türlerinde metabolit dağılımlarının benzersiz keşiflerine izin verir.
Disclosures
Rapor etmek için çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Laura-Isobel McCall, PhD, Burroughs Wellcome Fonu'ndan Bulaşıcı Hastalık Patogenezi Ödülü'nde bir araştırmacıya sahiptir. Yazarlar ayrıca NIH ödül numarası R21AI148886, Oklahoma Solunum ve Bulaşıcı Hastalıklar Merkezi'nden (OCRID) NIH ödül numarası P20GM103648 altında bir pilot hibe ve Oklahoma Üniversitesi'nden (LIM'e) başlangıç fonlarından destek almak istemektedir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve fon sağlayıcının resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Yazarlar ayrıca bu protokolde kullanılan araçların geliştiricilerine teşekkür etmek istiyor. İlgili tüm yayınlar, uygun olduğu durumlarda atıf alınmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
| 3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| 96 well plate | Fisher | 3252449 | |
| AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
| ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
| CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
| chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
| cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
| cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
| dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
| dry ice | NA | NA | any brand, as available |
| extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
| flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
| freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
| fume hood | NA | NA | any brand, as available |
| high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
| ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
| ili software | ili.embl.de | NA | |
| isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
| LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
| LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
| LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
| LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
| LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
| liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
| luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
| Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
| MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
| MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
| MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
| p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
| Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
| Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
| real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
| salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
| SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
| specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
| speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
| sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
| sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
| Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
| TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
| tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
| TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
| UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
| ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
| ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
| wet ice | NA | NA | any brand, as available |
| zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |
References
- McCall, L. -I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
- McCall, L. -I., Zhang, W. -W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
- de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
- Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G.
- Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
- Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
- Parab, A. R., McCall, L. -I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
- Lewis, C. M., McCall, L. -I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
- Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
- Newsom, S. N., McCall, L. -I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
- Wishart, D. S., et al.
- Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
- McCall, L. -I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
- Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
- Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
- Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
- McCall, L. -I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
- Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
- Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
- Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
- Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
- Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- FBMN with MZmine. , Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021).
- Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
- Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
- Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
- Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
- Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
- Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
- Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
- Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
- Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
- Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
- Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
- Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
- Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
- McCall, L. -I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
- Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
- Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).
