Summary
Detta protokoll beskriver stegen för att generera en 3D-modell av metabolitfördelning under trypanosomatidinfektion, inklusive provsamling, metabolitutvinning, en översikt över vätskekromatografi-tandem masspektrometridataförvärv, 3D-modellgenerering och slutligen datavisualisering.
Abstract
Patogen tropism och sjukdom tropism hänvisar till vävnad platser selektivt koloniserade eller skadade av patogener, vilket leder till lokaliserade sjukdom symtom. Human-infective trypanosomatid parasiter inkluderar Trypanosoma cruzi, orsaksmedlet för Chagas sjukdom; Trypanosoma brucei, orsaksmedlet för sömnsjuka; och Leishmania arter, orsaksmedel av leishmaniasis. Tillsammans påverkar de 20 miljoner människor över hela världen. Dessa parasiter visar specifika trohet: hjärta, matstrupe, kolon för T. cruzi, fettvävnad, bukspottkörtel, hud, cirkulationssystem och centrala nervsystemet för T. brucei, hud för dermotropa Leishmania stammar och lever, mjälte och benmärg för viscerotropic Leishmania stammar. Ett rumsligt perspektiv är därför viktigt för att förstå trypanosomatid sjukdom patogenes. Kemisk kartografi genererar 3D-visualiseringar av små molekylöverflödet som genereras via flytande kromatografi-masspektrometri, i jämförelse med mikrobiologiska och immunologiska parametrar. Detta protokoll visar hur kemisk kartografi kan tillämpas för att studera patogena processer under trypanosomatid infektion, med början från systematisk vävnad provtagning och metabolit extraktion, följt av flytande kromatografi-tandem masspektrometri data förvärv, och avslutas med generering av 3D kartor av metabolit distribution. Denna metod kan användas för flera forskning frågor, såsom näringsbehov för vävnad kolonisering av T. cruzi, T. brucei eller Leishmania, immunometabolism på infektionsställen, och förhållandet mellan lokala vävnad metabolisk störning och kliniska sjukdom symtom, vilket leder till omfattande inblick i trypanosomatid sjukdom patogenes.
Introduction
Trypanosomatid parasiter består av Leishmania arter, afrikanska trypanosomer (Trypanosoma brucei) och amerikanska trypanosomer (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoa orsakar leishmaniasis, som inkluderar självläkande och självbegränsad lokaliserad testning leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis där slemhinnan vävnader i mun, näsa och hals skadas, och visceral leishmaniasis med parasit tropism till viscerala organ orsakar feber och hepatosplenomegaly1,2. T. brucei orsakar human afrikansk trypanosomiasis (HAT), även känd som sömnsjuka, främst rapporterad i afrikanska länder3. De kliniska tecknen och symptomen inkluderar hepatosplenomegaly, feber, huvudvärk, muskuloskeletala smärtor, lymfadenopatier och anemi i hemo-lymfatiska scenen när parasiter lokaliseras till blodomloppet och lymfatiska. Detta följs av meningo-encephalitic scenen, där parasiter lokaliserar till centrala nervsystemet och orsakar sömnstörningar, beteendeförändring och så småningom dödlig koma4. T. cruzi orsakar Chagas sjukdom, endemisk i Amerika. Infekterade individer upplever ett första akut stadium, vanligtvis asymtomatiskt, med bred parasittropism. Cirka 10%-30% av infekterade individer upplever kroniska stadiumsymtom efter årtionden av infektion, kännetecknad av megaoesofager, megakolon och kardiovaskulära komplikationer5,6.
Metabolomik studerar små molekylära arter (50-1 500 Da), inklusive biologiska föreningar från primär eller sekundär metabolism och externt härledda föreningar som läkemedel eller livsmedelsbaserade molekyler. I samband med interaktioner mellan värdpatogener kan metabolomik utforska infektionens inverkan på värdmetabolitmiljöer, avgörande för att få tillgång till patogenens effekt på värden. Den kan också bedöma patogenanpassningar till värdens näringsmässiga och immunologiska miljö7,8,9. Masspektrometri (MS) och kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är vanliga metabolomikverktyg som används för att identifiera, kvantifiera och karakterisera metaboliter. Denna "omics" -metod kan också tillämpas på biomarkörupptäckt och läkemedelsutveckling10,11.
Med tanke på den specifika vävnad tropism av trypanosomatid parasiter, rumsliga metabolomics analyser kan möjliggöra betydande inblick i patogenesen av de sjukdomar de orsakar. Kartläggning av den rumsliga fördelningen av metaboliter visade metaboliter lokalt drabbade av kronisk Trypanosoma cruzi infektion i mus hjärtat vävnad och akut och långsiktiga Trypanosoma cruzi infektion i musen mag-tarmkanalen6,12,13. Specifikt visade 3D kemisk kartografi en koppling mellan parasit persistens och metaboliska förändringar i hjärtat vävnaden av kroniskt Trypanosoma cruzi-infekterade möss. Metabolism var mest störd i lägre och apikala segment av hjärtat, matchande med platser av Chagas sjukdom symtom (hjärt apikal stora). Metabolitfamiljer som störs av infektion på specifika hjärtplatser och korrelerade till sjukdomens svårighetsgrad inkluderar akrylkarnitiner och glycerofofoboliner12,13,14. I mag-tarmkanalen överensstämde ihållande metaboliska förändringar med platser med Chagas sjukdomssymtom: matstrupe och kolon. Däremot normaliseras ämnesomsättningen på platser som inte är associerade med Chagas sjukdomssymtom, såsom tunntarmen. Metaboliter som lokalt störs av infektion i mag-tarmkanalen inkluderar akrylkarnitiner, glycerofofoboliner, kynurenin, tryptofan och kolsyra. Dessutom möjliggjorde dessa analyser identifieringen av en ny metabolisk mekanism för tolerans mot Chagas sjukdom6. Tillämpa dessa metoder på studien av testning leishmaniasis visade betydande metaboliska störtben på platsen för lesion, men också specifika metaboliska förändringar i lesion-intilliggande, macroscopically friska vävnad. Till exempel var glutamin uttömda på lesion webbplats, medan glycerophosphocholines i m/z (massa till laddning förhållandet) 200-299, 400-499, 500-599 och 600-699 ökades avsevärt vid lesion webbplats. PC (O-34:1) ökades endast på lesion-intilliggande platser15.
Målet med detta manuskript är att visa de steg som krävs för att generera 3D-modeller av metabolitfördelning ("kemisk kartografi") som tillämpas på trypanosomatid parasitinfektionsmodeller (figur 1). Detta tillvägagångssätt bygger på flera kritiska framsteg inom ramen för metabolomik och metabolomik databehandling, särskilt utvecklingen av 'ili programvara för att plotta metabolomik data på 3D-modeller lätt16.
Protocol
Alla beskrivna djurförsök godkändes av University of Oklahoma eller University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committee. Alla steghantering av infektiöst material utfördes i ett biosäkerhetsskåp (klass II, typ A2) och enligt lokala föreskrifter.
1. Vävnadssamling
- Infektera lämpliga trypanosomatid infektion djurmodeller, i allmänhet möss eller hamstrar.
OBS: Det finns ett stort utbud av musmodeller för trypanosomatidinfektion, beroende på önskade symtom som ska produceras, sjukdomsprogression, sjukdomens svårighetsgrad etc. Användarna kan välja när det passar dem.- För testning leishmaniasis infektion modeller, infektera subkutant i fotplattan eller intradermally i örat15.
- För visceral leishmaniasis infektion modeller, infektera intravenöst1,17.
- För Chagas sjukdom och sömnsjuka infektion modeller, infektera intraperitoneally6,12,18,19. Bestäm parasitdosen som ska användas baserat på parasitstammen och planerade tidpunkter.
- Planera sektionspositioner.
- Planera att generera sektioner med minst 10 mg vävnad per sektion. Det är bäst att använda 30-50 mg.
- För Chagas sjukdom infektion modeller, planera att samla hjärt- och gastrointestinala segment systematiskt.
- För testning leishmaniasis infektion modeller, samla lesional vävnad och lesion-intill prover.
- För visceral leishmaniasis infektion modeller, planera att samla mjälte och flera leverlober. Ytterligare vävnadsställen såsom fettvävnad kan också vara av intresse att samla in.
VARNING: Prover från smittade djur måste hanteras enligt lämpligt, institutionellt godkänt biosäkerhetsprotokoll. Detta kommer i allmänhet att omfatta krav på personlig skyddsutrustning (PPE) och endast öppningsrör och insamling av prover i ett biosäkerhetsskåp (klass II, typ A2).
- Etikett- och vägrör för homogenisering.
- Använd den rörtyp som är lämplig för det tillgängliga homogeniseringssystemet. För en TissueLyser, använd 2 mL mikrocentrifugerör.
- Avliva möss vid önskade infektionstidpunkter med isofluranöverdos som godkänts av institutionell IACUC eller enligt IACUC-godkänt protokoll.
- Sektionsvävnad systematiskt som planerat, med en sektion per rör.
- Kom ihåg att tvätta provuppsamlingsutrustning mellan prover med extraktionsmedel (50% metanol i detta protokoll).
- Håll rörlocket öppet, knäpp omedelbart frysprover i flytande kväve.
VARNING: Stäng inte rör förrän något flytande kväve som kommer in i röret helt har avdunstat för att förhindra att rören exploderar när kvävet expanderar. Vidta lämpliga åtgärder för att säkerställa att huden inte kommer i kontakt med flytande kväve (använd kryohandskar och tång för att hålla rören). Använd en skyddssköld. - Förvara rören på torris tills alla önskade prover har samlats in.
- Pauspunkt: Förvara prover vid -80 °C tills de är klara att göra extraktioner.
- Väg rör för att bestämma vävnadsprovvikten. Spela in i ett kalkylblad.
- Håll proverna frysta under vägningsprocessen: håll rören på torr is, väg snabbt, lägg tillbaka på torris omedelbart. Låt inte proverna tina under vägning.
2. Metabolitutvinning
OBS: Endast vätskor och reagenser av LC-MS-kvalitet får användas i hela. Denna metod har anpassats från Reference20.
- Förbered alla extraktionsmedel (LC-MS grade H2O, LC-MS grade metanol, spetsad med 4 μM sulfachlorpyridazine, LC-MS grade dichloromethane: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin) i 1 L glasflaskor, med hjälp av särskilda glas.
OBS: Den volym som skall beredas bör beräknas på grundval av provvikter, med hänsyn till 500 μL vatten per 50 mg prov, 500 μL metanol spetsat med 4 μM sulfaklorpyridazin per 50 mg prov och 1 000 μL förkockad diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin per 1 000 μL förskolnad diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin per 1 000 μL förskolnad diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin per 1 000 μL förskolnad diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin per 1 000 μL förfördelad diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazine per 1 000 μL förskolnad diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin per 1 000 μL förfördelad diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin per 50 mg prov och 1 000 μL förskolda diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin per 1 00 mg prov och 1 000 μL förskolnad diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin per Förvara extraktionslösningsmedlet vid 4 °C minst över natten för att kylas ned. - Utför vattenbaserad homogenisering av vävnadsproverna enligt stegen nedan.
- Tillsätt en 5 mm pärla i rostfritt stål (se Materialtabell) till vart och ett av de 2 ml mikrocentrifugerör som innehåller vävnadsprover med hjälp av en pärldispenser. Håll rören på is.
- Gör ett blankt rör som innehåller LC-MS-klass H2O som går igenom alla steg och fungerar som ett extraktionsämne. Använd den genomsnittliga H2O-volymen från provextraktioner. Tillsätt kyld LC-MS-klass H2O till de frysta vävnadsproverna.
- Normalisera vattenvolymen till vävnadsvikten genom att tillsätta 500 μL vatten / 50 mg prov, med hjälp av provvikterna beräknade i steg 1.7.
VARNING: Vid hantering av biofarliga prover, fortsätt att följa lämpligt, institutionellt godkänt biosäkerhetsprotokoll. Detta kommer i allmänhet att omfatta krav på personlig skyddsutrustning (PPE) och öppningsrör endast inuti biosäkerhetsskåpet (klass II, typ A2).
- Normalisera vattenvolymen till vävnadsvikten genom att tillsätta 500 μL vatten / 50 mg prov, med hjälp av provvikterna beräknade i steg 1.7.
- Homogenisera proverna vid 25 Hz-hastighet i 3 minuter med hjälp av en vävnadshomogenisator (se Materialtabell).
- Stäng rören tätt för att undvika att reagenserna spills under bearbetningen.
- Samla in cirka 1/10 av homogeniseringsvolymen för DNA-extraktion, qPCR, proteinbaserade analyser eller andra analyser (om så önskas). Förvara i ett mikrocentrifugerör eller en 96-brunnsplatta (beroende på den insamlade volymen) i upp till 6 månader vid -80 °C, om DNA-extraktionsexperiment ska utföras en annan dag. Längre lagringstid kan vara möjlig men har inte testats.
- Utför DNA-extraktioner med hjälp av standardutrustning för DNA-extraktion av däggdjur (se Materialtabell) från vävnader enligt beskrivningen i Reference13. Kvantifiera DNA-utbytet och lagra det extraherade DNA vid -20 °C. Acceptabel DNA-kvantitet och kvalitet för qPCR har observerats även upp till 3 år senare.
OBS: Detta steg kan utföras på fryst homogenat en efterföljande dag från metabolit extraktion. - Utför qPCR enligt beskrivningen i Reference13 med hjälp av 180 ng extraherat DNA.
OBS: Detta kan utföras på DNA som samlats in en tidigare dag och frysts vid -20 °C.- Vid studier på T. cruzi-infektion, använd följande primers: ASTCGGCTGATCGTTTCGA och AATTCCTCCAAGCAGCGGATA för att kvantifiera parasitnivåer21 och följande primers för att normalisera till värd-DNA-nivåer: TCCCTCTCATCAGTCTATGGCCCA och CAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22 (se Tabell över material).
OBS: De rekommenderade qPCR-cyklerna är följande: denatur vid 95 °C i 10 min; utföra 40 cykler vid 95 °C i 30 s och sedan 58 °C i 60 s och slutligen 72 °C för 60 s. Utför analys av smältkurvorna efter behov för den tillgängliga termocykeln. Bearbeta data med ΔΔCt-metoden23 för att erhålla relativ parasitbelastning mellan provtagningsplatserna. Absolut kvantifiering kan erhållas genom att jämföra ΔΔCt-värden som härletts med en standardkurva som genereras av kända mängder parasiter, spetsats till oinfekterade vävnadsprover och extraheras enligt steg 2.2-2.2.4.1.
- Vid studier på T. cruzi-infektion, använd följande primers: ASTCGGCTGATCGTTTCGA och AATTCCTCCAAGCAGCGGATA för att kvantifiera parasitnivåer21 och följande primers för att normalisera till värd-DNA-nivåer: TCCCTCTCATCAGTCTATGGCCCA och CAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22 (se Tabell över material).
- Utför proteinbaserad karakterisering av immunsvar med multiplexerade cytokinsatser eller kommersiella STANDARD-ELISA-kit (se Materialtabell) enligt beskrivningen i Reference13 på det lagrade homogenatet.
- Utför DNA-extraktioner med hjälp av standardutrustning för DNA-extraktion av däggdjur (se Materialtabell) från vävnader enligt beskrivningen i Reference13. Kvantifiera DNA-utbytet och lagra det extraherade DNA vid -20 °C. Acceptabel DNA-kvantitet och kvalitet för qPCR har observerats även upp till 3 år senare.
- Spara minst hälften av 500 μL av homogeniseringsvolymen för extraktion av metaboliter.
- Utför vattenmetabolitextraktion.
OBS: Valet av lösningsmedel kan anpassas baserat på de kemiska egenskaperna hos metaboliter av intresse.- Tillsätt iskall LC-MS-klass metanol spetsad med 4 μM sulfaklorpyridazin till homogenatet för att uppnå en slutlig koncentration på 50% metanol med 2 μM sulfaklorpyridazin i vatten.
VARNING: Metanol är brandfarligt och farligt. Använd lämpliga säkerhetsrutiner, inklusive hantering inuti en rökhuv eller ett biosäkerhetsskåp. - Homogenisera prover i en vävnadshomogenisator vid 25 Hz hastighet i 3 min. Centrifugprover vid 16 000 x g vid 4 °C i 10 minuter.
- Samla en lika stor mängd supernatant i en 96-brunnsplatta. Välj den volym som ska matcha den minsta volymen metanol + vatten kombinerat över alla prover. Det här är vattenfraktionen.
- Lägg åt sidan alla återstående vattenhaltiga homogena supernatanter vid -80 °C som backup.
- Förvara de fasta resterna på isen medan du samlar in supernatanterna.
- Torka vattenextraktionssvintant tills det är torrt (~3 h eller över natten). Använd maximal hastighet och ingen uppvärmning.
- Frys den torkade 96-brunnsplattan vid -80 °C.
- Tillsätt iskall LC-MS-klass metanol spetsad med 4 μM sulfaklorpyridazin till homogenatet för att uppnå en slutlig koncentration på 50% metanol med 2 μM sulfaklorpyridazin i vatten.
- Utför extraktion av organisk metabolit.
OBS: Valet av lösningsmedel kan anpassas baserat på de kemiska egenskaperna hos metaboliter av intresse.- Tillsätt 1 000 μL per 50 mg av provet av förknämd diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin till de fasta resterna från steg 2.3.4.
VARNING: Använd lämpliga säkerhetsrutiner vid hantering av lösningsmedel, inklusive hantering inuti en rökhuv med god flödeshastighet. - Homogenisera prover i en vävnadshomogenisator vid 25 Hz hastighet i 5 min. Centrifugera proverna vid 16 000 x g vid 4 °C i 10 minuter.
- Samla en lika stor mängd supernatant i en 96-brunnsplatta. Välj den volym som ska matcha den minsta volymen diklormetan: metanol, över alla prover. Det här är den organiska fraktionen.
- Förvara pelleten vid -80 °C som reserv. Förvara det återstående organiska extraktet vid -80 °C som en säkerhetskopia. Lufttorka det organiska extraktet i en rökhuv över natten.
- Frys den torkade 96-brunnsplattan vid -80 °C.
- Tillsätt 1 000 μL per 50 mg av provet av förknämd diklormetan: metanol spetsad med 2 μM sulfaklorpridazin till de fasta resterna från steg 2.3.4.
3. Datainsamling av LC-MS
- Resuspend vattenhaltiga och organiska extrakt i 60 μL vardera av 50% metanol + 2 μM sulfadimetoxin, och kombinera. Sonicate i 10 min; centrifugera sedan i 10 minuter och överför supernatanten till en ren 96-wellplate. Täta med zonfri plåttätning och placera plattan i en LC-autosampler.
VARNING: Använd lämpliga säkerhetsrutiner vid hantering av lösningsmedel, inklusive hantering inuti en rökhuv med god flödeshastighet. - Anslut lämpliga mobila faser till LC-systemet (se Materialförteckning).
OBS: För positivt läge omvänd fas LC rekommenderar författarna LC-MS-klass H2O + 0,1% myrsyra som mobil fas A och LC-MS-klass acetonitril + 0,1% myrsyra som mobil fas B med en flödeshastighet på 0,5 ml/min och en 7,5 min LC-gradient. Rekommenderade övertoningssteg publiceras i Reference6: 0-1 min, 2% B; 1-2,5 min, linjär ökning till 98% B; 2,5-4,5 min, håll på 98% B; 4,5-5,5 min, linjär minskning till 2% B; 5,5-7,5 min, håll på 2% B. - Se till att instrumentet är rent. Kalibrera MS i både positivt och negativt läge.
- Utför ms-prestandautvärderingen på lämpligt sätt för instrumentet.
- Skapa MS-körningssekvens.
- Börja med 2 ämnen, 2 standarder (6-blandningar) och 5 poolade kvalitetskontroller (QC) i en utspädningsserie, från 2 μL injektionsvolym och ökning stegvis till 30 μL injektionsvolym.
- Slumpmässigt provordningen.
- Efter var 12:e sampling kör du ett tomt och sedan en poolad QC.
- Anslut C8 LC-kolonnen (1,7 μm partikelstorlek, 100 Å porstorlek, 50 x 2,1 mm längd x inre diameter) och övervaka för läckage och överdrivet baktryck. Åtgärda problem enligt instrumentstandardens driftsprocedur.
- Starta MS-körningssekvensen och samla in databeroende LC-MS/MS-data.
OBS: För ett Q-Exactive Plus MS-instrument, använd Heated Electrospray Jonisering och databeroende MS2-förvärv (topp 5) i positivt läge, en upplösning på 70 000 för MS1 och 17 500 för MS2, AGC-mål på 1E6 för MS1 och 2E5 för MS2, maximalt 100 ms för både MS1 och MS2, skanningsintervall till 100-150 m /z för MS1, och MS2 isoleringsfönster på 1 m/z. Ställ in mantgasen till 35, auxgas till 10 och sopa gas till 0, sprayspänning till 3,8 kV, kapillärtemperatur till 320 °C, S-lins RF-nivå till 50 och aux gastemperatur till 350 °C.- Verifiera datakvaliteten: kontrollera de första ämnena (bekräfta bristen på större toppar), standarder (bekräfta förekomsten av förväntade toppar och symmetrisk toppform) och QCs (bekräfta förekomsten av förväntade toppar, toppform och förväntad toppintensitet).
- Övervaka regelbundet MS-körning under körningssekvensen.
- När körningen är klar kontrollerar du data för missade injektioner eller andra fel.
- Lagra LC-kolumnen enligt tillverkarens rekommendationer. Ta bort och förvara prover vid -80 °C.
- Ladda upp rådata till datadatabasen.
OBS: MassIVE (massive.ucsd.edu) rekommenderas för att möjliggöra nedströmslänken till molekylära nätverk för metabolitanteckningar24,25.
4. Behandling av LC-MS-data
- Konvertera råfiler till öppet format (.mzXML eller .mzML) med MSConvert26.
- Ladda upp rådata och mzXML- eller mzML-data till datadatabasen.
- Generera funktionstabell. Det finns flera verktyg för att göra det (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS, etc.27,28,29,30).
OBS: MZmine rekommenderas eftersom det är gratis, öppen källkod och kan direkt importera mzXML-filer efter MSconvert, har grafiska användargränssnittsalternativ för bearbetning av data och övervakning av effekten av parameterval och kan direkt exportera till GNPS för molekylärt nätverk24.
OBS: Följ verktygsdokumentationen och använd parametrar som är lämpliga för det tillgängliga instrumentet. Ytterligare information finns också i Reference31.- Exportera funktionstabell i .csv format.
5.3D modellgeneration
- Handdraga 3D-modell de novo för att skala enligt stegen som nämns nedan.
- Ta en bild av det intressanta organet.
- Utför följande i SketchUp-programvaran (se Tabell över material) som nämnts nedan.
- Ta bort standardbilden av en man som visas när programvaran öppnas.
- Klicka på Arkiv > Importera för att importera en bild av de organ som är av intresse.
- Klicka på linjeverktyget och välj alternativet Frihand . Använd pennverktyget för att spåra och rita konturerna av de organ som är av intresse. Se till att stänga linjen genom att rita hela vägen tillbaka till startpunkten. När linjen har stängts visas det ritade området automatiskt skuggat.
- Välj push/pull-verktyget och dra upp det skuggade området för att konvertera ritningen från 2D till 3D.
- Ta bort orgelbilden: välj knappen Radergummi och högerklicka sedan på bilden och välj Radera.
- Exportera filen i DAE-format: Fil > exportera > 3D-modell.
- Förbättra modellens realism enligt stegen som nämns nedan.
- Importera modellen till MeshLab-programvara (se Tabell över material): öppna MeshLab och välj Fil > Importera nät. Välj DAE-modellen som genererades i föregående steg. En föröppnad alternativmeny dyker upp. Välj OK.
- Välj Wireframe på den översta menyn. Välj sedan: Filter > Remeshing, Simplification and Reconstruction > Underindelningsytor: Mittpunkt. Lämna alla värden som standard och välj Använd två gånger. Inspektera modellens trådramsvy visuellt för att säkerställa att den är fingallerad. Stäng popup-menyn.
- Exportera modellen i STL-format: Arkiv > Exportera nät som och välj sedan STL-filformat (*.stl) på listrutan Filer . Klicka på Spara. Välj OK på nästa popup-meny.
- Öppna Meshmixer-programvaran (se Materialförteckning). Klicka på knappen Importera (+). Välj stl-filen som genererades i föregående steg. Använd Sculpt > Brushes > Dra och Sculpt > Borstar > Blåsa upp verktyg för att dra ut modellens ytor som måste avrundas.
- När modellen har önskat utseende sparar du den i STL-format: Arkiv > exportera. Namnge filen efter önskemål och välj STL Binärt format (*.stl) i listrutan Spara som typ. Klicka på Spara. Om en popup-meny visas klickar du på Fortsätt.
6. 'ili plot generation
- Få koordinater för de positioner i 3D-modellen som motsvarar provtagningsplatserna.
- Öppna 3D-modellen från steg 5.1.3.5 i MeshLab-programvaran : File > Import Mesh. Välj den modell som genereras i steg 5.1.3.5. Klicka på OK i popup-fönstret Efter öppen bearbetning .
- Om du vill hämta x-, y- och z-koordinater för varje samplingsplats: välj verktyget PickPoints och högerklicka med jämna mellanrum över 3D-modellytan. När alla önskade koordinater har valts klickar du på den översta knappen Spara i popup-fönstret Formulär .
OBS: Detta exporterar koordinaterna i PP-filformat. Den här filen kan öppnas i kalkylprogram. - I kalkylbladsprogram: Öppna PP-filen som genereras i steg 6.1.2. Justera datavisningen med data > text till kolumner > avgränsade. Klicka på Nästa och välj sedan Blanksteg och klicka på Slutför.
- Formatera om så att endast numeriska värden finns kvar i kalkylbladscellerna genom att välja Hem > Sök och Markera > Ersätt. I rutan Sök efter anger du: y=". Lämna rutan Ersätt med tom. Klicka på Ersätt alla och sedan på OK. Upprepa för x=" och för z=" och för " />. Värdena är nu klara för steg 6.2.
- Gör funktionstabellen 'ili. Denna metod har anpassats från Reference16.
- Bygg funktionstabellen i ett kalkylbladsprogram. Rader motsvarar varje position och kolumner till data.
OBS: De första kolumnerna måste vara positionsnamnet (exempelnamn), följt av x-, y- och z-koordinater för de provtagningspunkter som erhålls i steg 6.1.2 (med kolumnrubrikerna x, y, z). Den femte kolumnen måste ha titeln "radie". - Klistra in lämpliga metadata och metabolitfunktionsförekomster i de efterföljande kalkylbladskolumnerna.
- Ange önskad storlek på de provtagningsplatser som ska visualiseras på modellen i kolumnen "radie". Bestäm värdena för radien empiriskt: ange 1 som standard och utvärdera sedan om radien eller koordinaterna behöver justeras i steg 6.3. Spara filen i .csv format (Arkiv > Spara som) och välj sedan CSV (Kommaavgränsat) (*.csv) på den nedrullningsbara menyn. Namnge filen efter önskemål. Klicka på Spara.
- Bygg funktionstabellen i ett kalkylbladsprogram. Rader motsvarar varje position och kolumner till data.
- Öppna data i 'ili (programvara utvecklad av16).
- Öppna webbplatsen "ili (ili.embl.de). Välj Surface. Dra och släpp den skapade 3D-modellen i webbläsarfönstret. Dra och släpp den skapade funktionstabellen i samma webbläsarfönster.
- Använd förklaringen längst ned till höger för att projicera önskad datakolumn i 3D-modellen. Se till att de fläckar och radier som valts i steg 6.2.1 matchar provtagningsplatserna. Justera vid behov värdena i funktionstabellen eller välja ytterligare koordinater i MeshLab (se steg 6.1.2).
Visualiseringen kan också förbättras genom att välja > kantlinjeopacitet och ställa in skjutreglaget till dess maximala värde. - Välj varje datakolumn i följd för att bedöma fördelningen av denna metabolitfunktion i 3D-modellen.
OBS: Detta tillvägagångssätt kan också användas för att visualisera endast specifika metabolitegenskaper av intresse, till exempel de med p < 0,05 eller en viss vikningsförändring mellan infekterade och oinfekterade prover, enligt vad som bestäms i externa statistiska analysverktyg. Funktioner att visualisera kan också väljas utanför 'ili genom maskininlärningsmetoder som en slumpmässig skog.
- Utför linjär data-/loggdatavisualisering enligt stegen nedan.
- Med hjälp av fliken Mappning längst upp till höger på sidan väljer du Linjär eller Logarithmic i den nedrullningsbara menyn Skala .
- Ange samma skala för alla tomter om du visualiserar flera funktioner.
WEBBPLATSEN väljer automatiskt det lägsta och högsta för varje datakolumn som ska visas. - Om du vill ange skalan manuellt avmarkerar du alternativet Auto Min/Max och anger önskad skalning. Alla data visas nu inom samma skala.
- Ändra färgskalan för data (gråskala, blå-vit-röd osv.).
- Ändra färgskalan till önskat färgschema på mappningsmenyn med den nedrullningsbar menyn Färgkarta . Kontrollera att det valda färgschemat är färgblindt.
- Om du vill ändra färgen på 3D-modellen eller bakgrundsfärgen använder du färg- och bakgrundsalternativ under 3D-menyn.
- Dölj 3D-axlar genom att avmarkera rutan Visa origin under 3D-menyn .
- Spara bilden genom att skärmdumpa, använda klippverktyget eller kortkommandot Crtl + S för Windows eller Linux och
+ S på OS X.
+ S på OS X.Representative Results
Antalet metabolitfunktioner som erhålls beror på vilken vävnadstyp som analyseras och databehandlingsparametrar. Till exempel har detta protokoll använts för att analysera den rumsliga effekten av T. cruzi infektion på mag-tarmkanalen metabolom i en musmodell av T. cruzi infektion. I tidigare arbete injicerades manliga C3H/HeJ intraperitoneally med 1 000 CL + luc T. cruzi parasiter32,6. Djur avlivades 12 eller 89 dagar efter infektion, och en kemisk kartografi analys av 13 sammanhängande segment av mag-tarmkanalen utfördes enligt beskrivningen i detta protokoll. Den här analysen ledde till en funktions tabell med 5 502 funktioner, som sedan visualiserades i 3D med hjälp av stegen som beskrivs i det här protokollet. Detta tillvägagångssätt möjliggör visualisering av metabolitegenskaper hos enskilda djur som är höga på platsen för hög parasitbelastning (kynurenin, figur 2B jämfört med parasitbelastning, figur 2A), av metaboliter med differentiell fördelning mellan vävnadsregioner (glutamin, figur 2C) och metabolitegenskaper som finns på jämförbara nivåer över små och stora tarmar (LPE 16:0 Figur 2D ). Kynurenin valdes för visualisering på grund av dess kända förhållande till inflammation och tidigare publikationer om kynurenin-härledda metaboliters förmåga att reglera T. cruzi load33. Slumpmässiga skogsbaserade maskininlärningsmodeller hade tidigare avslöjat ett samband mellan kynurenin nivåer och infektion status6. Glutamin valdes för en visualisering baserat på tidigare publikationer som visar ett samband mellan in vitro glutamin tillgänglighet och T. cruzi läkemedelskänslighet34. Differentiell fördelning bekräftades med logistisk regression, s < 0,05. LPE 16:0 valdes efter visuell inspektion av data för att upptäcka metabolitfunktioner som finns på jämförbara nivåer över vävnadsställen.
Bild 1: Protokollöversikt. Illustrationen skapades med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Kemisk kartografianalys. Manliga C3H/HeJ möss injicerades intraperitoneally med 1,000 CL +luc T. cruzi parasiter32. Djur avlivades 12 eller 89 dagar efter infektion, och mag-tarmkanalen samlades in och sektionerades systematiskt (steg 1)6. Metaboliter extraherades som i steg 2 och analyserades av LC-MS/MS.3D modellgenerering utfördes med hjälp av SketchUp-programvaran (steg 5), och data ritades i 3D som i steg 6. (A) Parasitfördelning i en viss mus, 12 dagar efter infektion. B) Kynureninmetabolitfördelning i samma mus, 12 dagar efter infektion. C) Genomsnittlig glutaminfördelning mellan infekterade möss, 89 dagar efter infektion. (D) Jämförbara nivåer av m/z 454.292 retentionstid 2.929 min, annoterade som 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (LPE 16:0), i samma mus som i A och B i tunntarmen och tjocktarmen. Prover och data genererades i sex. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Att förstå trypanosomatid infektioner är viktigt för att vägleda nya läkemedelsutveckling och behandlingsmetoder. Denna kemiska kartografi metod är unikt redo att ge handlingsbara insikter i förhållandet mellan metabolism och trypanosomatid sjukdom patogenes, så att ta itu med detta translationella behov.
Endast lösningsmedel av LC-MS-kvalitet rekommenderas vid metabolitextraktion och MS-analyser för att minska bakgrundskontamineringen. Polymerförorening35, som vanligen härrör från paraffinfilm och/eller annan plast36,37,38, skall om möjligt undvikas. Särskilt parafilm får aldrig användas. Dessa aspekter är avgörande eftersom LC-MS-datakvaliteten beror på de material som används under provberedning och metabolitutvinning. Datakvaliteten bör säkerställas innan "ili-diagram" genereras. För att generera dessa omfattande rumsliga metabolomikkartor krävs dessutom insamling av alla intilliggande vävnadsprover och metabolitextraktion från alla insamlade prover för att undvika luckor i dessa kartor. Insamlingsförfaranden, logistik för metabolitutvinning och LC-MS-analys samt kostnader bör därför övervägas och planeras i enlighet därmed.
Det här protokollet kan ändras för att uppfylla användarnas behov på flera sätt. Till exempel kommer polariteten och lösligheten hos lösningsmedel som används under metabolitextraktion att påverka vilka metaboliter som detekteras39. För att maximera mångfalden av detekterade metabolitfunktioner för oriktade kemiska kartografianalyser rekommenderas kombination av flera extraktionssteg och lösningsmedel. Till exempel använder denna metod diklormetan, metanol och vatten som extraktionsmedel eftersom de möjliggör korrekt detektion av icke-polära och polära molekyler20,40. Dessa lösningsmedel är dock inte universellt lämpliga för varje MS-experiment, och forskare bör välja extraktionsmedel baserat på målen för deras projekt. På samma sätt kan olika LC-MS/MS-förhållanden användas, till exempel att ersätta bakåtfaskromatografi med normal faskromatografi. Alternativa kolumner kan också användas för insamling av data i omvänd fas istället för C8-kromatografi, men empiriskt är C8-kromatografi mer robust för vävnadslipider och har en lägre igensättningsfrekvens. Konceptuellt kan dessa protokoll också tillämpas på andra masspektrometrimetoder som gaskromatografi-masspektrometri etc.
Ett alternativt tillvägagångssätt är masspektrometri imaging. Till skillnad från masspektrometri imaging metoder, flytande kromatografi-mas spektrometri inte i sig bevara rumslig information10. Kemiska kartografimetoder överbryggar detta gap genom att inkludera provtagningsplats vid tidpunkten för projektets konceptualisering, i exempelmetadata och vid databehandlingssteg. En styrka i denna kemiska kartografimetod, till skillnad från masspektrometriavbildning, är förmågan att tillhandahålla självsäkra anteckningar (Metabolomics Standards Initiative nivå 1 eller nivå 2 anteckningsförtroende41), till skillnad från masspektrometriavbildning där huvuddelen av applikationerna förlitar sig på exakt massa endast för anteckning. Masspektrometriavbildning möjliggör finkornig rumslig kartläggning, ibland ner till encellsnivån, t.ex. 42,43. Däremot möjliggör kemiska kartografimetoder storskalig kartläggning av metabolitfördelning utan att kräva högspecialiserade kryosektionsfärdigheter för hela djur. Kemisk kartografi ger kompletterande bevis för de många rumsliga transkriptomiska metoder som utvecklas, t.ex. Alternativa metoder för parasitbelastningskvantifiering är mätning av bioluminescens vid tidpunkten för provtagningen6. Fina segment kan också samlas in för att göra det möjligt för konfokal eller elektronmikroskopi att bedöma lokaliserad parasitbörda och vävnadsskador. Vatten homogenatet, som används för cytokinkvantifiering i detta protokoll och tidigare publikationer13, kan också användas för att kvantifiera proteinbaserade markörer för vävnadsskador.
Det finns också flera sätt att få 3D-modeller som är lämpliga för att rita de resulterande LC-MS-data. Förutom den metod som föreslås här kan modeller köpas färdiga från olika onlineleverantörer. Se till att användarvillkoren överensstämmer med den avsedda användningen, särskilt när det gäller publicering. Modeller för stora organ kan genereras de novo med hjälp av 3D-skannrar enligt skannerinstruktioner. Alternativ som MATLAB finns för att generera och visualisera 3D-modeller för kemisk kartografi46, men de implementerades främst före utvecklingen av 'ili16. MATLAB är en dataanalys- och programmeringsverktygssvit som erbjuder en mängd olika applikationer inom många områden. MATLAB är dock varken gratis eller öppen källkod, och det kräver förtrogenhet med MATLAB-gränssnitt, särskilt med tanke på att MATLAB inte utvecklades för bearbetning av masspektrometridata. Denna föreslagna metods alternativ, nämligen SketchUp, Meshlab och 'ili, är fritt tillgängliga, användarvänliga och erbjuder liknande funktioner som MATLAB för kemiska kartografiändamål.
Denna metod är robust när det gäller provberedning och metabolitextraktion. Felsökning är oftast nödvändig i steget för datainsamling mellan LC och MS. Detta ligger utanför den här artikelns tillämpningsområde. Läsarna hänvisas till utmärkta publikationer om felsökning av LC-MS-datainsamling, inklusive20,47. På samma sätt ligger komplexiteten i metabolitanotering utanför ramen för denna metods fokus på 3D-modellgenerering. Användbara referenser om detta ämne inkluderar24,25,48,49.
Medan denna metod effektivt utforskar sjukdom patogenes, det finns begränsningar i detta tillvägagångssätt, av vilka några är vanliga i alla metabolomics experiment. En sådan begränsning är den låga anteckningsfrekvensen för LC-MS-funktioner50, som är beroende av referensspektralbibliotekens tillgänglighet och kvalitet. En ytterligare begränsning är att detta protokoll inte bevarar mRNA på grund av inkompatibiliteten hos RNA-konserveringsreagenser som RNAlater med LC-MS/MS-analys. Proteinkvaliteten är dock tillräcklig för nedströmsanalyser och kan därmed ersätta mRNA-baserade analyser.
En kemisk kartografi tillvägagångssätt för infektion patogenes återspeglar direkt hur bakteriella, virala eller parasitiska infektioner utvecklas i organsystem och orsakar lokaliserad sjukdom. Att analysera dessa regionala subsamples och generera 3D-modeller förmedlar i slutändan hur metaboliter fungerar över tredimensionellt utrymme och kastar ljus över dessa tidigare okända rumsliga dimensioner av molekylärbiologi. Med hjälp av detta protokoll, till exempel, metabolit lokalisering jämfördes med Trypanosoma cruzi parasit last. Resultaten klargjorde förhållandet mellan patogenen och värdvävnaden och visade också den metaboliska dynamiken i Chagas sjukdom symptom progression6. Kemiska kartografimetoder har också tillämpats på olika ämnen, såsom mänsklig byggd miljöinteraktion51,52,53, kemisk sammansättning av organsystem som mänsklig hud46 och lungor54 och växtmetabolism och miljöinteraktioner55. Framtida tillämpningar kan innebära bedömning av lokaliserad sjukdom tolerans och resiliens, eller förhållandet mellan lokala metabolit nivåer, patogen tropism och sjukdom tropism i modeller bortom trypanosomatid infektion. Detta tillvägagångssätt bör också ha bred tillämplighet att utöka nuvarande farmakokinetik protokoll, att bedöma förhållandet mellan lokala vävnad drognivåer och läkemedelsmetabolism kontra övergripande metaboliska sammanhang, vävnad skador och patogen clearance. Sammantaget möjliggör kemisk kartografi unika utforskningar av metabolitfördelningar i olika provtyper, med tillämpningar inklusive sjukdomspatogenes, människors hälsa, interaktioner mellan människa och miljö och mikrobiell dynamik.
Disclosures
Inga intressekonflikter att rapportera.
Acknowledgments
Laura-Isobel McCall, phD, innehar en utredare i Patogenesen för infektionssjukdomar från Burroughs Wellcome Fund. Författarna vill vidare erkänna stöd från NIH-tilldelningsnummer R21AI148886, ett pilotbidrag från Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) under NIH-tilldelningsnummer P20GM103648 och startfonder från University of Oklahoma (till LIM). Innehållet är enbart upphovsmännens ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansiärernas officiella åsikter. Författarna vill också tacka utvecklarna av de verktyg som används i detta protokoll. Alla relevanta publikationer har i förekommande fall citerats.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
| 3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| 96 well plate | Fisher | 3252449 | |
| AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
| ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
| CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
| chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
| cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
| cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
| dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
| dry ice | NA | NA | any brand, as available |
| extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
| flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
| freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
| fume hood | NA | NA | any brand, as available |
| high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
| ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
| ili software | ili.embl.de | NA | |
| isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
| LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
| LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
| LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
| LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
| LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
| liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
| luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
| Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
| MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
| MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
| MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
| p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
| Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
| Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
| real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
| salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
| SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
| specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
| speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
| sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
| sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
| Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
| TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
| tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
| TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
| UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
| ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
| ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
| wet ice | NA | NA | any brand, as available |
| zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |
References
- McCall, L. -I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
- McCall, L. -I., Zhang, W. -W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
- de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
- Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G.
- Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
- Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
- Parab, A. R., McCall, L. -I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
- Lewis, C. M., McCall, L. -I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
- Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
- Newsom, S. N., McCall, L. -I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
- Wishart, D. S., et al.
- Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
- McCall, L. -I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
- Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
- Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
- Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
- McCall, L. -I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
- Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
- Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
- Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
- Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
- Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
- Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
- FBMN with MZmine. , Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021).
- Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
- Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
- Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
- Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
- Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
- Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
- Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
- Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
- Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
- Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
- Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
- Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
- Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
- Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
- Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
- Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
- Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
- Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
- McCall, L. -I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
- Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
- Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).
