Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kemisk kartografi tilgange til undersøgelse af trypanosomatidinfektion

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63255
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1, 1,2,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, 2Laboratories of Molecular Anthropology and Microbiome Research, University of Oklahoma, Norman, 3Department of Anthropology, University of Oklahoma, Norman, 4Department of Microbiology and Plant Biology, University of Oklahoma, Norman
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver trinene til at generere en 3D-model af metabolitfordeling under trypanosomatidinfektion, herunder prøveindsamling, metabolitekstraktion, en oversigt over væskekromatografi-tandemmassespektrometri dataindsamling, 3D-modelgenerering og endelig datavisualisering.

Abstract

Patogentropisme og sygdomstropisme refererer til vævsstederne selektivt koloniseret eller beskadiget af patogener, hvilket fører til lokaliserede sygdomssymptomer. Human-infektiøsive trypanosomatid parasitter indbefatter Trypanosoma cruzi, det forårsagende middel til Chagas sygdom; Trypanosoma brucei, det forårsagende middel til sovesyge; og Leishmania arter, forårsagende midler til leishmaniasis. Derfor påvirker de 20 millioner mennesker over hele kloden. Disse parasitter viser specifik tropisme: hjerte, spiserør, tyktarm til T. cruzi, fedtvæv, bugspytkirtel, hud, kredsløbssystem og centralnervesystem til T. brucei, hud til dermotrope Leishmania-stammer og lever, milt og knoglemarv til viscerotrope Leishmania-stammer . Et rumligt perspektiv er derfor afgørende for at forstå trypanosomatid sygdomspatogenese. Kemisk kartografi genererer 3D-visualiseringer af små molekyle overflod genereret via væskekromatografi-massespektrometri sammenlignet med mikrobiologiske og immunologiske parametre. Denne protokol viser, hvordan kemisk kartografi kan anvendes til at studere patogene processer under trypanosomatidinfektion, begyndende med systematisk vævsprøveudtagning og metabolitekstraktion efterfulgt af dataindsamling om væskekromatografi-tandemmassespektrometri og afsluttende med generering af 3D-kort over metabolitfordeling. Denne metode kan bruges til flere forskningsspørgsmål, såsom næringsbehov for vævskolonisering af T. cruzi, T. brucei eller Leishmania, immunmetabolisme på infektionssteder og forholdet mellem lokal vævsmetabolisk forstyrrelse og kliniske sygdomssymptomer, hvilket fører til omfattende indsigt i trypanosomatid sygdomspatogenese.

Introduction

Trypanosomatid parasitter består af Leishmania arter, afrikanske trypanosomer (Trypanosoma brucei) og amerikanske trypanosomer (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoer forårsager leishmaniasis, som omfatter selvhelbredende og selvbegrænset lokaliseret kutan leishmaniasis, mukokutan leishmaniasis, hvor slimhindevævet i mund, næse og hals bliver beskadiget, og visceral leishmaniasis med parasittropisme til de viscerale organer, der forårsager feber og hepatosplenomegali1,2. T. brucei forårsager human afrikansk trypanosomiasis (HAT), også kendt som sovesyge, hovedsageligt rapporteret i afrikanske lande3. De kliniske tegn og symptomer omfatter hepatosplenomegali, feber, hovedpine, muskuloskeletale smerter, lymfadenopatier og anæmi i hæmolymfatisk stadium, når parasitter lokaliserer sig til blodbanen og lymfeknuder. Dette efterfølges af det meningo-encephalitiske stadium, hvor parasitter lokaliserer sig til centralnervesystemet og forårsager søvnforstyrrelse, adfærdsændring og til sidst dødelige komaer4. T. cruzi forårsager Chagas sygdom, endemisk i Amerika. Inficerede individer oplever et indledende akut stadium, normalt asymptomatisk, med bred parasittropisme. Omkring 10%-30% af de inficerede individer oplever kroniske stadium symptomer efter årtier med infektion, karakteriseret ved megaoesophagus, megacolon og kardiovaskulære komplikationer5,6.

Metabolomics studerer små molekylære arter (50-1.500 Da), herunder biologiske forbindelser fra primær eller sekundær metabolisme og eksternt afledte forbindelser såsom lægemidler eller fødevareafledte molekyler. I forbindelse med værtspatogeninteraktioner kan metabolomics undersøge infektionens indvirkning på værtsmetabolitmiljøer, hvilket er afgørende for at få adgang til patogenets virkning på værten. Det kan også vurdere patogentilpasninger til værtsns ernæringsmæssige og immunologiske miljø7,8,9. Massespektrometri (MS) og nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi er almindelige metabolomics-værktøjer, der bruges til at identificere, kvantificere og karakterisere metabolitter. Denne "omics" tilgang kan også anvendes til biomarkøropdagelse og lægemiddeludvikling10,11.

I betragtning af den specifikke vævstropisme af trypanosomatidparasitter kan rumlige metabolomics-analyser muliggøre betydelig indsigt i patogenesen af de sygdomme, de forårsager. Kortlægning af den rumlige fordeling af metabolitter afslørede metabolitter lokalt påvirket af kronisk Trypanosoma cruzi-infektion i musehjertevæv og akut og langvarig Trypanosoma cruzi-infektion i musens mave-tarmkanalen6,12,13. Specifikt viste 3D-kemisk kartografi en afbrydelse mellem parasitesistens og metaboliske ændringer i hjertevævet hos kronisk Trypanosoma cruzi-inficerede mus. Metabolisme var mest forstyrret i nedre og apikale segmenter af hjertet, der matchede med steder af Chagas sygdom symptomer (hjerte apikale aneurismer). Metabolitfamilier forstyrret af infektion på specifikke hjertesteder og korreleret med sygdommens sværhedsgrad omfatter acylcarnitiner og glycerophosphocholiner12,13,14. I mave-tarmkanalen var vedvarende metaboliske ændringer i uenige med steder med Chagas sygdom symptomer: spiserør og tyktarm. I modsætning hertil normaliseres stofskiftet igen på steder, der ikke er forbundet med Chagas sygdomssymptomer, såsom tyndtarmen. Metabolitter lokalt forstyrret af infektion i mave-tarmkanalen omfatter acylcarnitiner, glycerophosphocholiner, kynurenin, tryptophan og cholsyre. Desuden gjorde disse analyser det muligt at identificere en ny metabolisk mekanisme for tolerance over for Chagas sygdom6. Anvendelse af disse metoder til undersøgelse af kutan leishmaniasis afslørede signifikante metaboliske forstyrrelser på læsionsstedet, men også specifikke metaboliske ændringer i læsionstilstødende, makroskopisk sundt væv. For eksempel blev glutamin udtømt på læsionsstedet, mens glycerophosphocholiner i m / z (masse til ladningsforhold) 200-299, 400-499, 500-599 og 600-699 blev signifikant øget på læsionsstedet. PC (O-34:1) blev kun øget på læsions-tilstødende steder15.

Målet med dette manuskript er at demonstrere de trin, der er nødvendige for at generere 3D-modeller af metabolitfordeling ("kemisk kartografi") som anvendt på trypanosomatidparasitinfektionsmodeller (figur 1). Denne tilgang bygger på flere kritiske fremskridt i forbindelse med metabolomics og metabolomics databehandling, især udviklingen af 'ili-software til let at plotte metabolomics-data på 3D-modeller16.

Protocol

Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af University of Oklahoma eller University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committee. Alle trin, der håndterer smitsomt materiale, blev udført inde i et biosikkerhedsskab (klasse II, type A2) og i henhold til lokale regler.

1. Vævsopsamling

  1. Inficere passende trypanosomatid infektion dyremodeller, generelt mus eller hamstere.
    BEMÆRK: Der er et stort udvalg af musemodeller for trypanosomatidinfektion, afhængigt af de ønskede symptomer, der skal produceres, sygdomsprogressionshastighed, sygdommens sværhedsgrad osv. Brugerne kan vælge, når det passer dem.
    1. For kutane leishmaniasis infektionsmodeller, inficere subkutant i trædepuden eller intradermalt i øret15.
    2. For viscerale leishmaniasis infektionsmodeller inficeres intravenøst1,17.
    3. For Chagas sygdom og sovesyge infektionsmodeller, inficere intraperitonealt6,12,18,19. Bestem parasitdosis, der skal anvendes, baseret på parasitstammen og planlagte tidspunkter.
  2. Planlæg sektioneringspositioner.
    1. Planlæg at generere sektioner med mindst 10 mg væv pr. Sektion. Det er bedst at bruge 30-50 mg.
    2. For Chagas sygdom infektionsmodeller, planlægge at indsamle hjerte- og gastrointestinale segmenter systematisk.
    3. For kutane leishmaniasis infektionsmodeller, indsamle læsionsvæv og læsion-tilstødende prøver.
    4. For viscerale leishmaniasis infektion modeller, planlægge at indsamle milt og flere leverlober. Yderligere vævssteder såsom fedtvæv kan også være af interesse at indsamle.
      FORSIGTIG: Prøver fra inficerede dyr skal håndteres i henhold til den relevante, institutionelt godkendte biosikkerhedsprotokol. Dette vil generelt indebære krav om personlige værnemidler (PV) og kun åbning af rør og indsamling af prøver inde i et biosikkerhedsskab (klasse II, type A2).
  3. Mærk og vej rør til homogenisering.
    1. Brug den rørtype, der passer til det tilgængelige homogeniseringssystem. For en TissueLyser skal du bruge 2 ml mikrocentrifugerør.
    2. Afliv mus på de ønskede infektionstidspunkter ved hjælp af isofluranoverdosering som godkendt af institutionel IACUC eller i henhold til IACUC-godkendt protokol.
    3. Sektionsvæv systematisk som planlagt, med en sektion pr. Rør.
    4. Husk at vaske prøveopsamlingsudstyr mellem prøver med ekstraktionsopløsningsmiddel (50% methanol i denne protokol).
  4. Hold rørlåget åbent, og klik straks fryseprøver i flydende nitrogen.
    FORSIGTIG: Luk ikke rør, før flydende nitrogen, der kommer ind i røret, er helt fordampet for at forhindre rør i at eksplodere, når nitrogen udvides. Tag passende skridt til at sikre, at huden ikke kommer i kontakt med flydende nitrogen (brug kryohandsker og tang til at holde rørene). Brug en sikkerhedsskærm.
  5. Opbevar rørene på tøris, indtil alle de ønskede prøver er indsamlet.
  6. Pausepunkt: Opbevar prøver ved -80 °C, indtil de er klar til ekstraktioner.
  7. Vejerør til bestemmelse af vævsprøvens vægt. Optag i et regneark.
    1. Hold prøverne frosne under vejningen: Opbevar rørene på tøris, vej hurtigt, læg dem på tøris igen med det samme. Lad ikke prøverne tø op under vejning.

2. Ekstraktion af metabolit

BEMÆRK: Der må kun anvendes væsker og reagenser af LC-MS-kvalitet overalt. Denne metode blev tilpasset fra Reference20.

  1. Forbered alle ekstraktionsmidler (LC-MS-klasse H2O, LC-MS-kvalitet methanol, spidset med 4 μM sulfachlorpyridazin, LC-MS-kvalitet dichlormethan: methanol spiket med 2 μM sulfachlorpyridazin) i 1 L glasflasker ved hjælp af dedikeret glasvarer.
    BEMÆRK: Den mængde, der skal fremstilles, bør beregnes på grundlag af prøvens vægt under hensyntagen til 500 μL vand pr. 50 mg prøve, 500 μL methanol spidset med 4 μM sulfachlorpyridazin pr. 50 mg prøve og 1 000 μL forkølet dichlormethan: methanol spidset med 2 μM sulfachlorpyridazin pr. 50 mg prøve, hvilket øger det beregnede volumen med 10 % for at muliggøre pipetteringsnøjagtighed. Opbevar ekstraktionsopløsningsmiddel ved 4 °C mindst natten over for at forkøle.
  2. Udfør vandbaseret homogenisering af vævsprøverne i henhold til nedenstående trin.
    1. Tilsæt en 5 mm rustfri stålperle (se materialetabel) til hvert af de 2 ml mikrocentrifugerør, der indeholder vævsprøver, ved hjælp af en perledispenser. Hold rørene på is.
    2. Lav et tomt rør, der indeholder LC-MS-klasse H2O, der gennemgår alle trin og fungerer som et ekstraktionsemne. Brug det gennemsnitlige H2O-volumen fra prøveekstraktioner. Tilsæt kølet LC-MS klasse H2O til de frosne vævsprøver.
      1. Normaliser vandvolumen til vævsvægt ved at tilsætte 500 μL vand / 50 mg prøve ved hjælp af prøvevægtene beregnet på trin 1.7.
        FORSIGTIG: Ved håndtering af biofarlige prøver skal du fortsætte med at følge den relevante, institutionelt godkendte biosikkerhedsprotokol. Dette vil generelt kun omfatte krav til personlige værnemidler (PV'er) og åbningsrør inde i biosikkerhedsskabet (klasse II, type A2).
    3. Homogeniser prøver ved 25 Hz hastighed i 3 minutter ved hjælp af en vævshomogenisator (se tabel over materialer).
      1. Luk rørene tæt for at undgå spild af reagenserne under behandlingen.
    4. Indsaml ca. 1/10 af homogeniseringsvolumenet til DNA-ekstraktion, qPCR, proteinbaserede analyser eller andre analyser (hvis ønsket). Opbevares i et mikrocentrifugerør eller en plade med 96 brønde (afhængigt af det opsamlede volumen) i op til 6 måneder ved -80 °C, hvis DNA-ekstraktionsforsøg skal udføres på en anden dag. Længere opbevaringstider kan være mulige, men er ikke blevet testet.
      1. Udfør DNA-ekstraktioner ved hjælp af et hvilket som helst standard kommercielt kit til DNA-ekstraktion af pattedyr (se tabel over materialer) fra væv som beskrevet i reference13. Kvantificer DNA-udbyttet, og opbevar det ekstraherede DNA ved -20 °C. Acceptabel DNA-mængde og kvalitet for qPCR er blevet observeret selv op til 3 år senere.
        BEMÆRK: Dette trin kan udføres på frosset homogenat på en efterfølgende dag fra metabolitekstraktion.
      2. Udfør qPCR som beskrevet i Reference13 ved hjælp af 180 ng ekstraheret DNA.
        BEMÆRK: Dette kan udføres på DNA indsamlet på en tidligere dag og frosset ved -20 ° C.
        1. I tilfælde af undersøgelser af T. cruzi-infektion skal du anvende følgende primere: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA og AATTCCTCCAAGCAGCGGATA til at kvantificere parasitniveauer21 og følgende primere til normalisering til værts-DNA-niveauer: TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA og CAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22 (se materialetabel).
          BEMÆRK: De anbefalede qPCR-cyklusser er som følger: denaturer ved 95 °C i 10 minutter; udføre 40 cyklusser ved 95 °C i 30 s, derefter 58 °C i 60 s og til sidst 72 °C i 60 s. Udfør smeltekurveanalyse efter behov for den tilgængelige termocyklist. Behandle data ved hjælp af ΔΔCt-metoden23 for at opnå relativ parasitbelastning mellem prøveudtagningssteder. Absolut kvantificering kan opnås ved at sammenligne prøveafledte ΔΔCt-værdier med en standardkurve genereret fra kendte mængder parasitter, spiket i uinficerede vævsprøver og ekstraheret som i trin 2.2 til 2.2.4.1.
      3. Udfør proteinbaseret karakterisering af immunresponser ved hjælp af multiplexerede cytokinsæt eller standard kommercielle ELISA-sæt (se materialetabel) som beskrevet i Reference13 på det lagrede homogenat.
    5. Spar mindst halvdelen af homogeniseringsvolumenet på 500 μL til metabolitekstraktion.
  3. Udfør vandig metabolitekstraktion.
    BEMÆRK: Valg af opløsningsmiddel kan tilpasses baseret på de kemiske egenskaber af metabolitter af interesse.
    1. Der tilsættes iskold methanol af LC-MS-kvalitet spidset med 4 μM sulfachlorpyridazin til homogenatet for at opnå en endelig koncentration på 50 % methanol med 2 μM sulfachlorpyridazin i vand.
      FORSIGTIG: Methanol er brandfarligt og farligt. Brug passende sikkerhedsprocedurer, herunder håndtering inde i en stinkhætte eller et biosikkerhedsskab.
    2. Homogeniser prøver i en vævshomogenisator ved 25 Hz hastighed i 3 min. Centrifugeprøver ved 16.000 x g ved 4 °C i 10 min.
    3. Saml et lige stort volumen supernatant i en 96-brøndplade. Vælg det volumen, der svarer til det mindste volumen methanol + vand kombineret på tværs af alle prøver. Dette er den vandige fraktion.
      1. Eventuelle resterende vandige homogene supernatant ved -80 °C lægges til side som backup.
    4. Opbevar den faste rest på is, mens du samler supernatanterne.
    5. Tør vandig ekstraktionssupernatant, indtil den er tør (~ 3 timer eller natten over). Brug maksimal hastighed og ingen opvarmning.
    6. Frys den tørrede 96-brøndplade ved -80 °C.
  4. Udfør organisk metabolitekstraktion.
    BEMÆRK: Valg af opløsningsmiddel kan tilpasses baseret på de kemiske egenskaber af metabolitter af interesse.
    1. Der tilsættes 1 000 μL pr. 50 mg af prøven af forkølet dichlormethan: methanol spidset med 2 μM sulfachlorpyridazin til den faste rest fra trin 2.3.4.
      FORSIGTIG: Brug passende sikkerhedsprocedurer ved håndtering af opløsningsmidler, herunder håndtering inde i en stinkhætte med en god strømningshastighed.
    2. Homogeniser prøver i en vævshomogenisator ved 25 Hz hastighed i 5 minutter. Centrifugering af prøverne ved 16.000 x g ved 4 °C i 10 min.
    3. Saml et lige stort volumen supernatant i en 96-brøndplade. Vælg det volumen, der svarer til det mindste volumen dichlormethan: methanol, på tværs af alle prøver. Dette er den organiske fraktion.
    4. Opbevar pillen ved -80 °C som backup. Opbevar det resterende organiske ekstrakt ved -80 °C som backup. Lufttør det organiske ekstrakt i en stinkhætte natten over.
    5. Frys den tørrede 96-brøndplade ved -80 °C.

3. LC-MS dataindsamling

  1. Resuspend vandige og organiske ekstrakter til 60 μL hver af 50% methanol + 2 μM sulfadimethosin, og kombiner. Sonikat i 10 minutter; centrifuger derefter i 10 minutter og overfør supernatanten til en ren 96-brøndplade. Forsegl med zonefri pladeforsegling, og anbring pladen i en LC-autosampler.
    FORSIGTIG: Brug passende sikkerhedsprocedurer ved håndtering af opløsningsmidler, herunder håndtering inde i en stinkhætte med en god strømningshastighed.
  2. Tilslut passende mobile faser til LC-systemet (se tabel over materialer).
    BEMÆRK: For positiv tilstand omvendt fase LC anbefaler forfattere LC-MS-grade H2O + 0,1% myresyre som mobil fase A og LC-MS-grade acetonitril + 0,1% myresyre som mobil fase B med en strømningshastighed på 0,5 ml / min og en 7,5 min LC gradient. Anbefalede gradienttrin er som offentliggjort i Reference6: 0-1 min, 2% B; 1-2,5 min, lineær stigning til 98% B; 2,5-4,5 min, hold ved 98% B; 4,5-5,5 min, lineært fald til 2% B; 5,5-7,5 min, hold ved 2% B.
  3. Sørg for, at instrumentet er rent. Kalibrer MS i både positiv og negativ tilstand.
  4. Udfør evaluering af medlemsstaternes ydeevne, hvor det er relevant for instrumentet.
  5. Opret MS-kørselssekvens.
    1. Start med 2 emner, 2 standarder (6-blandinger) og 5 samlede kvalitetskontroller (QC) i en fortyndingsserie, der begynder ved 2 μL injektionsvolumen og øges trinvist til 30 μL injektionsvolumen.
    2. Randomiser prøverækkefølgen.
    3. Efter hver 12 prøver skal du køre et tomt og derefter en samlet QC.
  6. Tilslut C8 LC-søjlen (1,7 μm partikelstørrelse, 100 Å porestørrelse, 50 x 2,1 mm længde x indvendig diameter) og overvåg for lækager og overdreven modtryk. Løs problemer i henhold til instrumentets standarddriftsprocedure.
  7. Start MS-kørselssekvensen, og indsaml dataafhængige LC-MS/MS-data.
    BEMÆRK: For et Q-Exactive Plus MS-instrument skal du bruge opvarmet elektrosprayionisering og dataafhængig MS2-erhvervelse (top 5) i positiv tilstand, en opløsning på 70.000 for MS1 og 17.500 for MS2, AGC-mål på 1E6 for MS1 og 2E5 for MS2, maksimal IT på 100 ms for både MS1 og MS2, scanningsområde til 100-1500 m/z for MS1, og MS2 isolationsvindue på 1 m/z. Indstil kappegas til 35, aux gas til 10 og fej gas til 0, sprøjtespænding til 3,8 kV, kapillærtemperatur til 320 ° C, S-linse RF-niveau til 50 og aux-gastemperatur til 350 ° C.
    1. Kontroller datakvaliteten: Kontroller indledende emner (bekræft mangel på større toppe), standarder (bekræft tilstedeværelsen af forventede toppe og symmetrisk topform) og QC'er (bekræft tilstedeværelsen af forventede toppe, topform og forventet topintensitet).
    2. Overvåg regelmæssigt MS-kørsel under kørselssekvensen.
  8. Når kørslen er afsluttet, skal du kontrollere dataene for eventuelle ubesvarede injektioner eller andre fejl.
  9. Opbevar LC-kolonnen som anbefalet af producenten. Prøverne fjernes og opbevares ved -80 °C.
  10. Upload rådata til datalageret.
    BEMÆRK: MassIVE (massive.ucsd.edu) anbefales for at muliggøre downstream-forbindelsen til molekylært netværk for metabolitanmærkninger24,25.

4. LC-MS databehandling

  1. Konverter raw-filer til åbent format (.mzXML eller .mzML) ved hjælp af MSConvert26.
    1. Upload rådata og mzXML- eller mzML-data til datalageret.
  2. Generer funktionstabel. Der er flere værktøjer til at gøre det (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS osv.27,28,29,30).
    BEMÆRK: MZmine anbefales, fordi det er gratis, open source og direkte kan importere mzXML-filer efter MSconvert, har grafiske brugergrænsefladeindstillinger til behandling af data og overvågning af virkningen af parametervalg og kan eksportere direkte til GNPS til molekylært netværk24.
    BEMÆRK: Følg værktøjsdokumentationen, og brug parametre, der passer til det tilgængelige instrument. Yderligere oplysninger findes også i Reference31.
    1. Eksporter funktionstabel i .csv format.

5.3D model generation

  1. Håndtræk 3D-model de novo til skala i henhold til nedenstående trin.
    1. Tag et billede af organet af interesse.
    2. Udfør følgende i SketchUp-software (se Tabel over materialer) som nævnt nedenfor.
      1. Slet standardbilledet af en mand, der vises, når softwaren åbnes.
      2. Klik på Filer > Importer for at importere et billede af de organer, der er af interesse.
      3. Klik på værktøjet Linjer , og vælg indstillingen Frihånd . Brug blyantværktøjet til at spore og tegne konturerne af de organer, der er af interesse. Sørg for at lukke linjen ved at tegne helt tilbage til udgangspunktet. Når linjen er blevet lukket, vises det tegnede område automatisk skyggefuldt.
      4. Vælg Push/Pull-værktøjet , og træk op i det skraverede område for at konvertere tegningen fra 2D til 3D.
      5. Slet orgelbilledet: Vælg knappen Viskelæder , og højreklik derefter på billedet, og vælg Slet.
      6. Eksporter filen i . dae-format: File > Export > 3D-model.
    3. Forbedre modellens realisme i henhold til nedenstående trin.
      1. Importer modellen til MeshLab-software (se Tabel over materialer): Åbn MeshLab, og vælg File > Import Mesh. Vælg den .dae-model, der blev genereret på det forrige trin. En menu med indstillinger forud for åbning vises. Vælg OK.
      2. Vælg Wireframe i topmenuen. Vælg derefter: Filtre > Remeshing, Forenkling og Rekonstruktion > Underinddelingsoverflader: Midtpunkt. Lad alle værdier være standard, og vælg Anvend to gange. Undersøg visuelt wireframe-visningen af modellen for at sikre, at den er fint ristet. Luk lokalmenuen.
      3. Eksporter modellen i .stl-format: File > Export Mesh As, og vælg derefter STL File Format (*.stl) i rullemenuen Filtype . Klik på Gem. Vælg OK i den næste pop op-menu.
      4. Åbn Meshmixer-softwaren (se Tabel over materialer). Klik på knappen Importer (+ ). Vælg den .stl-fil , der blev genereret ved forrige trin. Brug Sculpt > Brushes > Drag and Sculpt > Brushes > Inflate værktøjer til at trække modellens overflader ud, der skal afrundes.
      5. Når modellen har det ønskede udseende, skal du gemme den i . stl-format: File > Export. Navngiv filen som ønsket, og vælg STL Binary Format (*.stl) i rullemenuen Gem som type. Klik på Gem. Hvis der vises en pop op-menu, skal du klikke på Fortsæt.

6. 'ili plot generation

  1. Få koordinater for de positioner i 3D-modellen, der svarer til prøveudtagningsstederne.
    1. Åbn 3D-modellen fra trin 5.1.3.5 i MeshLab-softwaren : File > Import Mesh. Vælg den model, der blev genereret i trin 5.1.3.5. Klik på OK i pop op-vinduet Post-Open Processing .
    2. Sådan får du x-, y- og z-koordinater for hvert prøvetagningssted: Vælg værktøjet PickPoints , og højreklik derefter med regelmæssigt adskilte intervaller på tværs af 3D-modellens overflade. Når alle de ønskede koordinater er valgt, skal du klikke på den øverste knap Gem i pop op-vinduet Formular .
      BEMÆRK: Dette eksporterer koordinaterne i .pp-filformat. Denne fil kan åbnes i regneark software.
    3. I regnearkssoftware: Åbn .pp-filen, der blev genereret i trin 6.1.2. Juster datavisningen ved hjælp af Data > Tekst til Kolonner > Afgrænset. Klik på Næste, og vælg derefter Mellemrum, og klik på Udfør.
    4. Omformater, så kun numeriske værdier forbliver i regnearkscellerne, ved at vælge Hjem > Find og vælg > Erstat. I feltet Find hvad skal du indtaste: y =". Lad feltet Erstat med være tomt. Klik på Erstat alle og derefter på OK. Gentag for x =" og for z = " og for " / >. Værdierne er nu klar til trin 6.2.
  2. Lav 'ili-funktionstabellen. Denne metode blev tilpasset fra Reference16.
    1. Byg funktionstabellen i en regnearkssoftware. Rækker svarer til hver position og kolonner til data.
      BEMÆRK: De første kolonner skal være positionsnavnet (eksempelnavn) efterfulgt af x-, y- og z-koordinater for prøveudtagningspunkterne opnået i trin 6.1.2 (med kolonneoverskrifter x, y, z). Den femte kolonne skal have titlen "radius".
    2. Indsæt de relevante metadata og metabolitfunktionens overflod i de efterfølgende regnearkskolonner.
    3. I kolonnen "radius" skal du indtaste den ønskede størrelse af de prøveudtagningssteder, der skal visualiseres på modellen. Bestem værdierne for radius empirisk: Indtast 1 som standard, og vurder derefter, om radius eller koordinater skal justeres i trin 6.3. Gem filen i .csv format (Fil > Gem som), og vælg derefter CSV (Kommasepareret) (*.csv) i rullemenuen. Navngiv filen som ønsket. Klik på Gem.
  3. Åbn dataene i 'ili (software udviklet af16).
    1. Åbn 'ili-webstedet (ili.embl.de). Vælg Overflade. Træk og slip den oprettede 3D-model i browservinduet. Træk og slip den oprettede funktionstabel i det samme browservindue.
    2. Brug forklaringen i nederste højre hjørne til at projicere den ønskede datakolonne på 3D-modellen. Sørg for, at de steder og radier, der er valgt i trin 6.2.1, stemmer overens med prøveudtagningsstederne. Juster om nødvendigt værdierne i funktionstabellen, eller vælg yderligere koordinater i MeshLab (se trin 6.1.2).
      BEMÆRK: Visualisering kan også forbedres ved at vælge Spots > Border Opacity og indstille skyderen til sin maksimale værdi.
    3. Vælg hver datakolonne fortløbende for at vurdere fordelingen af denne metabolitfunktion på 3D-modellen.
      BEMÆRK: Denne fremgangsmåde kan også bruges til kun at visualisere specifikke metabolitegenskaber af interesse, for eksempel dem med p-< 0,05 eller en vis foldændring mellem inficerede og uinficerede prøver, som bestemt i eksterne statistiske analyseværktøjer. Funktioner, der skal visualiseres, kan også vælges uden for 'ili gennem maskinlæringsmetoder såsom en tilfældig skov.
  4. Udfør lineær / log datavisualisering i henhold til nedenstående trin.
    1. Brug fanen Tilknytning øverst til højre på siden til at vælge Lineær eller Logaritmisk i rullemenuen Skaler .
    2. Indstil den samme skala for alle afbildninger, hvis du visualiserer flere funktioner.
      BEMÆRK: Webstedet vælger automatisk minimum og maksimum for hver datakolonne, der skal vises.
    3. Hvis du vil indstille skalaen manuelt, skal du fravælge indstillingen Auto Min/Max og indtaste den ønskede skalering. Alle data vises nu inden for samme skala.
  5. Skift farveskalaen for dataene (gråtoner, blå-hvid-rød osv.).
    1. Skift farveskalaen til det ønskede farveskema i menuen Tilknytning ved hjælp af rullemenuen Farvekort . Sørg for, at det valgte farveskema er farveblindt venligt.
  6. Hvis du vil ændre farven på 3D-modellen eller baggrundsfarven, skal du bruge indstillingerne Farve og Baggrund i 3D-menuen.
  7. Skjul 3D-akser ved at fjerne markeringen i feltet Vis Oprindelse i 3D-menuen.
  8. Gem billedet ved screenshotting, ved hjælp af udskæringsværktøjet eller genvejstasten Crtl + S til Windows eller Linux og Equation 1+ S på OS X.

Representative Results

Antallet af opnåede metabolitegenskaber afhænger af den analyserede vævstype og databehandlingsparametre. For eksempel er denne protokol blevet brugt til at analysere den rumlige virkning af T. cruzi-infektion på mave-tarmkanalens metabolom i en musemodel af T. cruzi-infektion. I tidligere arbejde blev mandlig C3H/HeJ injiceret intraperitonealt med 1.000 CL + luc T. cruzi parasitter32,6. Dyr blev aflivet 12 eller 89 dage efter infektion, og en kemisk kartografianalyse af 13 sammenhængende segmenter af mave-tarmkanalen blev udført som beskrevet i denne protokol. Denne analyse førte til en funktionstabel med 5.502 funktioner, som derefter blev visualiseret til 3D ved hjælp af de trin, der er beskrevet i denne protokol. Denne fremgangsmåde muliggør visualisering af metabolitegenskaber hos individuelle dyr, der er høje på stedet for høj parasitbelastning (kynurenin, figur 2B vs. parasitbelastning, figur 2A), af metabolitter med differentiel fordeling på tværs af vævsregioner (glutamin, figur 2C) og metabolitegenskaber, der findes på sammenlignelige niveauer på tværs af tyndtarmen og tyktarmen (LPE 16:0 Figur 2D ). Kynurenin blev udvalgt til visualisering på grund af dets kendte forhold til inflammation og tidligere publikationer om kynureninafledte metabolitters evne til at regulere T. cruzi load33. Tilfældige skovbaserede maskinlæringsmodeller havde tidligere afsløret en sammenhæng mellem kynureninniveauer og infektionsstatus6. Glutamin blev udvalgt til en visualisering baseret på tidligere publikationer, der viste et forhold mellem in vitro-glutamintilgængelighed og T. cruzi-lægemiddelfølsomhed34. Differentiel fordeling blev bekræftet ved hjælp af logistisk regression, p < 0,05. LPE 16:0 blev udvalgt efter visuel inspektion af dataene for at opdage metabolitegenskaber fundet på sammenlignelige niveauer på tværs af vævssteder.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over protokollen. Illustrationen blev oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kemisk kartografianalyse. C3H/HeJ-mus til hankøn blev injiceret intraperitonealt med 1.000 CL+luc T. cruzi-parasitter32. Dyr blev aflivet 12 eller 89 dage efter infektion, og mave-tarmkanalen blev indsamlet og sektioneret systematisk (trin 1)6. Metabolitter blev ekstraheret som i trin 2 og analyseret af LC-MS / MS.3D modelgenerering blev udført ved hjælp af SketchUp-softwaren (trin 5), og data blev plottet i 3D som i trin 6. A) Parasitens fordeling i en bestemt mus 12 dage efter infektion. (B) Fordeling af Kynureninmetabolit i samme mus 12 dage efter infektion. (C) Gennemsnitlig glutaminfordeling på tværs af inficerede mus, 89 dage efter infektion. D) Sammenlignelige niveauer af m/z 454.292 retentionstid 2.929 min., kommenteret som 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (LPE 16:0), i samme mus som i A og B i tyndtarmen og tyktarmen. Prøver og data blev genereret i6. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Forståelse af trypanosomatidinfektioner er afgørende for at guide nye lægemiddeludviklings- og behandlingsmetoder. Denne kemiske kartografimetode er unikt klar til at give handlingsrettet indsigt i forholdet mellem metabolisme og trypanosomatid sygdomspatogenese og dermed imødekomme dette translationelle behov.

Kun opløsningsmidler af LC-MS-kvalitet anbefales under metabolitekstraktion og MS-analyser for at mindske baggrundsforurening. Polymerkontaminering35, der almindeligvis stammer fra paraffinfilm og/eller anden plast36,37,38, skal så muligt undgås. Især parafilm må aldrig bruges. Disse aspekter er afgørende, da LC-MS-datakvaliteten afhænger af de materialer, der anvendes under prøveforberedelse og metabolitekstraktion. Datakvaliteten bør sikres, inden der genereres »ili-plots«. Desuden kræver generering af disse omfattende rumlige metabolomics-kort indsamling af alle tilstødende vævsprøver og metabolitekstraktion fra alle indsamlede prøver for at undgå huller i disse kort. Indsamlingsprocedurer, logistik i forbindelse med metabolitekstraktion og LC-MS-analyse samt omkostninger bør derfor overvejes og planlægges i overensstemmelse hermed.

Denne protokol kan ændres for at imødekomme brugernes behov på flere måder. For eksempel vil polariteten og opløseligheden af opløsningsmidler, der anvendes under metabolitekstraktion, påvirke, hvilke metabolitter der påvises39. For at maksimere mangfoldigheden af påviste metabolitegenskaber til ikke-målrettede kemiske kartografianalyser anbefales det at kombinere flere ekstraktionstrin og opløsningsmidler. For eksempel anvender denne metode dichlormethan, methanol og vand som ekstraktionsmidler, fordi de muliggør nøjagtig påvisning af ikke-polære og polære molekyler20,40. Disse opløsningsmidler er imidlertid ikke universelt egnede til hvert MS-eksperiment, og forskere bør vælge ekstraktionsopløsningsmidler baseret på målene for deres projekt. Ligeledes kan forskellige LC-MS/MS-betingelser anvendes, såsom udskiftning af omvendt fasekromatografi med normal fasekromatografi. Alternative kolonner kan også bruges til omvendt fase dataindsamling i stedet for C8-kromatografi, selvom C8-kromatografi empirisk er mere robust over for vævslipider og har en lavere tilstopningsfrekvens. Konceptuelt kan disse protokoller også anvendes på andre massespektrometrimetoder såsom gaskromatografi-massespektrometri osv.

En alternativ tilgang er massespektrometribilleddannelse. I modsætning til massespektrometribilleddannelsesmetoder bevarer væskekromatografi-massespektrometri ikke i sig selv rumlig information10. Kemisk kartografi tilgange bygger bro over dette hul ved at inkludere prøveudtagningssted på tidspunktet for projektkonceptualisering, i prøvemetadataene og ved databehandlingstrin. En styrke ved denne kemiske kartografitilgang, i modsætning til massespektrometribilleddannelse, er evnen til at give selvsikre kommentarer (Metabolomics Standards Initiative niveau 1 eller niveau 2 annotationstillid41), i modsætning til massespektrometribilleddannelse, hvor størstedelen af applikationerne kun er afhængige af nøjagtig masse til anmærkning. Massespektrometribilleddannelse muliggør finkornet rumlig kortlægning, nogle gange ned til enkeltcelleniveau, f.eks. 42,43. I modsætning hertil muliggør kemisk kartografitilgange storstilet kortlægning på tværs af organer af metabolitfordeling uden at kræve højt specialiserede kryosektionsfærdigheder for hele dyr. Kemisk kartografi giver supplerende dokumentation for de mange rumlige transkriptomiske tilgange, der udvikles, f.eks. 44, med den fordel, at der fokuseres på 'omics-laget tættest på fænotypen'45. Alternative metoder til kvantificering af parasitbelastning omfatter måling af bioluminescens på tidspunktet for prøveindsamling6. Fine segmenter kan også indsamles for at muliggøre konfokal eller elektronmikroskopi for at vurdere lokaliseret parasitbyrde og vævsskade. Vandhomogenatet, som anvendes til cytokinkvantificering i denne protokol og tidligere publikationer13, kan også bruges til at kvantificere proteinbaserede markører for vævsskade.

Der er også flere måder at få 3D-modeller, der er egnede til at plotte de resulterende LC-MS-data. Ud over den metode, der foreslås her, kan modeller købes forudfremstillet fra forskellige online leverandører. Sørg for, at vilkårene for brug stemmer overens med den tilsigtede brug, især med hensyn til offentliggørelse. Modeller til store organer kan genereres de novo ved hjælp af 3D-scannere i henhold til scannerinstruktionerne. Der findes alternativer som MATLAB til generering og visualisering af 3D-modeller til kemisk kartografi46, men de blev primært implementeret før udviklingen af 'ili16. MATLAB er en dataanalyse- og programmeringsværktøjspakke, der tilbyder en bred vifte af applikationer på tværs af mange områder. MATLAB er dog hverken gratis eller open source, og det kræver kendskab til MATLAB-grænseflader, især i betragtning af at MATLAB ikke blev udviklet til behandling af massespektrometridata. Denne foreslåede metodes alternativer, nemlig SketchUp, Meshlab og 'ili, er frit tilgængelige, brugervenlige og tilbyder lignende funktioner som MATLAB til kemiske kartografiformål.

Denne metode er robust med hensyn til prøveforberedelse og metabolitekstraktion. Fejlfinding er oftest nødvendig på LC-MS-dataindsamlingstrinnet. Dette ligger uden for denne artikels anvendelsesområde. Læsere ledes til fremragende publikationer om fejlfinding af LC-MS-dataindsamling, herunder 20,47. Ligeledes er kompleksiteten af metabolitannotation uden for rammerne af denne metodes fokus på 3D-modelgenerering. Nyttige referencer om dette emne omfatter24,25,48,49.

Mens denne metode effektivt udforsker sygdomspatogenese, er der begrænsninger for denne tilgang, hvoraf nogle er almindelige på tværs af ethvert metabolomics-eksperiment. En sådan begrænsning er den lave annotationsrate for LC-MS-funktioner50, som er betinget af referencespektralbibliotekernes tilgængelighed og kvalitet. En yderligere begrænsning er, at denne protokol ikke bevarer mRNA på grund af uforeneligheden af RNA-konserveringsreagenser såsom RNAlater med LC-MS / MS-analyse. Proteinkvaliteten er dog tilstrækkelig til downstream-analyser og kan dermed erstatte mRNA-baserede analyser.

En kemisk kartografi tilgang til infektionspatogenese afspejler direkte, hvordan bakterielle, virale eller parasitære infektioner udvikler sig i organsystemer og forårsager lokaliseret sygdom. Analyse af disse regionale delprøveudsampler og generering af 3D-modeller formidler i sidste ende, hvordan metabolitter fungerer på tværs af tredimensionelt rum og kaster lys over disse tidligere ukendte rumlige dimensioner af molekylærbiologi. Ved hjælp af denne protokol blev metabolitlokalisering for eksempel sammenlignet med Trypanosoma cruzi parasitbelastning. Resultaterne afklarede forholdet mellem patogenet og værtsvævet og demonstrerede også den metaboliske dynamik i Chagas sygdom symptom progression6. Kemiske kartografimetoder er også blevet anvendt på forskellige emner, såsom menneskebygget miljøinteraktion51,52,53, den kemiske sammensætning af organsystemer som menneskelig hud46 og lunger54 og plantemetabolisme og miljøinteraktioner55. Fremtidige anvendelser kan involvere vurdering af lokaliseret sygdomstolerance og modstandsdygtighed eller forholdet mellem lokale metabolitniveauer, patogentropisme og sygdomstropisme i modeller ud over trypanosomatidinfektion. Denne tilgang bør også have bred anvendelighed til at udvide de nuværende farmakokinetiske protokoller, til at vurdere forholdet mellem lokale vævslægemiddelniveauer og lægemiddelmetabolisme i forhold til den samlede metaboliske kontekst, vævsskade og patogenclearance. Samlet set tillader kemisk kartografi unikke udforskninger af metabolitfordelinger i forskellige prøvetyper med anvendelser, herunder sygdomspatogenese, menneskers sundhed, interaktioner mellem mennesker og miljø og mikrobiel dynamik.

Disclosures

Ingen interessekonflikter at indberette.

Acknowledgments

Laura-Isobel McCall, ph.d., har en Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Award fra Burroughs Wellcome Fund. Forfatterne ønsker endvidere at anerkende støtte fra NIH-prisnummer R21AI148886, et pilottilskud fra Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) under NIH-tildelingsnummer P20GM103648 og opstartsmidler fra University of Oklahoma (til LIM). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis bidragydernes officielle synspunkter. Forfatterne ønsker også at takke udviklerne af de værktøjer, der bruges i denne protokol. Alle relevante publikationer er blevet citeret, hvor det er relevant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tubes NA NA any brand, as available
1 L bottle, pyrex NA NA any brand, as available
1 L graduated cylinder, pyrex NA NA any brand, as available
2 mL SafeLock Eppendorf tubes VWR 20901-540 use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) NA NA as appropriate for system under investigation
5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
96 well plate Fisher 3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
analytical balance NA NA any brand, as available
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
biosafety cabinet NA NA class II, type A2; any brand, as available
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
camera NA NA any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol
chemiluminescent-capable imaging system NA NA any system, as available
cotton balls NA NA any brand, as available
cryogloves VWR 97008-208 replace with any brand, as available
dissection scissors NA NA any brand, as available
dry ice NA NA any brand, as available
extra-length forceps NA NA any brand, as available
flammable-grade refrigerator NA NA any brand, as available
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes NA NA any brand, as available
fume hood NA NA any brand, as available
high-resolution mass spectrometer NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)
ice bucket NA NA any brand, as available
ili software ili.embl.de NA
isoflurane Covetrus 29405
large tupperware NA NA any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball
LC-MS grade acetonitrile Fisher Optima A955-4
LC-MS grade dicholoromethane Fisher Optima D151-4
LC-MS grade formic acid Fisher Optima A11750
LC-MS grade methanol Fisher Optima A456-4
LC-MS grade water Fisher Optima W64
liquid chromatography column Phenomenex 00B-4499-AN may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge Phenomenex AJ0-8784 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid nitrogen NA NA any brand, as available
luciferin Goldbio LUCK-1G
MeshLab software https://www.meshlab.net/ NA
Meshmixer software https://www.meshmixer.com/ NA
MS calibrant NA NA appropriate one for available instrument
MS data processing software NA NA multiple options available; authors recommend MZmine
MSConvert software http://proteowizard.sourceforge.net/ NA
Nanodrop ThermoFisher ND-ONE-W other nanodrop models are also suitable
p1000 pipet tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p1000 pipettor NA NA any brand, as available
p20 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p20 pipettor NA NA any brand, as available
p200 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p200 pipettor NA NA any brand, as available
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) NA NA any brand, as available
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) Quansys biosciences 110949MS can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) Zymo D4069 replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available
real-time thermocycler NA NA any brand, as available
salt shaker or tea infuser NA NA any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin
SketchUp software https://www.sketchup.com/ NA
specimen forceps NA NA any brand, as available
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
spreadsheet software https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel NA can replace with other spreadsheet management software, as applicable
sulfachloropyridazine Sigma S9882-100G
sulfadimethoxine Sigma S7007-10G
Sybr green qPCR reaction mix Fisher A25780 can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
tissue homogenizer NA NA any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982
tissue samples NA NA from appropriate infection model
TissueLyser single-bead dispenser Qiagen 69965
UHPLC NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)
ultra-low temperature freezer (-80) NA NA any brand, as available
ultrasonic bath NA NA any system, as available
wet ice NA NA any brand, as available
zone-free sealing film VWR  490007-390

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCall, L. -I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
  2. McCall, L. -I., Zhang, W. -W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
  3. de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
  4. Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clinical Epidemiology. 6, 257-275 (2014).
  5. Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
  6. Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
  7. Parab, A. R., McCall, L. -I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
  8. Lewis, C. M., McCall, L. -I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
  9. Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
  10. Newsom, S. N., McCall, L. -I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
  11. Wishart, D. S., et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 35, Database issue 521-526 (2007).
  12. Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
  13. McCall, L. -I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
  14. Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
  15. Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
  16. Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
  17. McCall, L. -I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
  18. Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
  19. Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
  20. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
  21. Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
  22. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  25. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  26. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  27. Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
  28. Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  31. FBMN with MZmine. , Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021).
  32. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  33. Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
  34. Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
  35. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  36. Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
  37. Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
  38. Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
  39. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  40. Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
  41. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  42. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  43. Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
  44. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  45. Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
  46. Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
  47. Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
  48. Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
  49. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  50. Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
  51. Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
  52. Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
  53. McCall, L. -I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
  54. Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
  55. Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).

Tags

Immunologi og infektion udgave 179 Kemisk kartografi metabolitfordeling rumlig metabolomik 3D-modeller væskekromatografi-tandemmassespektrometri trypanosomatider infektion tropisme
Kemisk kartografi tilgange til undersøgelse af trypanosomatidinfektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dean, D. A., Haffner, J. J.,… More

Dean, D. A., Haffner, J. J., Katemauswa, M., McCall, L. I. Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection. J. Vis. Exp. (179), e63255, doi:10.3791/63255 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter