Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Chemische cartografie benaderingen om trypanosomatide infectie te bestuderen

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63255
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1, 1,2,4
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, Norman, 2Laboratories of Molecular Anthropology and Microbiome Research, University of Oklahoma, Norman, 3Department of Anthropology, University of Oklahoma, Norman, 4Department of Microbiology and Plant Biology, University of Oklahoma, Norman
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol beschrijft de stappen om een 3D-model van metabolietverdeling tijdens trypanosomatide-infectie te genereren, inclusief monsterverzameling, metabolietextractie, een overzicht van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriegegevensverzameling, 3D-modelgeneratie en ten slotte gegevensvisualisatie.

Abstract

Pathogeen tropisme en ziektetropisme verwijzen naar de weefsellocaties die selectief gekoloniseerd of beschadigd zijn door pathogenen, wat leidt tot gelokaliseerde ziektesymptomen. Mens-infectieuze trypanosomatide parasieten omvatten Trypanosoma cruzi, de veroorzaker van de ziekte van Chagas; Trypanosoma brucei, de veroorzaker van slaapziekte; en Leishmania-soorten , veroorzakers van leishmaniasis. Samen treffen ze 20 miljoen mensen over de hele wereld. Deze parasieten vertonen specifiek tropisme: hart, slokdarm, dikke darm voor T. cruzi, vetweefsel, pancreas, huid, bloedsomloop en centraal zenuwstelsel voor T. brucei, huid voor dermotrope Leishmania-stammen en lever, milt en beenmerg voor viscerotrope Leishmania-stammen . Een ruimtelijk perspectief is daarom essentieel om de pathogenese van trypanosomatide te begrijpen. Chemische cartografie genereert 3D-visualisaties van de overvloed aan kleine moleculen gegenereerd via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie, in vergelijking met microbiologische en immunologische parameters. Dit protocol laat zien hoe chemische cartografie kan worden toegepast om pathogene processen tijdens trypanosomatide-infectie te bestuderen, te beginnen met systematische weefselbemonstering en metabolietextractie, gevolgd door vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriegegevensverzameling en eindigend met het genereren van 3D-kaarten van metabolietverdeling. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere onderzoeksvragen, zoals voedingsbehoeften voor weefselkolonisatie door T. cruzi, T. brucei of Leishmania, immunometabolisme op plaatsen van infectie en de relatie tussen lokale weefselstofwisseling en klinische ziektesymptomen, wat leidt tot uitgebreid inzicht in de pathogenese van trypanosomatide.

Introduction

Trypanosomatide parasieten bestaan uit Leishmania-soorten, Afrikaanse trypanosomen (Trypanosoma brucei) en Amerikaanse trypanosomen (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoa veroorzaken leishmaniasis, waaronder zelfgenezende en zelfbeperkte gelokaliseerde cutane leishmaniasis, mucocutane leishmaniasis waarbij de mucosale weefsels van de mond, neus en keel beschadigd raken, en viscerale leishmaniasis met parasiettropisme naar de viscerale organen die koorts en hepatosplenomegalie veroorzaken1,2. T. brucei veroorzaakt Human African trypanosomiasis (HAT), ook bekend als slaapziekte, voornamelijk gemeld in Afrikaanse landen3. De klinische tekenen en symptomen omvatten hepatosplenomegalie, koorts, hoofdpijn, musculoskeletale pijnen, lymfadenopathieën en bloedarmoede in het hemo-lymfestadium wanneer parasieten zich in de bloedbaan en lymfevaten lokaliseren. Dit wordt gevolgd door de meningo-encefalitische fase, waar parasieten zich lokaliseren naar het centrale zenuwstelsel en slaapstoornissen, gedragsverandering en uiteindelijk fatale comas4 veroorzaken. T. cruzi veroorzaakt de ziekte van Chagas, endemisch in Amerika. Geïnfecteerde personen ervaren een eerste acute fase, meestal asymptomatisch, met breed parasiettropisme. Ongeveer 10% -30% van de geïnfecteerde personen ervaart symptomen in een chronisch stadium na tientallen jaren van infectie, gekenmerkt door megaoesophagus, megacolon en cardiovasculaire complicaties5,6.

Metabolomics bestudeert kleine moleculaire soorten (50-1.500 Da), waaronder biologische verbindingen uit het primaire of secundaire metabolisme en extern afgeleide verbindingen zoals geneesmiddelen of van voedsel afgeleide moleculen. In de context van gastheer-pathogeeninteracties kunnen metabolomica de impact van infectie op gastheermetabolietomgevingen onderzoeken, cruciaal bij het verkrijgen van toegang tot het effect van het pathogeen op de gastheer. Het kan ook pathogene aanpassingen aan de voedings- en immunologische omgeving van de gastheer beoordelen7,8,9. Massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie zijn veelgebruikte metabolomics-instrumenten die worden gebruikt om metabolieten te identificeren, kwantificeren en karakteriseren. Deze "omics"-benadering kan ook worden toegepast op de ontdekking van biomarkers en de ontwikkeling van geneesmiddelen10,11.

Gezien het specifieke weefseltropisme van trypanosomatide parasieten, kunnen ruimtelijke metabolomics-analyses een significant inzicht geven in de pathogenese van de ziekten die ze veroorzaken. Het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van metabolieten onthulde metabolieten die lokaal worden beïnvloed door chronische Trypanosoma cruzi-infectie in het hartweefsel van muizen en acute en langdurige Trypanosoma cruzi-infectie in het maagdarmkanaal van de muis6,12,13. Specifiek toonde 3D chemische cartografie een ontkoppeling aan tussen parasietpersistentie en metabole veranderingen in het hartweefsel van chronisch Trypanosoma cruzi-geïnfecteerde muizen. Het metabolisme was het meest verstoord in lagere en apicale segmenten van het hart, overeenkomend met plaatsen van symptomen van de ziekte van Chagas (cardiale apicale aneurysmata). Metabolietfamilies verstoord door infectie op specifieke cardiale plaatsen en gecorreleerd aan de ernst van de ziekte omvatten acylcarnitines en glycerofosfocholines12,13,14. In het maagdarmkanaal kwamen aanhoudende metabole veranderingen overeen met plaatsen van symptomen van de ziekte van Chagas: slokdarm en dikke darm. Daarentegen wordt het metabolisme opnieuw genormaliseerd op plaatsen die niet geassocieerd zijn met symptomen van de ziekte van Chagas, zoals de dunne darm. Metabolieten die lokaal worden verstoord door infectie in het maagdarmkanaal omvatten acylcarnitines, glycerofosfocholines, kynurenine, tryptofaan en cholzuur. Bovendien maakten deze analyses de identificatie mogelijk van een nieuw metabolisch mechanisme van tolerantie voor de ziekte van Chagas6. Het toepassen van deze methoden op de studie van cutane leishmaniasis onthulde significante metabole verstoringen op de plaats van de laesie, maar ook specifieke metabole veranderingen in laesie-aangrenzend, macroscopisch gezond weefsel. Glutamine was bijvoorbeeld uitgeput op de plaats van de laesie, terwijl glycerofosfocholines in de m / z (massa-ladingsverhouding) 200-299, 400-499, 500-599 en 600-699 significant verhoogd waren op de laesieplaats. PC (O-34:1) was alleen verhoogd op laesie-aangrenzende plaatsen15.

Het doel van dit manuscript is om de stappen aan te tonen die nodig zijn om 3D-modellen van metabolietverdeling ("chemische cartografie") te genereren zoals toegepast op trypanosomatide parasietinfectiemodellen (figuur 1). Deze aanpak bouwt voort op verschillende kritische ontwikkelingen in de context van metabolomics en metabolomics dataverwerking, met name de ontwikkeling van 'ili software om metabolomics data eenvoudig uit te zetten op 3D modellen16.

Protocol

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de Universiteit van Oklahoma of de University of California San Diego Institutional Animal Care and Use Committee. Alle stappen voor het hanteren van infectieus materiaal werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast (klasse II, type A2) en volgens de lokale voorschriften.

1. Weefselverzameling

  1. Infecteer geschikte trypanosomatide infectie diermodellen, meestal muizen of hamsters.
    OPMERKING: Er is een aanzienlijke verscheidenheid aan muismodellen voor trypanosomatide-infectie, afhankelijk van de gewenste symptomen die moeten worden geproduceerd, de snelheid van ziekteprogressie, de ernst van de ziekte, enz. De gebruikers kunnen kiezen wanneer het hen uitkomt.
    1. Voor cutane leishmaniasis-infectiemodellen, infecteer subcutaan in het voetkussen of intradermaal in het oor15.
    2. Voor viscerale leishmaniasis-infectiemodellen, intraveneus infecteren1,17.
    3. Voor chagas ziekte en slaapziekte infectie modellen, infecteren intraperitoneaal6,12,18,19. Bepaal de te gebruiken parasitaire dosis op basis van de parasietstam en geplande tijdstippen.
  2. Plan sectieposities.
    1. Plan om secties te genereren met een minimum van 10 mg weefsel per sectie. Het is het beste om 30-50 mg te gebruiken.
    2. Voor chagas ziekte-infectiemodellen, plan om cardiale en gastro-intestinale segmenten systematisch te verzamelen.
    3. Voor cutane leishmaniasis-infectiemodellen, verzamel laesieweefsel en laesie-aangrenzende monsters.
    4. Voor viscerale leishmaniasis-infectiemodellen, plan om milt en meerdere leverkwabben te verzamelen. Extra weefselplaatsen zoals vetweefsel kunnen ook interessant zijn om te verzamelen.
      LET OP: Monsters van geïnfecteerde dieren moeten worden behandeld volgens het juiste, institutioneel goedgekeurde bioveiligheidsprotocol. Dit omvat over het algemeen vereisten voor persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en alleen het openen van buizen en het verzamelen van monsters in een bioveiligheidskast (klasse II, type A2).
  3. Etiketteer en weegbuizen voor homogenisatie.
    1. Gebruik het buistype dat geschikt is voor het beschikbare homogenisatiesysteem. Gebruik voor een TissueLyser 2 ml microcentrifugebuizen.
    2. Euthanaseer muizen op de gewenste infectietijdpunten met behulp van een overdosis isofluraan zoals goedgekeurd door institutionele IACUC of volgens het IACUC-goedgekeurde protocol.
    3. Sectie weefsel systematisch zoals gepland, met één sectie per buis.
    4. Vergeet niet om monsterafnameapparatuur tussen monsters te wassen met extractieoplosmiddel (50% methanol in dit protocol).
  4. Houd het deksel van de buis open en klik onmiddellijk vriesmonsters in vloeibare stikstof.
    LET OP: Sluit geen buizen totdat er vloeibare stikstof in de buis is gekomen die volledig is verdampt om te voorkomen dat buizen exploderen als stikstof uitzet. Neem voldoende maatregelen om ervoor te zorgen dat de huid niet in contact komt met vloeibare stikstof (gebruik cryohandschoenen en tangen om de buizen vast te houden). Draag een veiligheidsgelaatsscherm.
  5. Bewaar de buizen op droogijs totdat alle gewenste monsters zijn verzameld.
  6. Pauzepunt: bewaar monsters bij -80 °C totdat ze klaar zijn om extracties uit te voeren.
  7. Weeg buizen om het gewicht van het weefselmonster te bepalen. Opnemen in een spreadsheet.
    1. Houd de monsters bevroren tijdens het weegproces: houd buizen op droogijs, weeg snel, zet meteen weer op droogijs. Laat de monsters niet ontdooien tijdens het wegen.

2. Extractie van metabolieten

OPMERKING: Alleen vloeistoffen en reagentia van LC-MS-kwaliteit mogen overal worden gebruikt. Deze methode is aangepast van Reference20.

  1. Bereid alle extractiemiddelen (LC-MS-kwaliteit H2O, LC-MS-kwaliteit methanol, geprikt met 4 μM sulfaardpyridazine, LC-MS-kwaliteit dichloormethaan: methanol geprikt met 2 μM sulfachlorpyridazine) in glazen flessen van 1 L, met behulp van speciaal glaswerk.
    OPMERKING: Het te bereiden volume moet worden berekend op basis van het gewicht van het monster, rekening houdend met 500 μL water per 50 mg monster, 500 μL methanol met een piek van 4 μM saffochloorpyridazine per 50 mg monster en 1.000 μL voorgekookt dichloormethaan: methanol geprikt met 2 μM saffloorpyridazine per 50 mg monster, waarbij het berekende volume met 10% wordt verhoogd om rekening te houden met onnauwkeurigheid bij het pipetteren. Bewaar het extractiemiddel ten minste een nacht bij 4 °C om het voor te koelen.
  2. Voer homogenisatie op waterbasis van de weefselmonsters uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Voeg één roestvrijstalen kraal van 5 mm (zie materiaaltabel) toe aan elk van de microcentrifugebuizen van 2 ml met weefselmonsters, met behulp van een kraaldispenser. Houd de buizen op ijs.
    2. Maak één lege buis met LC-MS-kwaliteit H2O die alle stappen doorloopt en dient als extractie blanco. Gebruik het gemiddelde H2O-volume van monsterextracties. Voeg gekoelde LC-MS-kwaliteit H2O toe aan de ingevroren weefselmonsters.
      1. Normaliseer het watervolume tot het weefselgewicht door 500 μL water / 50 mg monster toe te voegen, met behulp van de monstergewichten berekend in stap 1.7.
        LET OP: Als u biogevaarlijke monsters hanteert, blijf dan het juiste, institutioneel goedgekeurde bioveiligheidsprotocol volgen. Dit omvat over het algemeen eisen voor persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) en het openen van buizen alleen in de bioveiligheidskast (klasse II, type A2).
    3. Homogeniseer monsters met een snelheid van 25 Hz gedurende 3 minuten met behulp van een weefselhomogenisator (zie Materiaaltabel).
      1. Sluit buizen goed om morsen van de reagentia tijdens de verwerking te voorkomen.
    4. Verzamel ongeveer 1/10e van het homogenisatievolume voor DNA-extractie, qPCR, eiwitgebaseerde analyses of andere analyses (indien gewenst). Bewaren in een microcentrifugebuis of 96-wells plaat (afhankelijk van het verzamelde volume) gedurende maximaal 6 maanden bij -80 °C, als DNA-extractie-experimenten op een andere dag moeten worden uitgevoerd. Langere opslagtijden zijn mogelijk, maar zijn niet getest.
      1. Voer DNA-extracties uit met behulp van een standaard commerciële kit voor DNA-extractie bij zoogdieren (zie Tabel met materialen) uit weefsels zoals beschreven in Referentie13. Kwantificeer de DNA-opbrengst en bewaar het geëxtraheerde DNA bij -20 °C. Acceptabele DNA-kwantiteit en -kwaliteit voor qPCR is zelfs tot 3 jaar later waargenomen.
        OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd op bevroren homogenaat op een volgende dag uit metabolietextractie.
      2. Voer qPCR uit zoals beschreven in Reference13, met behulp van 180 ng geëxtraheerd DNA.
        OPMERKING: Dit kan worden uitgevoerd op DNA dat op een vorige dag is verzameld en ingevroren bij -20 °C.
        1. Gebruik in het geval van studies naar T. cruzi-infectie de volgende primers: ASTCGGCTGATCGTTTTCGA en AATTCCTCCAAGCAGCGGATA om parasietniveaus21 te kwantificeren en de volgende primers om te normaliseren naar gastheer-DNA-niveaus: TCCCTCTCATCAGTTCTATGGCCCA en CAGCAAGCATCTATGCACTTAGACCCC22 (zie Materiaaltabel).
          OPMERKING: De aanbevolen qPCR-cycli zijn als volgt: denatureren bij 95 °C gedurende 10 minuten; voer 40 cycli uit bij 95 °C gedurende 30 s, vervolgens 58 °C gedurende 60 s en ten slotte 72 °C gedurende 60 s. Voer smeltcurveanalyse uit zoals passend voor de beschikbare thermocycler. Verwerk gegevens met behulp van de ΔΔCt-methode23 om relatieve parasietbelasting tussen bemonsteringslocaties te verkrijgen. Absolute kwantificering kan worden verkregen door van monsters afgeleide ΔΔCt-waarden te vergelijken met een standaardcurve die wordt gegenereerd uit bekende hoeveelheden parasieten, die in niet-geïnfecteerde weefselmonsters wordt geprikt en geëxtraheerd zoals in de stappen 2.2 tot en met 2.2.4.1.
      3. Voer op eiwitten gebaseerde karakterisering van immuunresponsen uit met behulp van gemultiplexte cytokinekits of standaard commerciële ELISA-kits (zie Tabel met materialen) zoals beschreven in Referentie13 over het opgeslagen homogenaat.
    5. Bewaar ten minste de helft van de 500 μL van het homogenisatievolume voor metabolietextractie.
  3. Voer waterige metabolietextractie uit.
    OPMERKING: De selectie van oplosmiddelen kan worden aangepast op basis van de chemische eigenschappen van metabolieten van belang.
    1. Voeg ijskoude methanol van LC-MS-kwaliteit met een piek van 4 μM sulfachlorpyridazine toe aan het homogenaat om een uiteindelijke concentratie van 50% methanol met 2 μM sulfachlorpyridazine in water te bereiken.
      LET OP: Methanol is ontvlambaar en gevaarlijk. Gebruik de juiste veiligheidsprocedures, inclusief hantering in een zuurkast of bioveiligheidskast.
    2. Homogeniseer monsters in een weefselhomogenisator met een snelheid van 25 Hz gedurende 3 minuten. Centrifugeer monsters bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
    3. Verzamel een gelijk volume supernatant in een 96-well-plaat. Selecteer het volume dat overeenkomt met het kleinste volume methanol + water gecombineerd in alle monsters. Dit is de waterige fractie.
      1. Zet het resterende waterige homogenaat supernatant bij -80 °C opzij als back-up.
    4. Bewaar het vaste residu op ijs terwijl je de supernatanten verzamelt.
    5. Droog waterig extractie supernatant tot het droog is (~ 3 uur of 's nachts). Gebruik maximale snelheid en geen verwarming.
    6. Vries de gedroogde 96-well-plaat in op -80 °C.
  4. Voer organische metabolietextractie uit.
    OPMERKING: De selectie van oplosmiddelen kan worden aangepast op basis van de chemische eigenschappen van metabolieten van belang.
    1. Voeg 1.000 μL per 50 mg van het monster van voorgechloreerd dichloormethaan: methanol met 2 μM sulfachloorfyidazine toe aan het vaste residu van stap 2.3.4.
      LET OP: Gebruik de juiste veiligheidsprocedures bij het hanteren van oplosmiddelen, inclusief het hanteren in een zuurkast met een goed debiet.
    2. Homogeniseer monsters in een weefselhomogenisator met een snelheid van 25 Hz gedurende 5 minuten. Centrifugeer de monsters bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
    3. Verzamel een gelijk volume supernatant in een 96-well-plaat. Selecteer het volume dat overeenkomt met het kleinste volume dichloormethaan: methanol, voor alle monsters. Dit is de organische fractie.
    4. Bewaar de pellet bij -80 °C als back-up. Bewaar het resterende organische extract bij -80 °C als back-up. Droog het organische extract een nacht aan de lucht in een zuurkast.
    5. Vries de gedroogde 96-well-plaat in op -80 °C.

3. LC-MS data-acquisitie

  1. Resuspend waterige en organische extracten in 60 μL elk van 50% methanol + 2 μM sulfadimethoxine en combineer. Sonicate gedurende 10 min; Centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten en breng het supernatant over op een schone 96-wellplate. Sluit af met zonevrije plaatafdichting en plaats de plaat in een LC autosampler.
    LET OP: Gebruik de juiste veiligheidsprocedures bij het hanteren van oplosmiddelen, inclusief het hanteren in een zuurkast met een goed debiet.
  2. Sluit de juiste mobiele fasen aan op het LC-systeem (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Voor positieve modus omgekeerde fase LC bevelen auteurs LC-MS-grade H2O + 0,1% mierenzuur aan als mobiele fase A en LC-MS-grade acetonitril + 0,1% mierenzuur als mobiele fase B met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min en een LC-gradiënt van 7,5 minuten. Aanbevolen gradiëntstappen zijn zoals gepubliceerd in Reference6: 0-1 min, 2% B; 1-2,5 min, lineaire toename tot 98% B; 2,5-4,5 min, vasthouden op 98% B; 4,5-5,5 min, lineaire afname tot 2% B; 5,5-7,5 min, vasthouden op 2% B.
  3. Zorg ervoor dat het instrument schoon is. Kalibreer MS in zowel positieve als negatieve modus.
  4. Voer de evaluatie van de prestaties van de lidstaten uit, indien van toepassing op het instrument.
  5. Maak MS-uitvoeringsvolgorde.
    1. Begin met 2 blanco's, 2 standaarden (6-mixen) en 5 gepoolde kwaliteitscontroles (QC) in een verdunningsreeks, beginnend bij 2 μL injectievolume en stapsgewijs toenemend tot 30 μL injectievolume.
    2. Randomiseer de steekproefvolgorde.
    3. Voer na elke 12 monsters een lege en vervolgens een samengevoegde QC uit.
  6. Sluit de C8 LC-kolom aan (deeltjesgrootte van 1,7 μm, poriegrootte van 100 Å, lengte van 50 x 2,1 mm x inwendige diameter) en controleer op lekken en overmatige tegendruk. Los problemen op volgens de standaardwerkprocedure van het instrument.
  7. Start de MS-runvolgorde en verzamel gegevensafhankelijke LC-MS/MS-gegevens.
    OPMERKING: Gebruik voor een Q-Exactive Plus MS-instrument verwarmde elektrospray-ionisatie en gegevensafhankelijke MS2-acquisitie (top 5) in positieve modus, een resolutie van 70.000 voor MS1 en 17.500 voor MS2, AGC-doel van 1E6 voor MS1 en 2E5 voor MS2, maximale IT van 100 ms voor zowel MS1 als MS2, scanbereik tot 100-1500 m / z voor MS1, en MS2 isolatievenster van 1 m/z. Stel mantelgas in op 35, aux-gas op 10 en veeggas op 0, spuitspanning op 3,8 kV, capillaire temperatuur op 320 °C, S-lens RF-niveau op 50 en aux-gastemperatuur op 350 °C.
    1. Controleer de gegevenskwaliteit: controleer de initiële blanco's (bevestig het ontbreken van grote pieken), standaarden (bevestig de aanwezigheid van verwachte pieken en symmetrische piekvorm) en QC's (bevestig de aanwezigheid van verwachte pieken, piekvorm en verwachte piekintensiteit).
    2. Controleer regelmatig ms-run tijdens de run-reeks.
  8. Zodra de run is voltooid, controleert u de gegevens op gemiste injecties of andere fouten.
  9. Sla de LC-kolom op zoals aanbevolen door de fabrikant. Verwijder de monsters en bewaar deze bij -80 °C.
  10. Upload onbewerkte gegevens naar de gegevensopslagplaats.
    OPMERKING: Massive (massive.ucsd.edu) wordt aanbevolen om de downstream-link naar moleculaire netwerken voor metabolietannotaties mogelijk te maken24,25.

4. LC-MS gegevensverwerking

  1. Converteer RAW-bestanden naar open indeling (.mzXML of .mzML) met MSConvert26.
    1. Upload onbewerkte gegevens en mzXML- of mzML-gegevens naar de gegevensopslagplaats.
  2. Functietabel genereren. Er zijn meerdere tools om dit te doen (MZmine, MS-DIAL, openMS, XCMS, etc.27,28,29,30).
    OPMERKING: MZmine wordt aanbevolen omdat het gratis, open-source is en mzXML-bestanden direct kan importeren na MSconvert, grafische gebruikersinterface-opties heeft voor het verwerken van gegevens en het bewaken van de impact van parameterselectie, en rechtstreeks kan exporteren naar GNPS voor moleculaire netwerken24.
    OPMERKING: Volg de gereedschapsdocumentatie en gebruik parameters die geschikt zijn voor het beschikbare instrument. Aanvullende details zijn ook te vinden in Reference31.
    1. Tabel met functies exporteren in .csv indeling.

5.3D model generatie

  1. Hand-teken 3D-model de novo op schaal volgens de onderstaande stappen.
    1. Maak een foto van het orgel van belang.
    2. Voer het volgende uit in SketchUp-software (zie Tabel met materialen) zoals hieronder vermeld.
      1. Verwijder de standaardafbeelding van een man die wordt weergegeven wanneer de software wordt geopend.
      2. Klik op Bestand > Importeren om een afbeelding van de betreffende organen te importeren.
      3. Klik op het gereedschap Lijnen en selecteer de optie Vrije hand. Gebruik het potloodgereedschap om de contouren van de interessante organen te traceren en te tekenen. Zorg ervoor dat u de lijn sluit door helemaal terug te tekenen naar het beginpunt. Zodra de lijn met succes is gesloten, wordt het getekende gebied automatisch gearceerd weergegeven.
      4. Selecteer het gereedschap Push/Pull en trek het gearceerde gebied op om de tekening van 2D naar 3D te converteren.
      5. De orgelafbeelding verwijderen: selecteer de gumknop en klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Wissen.
      6. Exporteer het bestand in .dae-indeling: > exporteer > 3D-model.
    3. Verbeter het realisme van het model volgens de onderstaande stappen.
      1. Importeer het model in meshlab-software (zie materiaaltabel): open MeshLab en selecteer Bestand > Mesh importeren. Selecteer het .dae-model dat bij de vorige stap is gegenereerd. Er verschijnt een menu Opties vooraf openen. Selecteer OK.
      2. Selecteer Wireframe in het bovenste menu. Selecteer vervolgens: Filters > Remeshing, Simplification and Reconstruction > Subdivision surfaces: Midpoint. Laat alle waarden als standaard staan en selecteer Tweemaal toepassen . Inspecteer de draadframeweergave van het model visueel om ervoor te zorgen dat deze nauwkeurig is gerasterd. Sluit het pop-upmenu.
      3. Exporteer het model in STL-indeling: Bestand > Mesh exporteren als en selecteer vervolgens STL-bestandsindeling (*.stl) in het vervolgkeuzemenu Bestandstypen . Klik op Opslaan. Selecteer OK in het volgende pop-upmenu.
      4. Open de Meshmixer-software (zie Materiaaltabel). Klik op de knop Importeren (+ ). Selecteer het STL-bestand dat bij de vorige stap is gegenereerd. Gebruik de gereedschappen Beeldhouwen > penselen > slepen en beeldhouwen > penselen > opblazen om de oppervlakken van het model eruit te halen die moeten worden afgerond.
      5. Zodra het model het gewenste uiterlijk heeft, slaat u het op in .stl-indeling: Bestand > exporteren. Geef het bestand de gewenste naam en selecteer STL Binary Format (*.stl) in het vervolgkeuzemenu Opslaan als type. Klik op Opslaan. Als er een pop-upmenu verschijnt, klikt u op Doorgaan.

6. "ili plot generatie

  1. Verkrijg coördinaten voor de posities in het 3D-model die overeenkomen met de bemonsteringslocaties.
    1. Open het 3D-model uit stap 5.1.3.5 in de MeshLab software: Bestand > Mesh importeren. Selecteer het model dat is gegenereerd in stap 5.1.3.5. Klik op OK in het pop-upvenster Verwerking na het openen.
    2. Als u x-, y- en z-coördinaten voor elke bemonsteringsplek wilt verkrijgen, selecteert u het gereedschap PickPoints en klikt u met de rechtermuisknop op regelmatig verdeelde intervallen over het oppervlak van het 3D-model. Zodra alle gewenste coördinaten zijn geselecteerd, klikt u op de bovenste knop Opslaan in het pop-upvenster Formulier .
      OPMERKING: Hiermee worden de coördinaten geëxporteerd in .pp-bestandsindeling. Dit bestand kan worden geopend in spreadsheetsoftware.
    3. In spreadsheetsoftware: open het PP-bestand dat is gegenereerd in stap 6.1.2. Pas de gegevensweergave aan met Gegevens > Tekst naar kolommen > gescheiden. Klik op Volgende, selecteer vervolgens Spatiebalk en klik op Voltooien.
    4. Formatteer opnieuw zodat alleen numerieke waarden in de spreadsheetcellen blijven staan door Start > Zoeken en selecteren > vervangen te selecteren. Voer in het vak Zoeken wat in: y=". Laat het vak Vervangen door leeg. Klik op Alles vervangen en vervolgens op OK. Herhaal dit voor x=" en voor z=" en voor " />. Waarden zijn nu klaar voor stap 6.2.
  2. Maak de 'ili feature table. Deze methode is aangepast van Reference16.
    1. Bouw in een spreadsheetsoftware de functietabel. Rijen komen overeen met elke positie en kolommen met gegevens.
      OPMERKING: De eerste kolommen moeten de positienaam (monsternaam) zijn, gevolgd door x-, y- en z-coördinaten van de bemonsteringspunten die zijn verkregen in stap 6.1.2 (met kolomkoppen x, y, z). De vijfde kolom moet de titel "straal" hebben.
    2. Plak de juiste metagegevens en overvloed aan metabolietfuncties in de volgende spreadsheetkolommen.
    3. Voer in de kolom "straal" de gewenste grootte in van de bemonsteringspunten die op het model moeten worden gevisualiseerd. Bepaal de waarden voor straal empirisch: voer standaard 1 in en beoordeel vervolgens of straal of coördinaten moeten worden aangepast in stap 6.3. Sla het bestand op in .csv indeling (Bestand > Opslaan als) en selecteer vervolgens CSV (door komma's gescheiden) (*.csv) in het vervolgkeuzemenu. Geef het bestand de gewenste naam. Klik op Opslaan.
  3. Open de gegevens in 'ili (software ontwikkeld door16).
    1. Open de 'ili website (ili.embl.de). Selecteer Surface. Sleep het gemaakte 3D-model naar het browservenster. Sleep de gemaakte functietabel naar hetzelfde browservenster.
    2. Gebruik de legenda in de rechterbenedenhoek om de gewenste gegevenskolom op het 3D-model te projecteren. Zorg ervoor dat de in stap 6.2.1 geselecteerde vlekken en stralen overeenkomen met de bemonsteringslocaties. Pas indien nodig waarden in de functietabel aan of kies extra coördinaten in het MeshLab (zie stap 6.1.2).
      OPMERKING: Visualisatie kan ook worden verbeterd door de spots > Border Opacity te selecteren en de schuifregelaar in te stellen op de maximale waarde.
    3. Selecteer achtereenvolgens elke gegevenskolom om de verdeling van dit metabolietkenmerk op het 3D-model te beoordelen.
      OPMERKING: Deze benadering kan ook worden gebruikt om alleen specifieke metabolietkenmerken van belang te visualiseren, bijvoorbeeld die met p < 0,05 of een bepaalde vouwverandering tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde monsters, zoals bepaald in externe statistische analysetools. Functies om te visualiseren kunnen ook buiten 'ili worden geselecteerd door middel van machine learning-benaderingen zoals een willekeurig bos.
  4. Voer lineaire / loggegevensvisualisatie uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Gebruik het tabblad Toewijzing in de rechterbovenhoek van de pagina om Lineair of Logaritmisch te selecteren in het vervolgkeuzemenu Schalen .
    2. Stel dezelfde schaal in voor alle percelen als u meerdere functies visualiseert.
      OPMERKING: De website kiest automatisch het minimum en maximum voor elke gegevenskolom die moet worden weergegeven.
    3. Als u de schaal handmatig wilt instellen, schakelt u de optie Auto Min/Max uit en voert u de gewenste schaling in. Alle gegevens worden nu binnen dezelfde schaal weergegeven.
  5. Wijzig de kleurschaal van de gegevens (grijswaarden, blauw-wit-rood, enz.).
    1. Wijzig de kleurenschaal in het gewenste kleurenschema in het menu Toewijzing met behulp van het vervolgkeuzemenu Kleurenoverzicht . Zorg ervoor dat het geselecteerde kleurenschema kleurenblind is.
  6. Als u de kleur van het 3D-model of de achtergrondkleur wilt wijzigen, gebruikt u de opties Kleur en Achtergrond in het 3D-menu.
  7. Verberg 3D-assen door het selectievakje Toon de oorsprong onder het 3D-menu uit te schakelen.
  8. Sla de afbeelding op door een screenshot te maken, met behulp van het knipprogramma of de sneltoets Crtl + S voor Windows of Linux en Equation 1+ S op OS X.

Representative Results

Het aantal verkregen metabolietkenmerken hangt af van het geanalyseerde weefseltype en de parameters voor gegevensverwerking. Dit protocol is bijvoorbeeld gebruikt om de ruimtelijke impact van T. cruzi-infectie op het metaboloom van het maagdarmkanaal te analyseren in een muismodel van T. cruzi-infectie. In eerder werk werden mannelijke C3H/HeJ intraperitoneaal geïnjecteerd met 1.000 CL + luc T. cruzi parasieten32,6. Dieren werden 12 of 89 dagen na infectie geëuthanaseerd en een chemische cartografie-analyse van 13 aaneengesloten segmenten van het maagdarmkanaal werd uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol. Deze analyse leidde tot een functietabel van 5.502 functies, die vervolgens in 3D werden gevisualiseerd met behulp van de stappen die in dit protocol worden beschreven. Deze benadering maakt de visualisatie mogelijk van metabolietkenmerken bij individuele dieren die hoog zijn op de plaats van hoge parasietbelasting (kynurenine, figuur 2B vs. parasietbelasting, figuur 2A), van metabolieten met differentiële verdeling over weefselgebieden (glutamine, figuur 2C) en metabolietkenmerken die op vergelijkbare niveaus worden aangetroffen in dunne en dikke darm (LPE 16:0 Figuur 2D ). Kynurenine werd geselecteerd voor visualisatie vanwege de bekende relatie met ontsteking en eerdere publicaties over het vermogen van kynurenine-afgeleide metabolieten om T. cruzi load33 te reguleren. Random forest-based machine learning-modellen hadden eerder een verband onthuld tussen kynurenineniveaus en infectiestatus6. Glutamine werd geselecteerd voor een visualisatie op basis van eerdere publicaties die een verband aantonen tussen de beschikbaarheid van in vitro glutamine en de gevoeligheid van T. cruzi-geneesmiddelen34. Differentiële verdeling werd bevestigd met behulp van logistische regressie, p < 0,05. LPE 16:0 werd geselecteerd na visuele inspectie van de gegevens om metabolietkenmerken te ontdekken die op vergelijkbare niveaus op verschillende weefsellocaties werden aangetroffen.

Figure 1
Figuur 1: Protocoloverzicht. De illustratie is gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Chemische cartografie analyse. Mannelijke C3H/HeJ muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 1.000 CL+luc T. cruzi parasieten32. Dieren werden 12 of 89 dagen na infectie geëuthanaseerd en het maagdarmkanaal werd systematisch verzameld en gesneden (stap 1)6. Metabolieten werden geëxtraheerd zoals in stap 2 en geanalyseerd door LC-MS /MS.3D modelgeneratie werd uitgevoerd met behulp van de SketchUp-software (stap 5) en gegevens werden uitgezet in 3D zoals in stap 6. (A) Parasiet distributie in een specifieke muis, 12 dagen na infectie. (B) Kynurenine metaboliet distributie in dezelfde muis, 12 dagen na infectie. (C) Gemiddelde glutamineverdeling over geïnfecteerde muizen, 89 dagen na infectie. (D) Vergelijkbare niveaus van m/z 454.292 retentietijd 2.929 min, geannoteerd als 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (LPE 16:0), in dezelfde muis als in A en B in de dunne darm en dikke darm. Monsters en gegevens werden gegenereerd in6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het begrijpen van trypanosomatide-infecties is essentieel om nieuwe medicijnontwikkelings- en behandelingsbenaderingen te begeleiden. Deze chemische cartografiemethode is uniek klaar om bruikbare inzichten te bieden in de relatie tussen metabolisme en pathogenese van trypanosomatideziekte, waardoor deze translationele behoefte wordt aangepakt.

Alleen oplosmiddelen van LC-MS-kwaliteit worden aanbevolen tijdens metabolietextractie en MS-analyses om achtergrondverontreiniging te verminderen. Polymere verontreiniging35, gewoonlijk afkomstig van paraffinefilm en/of andere kunststoffen36,37,38, moet waar mogelijk worden vermeden. Met name parafilm mag nooit worden gebruikt. Deze aspecten zijn cruciaal omdat de kwaliteit van de LC-MS-gegevens afhankelijk is van de materialen die worden gebruikt tijdens de monstervoorbereiding en metabolietextractie. De kwaliteit van de gegevens moet worden gewaarborgd voordat ili-plots worden gegenereerd. Bovendien vereist het genereren van deze uitgebreide ruimtelijke metabolomics-kaarten de verzameling van alle aangrenzende weefselmonsters en metabolietextractie uit alle verzamelde monsters om hiaten in deze kaarten te voorkomen. Verzamelprocedures, logistiek van metabolietextractie en LC-MS-analyse, en kosten moeten daarom worden overwogen en dienovereenkomstig worden gepland.

Dit protocol kan op meerdere manieren worden aangepast om aan de behoeften van de gebruiker te voldoen. De polariteit en oplosbaarheid van oplosmiddelen die tijdens de extractie van metabolieten worden gebruikt, zullen bijvoorbeeld van invloed zijn op welke metabolieten worden gedetecteerd39. Om de diversiteit van gedetecteerde metabolietkenmerken voor ongerichte chemische cartografie-analyses te maximaliseren, wordt het combineren van meerdere extractiestappen en oplosmiddelen aanbevolen. Deze methode maakt bijvoorbeeld gebruik van dichloormethaan, methanol en water als extractiemiddelen omdat ze een nauwkeurige detectie van niet-polaire en polaire moleculen mogelijk maken20,40. Deze oplosmiddelen zijn echter niet universeel geschikt voor elk MS-experiment en onderzoekers moeten extractiemiddelen selecteren op basis van de doelen van hun project. Evenzo kunnen verschillende LC-MS / MS-omstandigheden worden gebruikt, zoals het vervangen van omgekeerde fasechromatografie door normale fasechromatografie. Alternatieve kolommen kunnen ook worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens in omgekeerde fasen in plaats van C8-chromatografie, hoewel C8-chromatografie empirisch gezien robuuster is voor weefsellipiden en een lagere verstoppingsfrequentie heeft. Conceptueel kunnen deze protocollen ook worden toegepast op andere massaspectrometriemethoden zoals gaschromatografie-massaspectrometrie, enz.

Een alternatieve benadering is massaspectrometrie beeldvorming. Inderdaad, in tegenstelling tot massaspectrometrie beeldvormingsbenaderingen, bewaart vloeistofchromatografie-massaspectrometrie niet inherent ruimtelijke informatie10. Chemische cartografiebenaderingen overbruggen deze kloof door de bemonsteringslocatie op te nemen op het moment van projectconceptualisatie, in de voorbeeldmetagegevens en bij gegevensverwerkingsstappen. Een kracht van deze chemische cartografiebenadering, in tegenstelling tot massaspectrometriebeeldvorming, is de mogelijkheid om zelfverzekerde annotaties te bieden (Metabolomics Standards Initiative niveau 1 of niveau 2 annotatievertrouwen41), in tegenstelling tot massaspectrometriebeeldvorming waarbij het grootste deel van de toepassingen alleen voor annotatie afhankelijk is van nauwkeurige massa. Massaspectrometrie beeldvorming zal fijnmazige ruimtelijke kartering mogelijk maken, soms tot op het niveau van eencellige, bijvoorbeeld,42,43. Chemische cartografiebenaderingen maken daarentegen grootschalige kruisorgaankartering van metabolietverdeling mogelijk zonder dat zeer gespecialiseerde cryosectievaardigheden voor hele dieren nodig zijn. Chemische cartografie levert aanvullend bewijs voor de vele ruimtelijke transcriptomische benaderingen die worden ontwikkeld, bijvoorbeeld,44, met het voordeel dat de focus ligt op de 'omics-laag die het dichtst bij het fenotype ligt'45. Alternatieve methoden voor het kwantificeren van de parasietbelasting omvatten het meten van bioluminescentie op het moment van monsterverzameling6. Fijne segmenten kunnen ook worden verzameld om confocale of elektronenmicroscopie mogelijk te maken om gelokaliseerde parasietbelasting en weefselschade te beoordelen. Het waterhomogenaat, dat wordt gebruikt voor cytokinekwantificering in dit protocol en eerdere publicaties13, kan ook worden gebruikt om op eiwitten gebaseerde markers van weefselschade te kwantificeren.

Er zijn ook meerdere manieren om 3D-modellen te verkrijgen die geschikt zijn om de resulterende LC-MS-gegevens te plotten. Naast de hier voorgestelde methode, kunnen modellen vooraf worden gekocht bij verschillende online leveranciers. Zorg ervoor dat de gebruiksvoorwaarden overeenkomen met het beoogde gebruik, met name met betrekking tot publicatie. Modellen voor grote organen kunnen de novo worden gegenereerd met behulp van 3D-scanners volgens scannerinstructies. Alternatieven zoals MATLAB bestaan voor het genereren en visualiseren van 3D-modellen voor chemische cartografie46, maar ze werden voornamelijk geïmplementeerd vóór de ontwikkeling van 'ili16. MATLAB is een data-analyse en programmeertool suite die een breed scala aan toepassingen biedt op vele gebieden. MATLAB is echter noch gratis noch open-source en vereist bekendheid met MATLAB-interfaces, vooral gezien het feit dat MATLAB niet is ontwikkeld voor het verwerken van massaspectrometriegegevens. De alternatieven van deze voorgestelde methode, namelijk SketchUp, Meshlab en 'ili, zijn vrij toegankelijk, gebruiksvriendelijk en bieden vergelijkbare functies als MATLAB voor chemische cartografiedoeleinden.

Deze methode is robuust met betrekking tot monstervoorbereiding en metabolietextractie. Probleemoplossing is meestal nodig bij de LC-MS-gegevensverzamelingsstap. Dit valt buiten het bestek van dit artikel. Lezers worden doorverwezen naar uitstekende publicaties over het oplossen van problemen met LC-MS-gegevensverzameling, waaronder 20,47. Evenzo vallen de complexiteiten van metabolietannotatie buiten het bereik van de focus van deze methode op het genereren van 3D-modellen. Nuttige referenties over dit onderwerp zijn 24,25,48,49.

Hoewel deze methode effectief de pathogenese van ziekten onderzoekt, zijn er beperkingen aan deze aanpak, waarvan sommige gebruikelijk zijn in elk metabolomics-experiment. Een van die beperkingen is de lage annotatiesnelheid van LC-MS-functies50, die afhankelijk is van de beschikbaarheid en kwaliteit van referentiespectrale bibliotheken. Een andere beperking is dat dit protocol mRNA niet bewaart vanwege de incompatibiliteit van RNA-conserveringsreagentia zoals RNAlater met LC-MS/MS-analyse. De eiwitkwaliteit is echter voldoende voor downstream-analyses en kan dus op mRNA gebaseerde analyses vervangen.

Een chemische cartografie benadering van infectie pathogenese weerspiegelt direct hoe bacteriële, virale of parasitaire infecties zich ontwikkelen in orgaansystemen en gelokaliseerde ziekten veroorzaken. Het analyseren van deze regionale subsamples en het genereren van 3D-modellen brengt uiteindelijk over hoe metabolieten functioneren in de driedimensionale ruimte, waardoor licht wordt geworpen op deze voorheen niet-herkende ruimtelijke dimensies van de moleculaire biologie. Met behulp van dit protocol werd bijvoorbeeld de lokalisatie van metabolieten vergeleken met de parasietbelasting van Trypanosoma cruzi. De resultaten verduidelijkten de relatie tussen het pathogeen en het gastheerweefsel en toonden ook de metabole dynamiek van symptoomprogressie van de ziekte van Chagas6. Chemische cartografiemethoden zijn ook toegepast op verschillende onderwerpen, zoals interactie tussen mens en gebouwde omgeving51,52,53, de chemische samenstelling van orgaansystemen zoals menselijke huid46 en longen54, en plantenmetabolisme en omgevingsinteracties55. Toekomstige toepassingen kunnen betrekking hebben op het beoordelen van gelokaliseerde ziektetolerantie en veerkracht, of de relatie tussen lokale metabolietniveaus, pathogeen tropisme en ziektetropisme in modellen die verder gaan dan trypanosomatide-infectie. Deze aanpak zou ook breed toepasbaar moeten zijn om de huidige farmacokinetische protocollen uit te breiden, om de relatie tussen lokale weefselgeneesmiddelniveaus en medicijnmetabolisme versus de algehele metabole context, weefselschade en pathogeenklaring te beoordelen. Over het algemeen maakt chemische cartografie unieke verkenningen van metabolietverdelingen in verschillende monstertypen mogelijk, met toepassingen zoals ziektepathogenese, menselijke gezondheid, interacties tussen mens en omgeving en microbiële dynamiek.

Disclosures

Geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

Laura-Isobel McCall, PhD, heeft een Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Award van het Burroughs Wellcome Fund. De auteurs willen verder de steun erkennen van NIH-awardnummer R21AI148886, een pilotbeurs van het Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) onder NIH-awardnummer P20GM103648, en start-upfondsen van de Universiteit van Oklahoma (naar LIM). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financiers. De auteurs willen ook de ontwikkelaars van de tools bedanken die in dit protocol worden gebruikt. Alle relevante publicaties zijn geciteerd, indien van toepassing.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tubes NA NA any brand, as available
1 L bottle, pyrex NA NA any brand, as available
1 L graduated cylinder, pyrex NA NA any brand, as available
2 mL SafeLock Eppendorf tubes VWR 20901-540 use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer
3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) NA NA as appropriate for system under investigation
5 mm stainless steel bead Qiagen 69989
96 well plate Fisher 3252449
AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
analytical balance NA NA any brand, as available
ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer NA NA any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007).
benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
biosafety cabinet NA NA class II, type A2; any brand, as available
CAGCAAGCATCTATGCACTTAG
ACCCC primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
camera NA NA any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol
chemiluminescent-capable imaging system NA NA any system, as available
cotton balls NA NA any brand, as available
cryogloves VWR 97008-208 replace with any brand, as available
dissection scissors NA NA any brand, as available
dry ice NA NA any brand, as available
extra-length forceps NA NA any brand, as available
flammable-grade refrigerator NA NA any brand, as available
freezer storage boxes for microcentrifuge tubes NA NA any brand, as available
fume hood NA NA any brand, as available
high-resolution mass spectrometer NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030)
ice bucket NA NA any brand, as available
ili software ili.embl.de NA
isoflurane Covetrus 29405
large tupperware NA NA any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball
LC-MS grade acetonitrile Fisher Optima A955-4
LC-MS grade dicholoromethane Fisher Optima D151-4
LC-MS grade formic acid Fisher Optima A11750
LC-MS grade methanol Fisher Optima A456-4
LC-MS grade water Fisher Optima W64
liquid chromatography column Phenomenex 00B-4499-AN may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge Phenomenex AJ0-8784 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid chromatography column guard cartridge holder Phenomenex AJ0-9000 may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest
liquid nitrogen NA NA any brand, as available
luciferin Goldbio LUCK-1G
MeshLab software https://www.meshlab.net/ NA
Meshmixer software https://www.meshmixer.com/ NA
MS calibrant NA NA appropriate one for available instrument
MS data processing software NA NA multiple options available; authors recommend MZmine
MSConvert software http://proteowizard.sourceforge.net/ NA
Nanodrop ThermoFisher ND-ONE-W other nanodrop models are also suitable
p1000 pipet tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p1000 pipettor NA NA any brand, as available
p20 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p20 pipettor NA NA any brand, as available
p200 pipette tips NA NA use the appropriate brand to fit available pipettors
p200 pipettor NA NA any brand, as available
personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) NA NA any brand, as available
Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) Quansys biosciences 110949MS can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits
Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) Zymo D4069 replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available
real-time thermocycler NA NA any brand, as available
salt shaker or tea infuser NA NA any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin
SketchUp software https://www.sketchup.com/ NA
specimen forceps NA NA any brand, as available
speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity NA NA any brand, as available
spreadsheet software https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel NA can replace with other spreadsheet management software, as applicable
sulfachloropyridazine Sigma S9882-100G
sulfadimethoxine Sigma S7007-10G
Sybr green qPCR reaction mix Fisher A25780 can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired
TCCCTCTCATCAGTTCTAT
GGCCCA primer		 NA NA any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003).
tissue homogenizer NA NA any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982
tissue samples NA NA from appropriate infection model
TissueLyser single-bead dispenser Qiagen 69965
UHPLC NA NA any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV)
ultra-low temperature freezer (-80) NA NA any brand, as available
ultrasonic bath NA NA any system, as available
wet ice NA NA any brand, as available
zone-free sealing film VWR  490007-390

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCall, L. -I., et al. Adaptation of Leishmania donovani to and visceral environments: in vivo selection and proteomic analysis. Journal of Proteome Research. 14 (2), 1033-1059 (2015).
  2. McCall, L. -I., Zhang, W. -W., Matlashewski, G. Determinants for the development of visceral leishmaniasis disease. PLoS Pathogens. 9 (1), 1003053 (2013).
  3. de Castro Neto, A. L., da Silveira, J. F., Mortara, R. A. Comparative analysis of virulence mechanisms of trypanosomatids pathogenic to humans. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 669079 (2021).
  4. Franco, J. R., Simarro, P. P., Diarra, A., Jannin, J. G. Epidemiology of human African trypanosomiasis. Clinical Epidemiology. 6, 257-275 (2014).
  5. Ottilie, S., et al. Rapid chagas disease drug target discovery using directed evolution in drug-sensitive yeast. ACS Chemical Biology. 12 (2), 422-434 (2017).
  6. Hossain, E., et al. Mapping of host-parasite-microbiome interactions reveals metabolic determinants of tropism and tolerance in Chagas disease. Science Advances. 6 (30), (2020).
  7. Parab, A. R., McCall, L. -I. Tryp-ing up metabolism: Role of metabolic adaptations in kinetoplastid disease pathogenesis. Infection and Immunity. 89 (4), (2021).
  8. Lewis, C. M., McCall, L. -I., Sharp, R. R., Spicer, P. G. Ethical priority of the most actionable system of biomolecules: the metabolome. American Journal of Physical Anthropology. 171 (2), 177-181 (2020).
  9. Liu, Z., Ulrich vonBargen, R., McCall, L. I. Central role of metabolism in Trypanosoma cruzi tropism and Chagas disease pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 63, 204-209 (2021).
  10. Newsom, S. N., McCall, L. -I. Metabolomics: Eavesdropping on silent conversations between hosts and their unwelcome guests. PLoS Pathogens. 14 (4), 1006926 (2018).
  11. Wishart, D. S., et al. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Research. 35, Database issue 521-526 (2007).
  12. Dean, D. A., et al. Spatial metabolomics identifies localized chemical changes in heart tissue during chronic cardiac Chagas disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (10), 0009819 (2021).
  13. McCall, L. -I., et al. Mass spectrometry-based chemical cartography of a cardiac parasitic infection. Analytical Chemistry. 89 (19), 10414-10421 (2017).
  14. Hoffman, K., et al. Alterations to the cardiac metabolome induced by chronic infection relate to the degree of cardiac pathology. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1638-1649 (2021).
  15. Parab, A. R., et al. Dysregulation of glycerophosphocholines in the cutaneous lesion caused by Leishmania major in experimental murine models. Pathogens. 10 (5), 593 (2021).
  16. Protsyuk, I., et al. 3D molecular cartography using LC-MS facilitated by Optimus and 'ili software. Nature Protocols. 13 (1), 134-154 (2018).
  17. McCall, L. -I., et al. Targeting ergosterol biosynthesis in Leishmania donovani: Essentiality of Sterol 14alpha-demethylase. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003588 (2015).
  18. Tear, W. F., et al. Selectivity and physicochemical optimization of repurposed Pyrazolo[1,5-]pyridazines for the treatment of human African trypanosomiasis. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (2), 756-783 (2020).
  19. Klug, D. M., et al. Hit-to-lead optimization of benzoxazepinoindazoles as human African trypanosomiasis therapeutics. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (5), 2527-2546 (2020).
  20. Want, E. J., et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS. Nature Protocols. 8 (1), 17-32 (2013).
  21. Piron, M., et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta Tropica. 103 (3), 195-200 (2007).
  22. Cummings, K. L., Tarleton, R. L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and Biochemical Parasitology. 129 (1), 53-59 (2003).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Nothias, L. -F., et al. Feature-based molecular networking in the GNPS analysis environment. Nature Methods. 17 (9), 905-908 (2020).
  25. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with global natural products social molecular networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  26. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  27. Tsugawa, H., et al. MS-DIAL: data-independent MS/MS deconvolution for comprehensive metabolome analysis. Nature Methods. 12 (6), 523-526 (2015).
  28. Sturm, M., et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics. 9, 163 (2008).
  29. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  30. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  31. FBMN with MZmine. , Available from: https://ccms-ucsd.github.io/GNPSDocumentation/featurebasedmolecularnetworking-with-mzmine2/ (2021).
  32. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cellular Microbiology. 16 (9), 1285-1300 (2014).
  33. Knubel, C. P., et al. 3-Hydroxy kynurenine treatment controls T. cruzi replication and the inflammatory pathology preventing the clinical symptoms of chronic Chagas disease. PloS One. 6 (10), 26550 (2011).
  34. Dumoulin, P. C., Vollrath, J., Tomko, S. S., Wang, J. X., Burleigh, B. Glutamine metabolism modulates azole susceptibility in amastigotes. eLife. 9, (2020).
  35. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  36. Weaver, R., Riley, R. J. Identification and reduction of ion suppression effects on pharmacokinetic parameters by polyethylene glycol 400. Rapid Communications in Mass Spectrometry: RCM. 20 (17), 2559-2564 (2006).
  37. Larger, P. J., Breda, M., Fraier, D., Hughes, H., James, C. A. Ion-suppression effects in liquid chromatography-tandem mass spectrometry due to a formulation agent, a case study in drug discovery bioanalysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 39 (1-2), 206-216 (2005).
  38. Furey, A., Moriarty, M., Bane, V., Kinsella, B., Lehane, M. Ion suppression; a critical review on causes, evaluation, prevention and applications. Talanta. 115, 104-122 (2013).
  39. Lu, W., et al. Metabolite measurement: Pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  40. Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
  41. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  42. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nature Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  43. Yang, B., Tsui, T., Caprioli, R. M., Norris, J. L. Sample preparation and analysis of single cells using high performance MALDI FTICR mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 2064, 125-134 (2020).
  44. Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics. Nature Reviews. Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).
  45. Patti, G. J., Yanes, O., Siuzdak, G. Innovation: Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (4), 263-269 (2012).
  46. Bouslimani, A., et al. Molecular cartography of the human skin surface in 3D. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 2120-2129 (2015).
  47. Dudzik, D., Barbas-Bernardos, C., García, A., Barbas, C. Quality assurance procedures for mass spectrometry untargeted metabolomics. A review. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 147, 149-173 (2018).
  48. Alseekh, S., et al. Mass spectrometry-based metabolomics: a guide for annotation, quantification and best reporting practices. Nature Methods. 18 (7), 747-756 (2021).
  49. Chaleckis, R., Meister, I., Zhang, P., Wheelock, C. E. Challenges, progress and promises of metabolite annotation for LC-MS-based metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 55, 44-50 (2019).
  50. Viant, M. R., Kurland, I. J., Jones, M. R., Dunn, W. B. How close are we to complete annotation of metabolomes. Current Opinion in Chemical Biology. 36, 64-69 (2017).
  51. Kapono, C. A., et al. Creating a 3D microbial and chemical snapshot of a human habitat. Scientific Reports. 8 (1), 3669 (2018).
  52. Petras, D., et al. Mass spectrometry-based visualization of molecules associated with human habitats. Analytical Chemistry. 88 (22), 10775-10784 (2016).
  53. McCall, L. -I., et al. Analysis of university workplace building surfaces reveals usage-specific chemical signatures. Building and Environment. 162, 106289 (2019).
  54. Garg, N., et al. Three-dimensional microbiome and metabolome cartography of a diseased human lung. Cell Host & Microbe. 22 (5), 705-716 (2017).
  55. Floros, D. J., et al. Mass spectrometry based molecular 3D-cartography of plant metabolites. Frontiers in Plant Science. 8, 429 (2017).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 179 Chemische cartografie metabolietverdeling ruimtelijke metabolomica 3D-modellen vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie trypanosomatiden infectie tropisme
Chemische cartografie benaderingen om trypanosomatide infectie te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dean, D. A., Haffner, J. J.,… More

Dean, D. A., Haffner, J. J., Katemauswa, M., McCall, L. I. Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection. J. Vis. Exp. (179), e63255, doi:10.3791/63255 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter