Summary
이 프로토콜은 샘플 수집, 대사 산물 추출, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 데이터 수집, 3D 모델 생성 및 마지막으로 데이터 시각화를 포함하여 trypanosomatid 감염 시 대사 산물 분포의 3D 모델을 생성하는 단계를 설명합니다.
Abstract
병원균 트로피즘과 질병 트로피즘은 병원체에 의해 선택적으로 식민지화되거나 손상된 조직 위치를 말하며, 국소질환 증상으로 이어진다. 인간 감염 trypanosomatid 기생충 은 Trypanosoma cruzi, Chagas 질병의 원인 에이전트를 포함합니다; 트리파노종 브루시, 수면 장애의 원인 에이전트; 그리고 리슈마니아 종, 리슈마니아의 원인 에이전트. 공동으로 전 세계 2천만 명에게 영향을 미칩니다. 이 기생충은 특정 열대성 을 보여줍니다 : 심장, 식도, T. cruzi 에 대한 결장, 지방 조직, 췌장, 피부, 순환 시스템 및 T. 브루시 에 대한 중추 신경계, 피부 성 류 매니아 균주를위한 피부, 간, 비장 및 내장 성 Leishmania 균주를위한 골수. 공간 적 관점은 그러므로 trypanosomatid 질병 병인을 이해하는 것이 필수적입니다. 화학 지도 제작은 미생물 및 면역 학적 매개 변수에 비해 액체 크로마토그래피 질량 분광법을 통해 생성 된 작은 분자 풍부의 3D 시각화를 생성합니다. 이 프로토콜은 체계적인 조직 샘플링 및 대사산물 추출에서 시작하여 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석 데이터 수집을 시작으로 대사 산물 분포의 3D 맵 생성으로 마무리하는 데 화학 적 지도 제작이 trypanosomatid 감염 중에 병원성 과정을 연구하는 데 어떻게 적용 될 수 있는지 보여줍니다. 이 방법은 T. cruzi, T. brucei, 또는 Leishmania 에 의한 조직 식민지화를 위한 영양소 요구 사항, 감염 부위의 면역대사, 그리고 국소 조직 대사 성 교란 및 임상 질환 증상 사이의 관계와 같은 다중 연구 질문에 사용될 수 있으며, 이는 trypanosomatid 질환 병기증에 대한 포괄적인 통찰력으로 이어진다.
Introduction
Trypanosomatid 기생충은 리슈마니아 종, 아프리카 trypanosomes (Trypanosoma brucei), 그리고 미국 trypanosomes (Trypanosoma cruzi)로 구성됩니다. 리슈마니아 원생동물은 자기 치유와 자기 제한된 국소 된 키산 염 리슈만 전각증, 점막 조직이 손상되는 점막 류만증, 내장 열대 성구와 내장 성비증을 가진 내장 성모를 일으키는 데 2, 그는 21, 그는 내장 및 그는 열을 일으키는 원인이 되는 내장 성 모성 마비를 일으키는 원인이 됩니다. T. 브루시 원인 인간 아프리카 trypanosomiasis (HAT), 또한 수 면 질병으로 알려진, 주로 아프리카 국가에서 보고 3. 임상 징후와 증상은 기생충이 혈류와 림프계로 국소화 될 때 간질, 발열, 두통, 근골격계 통증, 림프절 단계의 빈혈을 포함한다. 이것은 기생충이 중앙 신경계에 국소화하고 수면 장애, 행동 변경 및 결국 치명적인 comas4를 일으키는 원인이 되는 meningo-뇌찰 단계 뒤에 선행됩니다. T. 크루즈는 미대륙에서 샤가스 질병, 풍토병을 일으킵니다. 감염된 개별은 넓은 기생충 트로피와 함께 초기 급성 단계를 경험합니다, 일반적으로 무증상. 감염된 개별의 대략 10%-30%는 메가오식하게, megacolon 및 심장 혈관 합병증에 의해 특징지어지는 감염의 수십 년 후에 만성 단계 현상을 경험합니다5,6.
Metabolomics는 1 차또는 이차 물질 대사및 약물 또는 식품 유래 분자와 같은 외부 유래 화합물에서 생물학적 화합물을 포함하여 작은 분자 종 (50-1,500 Da)을 연구합니다. 숙주 병원체 상호 작용의 맥락에서, metabolomics는 호스트 대사 산물 환경에 감염의 충격을 탐구할 수 있습니다, 호스트에 병원체의 효력에 접근하는 데 결정적인. 또한 숙주 영양 및 면역 환경7,8,9에 병원균 적응을 평가할 수 있습니다. 질량 분광법(MS) 및 핵 자기 공명(NMR) 분광법은 대사 산물을 식별, 정량화 및 특성화하는 데 사용되는 일반적인 메타볼로믹스 도구입니다. 이 "omics" 접근은 또한 바이오마커 발견 및 약물 개발에 적용될 수 있습니다10,11.
trypanosomatid 기생충의 특정 조직 트로피즘을 감안할 때, 공간 metabolomics 분석은 그(것)들이 일으키는 원인이 되는 질병의 병인에 중요한 통찰력을 가능하게 할 수 있습니다. 대사 산물의 공간 분포를 매핑하면 마우스 심장 조직에서 만성 Trypanosoma cruzi 감염에 의해 로컬로 영향을 받는 대사 산물과 마우스 위장관내 급성 및 장기 Trypanosoma cruzi 감염6,12,13. 특히, 3D 화학 지도 제작은 만성 Trypanosoma cruzi 감염 마우스의 심장 조직에 있는 기생충 지속성 및 신진 대사 변경 사이 단절을 보여주었습니다. 신진 대사는 Chagas 질병 증상 (심장 apical 동맥류)의 사이트와 일치, 심장의 낮은 및 apical 세그먼트에서 가장 혼란했다. 특정 심장 부위의 감염에 의해 침을 흘리며 질병 심각도와 상관 관계가 있는 대사산물 가족은 아실카르니틴과 글리페로포스포콜린12,13,14를 포함한다. 위장관에서는 Chagas 질병 증상의 사이트와 일치 하는 지속적인 신진 대사 변경: 식 도와 결 장. 대조적으로, 신진 대사는 소장과 같은 Chagas 질병 현상과 연관되지 않는 사이트에서 재정규화됩니다. 위장관에서 감염에 의해 국소적으로 방해되는 대사산물은 아실카르니틴, 글리세로포스포콜린, 키누레닌, 트립토판 및 담수산을 포함한다. 또한, 이러한 분석은 Chagas 질병에 내성의 새로운 대사 메커니즘의 식별을 가능하게6. 피부 성 구종증의 연구에 이러한 방법을 적용하면 병변 부위의 중요한 대사 성변이 밝혀졌지만 병변 인접, 거시적으로 건강한 조직의 특정 대사 변화도 밝혀졌습니다. 예를 들어, 글루타민은 병변 부위에서 고갈된 반면, m/z(질량 대 전하 비율)의 글리세로포스포콜린은 200-299, 400-499, 500-599 및 600-699가 병변 부위에서 현저히 증가하였다. PC(O-34:1)는 병변 인접 부위15에서만 증가하였다.
본 원고의 목표는 트리파노소마티드 기생충 감염 모델에 적용된 대사산물 분포("화학지도제작")의 3D 모델을 생성하는 데 필요한 단계를 시연하는 것이다(도 1). 이 접근 방식은 메타볼로믹스 및 메타볼로믹스 데이터 처리, 특히 메타볼로믹스 데이터를 3D 모델에 쉽게 플롯하는 'ili 소프트웨어'의 개발의 맥락에서 몇 가지 중요한 발전을 기반으로 합니다16.
Protocol
설명된 모든 동물 실험은 오클라호마 대학 또는 캘리포니아 샌디에이고 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다. 전염성 물질을 취급하는 모든 단계는 생물 안전 캐비닛 (클래스 II, 유형 A2) 및 현지 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 조직 수집
- 적절한 trypanosomatid 감염 동물 모델, 일반적으로 마우스 또는 햄스터를 감염.
참고: 생산될 원하는 증상, 질병 진행 속도, 질병 심각도 등에 따라 trypanosomatid 감염을 위한 마우스 모델이 상당히 다양합니다. 사용자는 편의를 위해 선택할 수 있습니다.- 변색 leishmaniasis 감염 모형을 위해, 발판에 피하 또는 귀15에 상인으로 감염하십시오.
- 내장 리슈만마비 감염 모델의 경우 정맥 내 1,17을 감염시 감염시 보입니다.
- Chagas 질병 및 수면 병 감염 모형을 위해, 감염내 감염6,12,18,19를 감염하십시오. 기생충 균주와 계획 된 시간 지점에 따라 사용하는 기생충 용량을 결정합니다.
- 단면 위치를 계획합니다.
- 섹션당 최소 10 mg의 조직으로 섹션을 생성할 계획입니다. 그것은 30-50 mg을 사용 하는 것이 좋습니다.
- Chagas 질병 감염 모형을 위해, 체계적으로 심장과 위장 세그먼트를 수집할 계획입니다.
- 변성 리슈만광증 감염 모델의 경우, 레시오날 조직과 병변 에 인접한 샘플을 수집합니다.
- 내장 leishmaniasis 감염 모형을 위해, 비장 및 다중 간 엽을 수집할 계획입니다. 지방 조직과 같은 추가 조직 사이트는 또한 수집하는 것이 흥미로할 수 있습니다.
주의: 감염된 동물의 샘플은 적절하고 제도적으로 승인된 생물 안전 프로토콜에 따라 처리되어야 합니다. 이것은 일반적으로 개인 보호 장비 (PPE) 요구 사항과 튜브를 열고 생물 안전 캐비닛 (클래스 II, 유형 A2) 내부 샘플을 수집하는 것을 포함한다.
- 균질화를 위해 튜브를 라벨및 계량합니다.
- 사용 가능한 균질화 시스템에 적합한 튜브 유형을 사용합니다. 티슈리저의 경우 2mL 마이크로센심분리기 튜브를 사용하십시오.
- 기관 IACUC에 의해 승인 또는 IACUC 승인 프로토콜에 따라 isoflurane 과다 복용을 사용하여 원하는 감염 시점에서 마우스를 안락사.
- 섹션 조직은 체계적으로 계획대로, 튜브 당 하나의 섹션.
- 추출 용매 (이 프로토콜에서 50 % 메탄올)를 가진 샘플 사이에 샘플 수집 장비를 세척해야합니다.
- 튜브 뚜껑을 열어 두고 즉시 액체 질소로 샘플을 고정합니다.
주의: 튜브에 들어간 액체 질소가 완전히 증발하여 질소가 팽창함에 따라 튜브가 폭발하는 것을 방지하기 전까지는 튜브를 닫지 마십시오. 피부가 액체 질소와 접촉하지 않도록 적절한 조치를 취하십시오 (극저온 장갑과 집게를 사용하여 튜브를 보유하십시오). 안전 얼굴 방패를 착용하십시오. - 원하는 모든 샘플을 수집할 때까지 튜브를 드라이 아이스에 보관하십시오.
- 일시 중지 지점: 추출을 할 준비가 될 때까지 샘플을 -80 °C에서 저장합니다.
- 튜브를 계량하여 조직 샘플 체중을 결정합니다. 스프레드시트에 기록합니다.
- 계량 과정에서 샘플을 얼어 붙이십시오: 튜브를 드라이 아이스에 보관하고, 빠르게 계량하고, 드라이 아이스를 바로 다시 착용하십시오. 계량하는 동안 샘플이 해동되는 것을 허용하지 마십시오.
2. 대사 산물 추출
참고: LC-MS 등급 액체 및 시약만 전체적으로 사용해야 합니다. 이 메서드는 Reference20에서 적용되었습니다.
- 모든 추출 용매(LC-MS 급 H2O, LC-MS 급 메탄올)를 준비하여 4μM의 설파클로피리다진, LC-MS 급 디클로로메탄: 1L 유리 병에 2μM로 스파이크된 메탄올을 전용 유리병을 사용한다.
참고: 준비해야 할 볼륨은 샘플 가중치를 기준으로 계산해야 하며, 시료 50mg당 500μL의 물을 고려하여 50mg의 황파클로피리다진 4μM과 사전 냉각디클로로메탄 1,000 μL로 스파이크된 메탄올은 50mg의 황파클로피리다진 2μM로 스파이크되어 10mg의 시료를 계산하여 10mg의 부피를 계산하여 산출하였다. 추출 용매를 적어도 하룻밤 동안 4°C에서 저장하여 미리 식힙니다. - 아래에 언급된 단계에 따라 조직 샘플의 수성 균질화를 수행합니다.
- 비드 디스펜서를 사용하여 조직 샘플을 포함하는 2mL 마이크로 센심 분리기 튜브 각각에 5mm 스테인레스 스틸 비드( 재료 표 참조)를 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
- 모든 단계를 거치고 추출 공백역할을 하는 LC-MS 등급 H2O가 포함된 빈 튜브 하나를 만듭니다. 샘플 추출에서 평균 H2O 볼륨을 사용합니다. 냉동 조직 샘플에 차가운 LC-MS 등급 H2O를 추가합니다.
- 1.7단계에서 계산된 시료 가중치를 사용하여 500 μL의 물/50 mg의 시료를 추가하여 조직 중량에 물 부피를 정규화합니다.
주의: 생물 위험 샘플을 처리하는 경우, 적절하고 제도적으로 승인된 생물 안전 프로토콜을 계속 따르십시오. 이것은 일반적으로 개인 보호 장비 (PPE) 및 생물 안전 캐비닛 (클래스 II, 유형 A2) 내에서만 튜브를 여는 요구 사항을 포함한다.
- 1.7단계에서 계산된 시료 가중치를 사용하여 500 μL의 물/50 mg의 시료를 추가하여 조직 중량에 물 부피를 정규화합니다.
- 티슈 균질화제를 사용하여 3 분 동안 25 Hz 속도로 샘플을 균질화하십시오 ( 재료 표 참조).
- 처리 중에 시약이 유출되지 않도록 튜브를 단단히 닫습니다.
- DNA 추출, qPCR, 단백질 기반 분석 또는 기타 분석(원하는 경우)에 대한 균질화 부피의 약 1/10을 수집합니다. -80°C에서 최대 6개월 동안 마이크로센트심분리기 튜브 또는 96웰 플레이트(수집된 체적에 따라 다름)에 저장하여 DNA 추출 실험을 다른 날에 수행한다. 더 긴 저장 기간은 가능하지만 테스트되지 않았습니다.
- Reference13에 설명된 조직에서 포유류 DNA 추출을 위한 표준 상용 키트(재료표 참조)를 사용하여 DNA 추출을 수행합니다. DNA 수율을 정량화하고 추출된 DNA를 -20°C에 저장합니다. qPCR에 대한 허용 가능한 DNA 수량 및 품질은 최대 3 년 후에도 관찰되었습니다.
참고: 이 단계는 대사 산물 추출에서 후속 일에 얼어 붙은 동형모네이트에서 수행 할 수 있습니다. - 추출된 DNA의 180 ng를 사용하여 Reference13에 설명된 바와 같이 qPCR을 수행합니다.
참고: 이는 전날 수집된 DNA에서 수행되고 -20°C에서 냉동될 수 있다.- T. cruzi 감염에 대한 연구의 경우, 다음과 같은 프라이머를 사용: ASTCGGCTGATCGTTCGA와 AATTCCTCCAAGCAGCGGATA는 기생충 수준을 정량화하기 위해 21 및 다음과 같은 프라이머는 DNA 수준을 호스트하기 위해 정상화 : TCCCTCTCTCATCAGTTCTATGGCCCACACACCCACACACACA및 CAGCAAGCATATCTATATATATATATATATATATATATC
참고 : 권장 qPCR 주기는 다음과 같습니다 : 10 분 동안 95 °C에서 변성; 30s에 대해 95°C에서 40사이클을 수행한 다음 60s용 58°C, 마지막으로 72°C를 60s에 수행한다. 사용 가능한 열순환기에 적합한 용융 곡선 해석을 수행합니다. ΔΔCt 방법을 사용하여 데이터를 처리하여 샘플링 사이트 간의 상대적인 기생충 부하를 얻습니다. 절대 정량화는 샘플 유래 ΔCt 값을 알려진 양의 기생충으로부터 생성된 표준 곡선과 비교하여 얻을 수 있으며, 감염되지 않은 조직 샘플로 스파이크되고, 2.2 ~ 2.4.1 단계에서와 같이 추출된다.
- T. cruzi 감염에 대한 연구의 경우, 다음과 같은 프라이머를 사용: ASTCGGCTGATCGTTCGA와 AATTCCTCCAAGCAGCGGATA는 기생충 수준을 정량화하기 위해 21 및 다음과 같은 프라이머는 DNA 수준을 호스트하기 위해 정상화 : TCCCTCTCTCATCAGTTCTATGGCCCACACACCCACACACACA및 CAGCAAGCATATCTATATATATATATATATATATATATC
- 저장된 균주에 Reference13에 설명된 바와 같이 멀티플렉스 사이토카인 키트 또는 표준 상용 ELISA 키트(재료표 참조)를 사용하여 면역 반응의 단백질 기반 특성화를 수행합니다.
- Reference13에 설명된 조직에서 포유류 DNA 추출을 위한 표준 상용 키트(재료표 참조)를 사용하여 DNA 추출을 수행합니다. DNA 수율을 정량화하고 추출된 DNA를 -20°C에 저장합니다. qPCR에 대한 허용 가능한 DNA 수량 및 품질은 최대 3 년 후에도 관찰되었습니다.
- 대사 산물 추출을 위해 균질화 부피의 500 μL 중 적어도 절반을 저장합니다.
- 수성 대사 산물 추출을 수행합니다.
참고: 용매 선택은 관심 있는 대사산물의 화학적 특성에 기초하여 조정할 수 있습니다.- 얼음-차가운 LC-MS 급 메탄올은 4μM의 설파클로피리다진을 소동에 첨가하여 물에 2μM의 메탄올을 50% 메탄올의 최종 농도를 달성합니다.
주의: 메탄올은 인화성이며 위험합니다. 연기 후드 또는 생물 안전 캐비닛 내부 를 처리하는 것을 포함하여 적절한 안전 절차를 사용합니다. - 3 분 동안 25 Hz 속도로 조직 균질화샘플. 원심분리기 샘플은 10분 동안 4°C에서 16,000 x g 로 샘플링합니다.
- 동일한 양의 상체를 96개의 잘 플레이트에 수집합니다. 모든 샘플에서 결합된 메탄올 + 물의 가장 작은 부피와 일치하는 볼륨을 선택합니다. 이것은 수성 분획입니다.
- 백업으로 -80 °C에서 남은 수성 동종 상체를 따로 둡니다.
- 초자연체를 수집하는 동안 얼음에 고체 잔류물을 유지합니다.
- 건조 (~3 시간 또는 하룻밤) 건조 수성 추출 상수. 최대 속도와 난방을 사용하지 않습니다.
- -80°C에서 말린 96-잘 플레이트를 동결합니다.
- 얼음-차가운 LC-MS 급 메탄올은 4μM의 설파클로피리다진을 소동에 첨가하여 물에 2μM의 메탄올을 50% 메탄올의 최종 농도를 달성합니다.
- 유기 대사 산물 추출을 수행합니다.
참고: 용매 선택은 관심 있는 대사산물의 화학적 특성에 기초하여 조정할 수 있습니다.- 사전 냉각 디클로로메탄 샘플 50 mg당 1,000 μL을 추가하십시오: 메탄올은 2.3.4 단계에서 고체 잔류물까지 2μM의 황파클로피리다진으로 스파이크됩니다.
주의: 유량이 좋은 연기 후드 내부를 취급하는 등 용매를 취급할 때 적절한 안전 절차를 사용하십시오. - 5 분 동안 25 Hz 속도로 조직 균질화시 샘플을 균질화합니다. 10 분 동안 4 °C에서 16,000 x g 의 샘플을 원심 분리합니다.
- 동일한 양의 상체를 96개의 잘 플레이트에 수집합니다. 모든 샘플에서 가장 작은 디클로로메탄(메탄올)에 맞게 부피를 선택합니다. 이것은 유기 분획입니다.
- 펠릿을 -80°C에 백업으로 저장합니다. 나머지 유기 추출물을 -80°C에 백업으로 저장합니다. 유기 추출물을 연기 후드에 밤새 공기를 건조시십시오.
- -80°C에서 말린 96-잘 플레이트를 동결합니다.
- 사전 냉각 디클로로메탄 샘플 50 mg당 1,000 μL을 추가하십시오: 메탄올은 2.3.4 단계에서 고체 잔류물까지 2μM의 황파클로피리다진으로 스파이크됩니다.
3. LC-MS 데이터 수집
- 수성 및 유기 추출물을 각각 50% 메탄올 + 2 μM의 무반메톡신으로 재보중단하고 결합합니다. 10 분 동안 초음파 처리; 그런 다음 원심 분리기를 10 분 동안 깨끗한 96 웰 플레이트로 옮기습니다. 영역이 없는 플레이트 씰로 밀봉하고 플레이트를 LC 자동 샘플러에 놓습니다.
주의: 유량이 좋은 연기 후드 내부를 취급하는 등 용매를 취급할 때 적절한 안전 절차를 사용하십시오. - 적절한 모바일 단계를 LC 시스템에 연결합니다( 재료 표 참조).
참고: 양성 모드 반전 위상 LC의 경우, 저자는 LC-MS 급 H2O + 0.1% 포름산을 모바일 상 A 및 LC-MS 급 아세토니트릭 + 0.1% 포름산으로 권장하며, 이동상 B는 0.5mL/min, 7.5분 LC 그라데이션을 가진 이동상 B로 사용한다. 권장 그라데이션 단계는 참조6에 게시된 대로: 0-1분, 2% B; 1-2.5 분, 선형 증가 98% B; 2.5-4.5 분, 98% B에서 유지; 4.5-5.5 분, 선형 감소 2% B; 5.5-7.5 분, 2 % B에서 개최. - 기기가 깨끗한지 확인합니다. 양수 모드와 음수 모드에서 MS를 보정합니다.
- 계측기에 적합한 MS 성능 평가를 수행합니다.
- MS 실행 시퀀스를 만듭니다.
- 2개의 블랭크, 2개의 표준(6-mixes), 5개의 풀화된 품질 제어(QC)로 시작하여 2μL의 사출 부피에서 시작하여 단계적으로 30μL 사출 부피로 증가합니다.
- 샘플 순서를 임의화합니다.
- 12개의 샘플마다 공백을 실행한 다음 풀이 된 QC를 실행합니다.
- C8 LC 컬럼(1.7 μm 입자 크기, 100Å 모공 크기, 50 x 2.1mm 길이 x 내부 직경)을 연결하고 누수 및 과도한 배압을 모니터링합니다. 계측기 표준 작동 절차에 따라 문제를 해결합니다.
- MS 실행 시퀀스를 시작하고 데이터 종속 LC-MS/MS 데이터를 수집합니다.
참고: Q-Exactive 플러스 MS 계측기의 경우 가열 된 전기 스프레이 이온화 및 데이터 의존 MS2 획득 (상위 5) 양성 모드에서 사용, MS1에 대한 70,000 및 MS2에 대한 17,500의 해상도, MS1에 대한 1E6의 AGC 목표 와 MS2에 대한 2E5, MS1 및 MS2 모두에 대한 최대 IT 100 ms, 스캔 범위는 100-150 m1 에 대한 및 1m / z의 MS2 격리 창. 칼집 가스를 35로 설정하고, 가스를 10으로, 가스를 0으로 스윕하고, 3.8kV로 분무 전압, 모세관 온도에서 320°C로, S 렌즈 RF 레벨은 50° C로, 보조 가스 온도를 350°C로 설정한다.- 데이터 품질 확인: 초기 공백 확인(주요 피크 부족 확인), 표준(예상 피크 및 대칭 피크 셰이프의 존재 확인), 및 CC(예상 피크, 피크 셰이프 및 예상 피크 강도의 존재를 확인).
- 실행 시퀀스 중에 MS 실행을 주기적으로 모니터링합니다.
- 실행이 완료되면 누락된 주사 또는 기타 오류가 있는지 데이터를 확인합니다.
- 제조업체에서 권장하는 대로 LC 열을 저장합니다. 샘플을 -80°C에서 제거하고 저장합니다.
- 원시 데이터를 데이터 리포지토리에 업로드합니다.
참고: MassIVE(massive.ucsd.edu)는 대사산물 주석24,25에 대한 분자 네트워킹에 대한 다운스트림 링크를 활성화하는 것이 좋습니다.
4. LC-MS 데이터 처리
- MSConvert26을 사용하여 원시 파일을 열린 형식(.mzXML 또는 .mzML)으로 변환합니다.
- 원시 데이터와 mzXML 또는 mzML 데이터를 데이터 리포지토리에 업로드합니다.
- 피쳐 테이블을 생성합니다. 여러 가지 도구(MZmine, MS-다이얼, 오픈MS, XCMS 등 27,28,29,30)가 있습니다.
참고: MZmine은 무료, 오픈 소스이며 MSconvert 후 mzXML 파일을 직접 가져올 수 있기 때문에 권장되며, 데이터를 처리하고 매개 변수 선택의 영향을 모니터링하기 위한 그래픽 사용자 인터페이스 옵션이 있으며 분자 네트워킹24를 위해 GNPS로 직접 내보낼 수 있습니다24.
참고: 공구 설명서를 따르고 사용 가능한 계측기에 적합한 매개 변수를 사용합니다. 추가 세부 정보는 Reference31에서도 찾을 수 있습니다.- 피처 테이블을 .csv 형식으로 내보냅니다.
5.3D 모델 생성
- 아래에 언급된 단계에 따라 수작업으로 3D 모델 드 노보가 배율을 조정합니다.
- 관심 기관의 사진을 찍어.
- 아래와 같이 SketchUp 소프트웨어( 재료 표 참조)에서 다음을 수행합니다.
- 소프트웨어가 열릴 때 나타나는 사람의 기본 그림을 삭제합니다.
- 관심 기관의 사진을 가져오려면 가져오기 > 파일 > 클릭합니다.
- 선 도구를 클릭하고 Freehand 옵션을 선택합니다. 연필 도구를 사용하여 관심 기관의 윤곽을 추적하고 그립니다. 시작점으로 다시 그리는 방식으로 선을 닫아야 합니다. 선이 성공적으로 닫히면 그려진 영역이 자동으로 그늘진 것처럼 보입니다.
- 푸시/풀 도구를 선택하고 그늘진 영역을 위로 당겨 도면을 2D에서 3D로 변환합니다.
- 오르간 사진 삭제: 지우개 버튼을 선택한 다음 그림을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 지우기 선택합니다.
- 파일을 .dae 형식으로 내보내기: 파일 > 내보내기 > 3D 모델입니다.
- 아래에 설명된 단계에 따라 모델의 리얼리즘을 개선합니다.
- 모델을 MeshLab 소프트웨어( 재료 표 참조)로 가져오기: MeshLab을 열고 파일 > 가져오기 메시를 선택합니다. 이전 단계에서 생성된 .dae 모델을 선택합니다. 사전 오픈 옵션 메뉴가 나타납니다. 확인을 선택합니다.
- 상단 메뉴에서 와이어프레임을 선택합니다. 그런 다음 선택: 재메시, 단순화 및 재구성 > 세분화 표면: 중간점> 필터. 모든 값을 기본값으로 두고 두 번 적용을 선택합니다. 모델의 와이어프레임 뷰를 시각적으로 검사하여 미세하게 격자로 그리드를 유지합니다. 팝업 메뉴를 닫습니다.
- 모델을 .stl 형식으로 내보내기: 파일 > 내보내기 메시 As로, 다음 유형 드롭다운 메뉴의 파일에서 STL 파일 형식(*.stl)을 선택합니다. 저장을 클릭합니다. 다음 팝업 메뉴에서 확인을 선택합니다.
- 메시믹서 소프트웨어를 엽니다(재료 표 참조). 가져오기(+) 버튼을 클릭합니다. 이전 단계에서 생성된 .stl 파일을 선택합니다. 드래그 및 조각 > 브러시> 조각 > 브러시를 사용하여 팽창 도구를 > 모델의 표면을 반올림합니다.
- 모델이 원하는 모양이 되면 .stl 형식으로 저장합니다: 파일 > 내보내기. 파일을 원하는 대로 이름을 지정하고 형식 드롭다운 메뉴로 저장에서 STL 바이너리 형식(*.stl)을 선택합니다. 저장을 클릭합니다. 팝업 메뉴가 나타나면 계속을 클릭 합니다.
6. '일리 플롯 생성
- 샘플링 사이트에 해당하는 3D 모델의 위치에 대한 좌표를 가져옵니다.
- MeshLab 소프트웨어에서 5.1.3.5 단계에서 3D 모델을 엽니다: 파일 > 가져오기 메시. 5.1.3.5 단계에서 생성된 모델을 선택합니다. 오픈 후 처리 팝업 창에서 확인을 클릭합니다.
- 각 샘플링 스팟에 대해 x, y 및 z 좌표를 얻으려면 PickPoints 도구를 선택한 다음 3D 모델 표면을 가로질러 정기적으로 간격이 있는 간격으로 마우스 오른쪽 단추를 클릭합니다. 원하는 모든 좌표를 선택한 후 양식 팝업 창에서 가장 많이 저장 버튼을 클릭합니다.
참고: 이렇게 하면 좌표가 .pp 파일 형식으로 내보냅니다. 이 파일은 스프레드시트 소프트웨어에서 열 수 있습니다. - 스프레드시트 소프트웨어: 6.1.2 단계에서 생성된 .pp 파일을 엽니다. 데이터 > 텍스트를 사용하여 열에 대한 데이터 표시를 조정> 제한합니다. 다음을 클릭한 다음 공간을 선택한 다음 완료를 클릭 합니다.
- 홈 > 찾기 및 선택 > 교체를 선택하여 스프레드시트 셀에 숫자 값만 남아 있도록 합니다. 어떤 상자 찾기에서 입력: y=". 바꾸기를 상자로 비워 둡니다. 모두 교체를 클릭한 다음 OK에서 클릭 합니다. x=" 와 z=" 와 " /> 대해 반복합니다. 이제 값이 6.2 단계에 대한 준비가 되었습니다.
- '일리 기능 테이블을 확인합니다. 이 메서드는 Reference16에서 적용되었습니다.
- 스프레드시트 소프트웨어에서 피쳐 테이블을 빌드합니다. 행은 각 위치 및 열에 해당합니다.
참고: 첫 번째 열은 위치 이름(샘플 이름)이어야 하며, 6.1.2 단계에서 얻은 샘플링 스팟의 x, y 및 z 좌표가 있어야 합니다(열 헤더 x, y, z). 다섯 번째 열의 제목은 "반지름"이어야 합니다. - 후속 스프레드시트 열에 적절한 메타데이터 및 대사산물 피쳐를 붙여넣습니다.
- 열 "반지름"에서 모델에 시각화할 샘플링 스팟의 원하는 크기를 입력합니다. 반경값을 경험적으로 결정합니다: 기본값으로 1을 입력한 다음 6.3단계에서 반지름 또는 좌표를 조정해야 하는지 여부를 평가합니다. 파일을 .csv 형식(파일 > 저장으로 저장한 다음 드롭다운 메뉴에서 CSV(쉼표 디미티코) (*.csv) 를 선택합니다. 원하는 대로 파일의 이름을 지정합니다. 저장을 클릭합니다.
- 스프레드시트 소프트웨어에서 피쳐 테이블을 빌드합니다. 행은 각 위치 및 열에 해당합니다.
- 'ili(16에 의해 개발된 소프트웨어)'의 데이터를 엽니다.
- '일리 웹사이트(ili.embl.de)를 엽니다. 서피스를 선택합니다. 생성된 3D 모델을 브라우저 창에 드래그앤드롭합니다. 생성된 피쳐 테이블을 동일한 브라우저 창에 드래그앤드롭합니다.
- 오른쪽 하단 모서리에 있는 범례를 사용하여 3D 모델에서 원하는 데이터 열을 투영합니다. 6.2.1 단계에서 선택한 반점과 반점이 샘플링 사이트와 일치하는지 확인합니다. 필요한 경우 피쳐 테이블에서 값을 조정하거나 MeshLab에서 추가 좌표를 선택합니다(6.1.2 단계 참조).
참고: 경계 > 스팟 을 선택하고 슬라이더를 최대 값으로 설정하여 시각화를 개선할 수도 있습니다. - 각 데이터 열을 연속적으로 선택하여 3D 모델에서 이 대사산물 피쳐의 분포를 평가합니다.
참고: 이 접근법은 또한 외부 통계 분석 도구에서 결정된 바와 같이 p < 0.05 또는 감염되지 않은 샘플 간의 특정 접이식 변화와 같은 특정 대사산물 피처만 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 임의포리스트와 같은 머신 러닝 접근법을 통해 '일리 외부의 시각적 특징'도 선택할 수 있다.
- 아래 설명한 단계에 따라 선형/로그 데이터 시각화를 수행합니다.
- 페이지 오른쪽 상단에 있는 매핑 탭을 사용하여 배율 드롭다운 메뉴에서 선형 또는 로개리스믹을 선택합니다.
- 여러 피쳐를 시각화하는 경우 모든 플롯에 대해 동일한 축척을 설정합니다.
참고: 웹 사이트는 표시할 각 데이터 열에 대해 최소 및 최대값을 자동으로 선택합니다. - 배율을 수동으로 설정하려면 자동 최소/Max 옵션을 선택 해제하고 원하는 배율을 입력합니다. 이제 모든 데이터가 동일한 축척 내에 표시됩니다.
- 데이터의 색상 배율을 변경합니다(그레이스케일, 블루-화이트-레드 등).
- 색상 맵 드롭다운 메뉴를 사용하여 매핑 메뉴에서 원하는 색상 구성표로 색상 축척을 변경합니다. 선택한 색상 구성표가 색맹 에 친화적이지 확인합니다.
- 3D 모델의 색상 또는 배경 색을 변경하려면 3D 메뉴에서 색상 및 배경 옵션을 사용합니다.
- 3D 메뉴 에서 Origin 표시 상자를 선택 해제하여 3D 축을 숨깁니다.
- 스크린 샷, 저격 도구를 사용하여 이미지를 저장, 또는 윈도우 또는 리눅스에 대한 바로 가기 키 Crtl + S와
OS X에 + S.
OS X에 + S.Representative Results
얻어진 대사산물 피처의 수는 분석된 조직 유형 및 데이터 처리 파라미터에 따라 달라집니다. 예를 들어, 이 프로토콜은 T. cruzi 감염의 마우스 모델에서 위장관 메타볼로메에 대한 T. 크루지 감염의 공간적 영향을 분석하는 데 사용되었습니다. 이전 작업에서, 남성 C3H/HeJ는 1,000 CL + luc T. cruzi 기생충32,6로 회중적으로 주입되었다. 동물은 감염 후 12일 또는 89일 동안 안락사되었고, 위장관의 13개의 연속세그먼트에 대한 화학지도제작분석이 이 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행되었다. 이 분석을 통해 5,502개의 피쳐 테이블이 이 프로토콜에 설명된 단계를 사용하여 3D로 시각화되었습니다. 이 접근법은 높은 기생충 부하 (kynurenine, 그림 2B 대 기생충 부하, 그림 2A)의 사이트에서 높은 개별 동물에서 대사 산물 특징의 시각화를 가능하게합니다, 조직 영역 (글루타민, 그림 2C) 및 대사 산물 특징은 작고 큰 내장에 걸쳐 유사한 수준에서 발견되는 대사 산물 기능 (LPE: 16 그림)에 걸쳐 유사한 수준에서 발견된다 (LPE 26 그림 ). Kynurenine는 T. cruzi load33를 조절하는 kynurenine 유래 대사 산물의 능력에 염증 및 이전 간행물과의 알려진 관계 때문에 시각화를 위해 선택되었습니다. 무작위 산림 기반 기계 학습 모델은 이전에 kynurenine 수준과 감염 상태 6 사이의 연관성을 공개했다. 글루타민은 체외 글루타민 가용성과 T. 크루지 약물 감도 34 사이의 관계를 보여주는 이전 간행물을 기반으로 시각화를 위해 선택되었다. 차등 분포는 물류 회귀, p < 0.05를 사용하여 확인되었다. LPE 16:0은 조직의 사이트 전체에서 유사한 수준에서 발견되는 대사 산물 특징을 발견하기 위해 데이터를 육안으로 검사한 후 선택되었습니다.
그림 1: 프로토콜 개요입니다. 그림은 BioRender.com 함께 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 화학 지도 제작 분석. 남성 C3H/HeJ 마우스는 1,000 CL+luc T. cruzi 기생충으로 회대적으로 주입되었다. 동물은 감염 후 12일 또는 89일 동안 안락사되었고, 위장관을 체계적으로 채취하여 단면하였다(1단계)6. 대사 산물은 2단계에서와 같이 추출되었고 LC-MS/MS에 의해 분석되었으며.3D 모델 생성은 SketchUp 소프트웨어(Step 5)를 이용하여 수행되었고, 6단계에서와 같이 데이터가 3D로 플롯되었다. (A) 특정 마우스에서 기생충 분포, 12 일 감염 후. (B) 같은 마우스에서 키누레닌 대사 산물 분포, 12 일 감염 후. (C) 감염된 마우스에 걸쳐 글루타민 분포를 의미, 89 감염 후 일. (D) m /z 454.292 의 비교 수준 2.929 분, 2 헥사데카노일-sn-글리세로-3-인포에탄올라민(LPE 16:0),소장 및 대장에서 A및 B와 동일한 마우스로 음부한다. 샘플및 데이터는 6에서 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
trypanosomatid 감염을 이해하는 것은 새로운 약 발달 및 처리 접근을 지도하기 위하여 필수적입니다. 이 화학 지도 제작 방법은 신진 대사와 trypanosomatid 질병 병증 사이의 관계에 대한 실행 가능한 통찰력을 제공하기 위해 독특하게 태세를 갖추고 있으므로이 번역적 필요성을 해결합니다.
메타볼라이트 추출 및 MS 분석 중에 LCD-MS 등급 용매만 권장하여 백그라운드 오염을 줄입니다. 일반적으로 파라핀 필름 및/또는 기타 플라스틱36,37,38에서 파생되는 중합체 오염35는 가능한 경우 피해야 합니다. 특히 파라필름은 절대로 사용해서는 안 됩니다. LC-MS 데이터 품질은 샘플 준비 및 대사 산물 추출 중에 사용되는 재료에 따라 달라지므로 이러한 측면은 매우 중요합니다. 'ili 플롯을 생성하기 전에 데이터 품질을 보장해야 합니다. 또한 이러한 포괄적인 공간 메타볼로믹스 맵을 생성하려면 이러한 맵의 간격을 피하기 위해 수집된 모든 샘플에서 인접한 모든 조직 샘플과 대사산물 추출을 수집해야 합니다. 따라서 수집 절차, 대사 산물 추출 및 LC-MS 분석의 물류, 따라서 비용을 고려하고 그에 따라 계획해야합니다.
이 프로토콜은 여러 가지 방법으로 사용자 요구를 충족하도록 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 대사산물 추출 중에 사용되는 용매의 극성 및 용해도는 대사산물이 검출되는 것에 영향을 미칩니다39. 표적 화학 지도 제작 분석을 위해 검출된 대사산물 기능의 다양성을 극대화하려면 여러 추출 단계와 용매를 결합하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 이 방법은 비극성 및 극성 분자20,40의 정확한 검출을 가능하게 하기 때문에 디클로로메탄, 메탄올 및 물을 추출 용매로 활용합니다. 그러나 이러한 용매는 모든 MS 실험에 보편적으로 적합하지 않으며 연구원은 프로젝트의 목표에 따라 추출 용매를 선택해야 합니다. 마찬가지로, 역상 크로마토그래피를 정상 위상 크로마토그래피로 대체하는 등 다양한 LC-MS/MS 조건을 사용할 수 있습니다. 대체 컬럼은 C8 크로마토그래피 대신 반전 위상 데이터 수집에 사용할 수 있지만 경험적으로 C8 크로마토그래피는 조직 지질에 더 견고하며 막힘 주파수가 낮습니다. 개념적으로, 이러한 프로토콜은 가스 크로마토그래피 질량 분광법 등과 같은 다른 질량 분석 방법에도 적용될 수 있다.
다른 접근법은 질량 분석 이미징입니다. 실제로, 질량 분광화상 화상 진찰 접근과는 달리, 액체 크로마토그래피 질량 분광법은 본질적으로 공간 정보를 보존하지 않습니다10. 화학 지도 제작은 프로젝트 개념화 시, 샘플 메타데이터 및 데이터 처리 단계에서 샘플링 위치를 포함시켜 이러한 격차를 해소합니다. 질량 분석 영상과는 달리 이 화학 적 지도 제작 접근법의 강도는 대부분의 응용 프로그램이 주석에 만 정확한 질량에 의존하는 대량 분광 화상 진찰과는 달리 자신감 있는 주석(Metabolomics 표준 이니셔티브 레벨 1 또는 레벨 2 주석 신뢰41)을 제공하는 기능입니다. 질량 분석 이미징은 미세한 공간 매핑을 가능하게 할 것이며, 때로는 단일 세포 수준(예: 42,43)까지 내려갈 수 있습니다. 대조적으로, 화학지도학 접근은 고도로 전문화한 전동물 저온 절제 기술을 요구하지 않고 대사 산물 분포의 대규모 교차 기관 매핑을 가능하게 합니다. 화학 지도 제작은 개발중인 많은 공간 전사 적 접근법에 대한 보완적 증거를 제공합니다, 예를 들어,44, 표현형에 가장 가까운 'omics 층'에 초점을 맞추고의 장점과 함께 45. 기생충 부하 정량화를 위한 대체 방법은 견본 수집6의 시간에 생물 발광을 측정하는 포함합니다6. 미세 세그먼트는 또한 국소적인 기생충 부담 및 조직 손상을 평가하기 위하여 공초점 또는 전자 현미경 검사를 가능하게 하기 위하여 집합될 수 있었습니다. 이 프로토콜및 이전 간행물13에서 사이토카인 정량화에 사용되는 물 균질은 조직 손상의 단백질 기반 마커를 정량화하는 데 사용될 수도 있습니다.
또한 생성된 LC-MS 데이터를 플롯하는 데 적합한 3D 모델을 얻는 방법에도 여러 가지가 있습니다. 여기에 제안 된 방법 외에도 다양한 온라인 공급 업체에서 모델을 미리 구입할 수 있습니다. 사용 약관이 특히 게시와 관련된 의도된 사용과 일치하는지 확인합니다. 스캐너 지침에 따라 3D 스캐너를 사용하여 대형 장기용 모델을 생성할 수 있습니다. MATLAB과 같은 대안은 화학 지도 제작을 위한 3D 모델을 생성하고 시각화하기 위한 존재이지만, 주로 'ili16' 개발 전에 구현되었다. MATLAB은 다양한 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공하는 데이터 분석 및 프로그래밍 도구 제품군입니다. 그러나 MATLAB은 무료도 오픈 소스도 아니며, 특히 MATLAB이 대량 분광법 데이터를 처리하기 위해 개발되지 않았다는 점을 고려할 때 MATLAB 인터페이스에 익숙해야합니다. 이 제안된 방법의 대안, 즉 SketchUp, Meshlab 및 'ili는 자유롭게 접근 가능하고 사용자 친화적이며 화학 지도 제작 목적으로 MATLAB과 유사한 기능을 제공합니다.
이 방법은 샘플 준비 및 대사 산물 추출에 관한 강력한 방법입니다. 문제 해결은 LC-MS 데이터 수집 단계에서 가장 자주 필요합니다. 이는 이 문서의 범위를 벗어납니다. 독자는 LC-MS 데이터 수집 문제 해결에 대한 우수한 출판물로 이동되며 20,47을 포함합니다. 마찬가지로 대사산물 음장의 복잡성은 이 메서드가 3D 모델 생성에 초점을 맞추는 범위를 벗어납니다. 이 항목에 대한 유용한 참조는 24,25,48,49를 포함합니다.
이 방법은 효과적으로 질병 병인을 탐구하는 동안, 어떤 metabolomics 실험에 걸쳐 일반적인 몇몇이 접근에 한계가 있습니다. 이러한 제한 사항 중 하나는 LC-MS 기능의 낮은 주석 비율입니다50, 이는 참조 스펙트럼 라이브러리의 가용성과 품질에 따라 다름. 추가 제한은 이 프로토콜이 LC-MS/MS 분석을 가진 RNAlater와 같은 RNA 보존 시약의 비호환성때문에 mRNA를 보존하지 않는다는 것입니다. 그러나, 단백질 품질은 다운스트림 분석에 적합하므로 mRNA 기반 분석을 대체할 수 있다.
감염 병인에 대한 화학 지도 제작 접근법은 세균성, 바이러스성 또는 기생 감염이 기관 시스템에서 어떻게 발전하고 국소화된 질병을 일으키는지 직접적으로 반영합니다. 이러한 지역 하위 샘플을 분석하고 3D 모델을 생성하는 것은 궁극적으로 대사산물이 3차원 공간에서 작동하는 방법을 전달하여 이전에는 인식되지 않았던 분자 생물학 의 공간 차원에 빛을 발산합니다. 예를 들어, 이 프로토콜을 사용하여 대사산물 국소화는 트리파노소마 크루시 기생충 부하와 비교되었다. 결과는 병원체와 호스트 조직 사이 관계를 명확히 하고 또한 Chagas 질병 현상 진행의 신진 대사 역학을 보여주었습니다6. 화학지도 제작 방법은 인간 내장 환경 상호 작용51,52,53, 인간 피부46 및 폐와 같은 장기 시스템의 화학 적 구성, 식물 대사 및 환경 상호 작용555와 같은 다양한 주제에도 적용되었습니다. 향후 응용 프로그램은 지역화된 질병 내성 및 탄력성을 평가하거나, 현지 대사산물 수준, 병원체 트로피즘 및 질병 트로피주의 사이의 관계를 trypanosomatid 감염 을 넘어 모델에서 평가포함될 수 있습니다. 이 접근법은 또한 현재 약동성 프로토콜을 확장하는 광범위한 적용성을 가져야하며, 지역 조직 약물 수준과 약물 대사 와 전반적인 대사 문맥, 조직 손상 및 병원균 클리어런스 사이의 관계를 평가해야합니다. 전반적으로 화학 지도 제작은 질병 병인, 인간 건강, 인간 환경 상호 작용 및 미생물 역학을 포함한 응용 프로그램과 함께 다양한 샘플 유형의 대사 산물 분포를 독특한 탐색 할 수 있습니다.
Disclosures
보고할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
로라 이소벨 맥콜 박사, 버로우스 웰컴 기금에서 감염증 의 병기 상에 있는 조사관을 개최합니다. 저자는 NIH 어워드 번호 R21AI148886, NIH 상 번호 P20GM103648에 따라 오클라호마 호흡기 감염증 센터 (OCRID)의 파일럿 교부금, 오클라호마 대학에서 시작 기금 (LIM)의 지원을 인정하고자합니다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 기금 모금자의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 또한이 프로토콜에 사용되는 도구의 개발자에게 감사를 표하고자합니다. 모든 관련 출판물이 인용되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L bottle, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 1 L graduated cylinder, pyrex | NA | NA | any brand, as available |
| 2 mL SafeLock Eppendorf tubes | VWR | 20901-540 | use the appropriate tube model for the available tissue homogenizer |
| 3D model (de-novo generated according to protocol steps, or purchased) | NA | NA | as appropriate for system under investigation |
| 5 mm stainless steel bead | Qiagen | 69989 | |
| 96 well plate | Fisher | 3252449 | |
| AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| analytical balance | NA | NA | any brand, as available |
| ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer | NA | NA | any brand, as available; published in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195–200 (2007). |
| benchtop centrifuge with microcentrifuge, falcon tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| biosafety cabinet | NA | NA | class II, type A2; any brand, as available |
| CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| camera | NA | NA | any brand, as available. A cellphone camera is adequate for this protocol |
| chemiluminescent-capable imaging system | NA | NA | any system, as available |
| cotton balls | NA | NA | any brand, as available |
| cryogloves | VWR | 97008-208 | replace with any brand, as available |
| dissection scissors | NA | NA | any brand, as available |
| dry ice | NA | NA | any brand, as available |
| extra-length forceps | NA | NA | any brand, as available |
| flammable-grade refrigerator | NA | NA | any brand, as available |
| freezer storage boxes for microcentrifuge tubes | NA | NA | any brand, as available |
| fume hood | NA | NA | any brand, as available |
| high-resolution mass spectrometer | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalog number 0726030) |
| ice bucket | NA | NA | any brand, as available |
| ili software | ili.embl.de | NA | |
| isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| large tupperware | NA | NA | any brand, as available; large enough to comfortably contain mouse, cotton ball |
| LC-MS grade acetonitrile | Fisher Optima | A955-4 | |
| LC-MS grade dicholoromethane | Fisher Optima | D151-4 | |
| LC-MS grade formic acid | Fisher Optima | A11750 | |
| LC-MS grade methanol | Fisher Optima | A456-4 | |
| LC-MS grade water | Fisher Optima | W64 | |
| liquid chromatography column | Phenomenex | 00B-4499-AN | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge | Phenomenex | AJ0-8784 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid chromatography column guard cartridge holder | Phenomenex | AJ0-9000 | may be changed to other brands and models as appropriate for the metabolites of interest |
| liquid nitrogen | NA | NA | any brand, as available |
| luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| MeshLab software | https://www.meshlab.net/ | NA | |
| Meshmixer software | https://www.meshmixer.com/ | NA | |
| MS calibrant | NA | NA | appropriate one for available instrument |
| MS data processing software | NA | NA | multiple options available; authors recommend MZmine |
| MSConvert software | http://proteowizard.sourceforge.net/ | NA | |
| Nanodrop | ThermoFisher | ND-ONE-W | other nanodrop models are also suitable |
| p1000 pipet tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p1000 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p20 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p20 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| p200 pipette tips | NA | NA | use the appropriate brand to fit available pipettors |
| p200 pipettor | NA | NA | any brand, as available |
| personal protective equipment (gloves, lab coat, safety glasses/goggles; faceshield) | NA | NA | any brand, as available |
| Q-Plex Mouse Cytokine - Screen (16-Plex) | Quansys biosciences | 110949MS | can replace with other protein-based cytokine assays such as other commercial cytokine ELISA kits |
| Quick-DNA Miniprep Plus Kit (200 preps) | Zymo | D4069 | replace with any brand of mammalian DNA extraction kit, as available |
| real-time thermocycler | NA | NA | any brand, as available |
| salt shaker or tea infuser | NA | NA | any brand; to contain isoflurane-soaked cotton ball and prevent contact with mouse skin |
| SketchUp software | https://www.sketchup.com/ | NA | |
| specimen forceps | NA | NA | any brand, as available |
| speedvac with microcentrifuge tube and 96-well-plate capacity | NA | NA | any brand, as available |
| spreadsheet software | https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel | NA | can replace with other spreadsheet management software, as applicable |
| sulfachloropyridazine | Sigma | S9882-100G | |
| sulfadimethoxine | Sigma | S7007-10G | |
| Sybr green qPCR reaction mix | Fisher | A25780 | can replace with other Sybr green qPCR reaction mixes, as desired |
| TCCCTCTCATCAGTTCTAT GGCCCA primer |
NA | NA | any brand, as available; published in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53–59 (2003). |
| tissue homogenizer | NA | NA | any brand, as available; for example, Qiagen TissueLyser II, catalog number 85300, with TissueLyser Adapter Set (2 x 24), catalog number 69982 |
| tissue samples | NA | NA | from appropriate infection model |
| TissueLyser single-bead dispenser | Qiagen | 69965 | |
| UHPLC | NA | NA | any brand, as available, such as ThermoFisher Vanquish (catalog number IQLAAAGABHFAPUMBHV) |
| ultra-low temperature freezer (-80) | NA | NA | any brand, as available |
| ultrasonic bath | NA | NA | any system, as available |
| wet ice | NA | NA | any brand, as available |
| zone-free sealing film | VWR | 490007-390 |
References
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