Summary
Protokollen beskriver isolering, dyrkning og profilering af endotelceller fra human mesenterisk arterie. Derudover tilvejebringes en metode til at forberede menneskelig arterie til rumlig transkriptomik. Proteomics, transkriptomik og funktionelle assays kan udføres på isolerede celler. Denne protokol kan genbruges til enhver mellemstor eller stor arterie.
Abstract
Endotelceller (ECs) er afgørende for vaskulær og helkropsfunktion gennem deres dynamiske reaktion på miljømæssige signaler. Belysning af TRANSKRIPtomet og epigenomet af ECs er afgørende for at forstå deres roller i udvikling, sundhed og sygdom, men er begrænset i tilgængeligheden af isolerede primære celler. Nyere teknologier har muliggjort profilering af EC-transkriptomet og epigenomet med høj kapacitet, hvilket har ført til identifikation af tidligere ukendte EF-celleunderpopulationer og udviklingsforløb. Mens EF-kulturer er et nyttigt redskab til udforskning af EF-funktion og dysfunktion, kan kulturbetingelserne og flere passager introducere eksterne variabler, der ændrer egenskaberne ved indfødt EC, herunder morfologi, epigenetisk tilstand og genekspressionsprogram. For at overvinde denne begrænsning demonstrerer dette papir en metode til isolering af menneskelige primære EC'er fra donormesenteriske arterier, der sigter mod at fange deres oprindelige tilstand. ECs i intimlaget dissocieres mekanisk og biokemisk ved brug af bestemte enzymer. De resulterende celler kan anvendes direkte til bulk RNA eller enkeltcellet RNA-sekventering eller belagt til dyrkning. Derudover beskrives en arbejdsgang til fremstilling af humant arterielt væv til rumlig transkriptomik, specifikt til en kommercielt tilgængelig platform, selvom denne metode også er velegnet til andre rumlige transkriptomprofileringsteknikker. Denne metode kan anvendes på forskellige kar indsamlet fra en række donorer i sundheds- eller sygdomstilstande for at få indsigt i EF-transkriptionel og epigenetisk regulering, et centralt aspekt af endotelcellebiologi.
Introduction
Foring af blodkarets lumen, endotelceller (ECs) er afgørende regulatorer af vaskulær tone og vævsperfusion. ECs er bemærkelsesværdige i deres evne til at reagere på det ekstracellulære miljø og tilpasse sig ændringer i dynamikken og sammensætningen af blodgennemstrømningen. Disse dynamiske reaktioner formidles gennem et netværk af intracellulære signalhændelser, herunder transkriptionelle og posttranskriptionelle moduleringer med rumlig-tidsmæssig opløsning. Dysreguleringen af disse reaktioner er impliceret i mange patologier, herunder, men ikke begrænset til, hjerte-kar-sygdomme, diabetes og kræft 1,2.
En stor del af undersøgelserne gør brug af cellelinjer eller dyremodeller til at forhøre EF-transkriptom. Førstnævnte er et nyttigt værktøj i betragtning af den relative brugervenlighed og billighed. Seriel dyrkning kan imidlertid introducere fænotypiske ændringer i EC'er, såsom fibroblastiske træk og mangel på polarisering, hvilket afbryder dem fra deres in vivo-tilstand 3. De primære celler, f.eks. human navlestreng EC (HUVEC), har været et populært valg siden 1980'erne, men stammer fra et udviklingsvaskulært bed, der ikke findes hos voksne, og som derfor sandsynligvis ikke fuldt ud repræsenterer modne EC'er. Dyr, især musemodeller, repræsenterer bedre det fysiologiske eller patofysiologiske miljø i ECs og tillader forhør af transkriptomer som følge af genetisk forstyrrelse. Murine ECs kan isoleres fra forskellige væv, herunder aorta, lunger og fedtvæv ved hjælp af enzymbaserede procedurer 4,5,6,7. De isolerede celler kan dog ikke bruges til flere passager, medmindre de transformeres6 og er ofte begrænsede i antal, hvilket kræver pooling fra flere dyr 5,8,9.
Fremkomsten af nye teknologier, der udforsker kararkitekturen på et transkriptomisk niveau, især med enkeltcelleopløsning, har muliggjort en ny æra af endotelbiologi ved at afsløre nye funktioner og egenskaber ved EF'er 5,10,11,12,13,14. En rig ressource bygget af Tabula Muris-efterforskere indsamlede enkeltcelletranskriptomiske profiler af 100.000 celler, herunder EC'er på tværs af 20 forskellige murinorganer15, hvilket afslørede både almindelige EC-markørgener og unikke transkriptomiske signaturer med inter- og intravævsforskelle 5,13. Ikke desto mindre er der klare forskelle mellem mus og menneske i genom, epigenom og transkriptom, især i de ikke-kodende regioner 16,17,18. Disse ovennævnte ulemper understreger vigtigheden af at analysere EC'er ved hjælp af humane prøver for at få en trofast profil af PC'er i deres hjemland inden for sundhed og sygdom.
De fleste EC-isoleringsmetoder er afhængige af fysisk dissociation gennem homogenisering, finskæring og hakning af vævet før inkubation med proteolytiske enzymer til forskellige tidspunkter. Enzymerne og betingelserne varierer også betydeligt mellem vævstyper, fra trypsin til kollagenase, der anvendes alene eller i kombination 19,20,21. Yderligere antistofbaseret berigelse eller oprensning er ofte inkluderet for at øge renheden af ECs. Antistoffer mod EC-membranmarkører, f.eks. CD144 og CD31, konjugeres typisk til magnetiske perler og tilsættes til cellesuspensionen22,23. En sådan strategi kan generelt tilpasses med henblik på EF-isolering fra flere humane væv og musevæv, herunder de teknikker, der indføres i denne protokol.
I deres oprindelige tilstand interagerer EC'er med flere celletyper og kan eksistere i vaskulære nicher, hvor cellenærhed er afgørende for funktion. Mens enkeltcelle- og enkelt-nukleare RNA-sekventeringsundersøgelser (scRNA og snRNA-seq) har været afgørende for de nylige gennembrud i beskrivelsen af EC-heterogenitet, forstyrrer dissociationsprocessen vævskontekst og celle-cellekontakt, som også er vigtige for at forstå EC-biologi. Udviklet i 2012 og udnævnt til Årets metode i 202024, er rumlig transkriptomprofilering blevet brugt til at profilere global genekspression, samtidig med at de rumlige træk i forskellige væv bevares, herunder hjerne25, tumor26 og fedtvæv27. Teknologierne kan målrettes ved hjælp af specialiserede sonder, der er specifikke for bestemte RNA-sekvenser bundet til affinitetsreagenser eller fluorescerende tags, og dermed detektere udvalgte gener ved subcellulær opløsning 28,29,30,31. De kan også være umålrettede 32,33, typisk ved hjælp af rumligt stregkodede oligonukleotider til at fange RNA, som tilsammen omdannes til cDNA til efterfølgende seq-biblioteksforberedelse og dermed har den fordel, at de udleder hele vævsgenekspression på en upartisk måde. Imidlertid opnås rumlig opløsning i øjeblikket ikke på et enkelt mobilniveau med kommercielt tilgængelige teknologier. Dette kan til en vis grad overvindes med dataintegration med scRNA-seq-data, hvilket i sidste ende muliggør kortlægning af enkeltcelletranskriptomet i en kompleks vævskontekst, samtidig med at dets oprindelige rumlige information bevares34.
Heri beskrives en arbejdsgang for at profilere EC-transkriptomet ved hjælp af human overlegen mesenterisk arterie, en perifer arterie, der er blevet brugt til at studere vasodilatation, vaskulær ombygning, oxidativ stress og betændelse 35,36,37. To teknikker er beskrevet: 1) at isolere og berige EF'er fra intima af blodkar, der kombinerer mekanisk dissociation og enzymatisk fordøjelse egnet til enkeltcelletranskriptomsekventering eller efterfølgende in vitro-dyrkning; 2) at forberede arterielle sektioner til rumlig transkriptomprofilering (figur 1). Disse to teknikker kan udføres uafhængigt eller komplementært for at profilere EC'er og deres omgivende celler. Desuden kan denne arbejdsgang tilpasses til brug på enhver mellemstor eller stor arterie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humane vævsundersøgelser blev udført på deidentificerede prøver opnået fra Southern California Islet Cell Resource Center i City of Hope. Forskningstilladelserne til brug af humant væv efter mortem blev opnået fra donorernes pårørende, og etisk godkendelse af denne undersøgelse blev givet af Institutional Review Board of City of Hope (IRB nr. 01046).
1. Fysisk dissociation (estimeret tid: 1-2 timer)
- Læg en frisk arterie på en 10 cm skål og vask med steril Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (D-PBS).
- Med steril tang og dissektionssaks skal du fjerne fedt og ydre bindevæv, indtil karret er rent. Mål beholderens længde med en lineal placeret uden for fadet, og tag billeder til optegnelser (figur 1A).
- Forvarm passende fordøjelsesbuffer til 37 °C: Til scRNA-seq anvendes celle-dissociationsenzym; Til cellekulturassays anvendes 1-6 mg/ml Kollagenase D, 3 mg/ml bakterieafledt protease, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM glucose, med 1 mM CaCl2 6,38 (pH 7,0, kræver ikke justering) tilsat 5 minutter før brug.
- Tag den mesenteriske arterie (typisk med en diameter på 6-8 mm) og skær i længderetningen med en saks for at åbne karrets lumen lodret.
- Brug nåle til at fastgøre beholderen på sort voks på alle fire hjørner, så intimaen er udsat (figur 1B).
- Tilsæt 1 ml forvarmet fordøjelsesbuffer til intima. Tag en steril skalpel og skrab fartøjets lumen forsigtigt to gange.
BEMÆRK: Formålet med denne procedure er at adskille det indelige lag, som muligvis har brug for praksis. Der skal udøves tilstrækkelig kraft til at fjerne endotel, men ikke så meget, at de dybere lag af væv også fjernes, hvilket vil reducere EF-repræsentationen. - Overfør fordøjelsesbufferen til et 5 ml rør. Tilsæt 1 ml fordøjelsesbuffer til intimaen og pipetten forsigtigt op og ned for at samle de resterende celler og tilsæt til 5 ml-røret. Inkuber celler ved 37 °C, der roterer ved 150 o / min i 5 minutter.
- Tilsæt 2 ml M199-medium (eller D-PBS, hvis du fortsætter med scRNA-seq) til cellesuspensionen for at slukke den enzymatiske reaktion. Bland forsigtigt og centrifuger ved 4 °C, 600 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten, og opbevar supernatanten separat til dyrkning som en kontrol for at observere, om alle celler er fanget i pelleten i trin 1.8. Resuspend cellepillen i 1 ml M199-medium (eller D-PBS, hvis du fortsætter med scRNA-seq).
- Vurder cellens levedygtighed ved at blande 10 μL trypanblå med 10 μL cellemateriale. Overhold cellemorfologien og tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan celler anvendes til protein- eller RNA-kvantificering eller dyrkes in vitro ved hjælp af EF-kulturmedier efter standardprotokol39. Alternativt kan de forberedes til sekventering som beskrevet i næste afsnit. - Til kulturen skal du belægge to brønde af en 6-brønds plade ved at pipettere 500 μL fastgørelsesreagens i brønde i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter fjernelse af fastgørelsesreagens og vask med steril D-PBS dispenseres den fulde cellebestand i en brønd, og supernatanten holdes som en kontrol i den anden brønd.
2. Forberedelse til scRNA-seq-undersøgelser (estimeret tid: 3-4 timer)
- Centrifugering af cellestammen fra trin 1,11 ved 4 °C, 600 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og genophænd forsigtigt pillen med en P1000-pipette og bredboret spids i 1 ml 0,04% bovin serumalbumin (BSA) i D-PBS. Bland godt for at sikre en enkeltcellesuspension.
- Før opløsningen gennem en 40 μm sil for at fjerne celleaffald. Hvis der er snavs tilbage, skal du passere gennem en anden sil til 4 ml 0,04% BSA i D-PBS.
- Centrifuge ved 4 °C, 600 x g i 5 min. Fjern supernatanten, og brug pillen igen i 500 μL på 0,04 % BSA i D-PBS ved hjælp af en P1000-pipette med en bredboret pipettespids. Bland godt for at sikre en enkeltcellesuspension.
- Vurder cellens levedygtighed ved at blande 10 μL cellebestand med 10 μL trypanblå. Brug et hæmocytometer til at observere morfologien, afgøre, om der er en enkeltcellesuspension uden klynger, kontrollere for vævsaffald og beregne antallet af levende og døde celler.
- Hvis celler er grupperet eller snavs forbliver, gentag vask med 0,04% BSA i D-PBS eller passere gennem 40 μm sil igen.
BEMÆRK: Selvom dette vil reducere udbyttet, er det vigtigt, at celler findes i en ren enkeltcellesuspension for optimal sekventering. - Enkeltcellesuspensionen kan anvendes til scRNA-seq.
3. Rumlig transkriptomprofilering (estimeret tid: 3-4 timer)
- Tilsæt isopentan (2-methylbutan) til en metalbeholder og afkøl flydende nitrogen (LN2) eller tøris (LN2 foretrækkes, da det vil bringe temperaturen lavere end tøris). Hæld optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) i brønde af mærket plast cryomolds, og pas på ikke at skabe bobler og fjerne dem, der vises. Lad kryomold stå på tøris for at køle af.
- Skær mindst to koronale sektioner, 1 cm i længden af beholderen. Brug lange (12") tang til at nedsænke vævet i isopentan, indtil det er frosset. Nedsænk hurtigt vævet i OCT ved orientering med lumen synligt i midten. Pas på at fjerne eventuelle bobler, især dem ved siden af vævet.
- Brug lange (12") tang til at gribe fat i kryomolerne og holde dem i metalbeholderen. Mens bunden af formene skal være i væsken, bør den ikke være for dyb til at lade isopentan løbe over vævet. Overhold frysningen, OLT bliver gradvist hvid udefra på 1-2 minutter.
- Opbevar disse sektioner i en forseglet beholder ved -80 °C i op til 6 måneder.
BEMÆRK: Vedligehold prøver på tøris til enhver tid og tillad ikke mere end en fryse-optøningscyklus. Dette væv kan bruges til histologisk analyse, RNA / DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) eller rumlig transkriptomik, som vil blive beskrevet nu. - Kryostattemperaturen indstilles til -20 °C for kammeret og -10 °C for prøvehovedet. Ligevægt OCT indlejrede beholdersektioner, knive, børster og glider til -20 °C i kryostaten i ca. 30 min. Under ligevægt skal maskinen og alt udstyr, der kan berøre sektionerne, inklusive bladet, rengøres med 70 % ethanol efterfulgt af RNase-dekontamineringsopløsning.
- Fastgør prøven ved at dispensere en lille mængde OCT på den cirkulære kryostatblok og læg prøven ovenpå, før den fryser. Placer blokken i midten af prøvehovedet, og skru blokken på plads ved hjælp af et højt sort håndtag til venstre. Skær overskydende OCT, der omgiver fartøjet, væk.
- Indstilling af skæretykkelsen til 10 μm på kryostaten, skær ca. 60 sektioner og læg dem i et forkølet 1,5 ml rør. Disse sektioner vil blive brugt til at vurdere RNA-kvaliteten. Ved fjernelse fra kryostat tilsættes straks 1 ml RNA-ekstraktionsreagens og hvirvel, indtil sektionerne er helt opløst.
- Tilsæt 200 μL chloroform og bland, indtil opløsningen ligner en jordbærmilkshake. Centrifuge ved 11.200 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Saml den vandige fase (klar fase oven på hvide og lyserøde lag) og tilsæt 500 μL isopropanol til den. Bland ved at vende rørene over 10 gange og anbring dem ved -80 °C i mindst 20 minutter.
- Centrifuge ved 11.200 x g i 10 minutter ved 4 °C. Opløs den rensede RNA-pellet i 5 μL RNase-frit vand. Undersøg RNA Integrity Number (RIN).
BEMÆRK: Prøver med RIN ≥ 7 foretrækkes, men RIN ≥ 6 er acceptabel. Antallet af vævssektioner og volumen af opløsning til RNA-opløsning kan kræve optimering afhængigt af det system, der anvendes til at sikre, at den endelige RNA-koncentration ligger inden for RIN-funktionsområdet for at muliggøre nøjagtig RIN-evaluering. - Øv dig i at skære og placere sektioner korrekt inden for de fiduciale rammer ved hjælp af almindelige glasdias, før du fortsætter med kommercielt tilgængelig vævsoptimering eller genekspressionsdias. Dette kan opnås ved at tegne 6,5 mm x 6,5 mm firkanter på en almindelig glasrutsjebane, afkøle til -20 °C i kryostaten og placere sektioner i dette opsamlingsområde.
- Skær 10 μm sektioner med anti-rulleplade på plads, vend og flad forsigtigt ved forsigtigt at røre sektionen gennem den omgivende OCT.
- Brug RNase-fri kryostatbørster til at placere vævssektionen i firkanten ved kun at bruge den omgivende OCT. Placer straks en finger (i handsker) på bagsiden af opsamlingsområdet for at smelte sektionen til diaset.
- Når sektionen har klæbet, skal du placere glideren på kryobaren for at lade sektionen fryse. Der skal udvises forsigtighed for at undgå vævsfoldning og væv, der ligger over de afgrænsede kanter af den fiduciale ramme. Skær om nødvendigt vævet i halvdele eller fjerdedele langs lumen ved hjælp af et blad for at sikre, at beholdersektionen passer inden for rammen på 6,5 mm x 6,5 mm.
- Skær 10 μm sektioner af væv pr. 3.12-3.14 på vævsoptimering eller genekspressionsdias. Overfør rutsjebanen til en glidemailer placeret på tøris. Opbevar dias ved -80 °C i op til 4 uger, før du fortsætter med offentliggjorte rumlige protokoller33,34.
4. Sekventering af dataanalyse (estimeret tid: op til 1 uge afhængigt af kendskab til software)
BEMÆRK: Kun for rumlig transkriptomisk analyse skal du springe til trin 4.8. scRNA-seq-data behandles ved hjælp af den standardiserede rørledning, der er justeret til humant hg38-referencetranskriptom. R-pakken Seurat (v3.2.2) bruges til at analysere scRNA-seq-data efter offentliggjorte retningslinjer40.
- Filtrer ved hjælp af veletablerede kvalitetskontrolmålinger: Sjældne celler med meget højt antal gener (potentielt multipleter) og celler med høje mitokondrieprocenter (lavkvalitets- eller døende celler, der ofte præsenterer mitokondrieforurening) fjernes.
- Normaliser data ved hjælp af "sctransform", en metode til forbedring af prøveintegration sammenlignet med log-normalisering. Disse normaliserede data bruges til dimensionsreduktion og klyngedannelse, mens log-normaliserede ekspressionsniveauer bruges til analyse baseret på genekspressionsniveauer, såsom celletypeklassificering41.
- Vælg markørgener pr. celletype, f.eks . blodpladeendotelcelleadhæsionsmolekyle-1 (PECAM1) og von Willebrand-faktor (VWF) for EC'er, lumican (LUM) og prokollagen C-endopeptidase Enhancer (PCOLCE) for fibroblaster, B-celletranslokationsgen 1 (BTG1) og CD52 for makrofager, C1QA og C1QB for monocytter og myosintung kæde 11 (MYH11) og transgelin (TAGLN) til vaskulære glatte muskelceller36.
- Beregn det gennemsnitlige ekspressionsniveau på tværs af enkeltceller mellem hvert par markører for at have en enkelt markør med et gennemsnitligt ekspressionsniveau knyttet til hver celletype42.
- Anvend en Gaussian Mixture Model (GMM) med to komponenter på ekspressionsdataene for hver markør på tværs af enkeltceller for at adskille celler i to sæt, nemlig stærkt udtrykke markøren og ringe udtrykke markøren. På denne måde tildeles hver enkelt celle for hver markør til en af de to komponenter42.
- Brug statistisk berigelse til sættet af markørgener, en Fishers nøjagtige test, til at tildele en celletype til hver klynge. Ved at gøre dette opnås et sæt p-værdier pr. klynge, der hver svarer til en celletype. Celletypen med den laveste p-værdi tildeles den pågældende klynge.
- Behandl de rumlige transkriptomiske data ved hjælp af Space Ranger-rørledningerne, hvilket resulterer i rumlig afstrangkodning og generering af kvalitetskontrolmålinger (QC), herunder samlede justerede læsninger til hg38 humant transkriptom, medianantallet af unique molecular identifier (UMI) eller gener pr. Spot35.
BEMÆRK: R-pakken Seurat (v3.2.2) bruges til at analysere de Space Ranger-behandlede data efter offentliggjorte retningslinjer40. - Normalisere data ved hjælp af "sctransform", en metode, der er påvist at forbedre downstream-analysen sammenlignet med log-normalisering i betragtning af vævets heterogenitet og den meget høje varians i tællinger på tværs af pletterne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen af EC'er fra mesenterisk arterie ved hjælp af en kombination af mekanisk og enzymatisk dissociation eller kryopræservering til brug i forskellige nedstrømsassays er afbildet her (figur 1). EC'er kan profileres i mesenteriske arterier ved hjælp af følgende trin: A) mekanisk dissociation fra intima kombineret med kollagenasefordøjelse til kulturceller; B) generering af enkeltcellesuspension til scRNA-seq; eller C) tværsnit af arterien kan indlejres i OCT for at blive kryosektioneret til profil rumlig transkriptom (figur 1 og figur 2).
Figur 1: Arteriel vævsbehandling og rumlig profilering. (A) En renset mesenterisk arterie. (B) Fartøjet er skåret op for at afsløre intima. (C) Hæmatoxylin og Eosin (H&E) farvning af mesenterisk arterietværsnit i den fiduciale ramme. Billede taget ved hjælp af et 5x objektiv under widefield fluorescens omvendt mikroskop. (D) Repræsentativ Space Ranger-outputfil med total genekspression. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over EF-isolations- og profileringsteknikker. Flowdiagram, der viser forskellige metoder til behandling af mesenterisk arterie. Behandlingsteknikker resulterer i cellesuspensioner, der er egnede til enkeltcellet (sc) RNA-seq, endotelcellekultur (EC), eller hele væv er indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) til rumlig transkriptomprofilering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Isolerede EC'er dyrket ved hjælp af den beskrevne protokol viser en tydelig brostenslignende morfologi med minimale forurenende celler (figur 3A). Ekspression af EC-markør vaskulær endotel (VE)-Cadherin blev bekræftet under anvendelse af immunofluorescens, der visualiserede celle-celle-kryds (figur 3B). Isolerede EC'er blev underkastet flowcytometrianalyse for CD31. Som negative kontroller producerede ufarvede HUVEC'er (uden antistof) et 1,1% signal, og HUVEC'er inkuberet med IgG gav et signal på 0,8%. Som en positiv kontrol viste HUVEC'er farvet med CD31-antistof 99% renhed og blev brugt til at gate kanalerne for humane mesenteriske arterielle endotelceller (HMAECs). Ca. 80 % af cellerne var CD31-positive, hvilket indikerer, at HMAEC'er udgjorde størstedelen af den nyligt isolerede cellepopulation (figur 3C). Mislykkede isolationer ved enten at skrabe for hårdt / dybt, så cellerne ved for lav densitet eller opretholde kulturen ud over passage 3 resulterer i celler med forstyrret morfologi, der potentielt udtrykker mesenkymale markører (αSMA) eller forlænger, der ligner en fibroblastisk tilstand (figur 3D).
Figur 3: Validering af isolerede dyrkede mesenteriske arterielle EC'er. (A) Brightfield-billede af isolerede EC'er, 10x linse, skalastang = 50 μm. (B) Immunofluorescens af VE-Cadherin-ekspression med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) som nuklear markør. Billede taget ved hjælp af et 10x objektiv under widefield fluorescens omvendt mikroskop. Repræsentativt billede viser VE-Cadherin lokalisering. Skalabjælke = 50 μm. (C) FACS-plots af ufarvet HUVEC (øverst til venstre), HUVEC farvet med IgG-kontrol (øverst til højre), HUVEC farvet med CD31 (nederst til venstre) og de isolerede humane mesenteriske arterielle endotelceller (HMAEC) farvet med CD31 (nederst til højre) (D) Immunofluorescensbilleder af HMAEC'er med DAPI (nuklear markør), alfa-glat muskel actin (αSMA) og CD31. 40x objektiv, skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
ECs isoleret ved hjælp af celle-dissociationsenzym gennemgik scRNA-seq. Figur 4A viser en repræsentativ ensartet mangfoldig tilnærmelse og projektion (UMAP) isoleret fra mesenterisk arterie ved anvendelse af den nuværende protokol for scRNA-seq på isolerede HMAECs, med 34% celler grupperet som EC'er ved hjælp af henholdsvis PECAM1 og VWF (figur 4B,C) som markører.
Figur 4: scRNA-seq af mesenteriske arterielle EC'er. (A) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) plot af scRNA-seq data fra mesenterisk arterie. En 2-dimensionel projektion af manifolden i et højdimensionelt rum, hvor hvert punkt repræsenterer en enkelt celle, og nærheden til andre punkter angiver, hvor ens transkriptomet er med hinanden. Celler er farvekodede af deres celletyper. B) PECAM1-udtryk projiceret på UMAP. (C) VWF-udtryk projiceret på UMAP. Farvebjælker repræsenterer ekspressionen af niveauer af gener, hvor RNA-niveauerne er afbildet ved log-normaliserede unikke molekylære identifikatortællinger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Til rumlig transkriptomisk arbejdsgang blev ekstraheret RNA fra vævssektioner elektroforiseret på en gel for at visualisere RNA-kvalitet. Et svagt signal eller fravær af ribosomale RNA-bånd af 18S og 28S og tilstedeværelsen af nedbrydningsprodukter observeret i figur 5A, bane A1, er et eksempel på RNA af dårlig kvalitet og bør ikke behandles yderligere. Prøver med en koncentration uden for intervallet kan føre til lavere RIN (figur 5A, bane B1). Fortynding af RNA'et med to gange øgede imidlertid RIN tilstrækkeligt til at fortsætte (figur 5A, bane C1). Før bestemmelse af genekspression blev der udført en vævsoptimering for at bestemme den optimale permeabiliseringstid for at frigive RNA, der skal fanges af oligonukleotiderne på genekspressionsdiaset (figur 5B). Baseret på fluorescensbilleddannelse af komplementært DNA-fodaftryk (cDNA) producerede 18 minutters permeabilisering den laveste baggrund, men stærkeste signal, og blev således valgt til at være den optimale varighed. Hematoxylin og eosin (H & E) farvning visualiserede fartøjets morfologi, hvilket gjorde det muligt at identificere regioner af interesse (figur 5C). Bibliotekskvaliteten blev vurderet (figur 5D) og bestemt til at være egnet til sekventering. UMI tæller pr. spot, antal læsninger pr. spot og samlede gener er kvalitetsmålinger produceret af Space Ranger-rørledningen, variabiliteten af hver vist i figur 5E. Endelig blev genekspression (ved hjælp af Actin alpha-2 (ACTA2) som et eksempel, figur 5F) visualiseret med rumlig forankring på H & E-farvet kar.
Figur 5: Rumlig transkriptomisk arbejdsgang og repræsentative resultater (A) Kvalitetsvurdering af RNA ekstraheret fra to prøver af mesenterisk arterie, A1 fra en prøve, B1 fra den anden prøve, C1 fortyndet 2x fra B1. Røde pile angiver ribosomale 28S- og 18S-bånd. (B) Rumlig vævsoptimering (TO) arbejdsgang. (C) Genekspressionsdias (GEX), der viser vævssektionerne (venstre panel); H&E-billeder af vævssektionerne indlæst på GEX-diaset før permeabilisering i 18 minutter, omvendt transkription og bibliotekskonstruktion (højre panel), skalabjælke = 1 cm. (D) Kvalitetsvurdering af de udarbejdede biblioteker. (E) Outputmålinger fra Space Ranger viser intervaller mellem gennemsnitlige læsninger, UPI'er og gener pr. Sted for forskellige biblioteker. Fejllinjer angiver min. og maks. (F) ACTA2-udtryk på tværs af fartøjssektionen. Alle mikroskopibilleder blev taget ved hjælp af et widefield omvendt mikroskop, fra et 5x objektiv, tilescan modul. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede arbejdsgang beskriver et sæt teknikker til profilering af EC'er fra et enkelt stykke menneskelig arterie med enkeltcelle og rumlig opløsning. Der er flere kritiske trin og begrænsende faktorer i protokollen. En nøgle til transkriptomprofilering er friskheden af vævet og RNA-integriteten. Det er vigtigt at opretholde væv på is så meget som muligt inden behandling for at minimere RNA-nedbrydning. Typisk behandles post-mortem vævene mellem 8-14 timer efter dødstidspunktet. Det anbefales dog at påbegynde isolationen eller kryopræserveringen så hurtigt som muligt efter ekstraktion fra donorerne. Specielt til kortlægning af rumlig transkriptom bør vævet opbevares på tøris, og der bør ikke tillades mere end én fryse-optøningscyklus. Mere end ét fartøjstværsnit bør indlejres i OLT for om nødvendigt at tillade gentagelser. Der bør også gøres en indsats for at fremme et RNase-frit miljø under vævsbehandling og celleisolering. For det andet kan fartøjernes størrelse være en begrænsende faktor. For rumlig transkriptomik kan protokollen udføres på 1 mm af beholderen i alt, uanset diameteren. For dissociationsprotokollen for cellekultur og scRNA-seq ville den nedre grænse være, hvis beholderen er for smal (dvs. under 1 mm i diameter) til at muliggøre indsættelse af dissektionssaks. Baseret på disse principper kan dissociationsprotokollen tilpasses til enhver medium eller større arterie eller vene, så længe karrenes størrelse tillader åbning, og den rumlige transkriptomprocedure kan anvendes på alle fartøjer, der kan passe helt eller delvist ind i den fiduciale ramme.
For at behandle væv til enkeltcelletranskriptomanalyse har flere grupper beskrevet brugen af liberase og elastase til at opnå alle cellepopulationer inden forkarvæggen 9,43,44. De resulterende datasæt indeholder dog i gennemsnit kun 3-7% af den samlede cellepopulation, der er kommenteret som ECs 9,45. En måde at forbedre den begrænsede EF-repræsentation i scRNA-seq-dataene på er ved at berige EC-fraktionen ved at udnytte EC-overflademarkørerne via FACS44,46. Dette kræver dog normalt store mængder startvæv og dyrt udstyr, der muligvis ikke rutinemæssigt er tilgængeligt for alle laboratorier. Denne protokol udnytter den unikke anatomiske position af ECs, dvs. primært i det indelige lag, hvilket muliggør berigelse af ECs uden behov for hård vævsfordøjelse og forbedrer cellelevedygtigheden for scRNA-seq eller efterfølgende kultur. Procentdelen af ETC'er i den endelige celleblanding for scRNA-seq kan øges ved at tilføje et trin ved anvendelse af VE-Cadherin/CD144-antistofkonjugerede magnetiske perler. Dette trin udelukker dog muligvis ikke alle andre celler, der interagerer med EC'er på grund af den oprindelige celle-celle-interaktion. Ikke desto mindre, selvom de andre celletyper (f.eks. Makrofager, glatte muskelceller og fibroblaster) traditionelt ville blive betragtet som "forurening" i EF-isolation, kan de give nyttige oplysninger til celle-celleinteraktioner i vævssammenhæng. I scRNA-seq-dataanalysen kan EC'er effektivt kommenteres ved hjælp af EC-markørerne, og celle-celle-interaktionerne kan udledes bioinformatisk ved hjælp af flere populære bioinformatikmetoder (f.eks. CellChat47, CellphoneDB48, CytoTalk49 blandt andre). Desuden kan medtagelsen af disse data muliggøre en mere effektiv integration og dekonvolution af de rumlige transkriptomprofileringsdata, som ikke er i encelleopløsning (se nedenfor)34.
For rumligt transkriptom er der i øjeblikket ingen guldstandard for forberedelse af væv til denne teknik og begrænset forskning i fremstilling af vaskulatur, med det meste af den offentliggjorte forskning ved hjælp af animalsk væv50,51. Teknikken kræver kommercielt tilgængelige dias med specialiserede fudielle rammer med et optagelsesområde indeholdende ca. 5.000 stregkodede pletter med en diameter på 55 μm. Pletterne placeres 100 μm bortset fra midten af stedet til tilstødende pletter, hvilket efterlader ca. 45 μm mellemrum mellem pletter, der ikke vil blive profileret, hvilket begrænser opløsningen. Desuden vil et enkelt sted indeholde flere celler, da størstedelen af cellerne er under 55 μm i området. Som nævnt er dette således ikke en enkeltcellesekventeringsteknik. Ved at integrere dataene med scRNA-seq kan opløsningen imidlertid forbedres, og heterogeniteten inden for et sted kan afsløres34. Selvom den nuværende protokol fokuserer på et rumligt transkriptomisk profileringsassay, kan denne teknik tilpasses til andre nye rumlige profileringsmetoder52,53, da protein- og RNA-kvaliteten opretholdes i denne procedure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.Z. er grundlægger og bestyrelsesmedlem i Genemo, Inc.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (til Z.B.C.); DP1DK126138 og DP1HD087990 (til S.Z.); et Ella Fitzgerald Foundation-stipendium og et Wanek-familieprojekt (til Z.B.C.); og et Human Cell Atlas frønetværkstilskud (til Z.B.C. og S.Z.). Forskning rapporteret i denne publikation omfattede arbejde udført i Integrative Genomics Core at City of Hope støttet af National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tildelingsnummer P30CA033572. Forfatterne vil gerne takke Dr. Ismail Al-Abdullah og Dr. Meirigeng Qi fra ø-transplantationsteamet i City of Hope for isolering af humant væv, Dr. Dongqiang Yuan i City of Hope for hans hjælp med scRNA-seq-analyse og Dr. Marc Halushka ved Division of Cardiovascular Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine for hans uvurderlige indsigt i vaskulær histologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
- Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
- Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
- Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
- Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
- Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
- Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
- The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
- Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
- Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
- Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
- McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
- Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
- Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
- Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
- Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
- Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
- Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
- Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
- Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
- Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
- Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
- Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
- Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
- van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
- Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
- Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
- Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).
