Summary
Das Protokoll beschreibt die Isolierung, Kultur und Profilierung von Endothelzellen aus der menschlichen Mesenterialarterie. Zusätzlich wird eine Methode zur Vorbereitung der menschlichen Arterie für die räumliche Transkriptomik bereitgestellt. Proteomik, Transkriptomik und funktionelle Assays können an isolierten Zellen durchgeführt werden. Dieses Protokoll kann für jede mittelgroße oder große Arterie wiederverwendet werden.
Abstract
Endothelzellen (ECs) sind durch ihre dynamische Reaktion auf Umwelteinflüsse entscheidend für die Gefäß- und Ganzkörperfunktion. Die Aufklärung des Transkriptoms und Epigenoms von ECs ist von größter Bedeutung, um ihre Rolle bei Entwicklung, Gesundheit und Krankheit zu verstehen, ist jedoch in der Verfügbarkeit isolierter Primärzellen begrenzt. Jüngste Technologien haben die Hochdurchsatzprofilierung von EC-Transkriptom und Epigenom ermöglicht, was zur Identifizierung bisher unbekannter EC-Zellsubpopulationen und Entwicklungsverläufe geführt hat. Während EC-Kulturen ein nützliches Werkzeug bei der Erforschung von EC-Funktion und -Dysfunktion sind, können die Kulturbedingungen und mehrere Passagen externe Variablen einführen, die die Eigenschaften des nativen EC verändern, einschließlich Morphologie, epigenetischer Zustand und Genexpressionsprogramm. Um diese Einschränkung zu überwinden, demonstriert die vorliegende Arbeit eine Methode zur Isolierung menschlicher primärer ECs aus Spender-Mesenterialarterien, die darauf abzielt, ihren ursprünglichen Zustand zu erfassen. ECs in der intimen Schicht werden mechanisch und biochemisch unter Verwendung bestimmter Enzyme dissoziiert. Die resultierenden Zellen können direkt für die Bulk-RNA- oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung verwendet oder für die Kultur plattiert werden. Darüber hinaus wird ein Workflow für die Präparation von menschlichem arteriellem Gewebe für die räumliche Transkriptomik, speziell für eine kommerziell erhältliche Plattform, beschrieben, obwohl diese Methode auch für andere räumliche Transkriptom-Profiling-Techniken geeignet ist. Diese Methodik kann auf verschiedene Gefäße angewendet werden, die von einer Vielzahl von Spendern in Gesundheits- oder Krankheitszuständen gesammelt wurden, um Einblicke in die transkriptionelle und epigenetische Regulation der EG zu erhalten, ein zentraler Aspekt der Endothelzellbiologie.
Introduction
Endothelzellen (ECs), die das Lumen der Blutgefäße auskleiden, sind entscheidende Regulatoren des Gefäßtonus und der Gewebedurchblutung. ECs sind bemerkenswert in ihrer Fähigkeit, auf die extrazelluläre Umgebung zu reagieren und sich an Veränderungen in der Dynamik und Zusammensetzung des Blutflusses anzupassen. Diese dynamischen Reaktionen werden durch ein Netzwerk von intrazellulären Signalereignissen vermittelt, einschließlich transkriptioneller und posttranskriptioneller Modulationen mit räumlich-zeitlicher Auflösung. Die Dysregulation dieser Reaktionen ist an vielen Pathologien beteiligt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes und Krebs 1,2.
Ein großer Teil der Studien verwendet Zelllinien oder Tiermodelle, um das EC-Transkriptom abzufragen. Ersteres ist ein nützliches Werkzeug, angesichts der relativen Benutzerfreundlichkeit und Preiswertigkeit. Die serielle Kultivierung kann jedoch phänotypische Veränderungen an ECs einführen, wie z. B. fibroblastische Merkmale und einen Mangel an Polarisation, wodurch sie von ihrem In-vivo-Zustand getrennt werden 3. Die Primärzellen, z. B. die menschliche Nabelvene EC (HUVEC), sind seit den 1980er Jahren eine beliebte Wahl, stammen jedoch aus einem entwicklungsbedingten Gefäßbett, das bei Erwachsenen nicht existiert und daher wahrscheinlich nicht vollständig reife ECs darstellt. Tiere, insbesondere Mausmodelle, bilden die physiologische oder pathophysiologische Umgebung von EC besser ab und erlauben die Abfrage von Transkriptomen als Folge genetischer Störungen. Murine ECs können aus verschiedenen Geweben, einschließlich der Aorta, der Lunge und des Fettgewebes, mit enzymbasierten Verfahren 4,5,6,7 isoliert werden. Die isolierten Zellen können jedoch nicht für mehrere Passagen verwendet werden, es sei denn,sie sind transformiert 6 und sind oft in der Anzahl begrenzt, was eine Bündelung von mehreren Tierenerfordert 5,8,9.
Das Aufkommen neuer Technologien, die die Gefäßarchitektur auf transkriptomischer Ebene erforschen, insbesondere mit Einzelzellauflösung, hat eine neue Ära der Endothelbiologie ermöglicht, indem sie neue Funktionen und Eigenschaften der ECs 5,10,11,12,13,14 enthüllt hat. Eine reichhaltige Ressource, die von Tabula Muris-Forschern erstellt wurde, sammelte einzelzellige transkriptomische Profile von 100.000 Zellen, einschließlich ECs in 20 verschiedenen murinen Organen15, die sowohl gemeinsame EC-Markergene als auch einzigartige transkriptomische Signaturen mit Inter- und Intragewebeunterschiedenzeigten 5,13. Dennoch gibt es deutliche Unterschiede zwischen Maus und Mensch in Genom, Epigenom und Transkriptom, insbesondere in den nicht-kodierenden Regionen16,17,18. Diese oben genannten Nachteile unterstreichen die Bedeutung der Analyse von ECs unter Verwendung menschlicher Proben, um ein getreues Profil von ECs in ihrem Heimatzustand in Gesundheit und Krankheit zu erhalten.
Die meisten EC-Isolationsmethoden beruhen auf der physikalischen Dissoziation durch Homogenisierung, feines Schneiden und Zerkleinern des Gewebes vor der Inkubation mit proteolytischen Enzymen für unterschiedliche Zeiten. Die Enzyme und Bedingungen variieren auch erheblich zwischen den Gewebetypen, von Trypsin bis Kollagenase, die allein oder in Kombination verwendet werden 19,20,21. Weitere Antikörper-basierte Anreicherung oder Reinigung sind oft enthalten, um die Reinheit von ECs zu erhöhen. Typischerweise werden Antikörper gegen EC-Membranmarker, z. B. CD144 und CD31, an magnetische Kügelchen konjugiert und der Zellsuspension22,23 zugesetzt. Eine solche Strategie kann im Allgemeinen für die EG-Isolierung aus mehreren menschlichen und Mausgeweben angepasst werden, einschließlich der in diesem Protokoll eingeführten Techniken.
In ihrem nativen Zustand interagieren ECs mit mehreren Zelltypen und können in vaskulären Nischen existieren, in denen die Zellnähe für die Funktion entscheidend ist. Während Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierungsstudien (scRNA und snRNA-seq) für die jüngsten Durchbrüche bei der Beschreibung der EC-Heterogenität von größter Bedeutung waren, stört der Dissoziationsprozess den Gewebekontext und den Zell-Zell-Kontakt, die auch für das Verständnis der EC-Biologie wichtig sind. Das 2012 entwickelte und2020 24 zur Methode des Jahres ernannte räumliche Transkriptomprofilierung wurde verwendet, um die globale Genexpression zu profilieren und gleichzeitig die räumlichen Merkmale in verschiedenen Geweben einschließlich Gehirn 25, Tumor26 und Fettgewebe27 beizubehalten. Die Technologien können gezielt eingesetzt werden, indem spezielle Sonden verwendet werden, die für bestimmte RNA-Sequenzen spezifisch sind, die an Affinitätsreagenzien oder fluoreszierenden Tags befestigt sind, wodurch ausgewählte Gene mit subzellulärer Auflösung 28,29,30,31 nachgewiesen werden. Sie können auch ungezielt32,33 sein, typischerweise mit räumlich barcodierten Oligonukleotiden, um RNA zu fangen, die zusammen in cDNA für die anschließende Seq-Bibliotheksvorbereitung umgewandelt werden und daher den Vorteil haben, die Genexpression des gesamten Gewebes auf unvoreingenommene Weise abzuleiten. Allerdings wird die räumliche Auflösung derzeit auf einer einzigen zellulären Ebene mit kommerziell verfügbaren Technologien nicht erreicht. Dies kann bis zu einem gewissen Grad durch die Datenintegration mit scRNA-seq-Daten überwunden werden, was letztendlich die Kartierung von Einzelzelltranskriptomen in einem komplexen Gewebekontext unter Beibehaltung seiner ursprünglichen räumlichen Informationenermöglicht 34.
Hierin wird ein Workflow beschrieben, um ein EC-Transkriptom unter Verwendung der humanen oberen Mesenterialarterie zu profilieren, einer peripheren Arterie, die zur Untersuchung von Vasodilatation, Gefäßumbau, oxidativem Stress und Entzündungverwendet wurde 35,36,37. Es werden zwei Techniken beschrieben: 1) zur Isolierung und Anreicherung von ECs aus der Intima von Blutgefäßen, die mechanische Dissoziation und enzymatische Verdauung kombinieren, die für die Einzelzell-Transkriptomsequenzierung oder die anschließende In-vitro-Kultur geeignet sind; 2) zur Vorbereitung von arteriellen Schnitten für die räumliche Transkriptomprofilerstellung (Abbildung 1). Diese beiden Techniken können unabhängig voneinander oder komplementär durchgeführt werden, um ECs und ihre umgebenden Zellen zu profilieren. Darüber hinaus kann dieser Workflow für den Einsatz an jeder mittleren oder großen Arterie angepasst werden.
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Protocol
Studien an menschlichem Gewebe wurden an deidentifizierten Proben durchgeführt, die vom Southern California Islet Cell Resource Center in der Stadt der Hoffnung erhalten wurden. Die Forschungszustimmungen für die Verwendung von postmortalem menschlichem Gewebe wurden von den nächsten Angehörigen der Spender eingeholt, und die ethische Genehmigung für diese Studie wurde vom Institutional Review Board of City of Hope (IRB Nr. 01046) erteilt.
1. Physikalische Dissoziation (geschätzte Zeit: 1-2 h)
- Legen Sie eine frische Arterie auf eine 10 cm lange Schale und waschen Sie sie mit steriler Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS).
- Entfernen Sie mit steriler Pinzette und Dissektionsschere das Fett und das äußere Bindegewebe, bis das Gefäß sauber ist. Messen Sie die Länge des Gefäßes mit einem Lineal, das außerhalb der Schale platziert ist, und machen Sie Fotos für Aufzeichnungen (Abbildung 1A).
- Vorwärmender geeigneter Verdauungspuffer bis 37 °C: für scRNA-seq verwenden Sie ein Zelldissoziationsenzym; Für Zellkulturassays werden 1-6 mg/ml Collagenase D, 3 mg/ml bakterielle Protease, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM Glukose, wobei 1 mM CaCl2 6,38 (pH 7,0, erfordert keine Anpassung) 5 min vor der Anwendung hinzugefügt werden.
- Nehmen Sie die Arteria mesenterica (typischerweise mit einem Durchmesser von 6-8 mm) und schneiden Sie mit der Schere längs ab, um das Gefäßlumen vertikal zu öffnen.
- Befestigen Sie das Gefäß mit Nadeln an allen vier Ecken auf schwarzem Wachs, wobei die Intima freigelegt bleibt (Abbildung 1B).
- Fügen Sie 1 ml vorgewärmten Verdauungspuffer zu Intima hinzu. Nehmen Sie ein steriles Skalpell und kratzen Sie das Lumen des Gefäßes zweimal vorsichtig ab.
HINWEIS: Der Zweck dieses Verfahrens besteht darin, die Intimschicht zu dissoziieren, was möglicherweise Übung erfordert. Es muss genug Kraft ausgeübt werden, um Endothel zu entfernen, aber nicht so sehr, dass auch die tieferen Gewebeschichten entfernt werden, was die EC-Repräsentation verringert. - Übertragen Sie den Verdauungspuffer in ein 5-ml-Röhrchen. Fügen Sie 1 ml Verdauungspuffer in die Intima hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die verbleibenden Zellen zu sammeln und in die 5 ml Tube zu geben. Inkubieren Sie Zellen bei 37 °C und drehen Sie sie 5 min lang mit 150 U/min.
- Fügen Sie 2 ml M199-Medium (oder D-PBS, wenn Sie mit scRNA-seq fortfahren) zur Zellsuspension hinzu, um die enzymatische Reaktion abzuschrecken. Vorsichtig mischen und bei 4 °C, 600 x g für 5 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie den Überstand und lagern Sie den Überstand separat, um ihn als Kontrolle zu kultivieren, um zu beobachten, ob alle Zellen in Schritt 1.8 im Pellet eingefangen werden. Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml M199-Medium (oder D-PBS, wenn Sie mit scRNA-seq fortfahren).
- Beurteilen Sie die Zelllebensfähigkeit, indem Sie 10 μL Trypanblau mit 10 μL Zellmaterial mischen. Beobachten Sie die Zellmorphologie und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
HINWEIS: An dieser Stelle können Zellen zur Protein- oder RNA-Quantifizierung verwendet oder in vitro unter Verwendung von EC-Kulturmedien gemäß Standardprotokollen39 kultiviert werden. Alternativ können sie für die Sequenzierung vorbereitet werden, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. - Für die Kultur beschichten Sie zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte, indem Sie 500 μL Befestigungsreagenz für 30 min bei Raumtemperatur in Vertiefungen pipettieren. Nach dem Entfernen des Attachment-Reagenzes und dem Waschen mit sterilem D-PBS den vollständigen Zellbestand in eine Vertiefung geben und den Überstand als Kontrolle in der zweiten Vertiefung behalten.
2. Vorbereitung für scRNA-seq-Studien (geschätzte Zeit: 3-4 h)
- Zellmaterial aus Schritt 1.11 bei 4 °C, 600 x g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet vorsichtig mit einer P1000-Pipette und einer breiten Bohrungsspitze in 1 ml 0,04% Rinderserumalbumin (BSA) in D-PBS. Gut mischen, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
- Führen Sie die Lösung durch ein 40-μm-Sieb, um Zellablagerungen zu entfernen. Wenn Trümmer verbleiben, gehen Sie durch ein zweites Sieb in 4 ml von 0,04% BSA in D-PBS.
- Zentrifuge bei 4 °C, 600 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 500 μL von 0,04% BSA in D-PBS mit einer P1000-Pipette mit einer Breitrohr-Pipettenspitze. Gut mischen, um eine Einzelzellsuspension zu gewährleisten.
- Beurteilen Sie die Zelllebensfähigkeit, indem Sie 10 μL Zellmaterial mit 10 μL Trypanblau mischen. Beobachten Sie mit einem Hämozytometer die Morphologie, bestimmen Sie, ob es eine Einzelzellsuspension ohne Cluster gibt, überprüfen Sie auf Gewebeablagerungen und berechnen Sie die Anzahl der lebenden und toten Zellen.
- Wenn Zellen gruppiert sind oder Trümmer zurückbleiben, wiederholen Sie das Waschen mit 0,04% BSA in D-PBS oder durchlaufen Sie erneut ein 40-μm-Sieb.
HINWEIS: Während dies die Ausbeute reduziert, ist es wichtig, dass Zellen in einer sauberen Einzelzellsuspension für eine optimale Sequenzierung existieren. - Die Einzelzellsuspension kann für scRNA-seq verwendet werden.
3. Räumliches Transkriptom-Profiling (geschätzte Zeit: 3-4 h)
- Isopentan (2-Methylbutan) in einen Metallkanister geben und in flüssigem Stickstoff (LN 2) oder Trockeneis abkühlen (LN2 wird bevorzugt, da es die Temperatur niedriger als Trockeneis bringt). Gießen Sie eine optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) in Vertiefungen von markierten Kunststoffkryoformen, wobei Sie darauf achten, keine Blasen zu erzeugen und die auftretenden Blasen zu entfernen. Lassen Sie Kryoplast auf Trockeneis, um zu kühlen.
- Schneiden Sie mindestens zwei koronale Abschnitte, 1 cm lang des Gefäßes. Tauchen Sie das Gewebe mit einer langen (12") Pinzette in Isopentan ein, bis es gefroren ist. Tauchen Sie das Gewebe bei der Ausrichtung schnell in OCT ein, wobei das Lumen in der Mitte sichtbar ist. Achten Sie darauf, alle Blasen zu entfernen, insbesondere die neben dem Gewebe.
- Greifen Sie mit einer langen (12") Pinzette die Kryoformen und halten Sie sie in den Metallkanister. Während sich die Basis der Formen in der Flüssigkeit befinden sollte, sollte sie nicht zu tief sein, damit Isopentan über das Gewebe laufen kann. Beobachten Sie das Einfrieren, das OCT wird in 1-2 min progressiv von außen weiß.
- Lagern Sie diese Abschnitte bis zu 6 Monate in einem versiegelten Behälter bei -80 °C.
HINWEIS: Bewahren Sie die Proben jederzeit auf Trockeneis auf und lassen Sie nicht mehr als einen Frost-Tau-Zyklus zu. Dieses Gewebe kann für histologische Analysen, RNA / DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder räumliche Transkriptomik verwendet werden, die jetzt beschrieben werden. - Stellen Sie die Kryostatentemperatur auf -20 °C für die Kammer und -10 °C für den Probenkopf ein. Ausgeglichene OCT-eingebettete Gefäßabschnitte, Messer, Bürsten und Objektträger bis -20 °C im Kryostaten für ca. 30 min. Reinigen Sie beim Ausgleich die Maschine und alle Geräte, die die Abschnitte berühren können, einschließlich der Klinge, mit 70% Ethanol, gefolgt von RNase-Dekontaminationslösung.
- Befestigen Sie die Probe, indem Sie eine kleine Menge OCT auf den kreisförmigen Kryostatblock geben und die Probe darauf legen, bevor sie gefriert. Platzieren Sie den Block in der Mitte des Probenkopfes und schrauben Sie den Block mit einem hohen schwarzen Griff auf der linken Seite fest. Schneiden Sie alle überschüssigen OCT, die das Schiff umgeben, weg.
- Stellen Sie die Schnittdicke auf 10 μm am Kryostaten ein, schneiden Sie ca. 60 Abschnitte und legen Sie sie in ein vorgekühltes 1,5-ml-Rohr. Diese Abschnitte werden verwendet, um die RNA-Qualität zu beurteilen. Nach der Entfernung aus Kryostat sofort 1 ml RNA-Extraktionsreagenz und Wirbel hinzufügen, bis die Abschnitte vollständig gelöst sind.
- Fügen Sie 200 μL Chloroform hinzu und mischen Sie, bis die Lösung einem Erdbeermilchshake ähnelt. Zentrifuge bei 11.200 x g für 10 min bei 4 °C.
- Sammeln Sie die wässrige Phase (klare Phase auf weißen und rosa Schichten) und fügen Sie 500 μL Isopropanol hinzu. Mischen Sie, indem Sie die Rohre über 10 Mal umkehren und bei -80 ° C für mindestens 20 min platzieren.
- Zentrifuge bei 11.200 x g für 10 min bei 4 °C. Das gereinigte RNA-Pellet wird in 5 μL RNase-freiem Wasser gelöst. Untersuchen Sie die RNA-Integritätszahl (RIN).
HINWEIS: Proben mit RIN ≥ 7 werden bevorzugt, aber RIN ≥ 6 ist akzeptabel. Die Anzahl der Gewebeabschnitte und das Volumen der Lösung für die RNA-Auflösung erfordern möglicherweise eine Optimierung, abhängig von dem System, das verwendet wird, um sicherzustellen, dass die endgültige RNA-Konzentration innerhalb des RIN-Funktionsbereichs liegt, um eine genaue RIN-Bewertung zu ermöglichen. - Üben Sie das Schneiden und Platzieren von Abschnitten innerhalb der Passformrahmen mit einfachen Glasobjektträgern, bevor Sie mit kommerziell erhältlichen Gewebeoptimierungs- oder Genexpressionsobjektträgern fortfahren. Dies kann erreicht werden, indem 6,5 mm x 6,5 mm große Quadrate auf einem einfachen Glasobjektträger gezeichnet, im Kryostaten auf -20 °C abgekühlt und Abschnitte in diesem Erfassungsbereich platziert werden.
- Schneiden Sie 10-μm-Abschnitte mit Anti-Roll-Platte an Ort und Stelle, drehen Sie sie um und flachen Sie vorsichtig ab, indem Sie den Abschnitt vorsichtig durch das umgebende OCT berühren.
- Mit RNase-freien Kryostat-Bürsten platzieren Sie den Gewebeabschnitt innerhalb des Quadrats, wobei nur die umgebende OCT verwendet wird. Legen Sie sofort einen Finger (in Handschuhen) auf die Rückseite des Aufnahmebereichs, um den Abschnitt zum Objektträger zu schmelzen.
- Sobald der Abschnitt verklebt ist, legen Sie den Schieber auf den Kryobar, damit der Abschnitt einfrieren kann. Es ist darauf zu achten, dass Gewebefaltungen und Gewebe über den abgegrenzten Kanten des Treuhandrahmens vermieden werden. Falls erforderlich, schneiden Sie das Gewebe mit einer Klinge in Hälften oder Viertel entlang des Lumens, um sicherzustellen, dass der Gefäßabschnitt in den 6,5 mm x 6,5 mm großen Rahmen passt.
- Schneiden Sie 10 μm-Gewebeabschnitte gemäß 3.12-3.14 auf Gewebeoptimierungs- oder Genexpressionsobjektträger. Übertragen Sie die Folie auf einen Slide-Mailer, der auf Trockeneis platziert ist. Lagern Sie die Folien bis zu 4 Wochen lang bei -80 °C, bevor Sie mit den veröffentlichten räumlichen Protokollen33,34 fortfahren.
4. Sequenzierung der Datenanalyse (geschätzte Zeit: bis zu 1 Woche, abhängig von der Vertrautheit mit der Software)
HINWEIS: Fahren Sie nur für die räumliche transkriptomische Analyse mit Schritt 4.8 fort. scRNA-seq-Daten werden unter Verwendung der standardisierten Pipeline verarbeitet, die auf das menschliche hg38-Referenztranskriptom ausgerichtet ist. Das R-Paket Seurat (v3.2.2) wird verwendet, um scRNA-seq-Daten gemäß den veröffentlichten Richtlinien40 zu analysieren.
- Filtern Sie unter Verwendung etablierter Qualitätskontrollmetriken: Seltene Zellen mit einer sehr hohen Anzahl von Genen (potenziell Multiplikatoren) und Zellen mit hohen mitochondrialen Anteilen (minderwertige oder sterbende Zellen weisen häufig eine mitochondriale Kontamination auf) werden entfernt.
- Normalisieren Sie Daten mit "sctransform", einer Methode zur Verbesserung der Stichprobenintegration im Vergleich zur Log-Normalisierung. Diese normalisierten Daten werden für die Dimensionalitätsreduktion und das Clustering verwendet, während logarithm-normalisierte Expressionsniveaus für die Analyse auf der Grundlage von Genexpressionsniveaus verwendet werden, z. B. Zelltypklassifizierung41.
- Wählen Sie Markergene pro Zelltyp aus, z. B. Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (PECAM1) und von-Willebrand-Faktor (VWF) für ECs, Lumican (LUM) und Prokollagen C-Endopeptidase Enhancer (PCOLCE) für Fibroblasten, B-Zell-Translokationsgen 1 (BTG1) und CD52 für Makrophagen, C1QA und C1QB für Monozyten und Myosin Heavy Chain 11 (MYH11) und Transgelin (TAGLN) für glatte Gefäßmuskelzellen36.
- Berechnen Sie das durchschnittliche Expressionsniveau einzelner Zellen zwischen jedem Markerpaar, um einen einzelnen Marker mit einem durchschnittlichen Expressionsniveau zu erhalten, das jedem Zelltyp42 zugeordnet ist.
- Wenden Sie ein Gaußsches Mischungsmodell (GMM) mit zwei Komponenten auf die Expressionsdaten jedes Markers über einzelne Zellen hinweg an, um die Zellen in zwei Sätze zu trennen, nämlich den Marker stark exprimieren und den Marker niedrig exprimieren. Auf diese Weise wird für jeden Marker jede einzelne Zelle einer der beiden Komponenten42 zugeordnet.
- Verwenden Sie die statistische Anreicherung für den Satz von Markergenen, einen exakten Fisher-Test, um jedem Cluster einen Zelltyp zuzuweisen. Auf diese Weise erhält man pro Cluster eine Menge von p-Werten, die jeweils einem Zelltyp entsprechen. Der Zelltyp mit dem niedrigsten p-Wert wird diesem Cluster zugewiesen.
- Verarbeiten Sie die räumlichen transkriptomischen Daten mithilfe der Space Ranger-Pipelines, was zu einem räumlichen De-Barcoding und der Generierung von Qualitätskontrollmetriken (QC) führt, einschließlich der gesamten abgestimmten Lesevorgänge auf das menschliche Transkriptom hg38, die mittlere Anzahl der Unique Molecular Identifier (UMI) oder Gene pro Punkt35.
HINWEIS: Das R-Paket Seurat (v3.2.2) wird verwendet, um die von Space Ranger verarbeiteten Daten gemäß den veröffentlichten Richtlinien40 zu analysieren. - Normalisieren Sie Daten mit "sctransform", einer Methode, die nachweislich die nachgelagerte Analyse im Vergleich zur Log-Normalisierung angesichts der Heterogenität des Gewebes und der sehr hohen Varianz der Zählungen über die Flecken hinweg verbessert.
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Representative Results
Die Analyse von ECs aus der Arteria mesenterica unter Verwendung einer Kombination aus mechanischer und enzymatischer Dissoziation oder Kryokonservierung zur Verwendung in verschiedenen nachgeschalteten Assays ist hier dargestellt (Abbildung 1). ECs können in Mesenterialarterien mit den folgenden Schritten profiliert werden: A) mechanische Dissoziation von der Intima in Verbindung mit Kollagenase-Verdauung zu Kulturzellen; B) Erzeugung von Einzelzellsuspension für scRNA-seq; oder C) Querschnitte der Arterie können in OCT eingebettet werden, um kryosektiert zu werden, um das räumliche Transkriptom zu profilieren (Abbildung 1 und Abbildung 2).
Abbildung 1: Arterielle Gewebeverarbeitung und räumliches Profiling . (A) Eine gereinigte Mesenterialarterie. (B) Gefäß aufgeschnitten, um Intima freizulegen. (C) Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung des Querschnitts der Mesenterialarterie im treuhänderischen Rahmen. Das Bild wurde mit einem 5-fachen Objektiv unter einem inversen Weitfeldfluoreszenzmikroskop aufgenommen. (D) Repräsentative Space Ranger-Ausgabedatei der gesamten Genexpression. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Überblick über die EG-Isolierungs- und Profilierungstechniken. Flussdiagramm, das verschiedene Methoden zur Verarbeitung der Arteria mesenterica zeigt. Verarbeitungstechniken führen zu Zellsuspensionen, die für Einzelzell-RNA-Seq (sc), Endothelzellkultur (EC) oder ganzes Gewebe geeignet sind, die in eine optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) für die räumliche Transkriptomprofilierung eingebettet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Isolierte ECs, die mit dem beschriebenen Protokoll kultiviert wurden, zeigen eine ausgeprägte kopfsteinpflasterartige Morphologie mit minimalen kontaminierenden Zellen (Abbildung 3A). Die Expression des EC-Markers vaskuläres Endothel (VE)-Cadherin wurde mittels Immunfluoreszenz, die Zell-Zell-Verbindungen sichtbar macht, bestätigt (Abbildung 3B). Isolierte ECs wurden einer Durchflusszytometrie-Analyse für CD31 unterzogen. Als Negativkontrollen erzeugten unbefleckte HUVECs (ohne Antikörper) ein 1,1%-Signal und mit IgG inkubierte HUVECs ein 0,8%-Signal. Als Positivkontrolle zeigten HUVECs, die mit CD31-Antikörpern angefärbt waren, eine Reinheit von 99% und wurden verwendet, um die Kanäle für humane mesenteriale arterielle Endothelzellen (HMAECs) zu verstopfen. Etwa 80% der Zellen waren CD31-positiv, was darauf hindeutet, dass HMAECs den Großteil der frisch isolierten Zellpopulation ausmachten (Abbildung 3C). Erfolglose Isolierungen, entweder durch zu hartes / tiefes Abkratzen, Aussäen der Zellen mit zu geringer Dichte oder Aufrechterhalten der Kultur über Passage 3 hinaus, führen zu Zellen mit gestörter Morphologie, die möglicherweise mesenchymale Marker (αSMA) exprimieren oder sich verlängern, die einem fibroblastischen Zustand ähneln (Abbildung 3D).
Abbildung 3: Validierung isolierter kultivierter mesenterialer arterieller ECs. (A) Hellfeldbild isolierter ECs, 10-fache Linse, Skalenbalken = 50 μm. (B) Immunfluoreszenz der VE-Cadherin-Expression mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) als Kernmarker. Das Bild wurde mit einem 10-fachen Objektiv unter einem invertierten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Das repräsentative Bild zeigt die VE-Cadherin-Lokalisierung. Maßstabsleiste = 50 μm. (C) FACS-Diagramme von unbeflecktem HUVEC (oben links), HUVEC-gefärbt mit IgG-Kontrolle (oben rechts), HUVEC mit CD31 (unten links) und den isolierten humanen mesenterialen arteriellen Endothelzellen (HMAEC), die mit CD31 gefärbt sind (unten rechts) (D) Immunfluoreszenzbilder von HMAECs mit DAPI (Kernmarker), alpha-glattem Muskelaktin (αSMA) und CD31. 40x Linse, Maßstabsleiste = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
ECs, die mit Zelldissoziationsenzymen isoliert wurden, wurden scRNA-seq unterzogen. Abbildung 4A zeigt eine repräsentative einheitliche mannigfaltige Approximation und Projektion (UMAP), isoliert aus der Arteria mesenterica unter Verwendung des vorliegenden Protokolls für scRNA-seq auf isolierten HMAECs, wobei 34% der Zellen als ECs mit PECAM1 und VWF (Abbildung 4B,C) als Marker geclustert sind.
Abbildung 4: scRNA-seq der mesenterialen arteriellen ECs. (A) UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection) von scRNA-seq-Daten aus der Arteria mesenterialis. Eine 2-dimensionale Projektion der Mannigfaltigkeit in einem hochdimensionalen Raum, wobei jeder Punkt eine einzelne Zelle darstellt und die Nähe zu anderen Punkten anzeigt, wie ähnlich das Transkriptom zueinander ist. Zellen werden nach ihren Zelltypen farbcodiert. (B) PECAM1-Ausdruck, der auf UMAP projiziert wird. (C) Auf UMAP projizierter VWF-Ausdruck. Farbbalken stellen die Expression von Genebenen dar, bei denen die RNA-Spiegel durch log-normalisierte eindeutige molekulare Identifikatorzahlen dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Für den räumlichen transkriptomischen Workflow wurde extrahierte RNA aus Gewebeschnitten auf einem Gel elektrophorisiert, um die RNA-Qualität zu visualisieren. Ein schwaches Signal oder Fehlen von ribosomalen 18S- und 28S-RNA-Banden und das Vorhandensein von Abbauprodukten, die in Abbildung 5A, Spur A1, beobachtet wurden, sind ein Beispiel für RNA von schlechter Qualität und sollten nicht weiter verarbeitet werden. Proben mit einer Konzentration außerhalb des Bereichs könnten zu einem niedrigeren RIN führen (Abbildung 5A, Spur B1). Die Verdünnung der RNA um das Zweifache erhöhte jedoch die RIN, die für das weitere Vorgehen ausreichte (Abbildung 5A, Spur C1). Vor der Bestimmung der Genexpression wurde eine Gewebeoptimierung durchgeführt, um die optimale Permeabilisierungszeit für die Freisetzung von RNA zu bestimmen, die von den Oligonukleotiden auf dem Genexpressionsobjektträger eingefangen wird (Abbildung 5B). Basierend auf der Fluoreszenzbildgebung des komplementären DNA-Fußabdrucks (cDNA) erzeugte die 18-minütige Permeabilisierung den niedrigsten Hintergrund, aber das stärkste Signal und wurde daher als optimale Dauer ausgewählt. Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) visualisierte die Morphologie des Gefäßes und ermöglichte die Identifizierung interessanter Regionen (Abbildung 5C). Die Bibliotheksqualität wurde bewertet (Abbildung 5D) und als für die Sequenzierung geeignet befunden. UMI-Zählungen pro Spot, Anzahl der Lesevorgänge pro Spot und Gesamtgene sind Qualitätsmetriken, die von der Space Ranger-Pipeline erzeugt werden, wobei die Variabilität jedes einzelnen in Abbildung 5E dargestellt ist. Schließlich wurde die Genexpression (am Beispiel von Actin alpha-2 (ACTA2 ) Abbildung 5F) mit räumlicher Verankerung auf dem H&E-gefärbten Gefäß visualisiert.
Abbildung 5: Räumlicher transkriptomischer Workflow und repräsentative Ergebnisse (A) Qualitätsbewertung von RNA, die aus zwei Proben der Arteria mesenterica extrahiert wurde, A1 aus einer Probe, B1 aus der zweiten Probe, C1 2x verdünnt von B1. Rote Pfeile zeigen ribosomale 28S- und 18S-Bänder an. (B) Räumlicher Gewebeoptimierungs-Workflow (TO). (C) Objektträger zur Genexpression (GEX), die die Gewebeabschnitte zeigen (linkes Bild); H&E-Bilder der auf den EX-Objektträger geladenen Gewebeschnitte vor der Permeabilisierung für 18 min, Rücktranskription und Bibliotheksaufbau (rechtes Feld), Maßstabsleiste = 1 cm. (D) Qualitätsbewertung der vorbereiteten Bibliotheken. (E) Die Ausgabemetriken von Space Ranger zeigen Bereiche zwischen durchschnittlichen Lesewerten, UMIs und Genen pro Punkt für verschiedene Bibliotheken. Fehlerbalken bezeichnen min und max. (F) ACTA2-Ausdruck im gesamten Gefäßabschnitt. Alle Mikroskopiebilder wurden mit einem inversen Weitfeldmikroskop von einem 5-fach Linsen-Kachelscan-Modul aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Der vorgestellte Workflow beschreibt eine Reihe von Techniken zum Profilieren von ECs aus einem einzelnen Stück menschlicher Arterie mit Einzelzell- und räumlicher Auflösung. Es gibt mehrere kritische Schritte und einschränkende Faktoren im Protokoll. Ein Schlüssel zur Transkriptomprofilierung ist die Frische des Gewebes und die RNA-Integrität. Es ist wichtig, das Gewebe vor der Verarbeitung so weit wie möglich auf Eis zu halten, um den RNA-Abbau zu minimieren. Typischerweise werden die postmortalen Gewebe zwischen 8-14 h nach dem Zeitpunkt des Todes verarbeitet. Es wird jedoch empfohlen, die Isolierung oder Kryokonservierung so früh wie möglich nach der Extraktion von den Spendern zu beginnen. Speziell für die räumliche Transkriptomkartierung sollte das Gewebe auf Trockeneis gehalten werden und nicht mehr als ein Frost-Tau-Zyklus erlaubt sein. Mehr als ein Gefäßquerschnitt sollte in die OAT eingebettet sein, um bei Bedarf Wiederholungen zu ermöglichen. Es sollten auch Anstrengungen unternommen werden, um eine RNase-freie Umgebung während der Gewebeverarbeitung und Zellisolierung zu fördern. Zweitens kann die Größe der Gefäße ein limitierender Faktor sein. Für die räumliche Transkriptomik kann das Protokoll auf insgesamt 1 mm des Gefäßes durchgeführt werden, unabhängig vom Durchmesser. Für das Dissoziationsprotokoll für Zellkultur und scRNA-seq wäre die untere Grenze, wenn das Gefäß zu eng ist (d.h. unter 1 mm Durchmesser), um das Einsetzen einer Dissektionsschere zu ermöglichen. Basierend auf diesen Prinzipien kann das Dissoziationsprotokoll für jede mittelgroße oder größere Arterie oder Vene angepasst werden, solange die Größe der Gefäße die Öffnung zulässt, und das räumliche Transkriptomverfahren kann auf alle Gefäße angewendet werden, die ganz oder teilweise in den Treuerahmen passen.
Um Gewebe für die Einzelzell-Transkriptomanalyse zu verarbeiten, haben mehrere Gruppen die Verwendung von Liberase und Elastase beschrieben, um alle Zellpopulationen innerhalb der Gefäßwandzu erhalten 9,43,44. Die resultierenden Datensätze enthalten jedoch im Durchschnitt nur 3-7% der gesamten Zellpopulation, die als ECs 9,45 kommentiert werden. Eine Möglichkeit, die begrenzte EC-Repräsentation in den scRNA-seq-Daten zu verbessern, besteht darin, die EC-Fraktion durch Nutzung der EC-Oberflächenmarker über FACS44,46 anzureichern. Dies erfordert jedoch in der Regel große Mengen an Startgewebe und teure Geräte, die möglicherweise nicht für alle Labore routinemäßig verfügbar sind. Dieses Protokoll nutzt die einzigartige anatomische Position von ECs, d.h. hauptsächlich in der intimen Schicht, was eine Anreicherung von ECs ohne die Notwendigkeit einer harten Gewebeverdauung ermöglicht und die Zelllebensfähigkeit für scRNA-seq oder nachfolgende Kultur verbessert. Der Prozentsatz der ECs in der endgültigen Zellmischung für scRNA-seq kann durch Zugabe eines Schritts unter Verwendung von VE-Cadherin/CD144-Antikörper-konjugierten Magnetkügelchen erhöht werden. Dieser Schritt schließt jedoch möglicherweise nicht alle anderen Zellen aus, die aufgrund der nativen Zell-Zell-Interaktion mit ECs interagieren. Obwohl die anderen Zelltypen (z. B. Makrophagen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten) traditionell als "Kontamination" in der EC-Isolierung angesehen werden, können sie nützliche Informationen für Zell-Zell-Interaktionen im Gewebekontext liefern. In der scRNA-seq-Datenanalyse können ECs mit den EC-Markern effizient annotiert und die Zell-Zell-Interaktionen bioinformatisch mit mehreren gängigen bioinformatischen Methoden abgeleitet werden (z.B. CellChat47, CellphoneDB 48, CytoTalk49 u.a.). Darüber hinaus kann die Einbeziehung dieser Daten eine effektivere Integration und Dekonvolution der räumlichen Transkriptom-Profiling-Daten ermöglichen, die nicht bei Einzelzellauflösung vorliegen (siehe unten)34.
Für das räumliche Transkriptom gibt es derzeit keinen Goldstandard für die Vorbereitung von Gewebe für diese Technik und begrenzte Forschung bei der Vorbereitung von Gefäßen, wobei der größte Teil der veröffentlichten Forschung tierisches Gewebe verwendet50,51. Die Technik erfordert handelsübliche Objektträger mit speziellen Fudicialrahmen mit einem Aufnahmebereich, der etwa 5.000 barcodierte Spots mit einem Durchmesser von 55 μm enthält. Die Spots werden 100 μm voneinander entfernt von der Mitte des Spots zu benachbarten Spots platziert, wobei etwa 45 μm Lücken zwischen den Punkten bleiben, die nicht profiliert werden, wodurch die Auflösung begrenzt wird. Darüber hinaus enthält ein einzelner Punkt mehrere Zellen, da die Mehrheit der Zellen unter 55 μm groß ist. Wie bereits erwähnt, handelt es sich also nicht um eine Einzelzellsequenzierungstechnik. Durch die Integration der Daten mit scRNA-seq kann jedoch die Auflösung verbessert und die Heterogenität innerhalb eines Spots aufgedecktwerden 34. Obwohl sich das vorliegende Protokoll auf einen räumlichen transkriptomischen Profiling-Assay konzentriert, könnte diese Technik für andere aufkommende räumliche Profiling-Methoden52,53 angepasst werden, da die Protein- und RNA-Qualität bei diesem Verfahren erhalten bleibt.
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Disclosures
S.Z. ist Gründer und Vorstandsmitglied von Genemo, Inc.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (an Z.B.C.) unterstützt; DP1DK126138 und DP1HD087990 (bis S.Z.); ein Stipendium der Ella Fitzgerald Foundation und ein Wanek Family Project (an Z.B.C.); und ein Human Cell Atlas Seed Network Grant (an Z.B.C. und S.Z.). Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung umfasste Arbeiten, die im Integrative Genomics Core in City of Hope durchgeführt wurden, unterstützt vom National Cancer Institute der National Institutes of Health unter der Preisnummer P30CA033572. Die Autoren danken Dr. Ismail Al-Abdullah und Dr. Meirigeng Qi vom Inseltransplantationsteam der Stadt der Hoffnung für die Isolierung menschlicher Gewebe, Dr. Dongqiang Yuan von der Stadt der Hoffnung für seine Unterstützung bei der scRNA-seq-Analyse und Dr. Marc Halushka von der Abteilung für kardiovaskuläre Pathologie der Johns Hopkins University School of Medicine für seine unschätzbaren Einblicke in die Gefäßhistologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
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