Summary
Protokollet beskriver isolering, odling och profilering av endotelceller från mänsklig mesenterisk artär. Dessutom tillhandahålls en metod för att förbereda mänsklig artär för rumslig transkriptomik. Proteomik, transkriptomik och funktionella analyser kan utföras på isolerade celler. Detta protokoll kan återanvändas för alla medelstora eller stora artärer.
Abstract
Endotelceller (EK) är avgörande för vaskulär och helkroppsfunktion genom sitt dynamiska svar på miljösignaler. Att belysa ecs transkriptom och epigenom är av största vikt för att förstå deras roller i utveckling, hälsa och sjukdom, men är begränsad i tillgången på isolerade primära celler. Ny teknik har möjliggjort profilering med hög genomströmning av EG-transkriptom och epigenom, vilket har lett till identifiering av tidigare okända EG-cellsubpopulationer och utvecklingsbanor. Medan EG-kulturer är ett användbart verktyg för att utforska EG-funktion och dysfunktion, kan odlingsförhållandena och flera passager introducera externa variabler som förändrar egenskaperna hos infödd EC, inklusive morfologi, epigenetiskt tillstånd och genuttrycksprogram. För att övervinna denna begränsning visar föreliggande papper en metod för att isolera mänskliga primära EG från donatorns mesenteriska artärer som syftar till att fånga sitt hemland. ECs i intimalskiktet dissocieras mekaniskt och biokemiskt med användning av särskilda enzymer. De resulterande cellerna kan användas direkt för bulk-RNA eller encellig RNA-sekvensering eller pläteras för odling. Dessutom beskrivs ett arbetsflöde för framställning av mänsklig arteriell vävnad för rumslig transkriptomik, speciellt för en kommersiellt tillgänglig plattform, även om denna metod också är lämplig för andra rumsliga transkriptomprofileringstekniker. Denna metod kan tillämpas på olika kärl som samlats in från en mängd olika givare i hälso- eller sjukdomstillstånd för att få insikt i EG-transkriptionell och epigenetisk reglering, en central aspekt av endotelcellbiologi.
Introduction
Foder blodkärlens lumen, endotelceller (ECs) är avgörande regulatorer för vaskulär ton och vävnadsperfusion. ECs är anmärkningsvärda i sin förmåga att reagera på den extracellulära miljön och anpassa sig till förändringar i dynamiken och sammansättningen av blodflödet. Dessa dynamiska svar förmedlas genom ett nätverk av intracellulära signalhändelser, inklusive transkriptionella och posttranskriptionella moduleringar med spatio-temporal upplösning. Dysreguleringen av dessa svar är inblandad i många patologier, inklusive men inte begränsat till hjärt-kärlsjukdomar, diabetes och cancer 1,2.
En stor del av studierna använder cellinjer eller djurmodeller för att förhöra EC-transkriptom. Den förstnämnda är ett användbart verktyg, med tanke på den relativa användarvänligheten och billigheten. Seriell odling kan emellertid införa fenotypiska förändringar i EG, såsom fibroblastiska egenskaper och brist på polarisering, vilket kopplar bort dem från deras in vivo-tillstånd 3. De primära cellerna, t.ex. human navelven EC (HUVEC) har varit ett populärt val sedan 1980-talet men härrör från en utvecklingsvaskulär säng som inte finns hos vuxna, vilket sannolikt inte helt representerar mogna EC. Djur, särskilt musmodeller, representerar bättre den fysiologiska eller patofysiologiska miljön hos EG och tillåter förhör av transkriptom som ett resultat av genetisk störning. Murina EG kan isoleras från olika vävnader, inklusive aorta, lungor och fettvävnader med hjälp av enzymbaserade förfaranden 4,5,6,7. De isolerade cellerna kan emellertid inte användas för flera passager om de inte transformeras6 och är ofta begränsade i antal, vilket kräver sammanslagning från flera djur 5,8,9.
Tillkomsten av ny teknik som utforskar fartygsarkitekturen på transkriptomisk nivå, särskilt med encellsupplösning, har möjliggjort en ny era av endotelbiologi genom att avslöja nya funktioner och egenskaper hos EG 5,10,11,12,13,14. En rik resurs byggd av Tabula Muris-utredare samlade encellstranskriptomiska profiler av 100 000 celler inklusive EC över 20 olika murina organ15, vilket avslöjade både vanliga EC-markörgener och unika transkriptomiska signaturer med inter- och intravävnadsskillnader 5,13. Ändå finns det tydliga skillnader mellan mus och människa i genom, epigenom och transkriptom, särskilt i de icke-kodande regionerna 16,17,18. Dessa ovannämnda nackdelar betonar vikten av analys av EG med hjälp av mänskliga prover för att få en trogen profil av EG i sitt hemland i hälsa och sjukdom.
De flesta EC-isoleringsmetoder är beroende av fysisk dissociation genom homogenisering, finskärning och malet vävnad före inkubation med proteolytiska enzymer under olika tider. Enzymerna och tillstånden varierar också avsevärt mellan vävnadstyper, från trypsin till kollagenas, som används ensamt eller i kombination 19,20,21. Ytterligare antikroppsbaserad anrikning eller rening ingår ofta för att öka renheten hos EK. Typiskt är antikroppar mot EC-membranmarkörer, t.ex. CD144 och CD31 konjugerade till magnetiska pärlor och läggs till cellsuspensionen22,23. En sådan strategi kan i allmänhet anpassas för EG-isolering från flera mänskliga vävnader och musvävnader, inklusive de tekniker som införs i detta protokoll.
I sitt ursprungliga tillstånd interagerar ECs med flera celltyper och kan existera i vaskulära nischer där cellnärhet är avgörande för funktion. Medan encells- och enkärniga RNA-sekvenseringsstudier (scRNA och snRNA-seq) har varit avgörande för de senaste genombrotten för att beskriva EG-heterogenitet, stör dissociationsprocessen vävnadskontext och cell-cellkontakt, vilket också är viktigt för att förstå EG-biologi. Utvecklad 2012 och utsedd till Årets metod 202024, har rumslig transkriptomprofilering använts för att profilera globalt genuttryck samtidigt som de rumsliga egenskaperna i olika vävnader bibehålls, inklusive hjärna25, tumör26 och fettvävnad27. Teknikerna kan riktas med hjälp av specialiserade sonder som är specifika för specifika RNA-sekvenser fästa vid affinitetsreagens eller fluorescerande taggar, vilket detekterar utvalda gener vid subcellulär upplösning 28,29,30,31. De kan också vara oriktade32,33, vanligtvis med hjälp av rumsligt streckkodade oligonukleotider för att fånga RNA, som tillsammans omvandlas till cDNA för efterföljande seq-biblioteksberedning och därmed har fördelen att härleda hela vävnadsgenuttryck på ett opartiskt sätt. Rumslig upplösning uppnås dock för närvarande inte på en enda cellulär nivå med kommersiellt tillgänglig teknik. Detta kan övervinnas till viss del med dataintegration med scRNA-seq-data, vilket i slutändan möjliggör kartläggning av encellstranskriptom i ett komplext vävnadssammanhang samtidigt som den behåller sin ursprungliga rumsliga information34.
Här beskrivs ett arbetsflöde för att profilera EC-transkriptom med hjälp av mänsklig överlägsen mesenterisk artär, en perifer artär som har använts för att studera vasodilatation, vaskulär ombyggnad, oxidativ stress och inflammation 35,36,37. Två tekniker beskrivs: 1) att isolera och berika EK från intima blodkärl som kombinerar mekanisk dissociation och enzymatisk matsmältning som är lämplig för encellstranskriptomsekvensering eller efterföljande in vitro-odling; 2) att förbereda arteriella sektioner för rumslig transkriptomprofilering (Figur 1). Dessa två tekniker kan utföras oberoende eller komplementärt för att profilera ECs och deras omgivande celler. Dessutom kan detta arbetsflöde anpassas för användning på alla medelstora eller stora artärer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mänskliga vävnadsstudier utfördes på avidentifierade prover erhållna från Southern California Islet Cell Resource Center vid City of Hope. Forskningsmedgivandena för användning av postmortem mänskliga vävnader erhölls från givarnas anhöriga, och etiskt godkännande för denna studie beviljades av Institutional Review Board of City of Hope (IRB nr 01046).
1. Fysisk dissociation (beräknad tid: 1-2 timmar)
- Placera en ny artär på en 10 cm disk och tvätta med steril Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS).
- Ta bort fettet och yttre bindväv med sterila pincett och dissektionssax tills kärlet är rent. Mät fartygets längd med en linjal placerad utanför skålen och ta bilder för poster (Figur 1A).
- Förvärm lämplig matsmältningsbuffert till 37 °C: för scRNA-seq använd celldissociationsenzym. För cellodlingsanalyser använd 1-6 mg/ml kollagenas D, 3 mg/ml bakteriehärledd proteas, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM glukos, med 1 mM CaCl2 6,38 (pH 7,0, kräver ingen justering) tillsatt 5 min före användning.
- Ta den mesenteriska artären (vanligtvis med en diameter på 6-8 mm) och skär i längdriktningen med sax för att öppna kärlets lumen vertikalt.
- Fäst kärlet på svart vax i alla fyra hörnen med nålar och lämna intima exponerad (figur 1B).
- Tillsätt 1 ml förvärmd matsmältningsbuffert till intima. Ta en steril skalpell och skrapa kärlets lumen försiktigt två gånger.
OBS: Syftet med denna procedur är att dissociera det intima skiktet, vilket kan behöva övas. Tillräckligt med kraft måste utövas för att avlägsna endotel, men inte så mycket att de djupare skikten av vävnad också avlägsnas, vilket kommer att minska EG-representationen. - Överför matsmältningsbufferten till ett 5 ml rör. Tillsätt 1 ml matsmältningsbuffert till intima och pipetten upp och ner försiktigt för att samla de återstående cellerna och lägg till 5 ml röret. Inkubera celler vid 37 °C, rotera vid 150 rpm i 5 min.
- Tillsätt 2 ml M199-medium (eller D-PBS om du fortsätter med scRNA-seq) till cellsuspensionen för att släcka den enzymatiska reaktionen. Blanda försiktigt och centrifug vid 4 °C, 600 x g i 5 min.
- Ta bort supernatanten och förvara supernatanten separat för odling som en kontroll för att observera om alla celler fångas i pelleten i steg 1.8. Resuspend cellpelleten i 1 ml M199 medium (eller D-PBS om du fortsätter med scRNA-seq).
- Bedöm cellens livskraft genom att blanda 10 μL trypanblått med 10 μL celllager. Observera cellmorfologin och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
OBS: Vid denna tidpunkt kan celler användas för protein- eller RNA-kvantifiering eller odlas in vitro med användning av EG-odlingsmedier enligt standardprotokoll39. Alternativt kan de förberedas för sekvensering enligt beskrivningen i nästa avsnitt. - För kulturen, belägg två brunnar av en 6-brunnsplatta genom att pipettera 500 μL fästreagens i brunnar i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter avlägsnande av fästreagens och tvättning med steril D-PBS, dispensera hela cellbeståndet i en brunn, och supernatanten hålls som en kontroll i den andra brunnen.
2. Förberedelse för scRNA-seq-studier (beräknad tid: 3-4 timmar)
- Centrifugera cellbeståndet från steg 1.11 vid 4 °C, 600 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen försiktigt med en P1000-pipett och bredborrad spets i 1 ml 0,04% bovint serumalbumin (BSA) i D-PBS. Blanda väl för att säkerställa en encellig suspension.
- För lösningen genom en 40 μm sil för att avlägsna cellskrot. Om skräp kvarstår, passera genom en andra sil till 4 ml av 0,04% BSA i D-PBS.
- Centrifug vid 4 °C, 600 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen i 500 μL av 0,04% BSA i D-PBS med en P1000-pipett med en bredborrad pipettspets. Blanda väl för att säkerställa en encellig suspension.
- Bedöm cellens livskraft genom att blanda 10 μL celllager med 10 μL trypanblått. Använd en hemocytometer, observera morfologin, bestäm om det finns en encellig suspension utan kluster, kontrollera om vävnadsskräp och beräkna antalet levande och döda celler.
- Om celler är grupperade eller skräp kvarstår, upprepa tvätten med 0,04% BSA i D-PBS eller passera genom 40 μm sil igen.
OBS: Även om detta kommer att minska avkastningen är det viktigt att celler finns i en ren encellssuspension för optimal sekvensering. - Encellssuspensionen kan användas för scRNA-seq.
3. Rumslig transkriptomprofilering (beräknad tid: 3-4 timmar)
- Tillsätt isopentan (2-metylbutan) till en metallbehållare och kyla i flytande kväve (LN2) eller torris (LN2 är att föredra eftersom det kommer att sänka temperaturen än torris). Häll optimal skärtemperaturförening (OCT) i brunnar av märkta plastkryoolder och var noga med att inte skapa bubblor och ta bort de som visas. Låt kryomold på torris kyla.
- Skär minst två koronalsektioner, 1 cm långa på kärlet. Använd långa (12 ") pincett, sänk ner vävnaden i isopentan tills den är frusen. Sänk snabbt ner vävnaden i OCT vid orientering med lumen synlig i mitten. Var noga med att ta bort eventuella bubblor, särskilt de bredvid vävnaden.
- Ta tag i kryomolderna med långa (12 tum) pincett och håll dem i metallbehållaren. Medan basen av formarna ska vara i vätskan, bör den inte vara för djup för att låta isopentan rinna över vävnaden. Observera frysningen, OCT blir vit gradvis från utsidan på 1-2 minuter.
- Förvara dessa sektioner i en förseglad behållare vid -80 °C i upp till 6 månader.
OBS: Behåll prover på torris hela tiden och tillåt inte mer än en frys-tina cykel. Denna vävnad kan användas för histologisk analys, RNA / DNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) eller rumslig transkriptomik, som kommer att beskrivas nu. - Ställ in kryostattemperaturen på -20 °C för kammaren och -10 °C för provhuvudet. Jämvikt oct inbäddade kärlsektioner, knivar, borstar och glider till -20 ° C i kryostaten i cirka 30 minuter. Rengör maskinen och all utrustning som kan vidröra sektionerna, inklusive bladet, med 70% etanol följt av RNase dekontamineringslösning.
- Fäst provet genom att dosera en liten mängd OCT på det cirkulära kryostatblocket och placera provet ovanpå innan det fryser. Placera blocket i mitten av provhuvudet och skruva fast blocket på plats med ett högt svart handtag till vänster. Klipp bort eventuellt överskott av OCT som omger fartyget.
- Ställ in skärtjockleken på 10 μm på kryostaten, skär cirka 60 sektioner och placera dem i ett förkylt 1,5 ml rör. Dessa avsnitt kommer att användas för att bedöma RNA-kvaliteten. Vid avlägsnande från kryostat tillsätt omedelbart 1 ml RNA-extraktionsreagens och virvel tills sektionerna är helt upplösta.
- Tillsätt 200 μL kloroform och blanda tills lösningen liknar en jordgubbsmilkshake. Centrifug vid 11 200 x g i 10 min vid 4 °C.
- Samla vattenfasen (klar fas ovanpå vita och rosa lager) och tillsätt 500 μL isopropanol till den. Blanda genom att invertera rören över 10 gånger och placera vid -80 ° C i minst 20 minuter.
- Centrifug vid 11 200 x g i 10 min vid 4 °C. Lös upp den renade RNA-pelleten i 5 μL RNasfritt vatten. Undersök RNA-integritetsnumret (RIN).
OBS: Prover med RIN ≥ 7 är att föredra, men RIN ≥ 6 är acceptabelt. Antalet vävnadssektioner och volymen lösning för RNA-upplösning kan kräva optimering beroende på vilket system som används för att säkerställa att den slutliga RNA-koncentrationen ligger inom RIN-funktionsområdet för att möjliggöra noggrann RIN-utvärdering. - Öva på att klippa och placera sektioner ordentligt inom de fiduciella ramarna med vanliga glasglas innan du fortsätter till kommersiellt tillgängliga vävnadsoptimerings- eller genuttrycksbilder. Detta kan uppnås genom att rita 6,5 mm x 6,5 mm rutor på en vanlig glasskiva, kyla till -20 ° C i kryostaten och placera sektioner i detta fångstområde.
- Skär 10 μm sektioner med rullningstämningsplatta på plats, vänd och platta försiktigt genom att försiktigt röra sektionen genom den omgivande OCT.
- Använd RNase-fria kryostatborstar placera vävnadssektionen inom torget, med endast den omgivande OCT. Placera omedelbart ett finger (i handskar) på baksidan av fångstområdet för att smälta sektionen till bilden.
- När sektionen har fäst, placera bilden på kryobaren så att sektionen kan frysa. Försiktighet måste vidtas för att undvika vävnadsvikning och vävnad som ligger över de avgränsade kanterna på den fiduciella ramen. Skär vid behov vävnaden i halvor eller fjärdedelar längs lumen med ett blad för att säkerställa att kärlsektionen passar inom ramen på 6,5 mm x 6,5 mm.
- Skär 10 μm sektioner av vävnad enligt 3.12-3.14 på vävnadsoptimering eller genuttrycksbilder. Överför bilden till en glidpost placerad på torris. Förvara diabilder vid -80 °C i upp till 4 veckor innan du fortsätter med publicerade rumsliga protokoll33,34.
4. Sekvenseringsdataanalys (beräknad tid: upp till 1 vecka beroende på förtrogenhet med programvara)
OBS: Endast för rumslig transkriptomisk analys går du vidare till steg 4.8. scRNA-seq-data bearbetas med hjälp av den standardiserade rörledningen i linje med humant hg38-referenstranskriptom. R-paketet Seurat (v3.2.2) används för att analysera scRNA-seq-data enligt publicerade riktlinjer40.
- Filtrera med hjälp av väletablerade kvalitetskontrollmått: sällsynta celler med mycket stort antal gener (potentiellt multipletter) och celler med höga mitokondriella procentsatser (lågkvalitativa eller döende celler som ofta uppvisar mitokondriell kontaminering) avlägsnas.
- Normalisera data med "sctransform", en metod för att förbättra exempelintegreringen jämfört med log-normalisering. Dessa normaliserade data används för dimensionalitetsreduktion och klustring, medan log-normaliserade uttrycksnivåer används för analys baserat på genuttrycksnivåer, såsom celltypsklassificering41.
- Välj markörgener per celltyp, till exempel trombocytendotelcellsvidhäftningsmolekyl-1 (PECAM1) och von Willebrand-faktor (VWF) för EG, lumican (LUM) och prokollagen C-endopeptidasförstärkare (PCOLCE) för fibroblaster, B-celltranslokationsgen 1 (BTG1) och CD52 för makrofager, C1QA och C1QB för monocyter och myosin tung kedja 11 (MYH11) och transgelin (TAGLN) för vaskulära glatta muskelceller36.
- Beräkna den genomsnittliga uttrycksnivån över enskilda celler mellan varje par markörer för att ha en enda markör med en genomsnittlig uttrycksnivå associerad med varje celltyp42.
- Applicera en Gaussian Mixture Model (GMM) med två komponenter på uttrycksdata för varje markör över enskilda celler för att separera celler i två uppsättningar, nämligen att uttrycka markören högt och lågt uttrycka markören. På detta sätt tilldelas varje enskild cell för varje markör till en av de två komponenterna42.
- Använd statistisk anrikning för uppsättningen markörgener, ett Fishers exakta test, för att tilldela en celltyp till varje kluster. Genom att göra det erhålls en uppsättning p-värden per kluster, var och en motsvarande en celltyp. Celltypen med det lägsta p-värdet tilldelas klustret.
- Bearbeta rumsliga transkriptomiska data med hjälp av Space Ranger-rörledningarna vilket resulterar i rumslig avbarkodning och generering av kvalitetskontrollmått (QC), inklusive totala anpassade läsningar till hg38 humant transkriptom, medianvärdet för unik molekylär identifierare (UMI) eller gener per plats35.
R-paketet Seurat (v3.2.2) används för att analysera Space Ranger-bearbetade data enligt publicerade riktlinjer40. - Normalisera data med hjälp av "sctransform", en metod som demonstreras för att förbättra nedströmsanalysen jämfört med log-normalisering med tanke på vävnadens heterogenitet och den mycket höga variansen i antal över fläckarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen av EG från mesenterisk artär med användning av en kombination av mekanisk och enzymatisk dissociation eller kryokonservering för användning i olika nedströms analyser visas här (Figur 1). ECs kan profileras i mesenteriska artärer med hjälp av följande steg: A) mekanisk dissociation från intima i kombination med kollagenas matsmältning till odlingsceller; B) generering av encellssuspension för scRNA-seq; eller C) tvärsnitt av artären kan bäddas in i OCT för att kryosektioneras för att profilera rumsligt transkriptom (figur 1 och figur 2).
Figur 1: Arteriell vävnadsbehandling och rumslig profilering. (A) En rengjord mesenterisk artär. (B) Fartyget skärs upp för att exponera intima. (C) Hematoxylin och Eosin (H & E) färgning av mesenteriskt artärtvärsnitt i fiducialramen. Bild tagen med ett 5x-objektiv under widefield fluorescens inverterat mikroskop. (D) Representativ Space Ranger-utdatafil med totalt genuttryck. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Översikt över EG:s isolerings- och profileringstekniker. Flödesschema som visar olika metoder för bearbetning av mesenterisk artär. Bearbetningstekniker resulterar i cellsuspensioner som är lämpliga för encellig (sc) RNA-seq, endotelcellskultur (EC) eller hel vävnad är inbäddad i optimal skärtemperaturförening (OCT) för rumslig transkriptomprofilering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Isolerade EG odlade med hjälp av det beskrivna protokollet visar en distinkt kullerstensliknande morfologi med minimala förorenande celler (figur 3A). Uttryck av EC-markör vaskulär endotelial (VE)-cadherin bekräftades med användning av immunofluorescens som visualiserar cell-cellkorsningar (figur 3B). Isolerade EK utsattes för flödescytometrianalys för CD31. Som negativa kontroller producerade ofärgade HUVEC (utan antikropp) en 1.1% signal och HUVECs inkuberade med IgG gav en 0.8% signal. Som en positiv kontroll visade HUVECs färgade med CD31-antikropp 99% renhet och användes för att grinda kanalerna för humana mesenteriska arteriella endotelceller (HMAECs). Cirka 80% av cellerna var CD31-positiva vilket indikerar att HMAECs utgjorde majoriteten av den nyligen isolerade cellpopulationen (Figur 3C). Misslyckade isoleringar, genom att antingen skrapa för hårt / djupt, sådda cellerna med för låg densitet eller upprätthålla kulturen bortom passage 3 resulterar i celler med störd morfologi, som potentiellt uttrycker mesenkymala markörer (αSMA) eller förlängning som liknar ett fibroblastiskt tillstånd (Figur 3D).
Figur 3: Validering av isolerade odlade mesenteriska arteriella ECs. (A) Brightfield-bild av isolerade EG, 10x lins, skalstång = 50 μm. (B) Immunofluorescens av VE-Cadherin-uttryck med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) som en nukleär markör. Bild tagen med ett 10x objektiv under widefield fluorescens inverterat mikroskop. Representativ bild visar VE-Cadherin-lokalisering. Skalstång = 50 μm. (C) FACS-diagram av ofärgad HUVEC (uppe till vänster), HUVEC färgad med IgG-kontroll (uppe till höger), HUVEC färgad med CD31 (nere till vänster) och de isolerade humana mesenteriska arteriella endotelcellerna (HMAEC) färgade med CD31 (nere till höger) (D) Immunofluorescensbilder av HMAEC med DAPI (kärnmarkör), alfa-glattmuskelaktin (αSMA) och CD31. 40x lins, skalstång = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
ECs isolerade med användning av celldissociationsenzym genomgick scRNA-seq. Figur 4A visar en representativ enhetlig grenrörsapproximation och projektion (UMAP) isolerad från mesenterisk artär med användning av det nuvarande protokollet för scRNA-seq på isolerade HMAECs, med 34% celler grupperade som EG med PECAM1 respektive VWF (figur 4B,C) som markörer.
Figur 4: scRNA-seq av mesenteriska arteriella ECs. (A) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) plot av scRNA-seq-data från mesenterisk artär. En 2-dimensionell projektion av grenröret i ett högdimensionellt utrymme, där varje punkt representerar en enda cell och närheten till andra punkter indikerar hur lika transkriptomet är med varandra. Celler färgkodas av sina celltyper. (B) PECAM1-uttryck projicerat på UMAP. (C) VWF-uttryck projicerat på UMAP. Färgstaplar representerar uttrycket av nivåer av gener där RNA-nivåerna avbildas av log-normaliserade unika molekylära identifierare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För rumsligt transkriptomiskt arbetsflöde elektroforiserades extraherat RNA från vävnadssektioner på en gel för att visualisera RNA-kvalitet. En svag signal eller frånvaro av 18S och 28S ribosomala RNA-band och närvaron av nedbrytningsprodukter som observerats i figur 5A, körfält A1, är ett exempel på RNA av dålig kvalitet och bör inte bearbetas ytterligare. Prover med en koncentration utanför intervallet kan leda till lägre RIN (figur 5A, körfält B1). Utspädning av RNA med två gånger ökade emellertid RIN tillräckligt för att fortsätta (Figur 5A, körfält C1). Innan genuttryck bestämdes utfördes en vävnadsoptimering för att bestämma den optimala permeabiliseringstiden för att frigöra RNA som skulle fångas av oligonukleotiderna på genuttrycksbilden (Figur 5B). Baserat på fluorescensavbildning av komplementärt DNA (cDNA) fotavtryck producerade 18 min permeabilisering den lägsta bakgrunden men starkaste signalen och valdes därmed för att vara den optimala varaktigheten. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning visualiserade kärlets morfologi så att regioner av intresse kunde identifieras (Figur 5C). Bibliotekets kvalitet bedömdes (figur 5D) och bedömdes vara lämplig för sekvensering. UMI-antal per plats, antal läsningar per plats och totala gener är kvalitetsmått som produceras av Space Ranger-rörledningen, variabiliteten för var och en som visas i figur 5E. Slutligen visualiserades genuttryck (med Actin alfa-2 (ACTA2) som exempel, figur 5F) med rumslig förankring på det H&E-färgade kärlet.
Figur 5: Rumsligt transkriptomiskt arbetsflöde och representativa resultat (A) Kvalitetsbedömning av RNA extraherat från två prover av mesenterisk artär, A1 från ett prov, B1 från det andra provet, C1 utspätt 2x från B1. Röda pilar indikerar ribosomala 28S- och 18S-band. (B) Arbetsflöde för rumslig vävnadsoptimering (TO). (C) Genuttrycksbilder (GEX) som visar vävnadssektionerna (vänster panel). H&E-bilder av vävnadssektionerna laddade på GEX-bilden före permeabilisering i 18 min, omvänd transkription och bibliotekskonstruktion (höger panel), skalstång = 1 cm. (D) Kvalitetsbedömning av de förberedda biblioteken. (E) Utdatamått från Space Ranger visar intervall mellan genomsnittliga läsningar, UMI och gener per plats för olika bibliotek. Felstaplar anger min och max. (F) ACTA2-uttryck över fartygssektionen. Alla mikroskopibilder togs med hjälp av ett brett fält inverterat mikroskop, från en 5x lins, kakelmodul. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade arbetsflödet beskriver en uppsättning tekniker för att profilera EG från en enda bit av mänsklig artär med encellig och rumslig upplösning. Det finns flera kritiska steg och begränsande faktorer i protokollet. En nyckel till transkriptomprofilering är vävnadens färskhet och RNA-integritet. Det är viktigt att hålla vävnader på is så mycket som möjligt före bearbetning för att minimera RNA-nedbrytning. Vanligtvis behandlas post-mortemvävnaderna mellan 8-14 timmar efter dödstiden. Att påbörja isoleringen eller kryokonserveringen så snart som möjligt efter extraktion från givarna rekommenderas dock. Specifikt för kartläggning av rumsligt transkriptom bör vävnaden hållas på torris och högst en frys-tina cykel bör tillåtas. Mer än ett kärltvärsnitt bör vara inbäddat i ULT, för att möjliggöra upprepningar vid behov. Ansträngningar bör också göras för att främja en RNasfri miljö under vävnadsbehandling och cellisolering. För det andra kan fartygens storlek vara en begränsande faktor. För rumslig transkriptomik kan protokollet utföras på totalt 1 mm av kärlet, oavsett diameter. För dissociationsprotokollet för cellodling och scRNA-seq skulle den nedre gränsen vara om kärlet är för smalt (dvs. under 1 mm i diameter) för att möjliggöra införande av dissektionssax. Baserat på dessa principer kan dissociationsprotokollet anpassas för alla medelstora eller större artärer eller vener så länge som kärlens storlek tillåter öppning, och det rumsliga transkriptomförfarandet kan tillämpas på alla kärl som kan passa antingen helt eller delvis in i den fiduciella ramen.
För att bearbeta vävnad för encellstranskriptomanalys har flera grupper beskrivit användningen av liberas och elastas för att erhålla alla cellpopulationer inom kärlväggen 9,43,44. De resulterande dataseten innehåller dock i genomsnitt endast 3-7% av den totala cellpopulationen kommenterad som ECs 9,45. Ett sätt att förbättra den begränsade EG-representationen i scRNA-seq-data är att berika EC-fraktionen genom att utnyttja EG-ytmarkörerna via FACS44,46. Detta kräver dock vanligtvis stora mängder startvävnad och dyr utrustning som kanske inte rutinmässigt är tillgänglig för alla laboratorier. Detta protokoll utnyttjar ECs unika anatomiska position, dvs. främst i intimalskiktet, vilket möjliggör anrikning av ECs utan behov av hård vävnadsförtunning och förbättrar cellens livskraft för scRNA-seq eller efterföljande odling. Procentandelen EK i den slutliga cellblandningen för scRNA-seq kan ökas genom tillsats av ett steg med ve-kadherin/CD144-antikroppskonjugerade magnetiska pärlor. Detta steg kan dock inte utesluta alla andra celler som interagerar med ECs på grund av den ursprungliga cell-cellinteraktionen. Även om de andra celltyperna (t.ex. makrofager, glattmuskelceller och fibroblaster) traditionellt skulle betraktas som "kontaminering" i EG-isolering, kan de dock ge användbar information för cell-cellinteraktioner i vävnadssammanhang. I scRNA-seq-dataanalysen kan EC: er effektivt kommenteras med hjälp av EC-markörerna och cell-cellinteraktionerna kan härledas bioinformatiskt med hjälp av flera populära bioinformatikmetoder (t.ex. CellChat47, CellphoneDB48, CytoTalk49 bland andra). Dessutom kan införandet av dessa data möjliggöra effektivare integrering och dekonvolution av profileringsdata för rumsligt transkriptom, som inte har encellsupplösning (se nedan)34.
För rumsligt transkriptom finns det för närvarande ingen guldstandard för att förbereda någon vävnad för denna teknik och begränsad forskning vid beredning av vaskulatur, med det mesta av den publicerade forskningen med djurvävnad 50,51. Tekniken kräver kommersiellt tillgängliga bilder med specialiserade fudicialramar med ett fångstområde som innehåller cirka 5 000 streckkodade fläckar med en diameter av 55 μm. Fläckarna placeras 100 μm från mitten av platsen till intilliggande fläckar som lämnar cirka 45 μm mellanrum mellan fläckar som inte kommer att profileras, vilket begränsar upplösningen. Dessutom kommer en enda plats att innehålla flera celler, eftersom majoriteten av cellerna är under 55 μm i området. Således, som nämnts ovan, är detta inte en encellssekvenseringsteknik. Men genom att integrera data med scRNA-seq kan upplösningen förbättras och heterogeniteten inom en plats kan avslöjas34. Även om det nuvarande protokollet fokuserar på en rumslig transkriptomisk profileringsanalys, kan denna teknik anpassas för andra framväxande rumsliga profileringsmetoder52,53 eftersom protein- och RNA-kvaliteten bibehålls i denna procedur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.Z. är grundare och styrelseledamot i Genemo, Inc.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (till Z.B.C.); DP1DK126138 och DP1HD087990 (till S.Z.); ett bidrag från Ella Fitzgerald Foundation och ett Wanek Family Project (till Z.B.C.); och ett Human Cell Atlas-frönätverksbidrag (till Z.B.C. och S.Z.). Forskning som rapporteras i denna publikation inkluderade arbete som utförts i Integrative Genomics Core vid City of Hope med stöd av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tilldelningsnummer P30CA033572. Författarna vill tacka Dr. Ismail Al-Abdullah och Dr. Meirigeng Qi från ötransplantationsteamet vid City of Hope för isolering av mänskliga vävnader, Dr. Dongqiang Yuan vid City of Hope för hans hjälp med scRNA-seq-analys och Dr. Marc Halushka vid avdelningen för kardiovaskulär patologi, Johns Hopkins University School of Medicine för hans ovärderliga insikter i vaskulär histologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
- Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
- Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
- Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
- Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Stuart, T., Satija, R.
- Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
- Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
- The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
- Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
- Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
- Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
- McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
- Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
- Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
- Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
- Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
- Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
- Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
- Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
- Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
- Stuart, T., et al.
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
- Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
- Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
- Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
- Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
- van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
- Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
- Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
- Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Moffit, J. R., et al.
