Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ट्रांसक्रिप्टोम स्तर पर मानव प्राथमिक Mesenteric धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और प्रोफाइलिंग

Published: March 14, 2022 doi: 10.3791/63307
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,3, 2, 2, 1,3
1Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, 2Department of Bioengineering, University of California San Diego, 3Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल मानव मेसेन्टेरिक धमनी से एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव, संस्कृति और प्रोफाइलिंग का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए मानव धमनी को तैयार करने के लिए एक विधि प्रदान की जाती है। प्रोटिओमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, और कार्यात्मक assays अलग कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को किसी भी मध्यम या बड़े आकार की धमनी के लिए फिर से तैयार किया जा सकता है।

Abstract

एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) पर्यावरणीय संकेतों के लिए अपनी गतिशील प्रतिक्रिया के माध्यम से संवहनी और पूरे शरीर के कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं। ईसी के ट्रांसक्रिप्टोम और एपिजीनोम को स्पष्ट करना विकास, स्वास्थ्य और बीमारी में उनकी भूमिकाओं को समझने के लिए सर्वोपरि है, लेकिन पृथक प्राथमिक कोशिकाओं की उपलब्धता में सीमित है। हाल की प्रौद्योगिकियों ने ईसी ट्रांसक्रिप्टोम और एपिजीनोम के उच्च-थ्रूपुट प्रोफाइलिंग को सक्षम किया है, जिससे पहले अज्ञात ईसी सेल उप-आबादी और विकासात्मक प्रक्षेपवक्रों की पहचान हो सकती है। जबकि ईसी संस्कृतियां ईसी फ़ंक्शन और शिथिलता की खोज में एक उपयोगी उपकरण हैं, संस्कृति की स्थिति और कई मार्ग बाहरी चर पेश कर सकते हैं जो मूल ईसी के गुणों को बदलते हैं, जिसमें आकृति विज्ञान, एपिजेनेटिक राज्य और जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम शामिल हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, वर्तमान पेपर अपने मूल राज्य पर कब्जा करने के उद्देश्य से दाता मेसेंटेरिक धमनियों से मानव प्राथमिक ईसी को अलग करने की एक विधि को प्रदर्शित करता है। अंतरंग परत में ईसी को विशेष एंजाइमों के उपयोग के साथ यांत्रिक और जैव रासायनिक रूप से अलग किया जाता है। परिणामी कोशिकाओं का उपयोग सीधे थोक आरएनए या एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण के लिए किया जा सकता है या संस्कृति के लिए मढ़वाया जा सकता है। इसके अलावा, स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए मानव धमनी ऊतक की तैयारी के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है, विशेष रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेटफ़ॉर्म के लिए, हालांकि यह विधि अन्य स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग तकनीकों के लिए भी उपयुक्त है। इस पद्धति को स्वास्थ्य या रोग राज्यों में विभिन्न प्रकार के दाताओं से एकत्र किए गए विभिन्न जहाजों पर लागू किया जा सकता है ताकि ईसी ट्रांसक्रिप्शनल और एपिजेनेटिक विनियमन में अंतर्दृष्टि प्राप्त की जा सके, जो एंडोथेलियल सेल जीव विज्ञान का एक महत्वपूर्ण पहलू है।

Introduction

रक्त वाहिकाओं के लुमेन को अस्तर करना, एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) संवहनी टोन और ऊतक परफ्यूजन के महत्वपूर्ण नियामक हैं। ईसी बाह्य कोशिकीय वातावरण पर प्रतिक्रिया करने और रक्त प्रवाह की गतिशीलता और संरचना में परिवर्तन के अनुकूल होने की उनकी क्षमता में उल्लेखनीय हैं। इन गतिशील प्रतिक्रियाओं को इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग घटनाओं के नेटवर्क के माध्यम से मध्यस्थता की जाती है, जिसमें स्पैटिओ-टेम्पोरल रिज़ॉल्यूशन के साथ ट्रांसक्रिप्शनल और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल मॉड्यूलेशन शामिल हैं। इन प्रतिक्रियाओं की अव्यवस्था कई विकृतियों में फंस गई है, जिसमें हृदय रोग, मधुमेह और कैंसर 1,2 तक सीमित नहीं है।

अध्ययनों का एक बड़ा हिस्सा ईसी ट्रांसक्रिप्टोम से पूछताछ करने के लिए सेल लाइनों या पशु मॉडल का उपयोग करता है। पूर्व एक उपयोगी उपकरण है, उपयोग और सस्तीता की सापेक्ष आसानी को देखते हुए। हालांकि, सीरियल कल्चरिंग ईसी में फेनोटाइपिक परिवर्तन पेश कर सकती है, जैसे कि फाइब्रोब्लास्टिक विशेषताएं और ध्रुवीकरण की कमी, उन्हें विवो राज्य 3 से डिस्कनेक्ट कर सकतीहै। प्राथमिक कोशिकाएं, उदाहरण के लिए, मानव नाभि शिरा ईसी (एचयूवीईसी) 1980 के दशक के बाद से एक लोकप्रिय विकल्प रही हैं, लेकिन एक विकासात्मक संवहनी बिस्तर से व्युत्पन्न हैं जो वयस्कों में मौजूद नहीं है, इस प्रकार परिपक्व ईसी का पूरी तरह से प्रतिनिधित्व करने की संभावना नहीं है। जानवरों, विशेष रूप से माउस मॉडल, बेहतर ECs के शारीरिक या pathophysiological वातावरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और आनुवंशिक गड़बड़ी के परिणामस्वरूप transcriptomes की पूछताछ की अनुमति देते हैं। मुरीन ईसी को विभिन्न ऊतकों से अलग किया जा सकता है, जिसमें एंजाइम-आधारित प्रक्रियाओं 4,5,6,7 का उपयोग करके महाधमनी, फेफड़े और वसा ऊतक शामिल हैं। हालांकि, अलग-थलग कोशिकाओं का उपयोग कई मार्गों के लिए नहीं किया जा सकता है जब तक कि6 परिवर्तित न हो और अक्सर संख्याओं में सीमित न हो, जिसके लिए कई जानवरोंसे पूलिंग की आवश्यकता होती है 5,8,9।

एक ट्रांसक्रिप्टोमिक स्तर पर पोत वास्तुकला की खोज करने वाली नई प्रौद्योगिकियों के आगमन, विशेष रूप से एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन के साथ, उपन्यास कार्यों और ईसी 5,10,11,12,13,14 के गुणों का खुलासा करके एंडोथेलियल जीव विज्ञान के एक नए युग को सक्षम किया है। Tabula Muris जांचकर्ताओं द्वारा निर्मित एक समृद्ध संसाधन ने 100,000 कोशिकाओं के एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल एकत्र किए, जिसमें 20 अलग-अलग म्यूरीन अंगोंमें ईसी शामिल हैं, जिसमें आम ईसी मार्कर जीन और अद्वितीय ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर दोनों का पता चला है, जिसमें अंतर-और इंट्रा-ऊतक अंतर 5,13 के साथ अद्वितीय ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर शामिल हैं। फिर भी, जीनोम, एपिजीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम में माउस और मानव के बीच स्पष्ट अंतर हैं, विशेष रूप से गैर-कोडिंग क्षेत्रों में 16,17,18। ये उपर्युक्त कमियां स्वास्थ्य और बीमारी में अपने मूल राज्य में ईसी की एक वफादार प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए मानव नमूनों का उपयोग करके ईसी के विश्लेषण के महत्व पर जोर देती हैं।

अधिकांश ईसी अलगाव विधियां अलग-अलग समय के लिए प्रोटियोलिटिक एंजाइमों के साथ इनक्यूबेशन से पहले समरूपता, बारीक काटने और ऊतक को कम करने के माध्यम से शारीरिक पृथक्करण पर भरोसा करती हैं। एंजाइम और स्थितियां ऊतक प्रकारों के बीच भी काफी भिन्न होती हैं, ट्रिप्सिन से कोलेजेनेस तक, अकेले यासंयोजन में उपयोग किए जाते हैं 19,20,21। आगे एंटीबॉडी-आधारित संवर्धन या शुद्धिकरण को अक्सर ईसी की शुद्धता बढ़ाने के लिए शामिल किया जाता है। आमतौर पर, ईसी झिल्ली मार्करों के खिलाफ एंटीबॉडी, उदाहरण के लिए, CD144 और CD31 को चुंबकीय मोतियों के लिए संयुग्मित किया जाता है और सेल निलंबन22,23 में जोड़ा जाता है। इस तरह की रणनीति को आम तौर पर कई मानव और माउस ऊतकों से ईसी अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जिसमें इस प्रोटोकॉल में पेश की गई तकनीकें भी शामिल हैं।

अपने मूल राज्य में, ईसी कई सेल प्रकारों के साथ बातचीत करते हैं और संवहनी niches में मौजूद हो सकते हैं जहां सेल निकटता कार्य के लिए महत्वपूर्ण है। जबकि एकल-सेल और एकल-परमाणु आरएनए-अनुक्रमण (एससीआरएनए और एसएनआरएनए-सेक) अध्ययन ईसी विषमता का वर्णन करने में हाल की सफलताओं के लिए सर्वोपरि रहे हैं, पृथक्करण प्रक्रिया ऊतक संदर्भ और सेल-सेल संपर्क को बाधित करती है, जो ईसी जीव विज्ञान को समझने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं। 2012 में विकसित और 202024 में वर्ष की विधि का नाम दिया गया, स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग का उपयोग वैश्विक जीन अभिव्यक्ति को प्रोफ़ाइल करने के लिए किया गया है, जबकि मस्तिष्क25, ट्यूमर 26 और वसा ऊतक27 सहित विभिन्न ऊतकों में स्थानिक विशेषताओं को बनाए रखा गयाहै। प्रौद्योगिकियों को लक्षित किया जा सकता है, विशेष आरएनए अनुक्रमों के लिए विशिष्ट जांच का उपयोग करके आत्मीयता अभिकर्मकों या फ्लोरोसेंट टैग से जुड़ा हुआ है, इस प्रकार उपकोशिकीय रिज़ॉल्यूशन28,29,30,31 पर चुनिंदा जीन का पता लगाया जा सकता है। उन्हें32,33 भी अनलक्षित किया जा सकता है, आमतौर पर आरएनए पर कब्जा करने के लिए स्थानिक रूप से बारकोडेड ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उपयोग किया जाता है, जो बाद के सेक लाइब्रेरी की तैयारी के लिए सीडीएनए में परिवर्तित हो जाते हैं और इसलिए पूरे ऊतक जीन अभिव्यक्ति को एक निष्पक्ष तरीके से कम करने का लाभ होता है। हालांकि, स्थानिक संकल्प वर्तमान में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रौद्योगिकियों के साथ एक एकल सेलुलर स्तर पर प्राप्त नहीं किया जाता है। इसे scRNA-seq डेटा के साथ डेटा एकीकरण के साथ कुछ हद तक दूर किया जा सकता है, अंततः अपनी मूल स्थानिक जानकारी34 को बनाए रखते हुए एक जटिल ऊतक संदर्भ में एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोम के मानचित्रण की अनुमति देता है।

इसमें, मानव बेहतर मेसेंटेरिक धमनी का उपयोग करके ईसी ट्रांसक्रिप्टोम को प्रोफ़ाइल करने के लिए एक वर्कफ़्लो का वर्णन किया गया है, एक परिधीय धमनी जिसका उपयोग वासोडिलेशन, संवहनी रीमॉडलिंग, ऑक्सीडेटिव तनाव और सूजन35,36,37 का अध्ययन करने के लिए किया गया है। दो तकनीकों का वर्णन किया गया है: 1) एकल-कोशिका ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण या बाद में इन विट्रो संस्कृति के लिए उपयुक्त यांत्रिक पृथक्करण और एंजाइमेटिक पाचन के संयोजन वाले रक्त वाहिकाओं के अंतरंग से ईसी को अलग और समृद्ध करने के लिए; 2) स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग के लिए धमनी वर्गों को तैयार करने के लिए (चित्रा 1)। इन दो तकनीकों को स्वतंत्र रूप से या पूरक रूप से प्रोफ़ाइल ईसी और उनके आसपास की कोशिकाओं के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस वर्कफ़्लो को किसी भी मध्यम या बड़ी धमनी पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सिटी ऑफ होप में दक्षिणी कैलिफ़ोर्निया आइलेट सेल रिसोर्स सेंटर से प्राप्त deidentified नमूनों पर मानव ऊतक अध्ययन किए गए थे। पोस्टमॉर्टम मानव ऊतकों के उपयोग के लिए अनुसंधान सहमति दाताओं के परिजनों के अगले से प्राप्त की गई थी, और इस अध्ययन के लिए नैतिक अनुमोदन सिटी ऑफ होप के संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी नंबर 01046) द्वारा प्रदान किया गया था।

1. शारीरिक पृथक्करण (अनुमानित समय: 1-2 ज)

  1. एक 10 सेमी पकवान पर एक ताजा धमनी रखें और बाँझ Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (डी-पीबीएस) के साथ धोएं।
  2. बाँझ संदंश और विच्छेदन कैंची के साथ, वसा और बाहरी संयोजी ऊतकों को हटा दें जब तक कि पोत साफ न हो जाए। डिश के बाहर रखे गए एक शासक के साथ पोत की लंबाई को मापें और रिकॉर्ड के लिए तस्वीरें लें (चित्रा 1 ए)।
  3. पूर्व गर्म उपयुक्त पाचन बफर 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए: scRNA-seq सेल-पृथक्करण एंजाइम का उपयोग करने के लिए; सेल संस्कृति assays कोलेजनेस डी के 1-6 मिलीग्राम / एमएल का उपयोग करें, बैक्टीरिया-व्युत्पन्न प्रोटीज के 3 मिलीग्राम / एमएल, एचईपीईएस के 100 एमएम, एनसीएल के 120 एमएम, केसीएल के 50 एमएम, ग्लूकोज के 5 एमएम, 5 एमएम के साथ CaCl2 6,38 (पीएच 7.0, समायोजन की आवश्यकता नहीं है) के 1 एमएम के साथ उपयोग करने से पहले 5 मिनट पहले जोड़ा गया।
  4. मेसेन्टेरिक धमनी (आमतौर पर 6-8 मिमी के व्यास के साथ) लें और पोत लुमेन को लंबवत रूप से खोलने के लिए कैंची के साथ लंबाई में कटौती करें।
  5. सुइयों का उपयोग करते हुए, पोत को सभी चार कोनों पर काले मोम पर संलग्न करें, जिससे अंतरंगता उजागर हो जाती है (चित्रा 1 बी)।
  6. अंतरंग करने के लिए पूर्व गर्म पाचन बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक बाँझ स्केलपेल लें और पोत के लुमेन को धीरे से दो बार स्क्रैप करें।
    नोट: इस प्रक्रिया का उद्देश्य अंतरंग परत को अलग करना है, जिसे अभ्यास की आवश्यकता हो सकती है। एंडोथेलियम को हटाने के लिए पर्याप्त बल लगाने की आवश्यकता है, लेकिन इतना नहीं कि ऊतक की गहरी परतों को भी हटा दिया जाए, जो ईसी प्रतिनिधित्व को कम कर देगा।
  7. पाचन बफर को 5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। अंतरंग में पाचन बफर के 1 एमएल जोड़ें और शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 5 एमएल ट्यूब में जोड़ने के लिए ध्यान से ऊपर और नीचे पिपेट करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, 5 मिनट के लिए 150 आरपीएम पर घूर्णन करें।
  8. एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए सेल निलंबन में M199 माध्यम (या D-PBS यदि scRNA-seq के साथ आगे बढ़ रहा है) के 2 mL जोड़ें। धीरे से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, 5 मिनट के लिए 600 x g ।
  9. Supernatant निकालें और एक नियंत्रण के रूप में संस्कृति के लिए अलग से supernatant स्टोर अगर सभी कोशिकाओं चरण 1.8 में गोली में कब्जा कर रहे हैं निरीक्षण करने के लिए। M199 माध्यम के 1 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें (या D-PBS यदि scRNA-seq के साथ आगे बढ़ रहा है)।
  10. सेल स्टॉक के 10 μL के साथ ट्रिपैन नीले रंग के 10 μL मिश्रण द्वारा सेल व्यवहार्यता का आकलन करें। सेल आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: इस बिंदु पर, कोशिकाओं का उपयोग प्रोटीन या आरएनए परिमाणीकरण के लिए किया जा सकता है या मानक प्रोटोकॉल39 का पालन करते हुए ईसी संस्कृति मीडिया का उपयोग करके विट्रो में सुसंस्कृत किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, उन्हें अनुक्रमण के लिए तैयार किया जा सकता है जैसा कि अगले अनुभाग में वर्णित है।
  11. संस्कृति के लिए, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए कुओं में अनुलग्नक अभिकर्मक के 500 μL pipetting द्वारा एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के दो कुओं कोट। अनुलग्नक अभिकर्मक को हटाने और बाँझ डी-पीबीएस के साथ धोने के बाद, पूर्ण सेल स्टॉक को एक अच्छी तरह से वितरित करें, और supernatant को दूसरे कुएं में नियंत्रण के रूप में रखा गया।

2. scRNA-seq अध्ययन के लिए तैयारी (अनुमानित समय: 3-4 ज)

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर चरण 1.11 से सेल स्टॉक को सेंट्रीफ्यूज करें, 5 मिनट के लिए 600 x g । supernatant निकालें और एक P1000 पिपेट और डी-पीबीएस में 0.04% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के 1 mL में चौड़े बोर टिप के साथ गोली को धीरे से फिर से निलंबित करें। एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं।
  2. सेल मलबे को हटाने के लिए एक 40 μm छलनी के माध्यम से समाधान पारित करें। यदि मलबा रहता है, तो डी-पीबीएस में 0.04% बीएसए के 4 एमएल में एक दूसरे छलनी के माध्यम से गुजरें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, 5 मिनट के लिए 600 x g । supernatant निकालें और एक चौड़े बोर पिपेट टिप के साथ एक P1000 पिपेट का उपयोग कर डी-पीबीएस में 0.04% बीएसए के 500 μL में गोली resuspend. एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. ट्राइपैन नीले रंग के 10 μL के साथ सेल स्टॉक के 10 μL को मिलाकर सेल व्यवहार्यता का आकलन करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके, आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें, यह निर्धारित करें कि क्या क्लस्टर के बिना एकल-सेल निलंबन है, ऊतक मलबे की जांच करें, और जीवित और मृत कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
  5. यदि कोशिकाओं को क्लस्टर किया जाता है या मलबा रहता है, तो डी-पीबीएस में 0.04% बीएसए के साथ धोने को दोहराएं या फिर से 40 μm छलनी से गुजरें।
    नोट:: हालांकि यह उपज को कम करेगा, यह महत्वपूर्ण है कि कक्ष इष्टतम अनुक्रमण के लिए एक स्वच्छ एकल-सेल निलंबन में मौजूद हैं।
  6. एकल-सेल निलंबन का उपयोग scRNA-seq के लिए किया जा सकता है।

3. स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग (अनुमानित समय: 3-4 ज)

  1. एक धातु कनस्तर में आइसोपेन्टेन (2-मिथाइलब्यूटेन) जोड़ें और तरल नाइट्रोजन (एलएन2) या सूखी बर्फ में ठंडा करें (एलएन2 को पसंद किया जाता है क्योंकि यह शुष्क बर्फ से कम तापमान लाएगा)। लेबल किए गए प्लास्टिक क्रायोमोल्ड्स के कुओं में इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) डालें जो बुलबुले न बनाने और दिखाई देने वाले लोगों को हटाने का ध्यान रखते हैं। ठंडा करने के लिए सूखी बर्फ पर क्रायोमोल्ड छोड़ दें।
  2. कम से कम दो कोरोनल वर्गों को काटें, पोत की लंबाई में 1 सेमी। लंबे (12") संदंश का उपयोग करते हुए, जमे हुए होने तक आइसोपेन्टेन में ऊतक को डुबोएं। केंद्र में दिखाई देने वाले लुमेन के साथ अभिविन्यास में ओसीटी में ऊतक को जल्दी से डुबोएं। किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए ध्यान रखें, विशेष रूप से ऊतक के बगल में।
  3. लंबे (12") संदंश का उपयोग करके, क्रायोमोल्ड्स को समझें, और उन्हें धातु कनस्तर में रखें। जबकि मोल्ड्स का आधार तरल में होना चाहिए, यह ऊतक पर चलने के लिए आइसोपेन्टेन की अनुमति देने के लिए बहुत गहरा नहीं होना चाहिए। ठंड का निरीक्षण करें, OCT 1-2 मिनट में बाहर से उत्तरोत्तर सफेद हो जाएगा।
  4. इन वर्गों को 6 महीने तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर एक सीलबंद कंटेनर में संग्रहीत करें।
    नोट: हर समय सूखी बर्फ पर नमूने बनाए रखें और एक से अधिक फ्रीज-thaw चक्र की अनुमति न दें। इस ऊतक का उपयोग हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण, आरएनए / डीएनए प्रतिदीप्ति इन सीटू संकरण (फिश), या स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए किया जा सकता है, जिसे अब वर्णित किया जाएगा।
  5. क्रायोस्टेट तापमान को कक्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस और नमूना सिर के लिए -10 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। लगभग 30 मिनट के लिए क्रायोस्टेट में -20 डिग्री सेल्सियस के लिए ओसीटी एम्बेडेड पोत वर्गों, चाकू, ब्रश, और स्लाइड को संतुलित करें। संतुलन करते समय, मशीन और सभी उपकरणों को साफ करें जो ब्लेड सहित वर्गों को छू सकते हैं, 70% इथेनॉल के साथ RNase decontamination समाधान के बाद।
  6. परिपत्र क्रायोस्टेट ब्लॉक पर OCT की एक छोटी राशि वितरित करके और नमूने को फ्रीज होने से पहले शीर्ष पर रखकर नमूना संलग्न करें। ब्लॉक को नमूना सिर के केंद्र में रखें और बाईं ओर एक लंबे काले हैंडल का उपयोग करके ब्लॉक को जगह में पेंच करें। पोत के चारों ओर किसी भी अतिरिक्त ओसीटी को काट लें।
  7. क्रायोस्टेट पर काटने की मोटाई को 10 μm पर सेट करना, लगभग 60 वर्गों में कटौती करें और उन्हें पूर्व-ठंडा 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। इन वर्गों का उपयोग आरएनए गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया जाएगा। क्रायोस्टेट से हटाने पर, तुरंत आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक और भंवर के 1 एमएल जोड़ें जब तक कि अनुभाग पूरी तरह से भंग न हो जाएं।
  8. क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें और मिश्रण जब तक समाधान एक स्ट्रॉबेरी मिल्कशेक जैसा दिखता है। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 11,200 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  9. जलीय चरण (सफेद और गुलाबी परतों के शीर्ष पर स्पष्ट चरण) को इकट्ठा करें और इसमें 500 μL isopropanol जोड़ें। 10 से अधिक बार ट्यूबों को उलटकर मिलाएं और कम से कम 20 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 11,200 x g पर सेंट्रीफ्यूज। RNase मुक्त पानी के 5 μL में शुद्ध आरएनए गोली भंग. RNA Integrity Number (RIN) की जांच करें।
    नोट: RIN ≥ 7 के साथ नमूने पसंद किए जाते हैं, लेकिन RIN ≥ 6 स्वीकार्य है। ऊतक वर्गों की संख्या और आरएनए भंग करने के लिए समाधान की मात्रा को यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रणाली के आधार पर अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है कि अंतिम आरएनए एकाग्रता सटीक आरआईएन मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए आरआईएन फ़ंक्शन रेंज के भीतर है।
  11. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक अनुकूलन या जीन अभिव्यक्ति स्लाइड पर आगे बढ़ने से पहले सादे कांच स्लाइड का उपयोग करके फिड्यूशियल फ्रेम के भीतर वर्गों को ठीक से काटने और रखने का अभ्यास करें। यह एक सादे ग्लास स्लाइड पर 6.5 मिमी x 6.5 मिमी वर्गों को ड्राइंग करके, क्रायोस्टेट में -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करके, और इस कैप्चर क्षेत्र में अनुभागों को रखकर प्राप्त किया जा सकता है।
  12. जगह में विरोधी रोल प्लेट के साथ 10 μm वर्गों में कटौती, फ्लिप और ध्यान से आसपास के OCT के माध्यम से धीरे से अनुभाग को छूने से चपटा.
  13. RNase-free cryostat ब्रश का उपयोग करके केवल आस-पास के OCT का उपयोग करके, वर्ग के भीतर ऊतक अनुभाग को जगह देते हैं। स्लाइड पर अनुभाग को पिघलाने के लिए कैप्चर क्षेत्र के पीछे की ओर तुरंत एक उंगली (दस्ताने में) रखें।
  14. एक बार जब अनुभाग का पालन हो जाता है, तो अनुभाग को फ्रीज करने की अनुमति देने के लिए स्लाइड को क्रायोबार पर रखें। ऊतक तह और ऊतक fiducial फ्रेम के सीमांकित किनारों overlying से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए. यदि आवश्यक हो, तो ऊतक को ब्लेड का उपयोग करके लुमेन के साथ आधे या तिमाहियों में काट लें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पोत अनुभाग 6.5 मिमी x 6.5 मिमी फ्रेम के भीतर फिट बैठता है।
  15. ऊतक अनुकूलन या जीन अभिव्यक्ति स्लाइड पर 3.12-3.14 के अनुसार ऊतक के 10 μm वर्गों में कटौती। स्लाइड को सूखी बर्फ पर रखे गए स्लाइड मेलर पर स्थानांतरित करें. प्रकाशित स्थानिक प्रोटोकॉल33,34 के साथ आगे बढ़ने से पहले 4 सप्ताह तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड स्टोर करें।

4. अनुक्रमण डेटा विश्लेषण (अनुमानित समय: सॉफ्टवेयर के साथ परिचितता के आधार पर 1 सप्ताह तक)

नोट:: केवल स्थानिक transcriptomic विश्लेषण के लिए, चरण 4.8 करने के लिए छोड़ दें। scRNA-seq डेटा को मानव hg38 संदर्भ ट्रांसक्रिप्टोम के लिए संरेखित मानकीकृत पाइपलाइन का उपयोग करके संसाधित किया जाता है। R पैकेज Seurat (v3.2.2) का उपयोग प्रकाशित दिशानिर्देशों40 का पालन करते हुए scRNA-seq डेटा का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है।

  1. अच्छी तरह से स्थापित गुणवत्ता नियंत्रण मीट्रिक का उपयोग करके फ़िल्टर करें: जीन (संभावित रूप से गुणकों) की बहुत अधिक संख्या वाली दुर्लभ कोशिकाओं और उच्च माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिशत (कम गुणवत्ता वाली या मरने वाली कोशिकाएं अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल संदूषण पेश करती हैं) के साथ कोशिकाओं को हटा दिया जाता है।
  2. "sctransform" का उपयोग करके डेटा को सामान्य करें, जो लॉग-सामान्यीकरण की तुलना में नमूना एकीकरण में सुधार करने की एक विधि है। इन सामान्यीकृत डेटा का उपयोग आयामीता में कमी और क्लस्टरिंग के लिए किया जाता है, जबकि लॉग-सामान्यीकृत अभिव्यक्ति स्तरों का उपयोग जीन अभिव्यक्ति स्तरों के आधार पर विश्लेषण के लिए किया जाता है, जैसे कि सेल-प्रकार वर्गीकरण41।
  3. प्रति सेल प्रकार मार्कर जीन का चयन करें, उदाहरण के लिए, प्लेटलेट एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु -1 (PECAM1) और वॉन विलेब्रांड फैक्टर (VWF) ECs के लिए, lumican (LUM) और प्रोकोलेजन C-Endopeptidase Enhancer (PCOLCE) fibroblasts के लिए, बी-सेल ट्रांसलोकेशन जीन 1 (BTG1) और CD52 मैक्रोफेज के लिए, मोनोसाइट्स के लिए C1QA और C1QB , और मायोसिन भारी श्रृंखला 11 (MYH11) और मायोसिन भारी श्रृंखला 11 (MYH11) और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के लिए ट्रांसजेलिन (TAGLN)36.
  4. मार्करों की प्रत्येक जोड़ी के बीच एकल कोशिकाओं में औसत अभिव्यक्ति स्तर की गणना करें ताकि प्रत्येक सेल प्रकार42 के साथ जुड़े औसत अभिव्यक्ति स्तर के साथ एक एकल मार्कर हो।
  5. दो सेटों में कोशिकाओं को अलग करने के लिए एकल कोशिकाओं में प्रत्येक मार्कर की अभिव्यक्ति डेटा के लिए दो घटकों के साथ एक गाऊसी मिश्रण मॉडल (जीएमएम) लागू करें, अर्थात्, मार्कर को अत्यधिक व्यक्त करना और मार्कर को कम व्यक्त करना। इस तरह, प्रत्येक मार्कर के लिए, प्रत्येक एकल सेल को दो घटकों में से एक को सौंपा जाता है42।
  6. मार्कर जीन के सेट के लिए सांख्यिकीय संवर्धन का उपयोग करें, एक फिशर का सटीक परीक्षण, प्रत्येक क्लस्टर को एक सेल प्रकार असाइन करने के लिए। ऐसा करने से, पी-मानों का एक सेट प्रति क्लस्टर प्राप्त किया जाता है, प्रत्येक एक सेल प्रकार के अनुरूप होता है। सबसे कम p-मान के साथ कक्ष प्रकार उस क्लस्टर को असाइन किया गया है।
  7. स्पेस रेंजर पाइपलाइनों का उपयोग करके स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा को संसाधित करें, जिसके परिणामस्वरूप स्थानिक डी-बारकोडिंग और गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) मीट्रिक की पीढ़ी होती है, जिसमें कुल संरेखित एचजी 38 मानव ट्रांसक्रिप्टोम, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता (यूएमआई) की औसत संख्या या जीन प्रति स्पॉट35 शामिल हैं।
    नोट:: R पैकेज Seurat (v3.2.2) प्रकाशित दिशानिर्देशों40 का पालन करते हुए अंतरिक्ष रेंजर-संसाधित डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है।
  8. "sctransform" का उपयोग करके डेटा को सामान्य बनाना, एक विधि जो ऊतक की विषमता और धब्बों में गिनती में बहुत उच्च विचरण को देखते हुए लॉग-सामान्यीकरण की तुलना में डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में सुधार करने के लिए प्रदर्शित की जाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

विभिन्न डाउनस्ट्रीम assays में उपयोग के लिए यांत्रिक और enzymatical पृथक्करण या क्रायोप्रिजर्वेशन के संयोजन का उपयोग करके mesenteric धमनी से ECs का विश्लेषण यहाँ दर्शाया गया है (चित्रा 1)। ECs को निम्नलिखित चरणों का उपयोग करके mesenteric धमनियों में प्रोफ़ाइल किया जा सकता है: ए) संस्कृति कोशिकाओं के लिए कोलेजनेस पाचन के साथ युग्मित अंतरंग से यांत्रिक पृथक्करण; बी) scRNA-seq के लिए एकल सेल निलंबन की पीढ़ी; या सी) धमनी के क्रॉस-सेक्शन को ओसीटी में एम्बेडेड किया जा सकता है ताकि प्रोफ़ाइल स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम (चित्रा 1 और चित्रा 2) के लिए क्रायोसेक्शन किया जा सके।

Figure 1
चित्र1: धमनी ऊतक प्रसंस्करण और स्थानिक प्रोफाइलिंग(ए) एक साफ-अप मेसेंटेरिक धमनी। (बी) अंतरंगता को उजागर करने के लिए पोत को खुला काट दिया। (सी) हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) फिड्यूशियल फ्रेम में मेसेन्टेरिक धमनी क्रॉस-सेक्शन का धुंधला होना। वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत एक 5x लेंस का उपयोग करके कैप्चर की गई छवि। (डी) कुल जीन अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि स्पेस रेंजर आउटपुट फ़ाइल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ईसी अलगाव और प्रोफाइलिंग तकनीकों का अवलोकन। प्रवाह आरेख जो मेसेन्टेरिक धमनी के प्रसंस्करण के विभिन्न तरीकों को दर्शाता है। प्रसंस्करण तकनीकों के परिणामस्वरूप एकल-सेल (एससी) आरएनए-सेक, एंडोथेलियल सेल (ईसी) संस्कृति के लिए उपयुक्त सेल निलंबन होता है, या पूरे ऊतक को स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग के लिए इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) में एम्बेडेड किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग-अलग ईसी सुसंस्कृत न्यूनतम दूषित कोशिकाओं (चित्रा 3 ए) के साथ एक अलग कोबलस्टोन जैसी आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं। ईसी मार्कर संवहनी एंडोथेलियल (वीई) की अभिव्यक्ति-कैडरिन की पुष्टि इम्युनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके सेल-सेल जंक्शनों (चित्रा 3 बी) को देखने के लिए की गई थी। पृथक ईसी को सीडी 31 के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के अधीन किया गया था। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, unstained HUVECs (एंटीबॉडी के बिना) ने 1.1% सिग्नल का उत्पादन किया और IgG के साथ इनक्यूबेट किए गए HUVECs ने 0.8% सिग्नल प्राप्त किया। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, CD31 एंटीबॉडी के साथ दाग वाले HUVECs ने 99% शुद्धता प्रदर्शित की और मानव mesenteric धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (HMAECs) के लिए चैनलों को गेट करने के लिए उपयोग किया गया। लगभग 80% कोशिकाएं CD31 सकारात्मक थीं जो HMAECs को दर्शाती हैं जो ताजा अलग-थलग सेल आबादी (चित्रा 3 C) का बहुमत बनाती हैं। असफल अलगाव, या तो बहुत कठिन / गहरे स्क्रैपिंग के माध्यम से, कोशिकाओं को बहुत कम घनत्व पर सीडिंग, या मार्ग 3 से परे संस्कृति को बनाए रखने के परिणामस्वरूप परेशान आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं में परिणाम होता है, संभावित रूप से मेसेनकाइमल मार्कर (αSMA) को व्यक्त करता है या एक फाइब्रोब्लास्टिक राज्य (चित्रा 3 डी) जैसा दिखता है।

Figure 3
चित्रा 3: पृथक सुसंस्कृत mesenteric धमनी ECs का सत्यापन(A) पृथक ECs की ब्राइटफील्ड छवि, 10x लेंस, स्केल बार = 50 μm. (B) एक परमाणु मार्कर के रूप में 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ VE-कैडरिन अभिव्यक्ति का इम्यूनोफ्लोरेसेंस। वाइडफील्ड प्रतिदीप्ति उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत एक 10x लेंस का उपयोग करके कैप्चर की गई छवि। प्रतिनिधि छवि VE-कैडरिन स्थानीयकरण से पता चलता है. स्केल बार = 50 μm. (C) UNSTAINED HUVEC (ऊपर बाईं ओर), HUVEC IgG नियंत्रण (ऊपर दाएं), HUVEC CD31 (नीचे बाईं ओर) के साथ दाग, और पृथक मानव mesenteric धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (HMAEC) CD31 (नीचे दाएं) (डी) DAPI (परमाणु मार्कर), अल्फा-चिकनी मांसपेशी actin (αSMA) और CD31 के साथ HMAECs की Immunofluorescence छवियों के साथ दाग के FACS भूखंडों. 40x लेंस, स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सेल-पृथक्करण एंजाइम का उपयोग करके अलग किए गए ईसी एससीआरएनए-सेक से गुजरे। चित्रा 4A एक प्रतिनिधि समान कई गुना सन्निकटन और प्रोजेक्शन (UMAP) को अलग-थलग HMAECs पर scRNA-seq के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके mesenteric धमनी से अलग दिखाता है, जिसमें 34% कोशिकाओं को PECAM1 और VWF (चित्रा 4B, C क्रमशः) मार्करों के रूप में उपयोग करके ECs के रूप में क्लस्टर किया गया है।

Figure 4
चित्रा 4: मेसेन्टेरिक धमनी ECs के scRNA-seq. (A) यूनिफ़ॉर्म मैनिफोल्ड सन्निकटन और प्रोजेक्शन (UMAP) मेसेन्टेरिक धमनी से scRNA-seq डेटा का प्लॉट। एक उच्च आयामी स्थान में कई गुना का एक 2-आयामी प्रक्षेपण, जहां प्रत्येक बिंदु एक एकल सेल का प्रतिनिधित्व करता है और अन्य बिंदुओं की निकटता इंगित करती है कि ट्रांसक्रिप्टोम एक दूसरे के साथ कितना समान है। कोशिकाओं को उनके सेल प्रकारों द्वारा रंग-कोडित किया जाता है। (बी) PECAM1 अभिव्यक्ति UMAP पर प्रक्षेपित. (C) UMAP पर प्रक्षेपित VWF व्यंजक। रंग सलाखों जीन के स्तर की अभिव्यक्ति का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां आरएनए स्तरों को लॉग-सामान्यीकृत अद्वितीय आणविक पहचानकर्ता गिनती द्वारा दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक वर्कफ़्लो के लिए, ऊतक वर्गों से निकाले गए आरएनए को आरएनए गुणवत्ता की कल्पना करने के लिए जेल पर वैद्युतकणसंचलन किया गया था। एक कमजोर संकेत या 18S और 28S राइबोसोमल आरएनए बैंड की अनुपस्थिति, और चित्रा 5A, लेन A1 में देखे गए गिरावट उत्पादों की उपस्थिति, खराब गुणवत्ता वाले आरएनए का एक उदाहरण है और इसे आगे संसाधित नहीं किया जाना चाहिए। सीमा से बाहर एक एकाग्रता के साथ नमूने कम RIN (चित्रा 5A, लेन B1) के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। हालांकि, आरएनए को दो गुना कम करने से आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त आरआईएन में वृद्धि हुई (चित्रा 5 ए, लेन सी 1)। जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण करने से पहले, जीन अभिव्यक्ति स्लाइड (चित्रा 5 बी) पर ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स द्वारा कब्जा किए जाने वाले आरएनए को जारी करने के लिए इष्टतम परमेबिलाइजेशन समय निर्धारित करने के लिए एक ऊतक अनुकूलन किया गया था। पूरक डीएनए (cDNA) पदचिह्न के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के आधार पर, 18 मिनट permeabilization ने सबसे कम पृष्ठभूमि लेकिन सबसे मजबूत संकेत का उत्पादन किया, और इस प्रकार इष्टतम अवधि होने के लिए चुना गया था। हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होने से पोत की आकृति विज्ञान की कल्पना की गई जिससे ब्याज के क्षेत्रों की पहचान की जा सकती है (चित्रा 5 सी)। पुस्तकालय की गुणवत्ता का मूल्यांकन किया गया था (चित्रा 5 डी) और अनुक्रमण के लिए उपयुक्त होने के लिए निर्धारित किया गया था। UMI प्रति स्पॉट गिनती है, प्रति स्थान पढ़ने की संख्या, और कुल जीन अंतरिक्ष रेंजर पाइपलाइन द्वारा उत्पादित गुणवत्ता मीट्रिक हैं, चित्रा 5E में प्रदर्शित प्रत्येक की परिवर्तनशीलता। अंत में, जीन अभिव्यक्ति (एक उदाहरण के रूप में एक्टिन अल्फा -2 (एक्टा 2) का उपयोग करते हुए, चित्रा 5 एफ) को एच एंड ई दाग वाले पोत पर स्थानिक एंकरिंग के साथ कल्पना की गई थी।

Figure 5
चित्रा 5: स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक वर्कफ़्लो और प्रतिनिधि परिणाम (ए) मेसेन्टेरिक धमनी के दो नमूनों से निकाले गए आरएनए की गुणवत्ता मूल्यांकन, एक नमूने से ए 1, दूसरे नमूने से बी 1, बी 1 पतला 2x बी 1 से। लाल तीर राइबोसोमल 28S और 18S बैंड को इंगित करते हैं। (बी) स्थानिक ऊतक अनुकूलन (TO) वर्कफ़्लो। (सी) जीन अभिव्यक्ति (जीईएक्स) स्लाइड ऊतक वर्गों (बाएं पैनल) को दिखाते हुए; 18 मिनट के लिए permeabilization से पहले GEX स्लाइड पर लोड ऊतक वर्गों की एच एंड ई छवियां, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और लाइब्रेरी निर्माण (सही पैनल), स्केल बार = 1 सेमी (डी) तैयार पुस्तकालयों की गुणवत्ता मूल्यांकन। (ई) स्पेस रेंजर से आउटपुट मैट्रिक्स विभिन्न पुस्तकालयों के लिए औसत रीड्स, यूएमआई और जीन प्रति स्थान के बीच रेंज दिखाते हैं। त्रुटि पट्टियाँ न्यूनतम और अधिकतम को निरूपित करती हैं। (F) ACTA2 अभिव्यक्ति पोत अनुभाग में। सभी माइक्रोस्कोपी छवियों को एक वाइडफील्ड उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया गया था, एक 5x लेंस, टाइल्सकैन मॉड्यूल से। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रस्तुत वर्कफ़्लो एकल-कोशिका और स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के साथ मानव धमनी के एक टुकड़े से ईसी को प्रोफ़ाइल करने के लिए तकनीकों के एक सेट का विवरण देता है। प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम और सीमित कारक हैं। ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग की एक कुंजी ऊतक की ताजगी और आरएनए अखंडता है। आरएनए गिरावट को कम करने के लिए प्रसंस्करण से पहले जितना संभव हो सके बर्फ पर ऊतकों को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। आमतौर पर, पोस्टमार्टम ऊतकों को मृत्यु के समय के बाद 8-14 घंटे के बीच संसाधित किया जाता है। हालांकि, दाताओं से जितनी जल्दी हो सके निष्कर्षण के बाद अलगाव या क्रायोप्रिजर्वेशन की शुरुआत की सिफारिश की जाती है। विशेष रूप से स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम मैपिंग के लिए, ऊतक को सूखी बर्फ पर रखा जाना चाहिए और एक से अधिक फ्रीज-पिघलने वाले चक्र की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए। यदि आवश्यक हो तो दोहराव की अनुमति देने के लिए एक से अधिक पोत क्रॉस-सेक्शन को ओसीटी में एम्बेडेड किया जाना चाहिए। ऊतक प्रसंस्करण और सेल अलगाव के दौरान एक RNase मुक्त वातावरण को बढ़ावा देने के लिए भी प्रयास किए जाने चाहिए। दूसरे, जहाजों का आकार एक सीमित कारक हो सकता है। स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के लिए, प्रोटोकॉल को कुल मिलाकर पोत के 1 मिमी पर किया जा सकता है, भले ही व्यास की परवाह किए बिना। सेल संस्कृति और scRNA-seq के लिए पृथक्करण प्रोटोकॉल के लिए, निचली सीमा तब होगी जब पोत बहुत संकीर्ण है (यानी, व्यास में 1 मिमी से नीचे) विच्छेदन कैंची के सम्मिलन को सक्षम करने के लिए। इन सिद्धांतों के आधार पर, पृथक्करण प्रोटोकॉल को किसी भी मध्यम या बड़े आकार की धमनी या नस के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जब तक कि जहाजों का आकार खोलने की अनुमति देता है, और स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रक्रिया को किसी भी जहाजों पर लागू किया जा सकता है जो या तो पूरी तरह से या आंशिक रूप से फिड्यूशियल फ्रेम में फिट हो सकते हैं।

एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण के लिए ऊतक को संसाधित करने के लिए, कई समूहों ने पोत की दीवार 9,43,44 के भीतर सभी सेल आबादी प्राप्त करने के लिए लिबेरेस और इलास्टेज के उपयोग का वर्णन किया है। हालांकि, परिणामी डेटासेट में औसतन कुल सेल आबादी का केवल 3-7% होता है जिसे ECs 9,45 के रूप में एनोटेट किया जाता है। SCRNA-seq डेटा में सीमित ईसी प्रतिनिधित्व में सुधार करने का एक तरीका FACS44,46 के माध्यम से EC सतह मार्करों का लाभ उठाकर EC अंश को समृद्ध करना है। हालांकि, इसके लिए आमतौर पर बड़ी मात्रा में शुरुआती ऊतक और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है जो सभी प्रयोगशालाओं के लिए नियमित रूप से उपलब्ध नहीं हो सकते हैं। यह प्रोटोकॉल ईसी की अद्वितीय शारीरिक स्थिति का लाभ उठाता है, अर्थात् मुख्य रूप से अंतरंग परत में, जो कठोर ऊतक पाचन की आवश्यकता के बिना ईसी के संवर्धन की अनुमति देता है और एससीआरएनए-सेक या बाद की संस्कृति के लिए सेल व्यवहार्यता को बढ़ाता है। SCRNA-seq के लिए अंतिम सेल मिश्रण में ECs के प्रतिशत को VE-Cadherin / CD144 एंटीबॉडी-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एक कदम जोड़कर बढ़ाया जा सकता है। हालाँकि, यह चरण मूल कक्ष-कक्ष इंटरैक्शन के कारण ECs के साथ सहभागिता करने वाले अन्य सभी कक्षों को बाहर नहीं कर सकता है। फिर भी, हालांकि पारंपरिक रूप से अन्य सेल प्रकारों (जैसे, मैक्रोफेज, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और फाइब्रोब्लास्ट्स) को ईसी अलगाव में "संदूषण" के रूप में माना जाएगा, वे ऊतक संदर्भ में सेल-सेल इंटरैक्शन के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं। scRNA-seq डेटा विश्लेषण में, ईसी को ईसी मार्करों का उपयोग करके कुशलतापूर्वक एनोटेट किया जा सकता है और सेल-सेल इंटरैक्शन को कई लोकप्रिय जैव सूचना विज्ञान विधियों (उदाहरण के लिए, सेलचैट47, सेलफोनडीबी48, साइटोटॉक49) का उपयोग करके जैव सूचना विज्ञान का अनुमान लगाया जा सकता है। इसके अलावा, इन डेटा को शामिल करने से स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग डेटा के अधिक प्रभावी एकीकरण और डीकन्वोल्यूशन को सक्षम किया जा सकता है, जो एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर नहीं हैं (नीचे देखें)34।

स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोम के लिए, वर्तमान में इस तकनीक के लिए किसी भी ऊतक को तैयार करने के लिए कोई सोने का मानक नहीं है और वास्कुलचर तैयार करने में सीमित शोध है, जिसमें अधिकांश प्रकाशित शोध पशु ऊतक50,51 का उपयोग कर रहे हैं। तकनीक को 55 μm के व्यास के साथ लगभग 5,000 बारकोडेड स्पॉट वाले कैप्चर क्षेत्र के साथ विशेष fudicial फ्रेम के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्लाइड की आवश्यकता होती है। धब्बों को स्पॉट के केंद्र से आसन्न स्थानों के केंद्र के अलावा 100 μm रखा जाता है, जो स्पॉट के बीच लगभग 45 μm अंतराल छोड़ देता है जो कि प्रोफाइल नहीं किया जाएगा, रिज़ॉल्यूशन को सीमित करेगा। इसके अलावा, एक एकल स्थान में कई कोशिकाएं होंगी, क्योंकि अधिकांश कोशिकाएं क्षेत्र में 55 μm से नीचे होती हैं। इस प्रकार, जैसा कि उपर्युक्त है, यह एक एकल-सेल अनुक्रमण तकनीक नहीं है। हालांकि, scRNA-seq के साथ डेटा को एकीकृत करके, रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाया जा सकता है, और एक स्थान के भीतर विषमता को प्रकट किया जा सकताहै। यद्यपि वर्तमान प्रोटोकॉल एक स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग परख पर केंद्रित है, इस तकनीक को अन्य उभरते हुए स्थानिक प्रोफाइलिंग विधियों52,53 के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्योंकि इस प्रक्रिया में प्रोटीन और आरएनए गुणवत्ता बनाए रखी जाती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

एसजेड जेनेमो, इंक के संस्थापक और बोर्ड सदस्य हैं।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (Z.B.C. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था; DP1DK126138 और DP1HD087990 (S.Z.); एक एला Fitzgerald फाउंडेशन अनुदान और एक Wanek परिवार परियोजना (Z.B.C.के लिए); और एक मानव सेल एटलस बीज नेटवर्क अनुदान (Z.B.C. और S.Z. के लिए)। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध में पुरस्कार संख्या P30CA033572 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा समर्थित सिटी ऑफ होप में इंटीग्रेटिव जीनोमिक्स कोर में किए गए काम को शामिल किया गया था। लेखकों को मानव ऊतकों के अलगाव के लिए आशा के शहर में आइलेट प्रत्यारोपण टीम के डॉ इस्माइल अल-अब्दुल्ला और डॉ. Meirigeng क्यूई, एससीआरएनए-seq विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए आशा के शहर में डॉ Dongqiang युआन, और डॉ मार्क Halushka कार्डियोवस्कुलर पैथोलॉजी के प्रभाग में धन्यवाद करना चाहते हैं, जॉन्स हॉपकिन्स यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन संवहनी histology में अपनी अमूल्य अंतर्दृष्टि के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL micro-centrifuge tube USA Scientific 1615-5500
10 cm dish Genesee Scientific 25-202
23G needles BD 305145
2-methylbutane Thermo Fisher AC327270010
40 µm strainer Fisher 14100150
4200 TapeStation System Agilent Technologies G2991BA
5 mL tube Thermo Fisher 14282300
6-well plate Greiner Bio-One 07-000-208
Attachment factor Cell Applications 123-500 Attachment reagent in the protocol
Black wax Any commercial black wax can be used
Bovine serum albumin heat shock treated Fisher BP1600-100
CaCl2 Fisher BP510
Centrifuge Eppendorf
Chloroform Fisher C607
Collagenase D Roche 11088866001
Cryostat Leica
Cryostat brushes
D-Glucose Fisher D16-1
Dimethyl sulfoxide Fisher MT25950CQC
Dispase II Roche 4942078001 Bacteria-derived protease in the protocol
Disposable Safety Scalpels Myco Instrumentation 6008TR-10
D-PBS Thermo Fisher 14080055
Ethanol Fisher BP2818-4
Fetal bovine serum Fisher 10437028
Hemocytometer Fisher 267110
HEPES Sigma Aldrich H3375-100g
High sensitivity D1000 sample buffer Agilent Technologies 5067-5603
High sensitivity D1000 screen tape Agilent Technologies 5067-5584
Incubator Kept at 37 °C 5% CO2
Isopropanol Fisher BP26324
KCl Fisher P217-3
Liquid nitrogen
Medium 199 Sigma Aldrich M2520-10X
Metal cannister
Microscope Leica To assess cell morphology
Microvascular endothelial culture medium Cell Applications 111-500
NaCl Fisher S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker Eppendorf
Optimal Cutting Temperature compound Fisher 4585
Plastic cryomolds Fisher 22363553
RNA screen tape Agilent Technologies 5067-5576
RNA screen Tape sample buffer Agilent Technologies 5067-5577
RNase ZAP Thermo Fisher AM9780
RNase-free water Takara RR036B RNase-free water (2) in kit
Sterile 12" long forceps F.S.T 91100-16
Sterile fine forceps F.S.T 11050-10
Sterile fine scissors F.S.T 14061-11
Superfrost PLUS Gold Slides Fisher 1518848
TRIzol reagent Fisher 15596018
Trypan Blue Corning MT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red Thermo Fisher 12605010 Cell-dissociation enzyme in the protocol
Visium Accessory Kit 10X Genomics PN-1000215
Visium Gateway Package, 2rxns 10X Genomics PN-1000316
Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns 10X Genomics PN-1000184

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

Tags

चिकित्सा अंक 181
ट्रांसक्रिप्टोम स्तर पर मानव प्राथमिक Mesenteric धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं के अलगाव और प्रोफाइलिंग
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Malhi, N. K., Luo, Y., Tang, X.,… More

Malhi, N. K., Luo, Y., Tang, X., Sriram, K., Calandrelli, R., Zhong, S., Chen, Z. B. Isolation and Profiling of Human Primary Mesenteric Arterial Endothelial Cells at the Transcriptome Level. J. Vis. Exp. (181), e63307, doi:10.3791/63307 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter