Summary
הפרוטוקול מתאר את הבידוד, התרבית והפרופיל של תאי האנדותל מהעורק המזנטרי האנושי. בנוסף, מסופקת שיטה להכנת העורק האנושי לתעתיק מרחבי. פרוטאומיקה, תעתיק ובדיקות תפקודיות יכולות להתבצע על תאים מבודדים. פרוטוקול זה יכול להיות repurposed עבור כל עורק בגודל בינוני או גדול.
Abstract
תאי אנדותל (ECs) חיוניים לתפקוד כלי הדם והגוף כולו באמצעות התגובה הדינמית שלהם לרמזים סביבתיים. הבהרת השעתוק והאפיגנום של ECs היא בעלת חשיבות עליונה להבנת תפקידם בהתפתחות, בבריאות ובמחלות, אך היא מוגבלת בזמינותם של תאים ראשוניים מבודדים. הטכנולוגיות האחרונות אפשרו פרופיל בתפוקה גבוהה של תעתיק EC ואפיגנום, מה שהוביל לזיהוי תת-אוכלוסיות של תאי EC שלא היו ידועים קודם לכן ומסלולי התפתחות. בעוד שתרביות EC הן כלי שימושי בחקר תפקוד EC וחוסר תפקוד לקוי, תנאי התרבית והקטעים המרובים יכולים להציג משתנים חיצוניים המשנים את התכונות של EC ילידי, כולל מורפולוגיה, מצב אפיגנטי ותוכנית ביטוי גנים. כדי להתגבר על מגבלה זו, המאמר הנוכחי מדגים שיטה לבידוד ECs ראשוניים אנושיים מעורקים מזנטריים של תורמים שמטרתם ללכוד את מצב מולדתם. ECs בשכבה האינטימית מנותקים מכנית וביוכימית עם שימוש באנזימים מסוימים. התאים המתקבלים יכולים לשמש ישירות לריצוף RNA בתפזורת או לריצוף RNA חד-תאי או מצופה לתרבית. בנוסף, מתוארת זרימת עבודה להכנת רקמת עורקים אנושית עבור תעתיק מרחבי, במיוחד עבור פלטפורמה זמינה מסחרית, אם כי שיטה זו מתאימה גם לטכניקות אחרות של פרופיל תעתיק מרחבי. ניתן ליישם מתודולוגיה זו על כלי שיט שונים שנאספו ממגוון תורמים במצבי בריאות או מחלות כדי לקבל תובנות לגבי ויסות שעתוק ואפיגנטי של EC, היבט מרכזי בביולוגיה של תאי האנדותל.
Introduction
תאי האנדותל (ECs) הם מווסתים חיוניים של טונוס כלי הדם ושל זלוף הרקמות. ECs הם יוצאי דופן ביכולתם להגיב לסביבה החוץ-תאית ולהסתגל לשינויים בדינמיקה ובהרכב של זרימת הדם. תגובות דינמיות אלה מתווכות באמצעות רשת של אירועי איתות תוך-תאיים, כולל אפנון שעתוק ופוסט-שעתוק עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית. חוסר הוויסות של תגובות אלה מעורב בפתולוגיות רבות, כולל אך לא מוגבל למחלות לב וכלי דם, סוכרת וסרטן 1,2.
חלק גדול מהמחקרים עושים שימוש בקווי תאים או במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את תעתיק ה-EC. הראשון הוא כלי שימושי, בהתחשב בקלות השימוש היחסית ובזולות. עם זאת, התרבות הסדרתית יכולה להכניס שינויים פנוטיפיים ל-ECs, כגון תכונות פיברובלסטיות וחוסר קיטוב, ולנתק אותן ממצב ה-in vivo 3 שלהן. התאים הראשוניים, למשל, EC של וריד טבור אנושי (HUVEC) היו בחירה פופולרית מאז שנות ה-80 של המאה ה-20, אך הם נגזרים ממצע כלי דם התפתחותי שאינו קיים אצל מבוגרים, ולכן לא סביר שייצגו באופן מלא ECs בוגרים. בעלי חיים, במיוחד מודלים של עכברים, מייצגים טוב יותר את הסביבה הפיזיולוגית או הפתופיזיולוגית של ECs ומאפשרים חקירה של תעתיקים כתוצאה מהפרעה גנטית. ניתן לבודד את ה-ECs של מורין מרקמות שונות, כולל אבי העורקים, הריאות ורקמות השומן באמצעות הליכים מבוססי אנזימים 4,5,6,7. עם זאת, לא ניתן להשתמש בתאים המבודדים עבור מעברים מרובים אלא אם כן הם מומרים6 ולעתים קרובות הם מוגבלים במספרם, מה שדורש איגום מבעלי חיים מרובים 5,8,9.
הופעתן של טכנולוגיות חדשות החוקרות את ארכיטקטורת כלי השיט ברמה תעתיקית, במיוחד עם רזולוציה של תא יחיד, אפשרה עידן חדש של ביולוגיה אנדותל על ידי חשיפת פונקציות ותכונות חדשניות של ECs 5,10,11,12,13,14. משאב עשיר שנבנה על ידי חוקרי טאבולה מוריס אסף פרופילי תעתיק חד-תאיים של 100,000 תאים, כולל ECs על פני 20 איברי מורין שונים15, אשר חשפו הן גנים נפוצים של סמן EC והן חתימות תעתיק ייחודיות עם הבדלים בין רקמותותוך-רקמה 5,13. עם זאת, ישנם הבדלים ברורים בין עכבר לאדם בגנום, באפיגנום ובשעתוק, במיוחד באזורים שאינם מקודדים 16,17,18. חסרונות אלה הנ"ל מדגישים את החשיבות של ניתוח של ECs באמצעות דגימות אנושיות על מנת לקבל פרופיל נאמן של ECs במדינת מולדתם בבריאות ומחלות.
רוב שיטות הבידוד של EC מסתמכות על דיסוציאציה פיזית באמצעות הומוגניזציה, חיתוך דק וטחינה של הרקמה לפני הדגירה עם אנזימים פרוטאוליטיים לזמנים שונים. האנזימים והתנאים גם משתנים במידה ניכרת בין סוגי הרקמות, מטריפסין ועד קולגן, המשמשים לבדם או בשילוב 19,20,21. העשרה או טיהור נוספים מבוססי נוגדנים נכללים לעתים קרובות כדי להגביר את טוהר ה- ECs. בדרך כלל, נוגדנים נגד סמני ממברנה EC, למשל, CD144 ו- CD31 מצומדים לחרוזים מגנטיים ומוסיפים לתרחיף התא22,23. אסטרטגיה כזו יכולה להיות מותאמת באופן כללי לבידוד EC ממספר רקמות אנושיות ועכבריות, כולל הטכניקות שהוצגו בפרוטוקול זה.
במצבם המקורי, ECs מקיימים אינטראקציה עם סוגי תאים מרובים ועשויים להתקיים בנישות כלי דם שבהן קרבת התאים חיונית לתפקוד. בעוד שמחקרים של ריצוף RNA חד-תאי וחד-גרעיני (scRNA ו-snRNA-seq) היו בעלי חשיבות עליונה לפריצות הדרך האחרונות בתיאור ההטרוגניות של EC, תהליך הדיסוציאציה משבש את הקשר הרקמות ואת המגע בין התא לתא, שגם הם חשובים להבנת הביולוגיה של EC. פותח בשנת 2012 ונבחר לשיטת השנה בשנת 202024, פרופיל תעתיק מרחבי שימש לפרופיל ביטוי גנים גלובלי תוך שמירה על המאפיינים המרחביים ברקמות שונות כולל מוח25, גידול26 ורקמת שומן27. ניתן למקד את הטכנולוגיות, תוך שימוש בגששים מיוחדים ספציפיים לרצפי RNA מסוימים המחוברים לריאגנטים של זיקה או לתגים פלואורסצנטיים, ובכך לזהות גנים נבחרים ברזולוציה תת-תאית 28,29,30,31. הם יכולים גם להיות לא ממוקדים32,33, בדרך כלל באמצעות אוליגונוקלאוטידים בעלי ברקוד מרחבי כדי ללכוד רנ"א, אשר יחד מומרים ל-cDNA להכנת ספריית seq לאחר מכן ולכן יש להם את היתרון של הסקת ביטוי גנים של רקמות שלמות באופן בלתי משוחד. עם זאת, רזולוציה מרחבית אינה מושגת כיום ברמה תאית אחת עם טכנולוגיות זמינות מסחרית. ניתן להתגבר על כך במידה מסוימת באמצעות שילוב נתונים עם נתוני scRNA-seq, מה שבסופו של דבר מאפשר מיפוי של תעתיק חד-תאי בהקשר של רקמה מורכבת תוך שמירה על המידע המרחבי המקורי שלו34.
כאן, מתוארת זרימת עבודה לפרופיל תעתיק EC באמצעות עורק מזנטרי עליון אנושי, עורק היקפי ששימש לחקר הרחבת כלי דם, שיפוץ כלי דם, עקה חמצונית ודלקת 35,36,37. שתי טכניקות מתוארות: 1) לבודד ולהעשיר ECs מן האינטימה של כלי הדם המשלבים דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי המתאים לריצוף תעתיק של תאים בודדים או לתרבית מבחנה שלאחר מכן; 2) להכין מקטעי עורקים ליצירת פרופיל תעתיק מרחבי (איור 1). ניתן לבצע את שתי הטכניקות הללו באופן עצמאי או משלים לפרופיל ECs ולתאים הסובבים אותם. יתר על כן, ניתן להתאים זרימת עבודה זו לשימוש בכל עורק בינוני או גדול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקרי רקמות אנושיות נערכו על דגימות לא מזוהמות שהתקבלו ממרכז משאבי התאים של האיים של דרום קליפורניה בעיר התקווה. ההסכמות המחקריות לשימוש ברקמות אנושיות לאחר המוות התקבלו מקרובי משפחתם של התורמים, ואישור אתי למחקר זה ניתן על ידי מועצת הביקורת המוסדית של עיר התקווה (IRB No. 01046).
1. דיסוציאציה פיזית (זמן משוער: 1-2 שעות)
- מניחים עורק טרי על תבשיל בקוטר 10 ס"מ ושוטפים עם מלח סטרילי של Dulbecco עם מאגר פוספט (D-PBS).
- עם מלקחיים סטריליים ומספריים דיסקציה, להסיר את השומן ואת רקמות החיבור החיצוניות עד הכלי נקי. מדוד את אורך הכלי עם סרגל המוצב מחוץ לצלחת וצלם תמונות לתיעוד (איור 1A).
- חיץ עיכול מתאים מראש ל-37 מעלות צלזיוס: עבור scRNA-seq השתמשו באנזים דיסוציאציה של תאים; עבור מבחני תרביות תאים, השתמשו ב-1-6 מ"ג/מ"ל של קולגןאז D, 3 מ"ג/מ"ל של פרוטאז שמקורו בחיידקים, 100 mM של HEPES, 120 mM של NaCl, 50 mM של KCl, 5 mM של גלוקוז, עם 1 mM של CaCl2 6,38 (pH 7.0, אינו דורש התאמה) שנוספו 5 דקות לפני השימוש.
- קח את העורק המזנטרי (בדרך כלל בקוטר של 6-8 מ"מ) וחתוך לאורך עם מספריים כדי לפתוח את לומן הכלי אנכית.
- באמצעות מחטים, חברו את הכלי לשעווה שחורה בכל ארבע הפינות, והשאירו את האינטימה חשופה (איור 1B).
- מוסיפים 1 מ"ל של מאגר עיכול שחומם מראש לאינטימה. קח אזמל סטרילי ולגרד את לומן של הכלי בעדינות פעמיים.
הערה: מטרת הליך זה היא לנתק את השכבה האינטימית, שעשויה להצריך תרגול. מספיק כוח צריך להיות מופעל כדי להסיר אנדותל, אבל לא כל כך הרבה כי שכבות עמוקות יותר של רקמה מוסרים גם, אשר יפחית את ייצוג EC. - מעבירים את חיץ העיכול לצינור של 5 מ"ל. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ עיכול לאינטימה ופיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי לאסוף את התאים הנותרים ולהוסיף לצינור 5 מ"ל. תאי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, מסתובבים ב-150 סל"ד למשך 5 דקות.
- הוסף 2 מ"ל של M199 בינוני (או D-PBS אם ממשיכים עם scRNA-seq) לתרחיף התא כדי להרוות את התגובה האנזימטית. מערבבים בעדינות וצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 600 x גרם למשך 5 דקות.
- הסר את הסופרנטנט ואחסן את הסופרנאטנט בנפרד לתרבית כבקרה כדי לבחון אם כל התאים נלכדים בכדור בשלב 1.8. בצעו החייאה של כדור התא ב-1 מ"ל של מדיום M199 (או D-PBS אם ממשיכים עם scRNA-seq).
- הערך את כדאיות התא על-ידי ערבוב של 10 μL של כחול טריפאן עם 10 μL של מלאי התאים. שימו לב למורפולוגיה של התאים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.
הערה: בשלב זה, ניתן להשתמש בתאים לכימות חלבונים או RNA או בתרבית במבחנה באמצעות מדיה של תרבית EC בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים39. לחלופין, ניתן להכין אותם לריצוף כמתואר בסעיף הבא. - עבור התרבות, מצפים שתי בארות של צלחת של 6 בארות על ידי צנרת 500 μL של מגיב חיבור לתוך בארות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת ריאגנט חיבור ושטיפה עם D-PBS סטרילי, מחלקים את מלאי התאים המלא לבאר אחת, והסופרנטנט נשמר כבקרה לתוך הבאר השנייה.
2. הכנה למחקרי scRNA-seq (זמן משוער: 3-4 שעות)
- צנטריפוגה מלאי התאים משלב 1.11 ב 4 °C ,600 x g במשך 5 דקות. מוציאים את הסופרנטנט ומחזירים את הכדור בעדינות עם פיפטה P1000 וטיפ רחב ב-1 מ"ל של 0.04% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-D-PBS. ערבבו היטב כדי להבטיח השעיה חד-תאית.
- מעבירים את התמיסה דרך מסננת של 40 מיקרומטר כדי להסיר את פסולת התאים. אם נשארת פסולת, עברו דרך מסננת שנייה ל-4 מ"ל של 0.04% BSA ב-D-PBS.
- צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 600 x גרם למשך 5 דקות. הסר את ה-supernatant והחזיר את הכדור ב-500 μL של 0.04% BSA ב-D-PBS באמצעות פיפטה P1000 עם קצה פיפטה רחב-נשא. ערבבו היטב כדי להבטיח השעיה חד-תאית.
- הערך את הכדאיות של התא על-ידי ערבוב של 10 μL של מלאי התאים עם 10 μL של טריפאן כחול. באמצעות המוציטומטר, שימו לב למורפולוגיה, קבעו אם יש תרחיף חד-תאי ללא אשכולות, בדקו אם יש פסולת רקמה, וחשבו את מספר התאים החיים והמתים.
- אם התאים מקובצים או נשארת פסולת, יש לחזור על שטיפה עם 0.04% BSA ב-D-PBS או לעבור שוב דרך מסננת של 40 מיקרומטר.
הערה: אמנם זה יפחית את התפוקה, אך חשוב שהתאים יתקיימו בתרחיף נקי של תא יחיד לריצוף אופטימלי. - ההשעיה החד-תאית יכולה לשמש ל-scRNA-seq.
3. פרופיל תעתיק מרחבי (זמן משוער: 3-4 שעות)
- מוסיפים איזופנטן (2-מתילבוטאן) למכל מתכת וצוננים בחנקן נוזלי (LN2) או בקרח יבש (LN2 עדיף מכיוון שהוא יביא את הטמפרטורה נמוכה יותר מקרח יבש). יוצקים תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) בבארות של קריומולדות פלסטיק מסומנות תוך הקפדה לא ליצור בועות ולהסיר את אלה המופיעות. השאירו את הקריומלד על קרח יבש כדי להצטנן.
- חותכים לפחות שני חלקים קורונליים, 1 ס"מ אורך הכלי. באמצעות מלקחיים ארוכים (12 אינץ') מטביעים את הרקמה באיזופנטן עד להקפאה. הטביע במהירות את הרקמה ב- OCT בכיוון עם הלומן הנראה במרכז. הקפידו להסיר בועות, במיוחד אלה שליד הרקמה.
- באמצעות מלקחיים ארוכים (12 אינץ'), תפסו את הקרימולדים והצמידו אותם למכל המתכת. בעוד הבסיס של תבניות צריך להיות בנוזל, זה לא צריך להיות עמוק מדי כדי לאפשר איזופנטן לרוץ על הרקמה. שימו לב להקפאה, ה-OCT יהפוך ללבן בהדרגה מבחוץ תוך 1-2 דקות.
- אחסן חלקים אלה במיכל אטום בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) למשך עד 6 חודשים.
הערה: שמרו דגימות על קרח יבש בכל עת ואל תאפשרו יותר ממחזור הפשרה אחד של הקפאה. רקמה זו יכולה לשמש לניתוח היסטולוגי, פלואורסצנציה של RNA/DNA בהכלאה באתרה (FISH), או תעתיק מרחבי, שיתואר כעת. - הגדר את טמפרטורת הקריוסטט ל -20 מעלות צלזיוס עבור החדר ו -10 מעלות צלזיוס עבור ראש הדגימה. שיווי משקל OCT משובץ קטעי כלי שיט, סכינים, מברשות, ומגלשות ל -20 מעלות צלזיוס בקריוסטאט למשך כ -30 דקות. תוך כדי שיווי משקל, נקו את המכונה ואת כל הציוד שעשוי לגעת בחלקים, כולל הלהב, עם 70% אתנול ואחריו תמיסת RNase deontamination.
- חברו את הדגימה על ידי חלוקת כמות קטנה של OCT על בלוק ה-cryostat העגול והנחת הדגימה למעלה לפני שהיא קופאת. מניחים את הבלוק במרכז ראש הדגימה ומבריגים את הבלוק במקומו באמצעות ידית שחורה גבוהה משמאל. חתכו כל עודף OCT המקיף את כלי השיט.
- הגדרת עובי החיתוך ל-10 מיקרומטר על הקריוסטט, חותכים כ-60 חלקים ומניחים אותם בצינור מקורר מראש של 1.5 מ"ל. סעיפים אלה ישמשו להערכת איכות הרנ"א. עם הסרת הקריוסטט, יש להוסיף מיד 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA ומערבולת עד שהקטעים מומסים לחלוטין.
- מוסיפים 200 μL של כלורופורם ומערבבים עד שהתמיסה דומה למילקשייק תות. צנטריפוגה ב 11,200 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
- אספו את הפאזה המימית (פאזה שקופה על גבי שכבות לבנות וורודות) והוסיפו לה 500 μL של איזופרופנול. מערבבים על ידי היפוך הצינורות מעל 10 פעמים ומניחים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות.
- צנטריפוגה ב 11,200 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F). ממיסים את גלולת ה-RNA המטוהרת ב-5 μL של מים נטולי RNase. בדוק את מספר שלמות הרנ"א (RIN).
הערה: דוגמאות עם RIN ≥ 7 עדיפות, אך RIN ≥ 6 מקובל. מספר חלקי הרקמה ונפח התמיסה להמסת RNA עשויים לדרוש אופטימיזציה בהתאם למערכת המשמשת כדי להבטיח שריכוז הרנ"א הסופי נמצא בטווח התפקוד של RIN כדי לאפשר הערכת RIN מדויקת. - תרגלו חיתוך והצבה של מקטעים בצורה נכונה בתוך המסגרות הפידוקיאליות באמצעות שקופיות זכוכית רגילות לפני שתמשיכו לאופטימיזציה של רקמות זמינות מסחרית או לשקופיות ביטוי גנים. ניתן להשיג זאת על ידי ציור ריבועים של 6.5 מ"מ x 6.5 מ"מ על מגלשת זכוכית רגילה, קירור ל -20 מעלות צלזיוס בקריוסטאט, והצבת חלקים באזור לכידה זה.
- חותכים מקטעים של 10 מיקרומטר עם צלחת נגד גלגול במקום, הופכים ומשטיחים בזהירות על ידי נגיעה עדינה בקטע דרך ה-OCT שמסביב.
- באמצעות מברשות cryostat ללא RNase ממקמות את חלק הרקמה בתוך הריבוע, תוך שימוש רק ב- OCT שמסביב. יש להניח מיד אצבע אחת (בכפפות) על החלק האחורי של אזור הלכידה כדי להמיס את החלק אל המגלשה.
- לאחר שהקטע נדבק, הניחו את השקופית על ה-cryobar כדי לאפשר למקטע להקפיא. יש להיזהר כדי למנוע קיפול רקמות ורקמות מעל הקצוות המסומנים של המסגרת הפידוקיאלית. במידת הצורך, חתכו את הרקמה לחצאים או לרבעים לאורך הלומן באמצעות להב כדי לוודא שמקטע הכלי מתאים למסגרת של 6.5 מ"מ x 6.5 מ"מ.
- חותכים 10 מיקרומטר מקטעי רקמה לפי 3.12-3.14 לאופטימיזציה של רקמות או לשקופיות ביטוי גנים. העבר את המגלשה לדואר שקופיות המונח על קרח יבש. אחסן שקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות לפני שתמשיך עם פרוטוקולים מרחביים שפורסמו33,34.
4. ניתוח נתוני רצף (זמן משוער: עד שבוע אחד בהתאם להיכרות עם התוכנה)
הערה: לניתוח תעתיק מרחבי בלבד, דלג לשלב 4.8. נתוני scRNA-seq מעובדים באמצעות הצינור הסטנדרטי המותאם לתעתיק הייחוס האנושי hg38. חבילת R Seurat (v3.2.2) משמשת לניתוח נתוני scRNA-seq בעקבות הנחיותשפורסמו 40.
- מסננים באמצעות מדדי בקרת איכות מבוססים היטב: תאים נדירים עם מספר גבוה מאוד של גנים (פוטנציאליים מכפילים) ותאים עם אחוזי מיטוכונדריאליים גבוהים (תאים באיכות נמוכה או גוססים מציגים לעתים קרובות זיהום מיטוכונדריאלי) מוסרים.
- נרמל נתונים באמצעות "sctransform", שיטה לשיפור שילוב הדגימה בהשוואה לנורמליזציה של יומן. נתונים מנורמלים אלה משמשים להפחתת ממדיות ולאשכולות, בעוד שרמות ביטוי מנורמלות ביומן משמשות לניתוח המבוסס על רמות ביטוי גנים, כגון סיווג מסוג תאים41.
- בחר גנים של סמן לכל סוג תא, לדוגמה, מולקולת הידבקות של תאי אנדותל טסיות דם -1 (PECAM1) ופקטור פון וילברנד (VWF) עבור ECs, לומיקן (LUM) ופרוקולגן C-Endopeptidase משפר (PCOLCE) עבור פיברובלסטים, גן טרנסלוקציה של תאי B 1 (BTG1) ו - CD52 עבור מקרופאגים, C1QA ו- C1QB עבור מונוציטים, ושרשרת כבדה של מיוזין 11 (MYH11) ו transgelin (TAGLN) עבור תאי שריר חלקים של כלי הדם36.
- חישב את רמת הביטוי הממוצעת על פני תאים בודדים בין כל זוג סמנים כדי שיהיה סמן יחיד עם רמת ביטוי ממוצעת המשויכת לכל סוג תא42.
- החל מודל תערובת גאוס (GMM) עם שני מרכיבים על נתוני הביטוי של כל סמן על פני תאים בודדים על מנת להפריד תאים לשתי קבוצות, כלומר, ביטוי גבוה של הסמן וביטוי נמוך של הסמן. בדרך זו, עבור כל סמן, כל תא בודד מוקצה לאחד משני הרכיבים42.
- השתמש בהעשרה סטטיסטית עבור קבוצת הגנים של הסמן, הבדיקה המדויקת של פישר, כדי להקצות סוג תא לכל אשכול. על ידי כך מתקבלת קבוצה של ערכי p לכל אשכול, שכל אחד מהם מתאים לסוג תא. סוג התא עם ערך ה-p הנמוך ביותר מוקצה לאשכול זה.
- לעבד את נתוני התמלול המרחבי באמצעות צינורות Space Ranger וכתוצאה מכך לנטרל את הברקוד המרחבי וליצור מדדי בקרת איכות (QC), כולל סך כל הקריאות המיושרות לתעתיק האנושי hg38, המספר החציוני של מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) או גנים לנקודה35.
הערה: חבילת R Seurat (v3.2.2) משמשת לניתוח הנתונים המעובדים על-ידי Space Ranger בהתאם להנחיותשפורסמו 40. - נרמל נתונים באמצעות "sctransform", שיטה אשר הוכחה כדי לשפר את הניתוח במורד הזרם בהשוואה לנורמליזציה של לוגים בהתחשב בהטרוגניות של הרקמה והשונות הגבוהה מאוד בספירה על פני הכתמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הניתוח של ECs מעורק מזנטרי באמצעות שילוב של דיסוציאציה מכנית ואנזימטית או שימור בהקפאה לשימוש במבחנים שונים במורד הזרם מתואר כאן (איור 1). ECs ניתן פרופיל בעורקים מזנטריים באמצעות השלבים הבאים: A) דיסוציאציה מכנית מן האינטימה יחד עם עיכול קולגן לתאי תרבית; ב) יצירת תרחיף חד-תאי ל-scRNA-seq; או C) חתכי רוחב של העורק יכולים להיות מוטמעים ב-OCT כדי שיהיו מכוונים לפרופיל של תעתיק מרחבי (איור 1 ואיור 2).
איור 1: עיבוד רקמת עורקים ופרופיל מרחבי. (ב) כלי שיט שנחתך כדי לחשוף את האינטימה. (C) המטוקסילין ואוסין (H&E) צביעה של חתך עורק מזנטרי במסגרת הפידוקיאלית. התמונה צולמה באמצעות עדשת 5x תחת מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי רחב-שדה. (D) קובץ פלט של ריינג'ר חלל מייצג של ביטוי גנים כולל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: סקירה כללית של טכניקות בידוד ופרופילים של EC. דיאגרמת זרימה המציגה שיטות שונות לעיבוד עורק מזנטרי. טכניקות עיבוד גורמות לתרחיפי תאים המתאימים ל-RNA-seq חד-תאי (sc), לתרבית תאי אנדותל (EC) או לרקמה שלמה המוטבעת בתרכובת אופטימלית של טמפרטורת חיתוך (OCT) ליצירת פרופיל תעתיק מרחבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
ECs מבודדים שעברו תרבית באמצעות הפרוטוקול המתואר מציגים מורפולוגיה ייחודית דמוית אבן מרוצפת עם תאים מזהמים מינימליים (איור 3A). ביטוי של סמן EC של אנדותל כלי דם (VE)-Cadherin אושר באמצעות אימונופלואורסצנציה המדמיינת צמתים של תאים-תאיים (איור 3B). ECs מבודדים היו נתונים לניתוח ציטומטריה של זרימה עבור CD31. כבקרות שליליות, HUVECs לא מוכתמים (ללא נוגדנים) הפיקו אות של 1.1% ו-HUVECs שהודגמו עם IgG הניבו אות של 0.8%. כבקרה חיובית, HUVECs מוכתמים בנוגדן CD31 הראו טוהר של 99% ושימשו לשער את התעלות עבור תאי אנדותל עורקיים מזנטריים אנושיים (HMAECs). כ-80% מהתאים היו חיוביים ל-CD31, מה שמצביע על כך ש-HMAECs היוו את רוב אוכלוסיית התאים שבודדו זה עתה (איור 3C). בידודים לא מוצלחים, באמצעות גירוד קשה/עמוק מדי, זריעת התאים בצפיפות נמוכה מדי, או שמירה על תרבית מעבר למעבר 3 גורמים לתאים עם מורפולוגיה מופרעת, שעשויים לבטא סמנים מזנכימליים (αSMA) או התארכות הדומה למצב פיברובלסטי (איור 3D).
איור 3: אימות של ECs עורקים מזנטריים מתורבתים מבודדים בתרבית. (A) תמונת ברייטפילד של ECs מבודדים, עדשת 10x, סרגל קנה מידה = 50 μm. (B) אימונופלואורסצנציה של ביטוי VE-Cadherin עם 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) כסמן גרעיני. התמונה צולמה באמצעות עדשת 10x תחת מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי רחב שדה. תמונה מייצגת מציגה לוקליזציה של VE-Cadherin. סרגל קנה מידה = 50 μm. (C) חלקות FACS של HUVEC לא מוכתם (משמאל למעלה), HUVEC מוכתם בבקרת IgG (מימין למעלה), HUVEC מוכתם ב- CD31 (למטה משמאל), ותאי האנדותל המזנטריים האנושיים המבודדים (HMAEC) המוכתמים ב- CD31 (מימין למטה) (D) תמונות אימונופלואורסצנטיות של HMAECs עם DAPI (סמן גרעיני), אקטין שריר אלפא-חלק (αSMA) ו- CD31. עדשת 40x, סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ECs שבודדו באמצעות אנזים דיסוציאציה של תאים עברו scRNA-seq. איור 4A מראה קירוב והקרנה של סעפות אחידות מייצגות (UMAP) שבודדו מעורק מזנטרי באמצעות הפרוטוקול הנוכחי של scRNA-seq על HMAECs מבודדים, כאשר 34% מהתאים מקובצים כ-ECs באמצעות PECAM1 ו-VWF (איור 4B,C בהתאמה) כסמנים.
איור 4: scRNA-seq של ECs עורקיים מזנטריים. (A) קירוב סעפת אחידה והקרנה (UMAP) תרשים של נתוני scRNA-seq מעורק מזנטרי. הקרנה דו-ממדית של הסעפת במרחב ממדי גבוה, כאשר כל נקודה מייצגת תא יחיד והקרבה לנקודות אחרות מצביעה על מידת הדמיון של השעתוק זה לזה. תאים מקודדים בצבעים לפי סוגי התאים שלהם. (B) ביטוי PECAM1 מוקרן על UMAP. (C) ביטוי VWF מוקרן על UMAP. פסי צבע מייצגים את הביטוי של רמות של גנים שבהם רמות הרנ"א מתוארות על-ידי ספירת מזהים מולקולריים ייחודיים מנורמלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
עבור זרימת עבודה של תעתיק מרחבי, RNA שחולץ מקטעי רקמות עבר אלקטרופוריה על ג'ל כדי לדמיין את איכות הרנ"א. אות חלש או היעדר רצועות RNA ריבוזומליות 18S ו-28S, ונוכחותם של תוצרי פירוק שנצפו באיור 5A, נתיב A1, היא דוגמה לרנ"א באיכות ירודה ואין לעבד אותה הלאה. דגימות עם ריכוז מחוץ לטווח עשויות להוביל ל-RIN נמוך יותר (איור 5A, נתיב B1). עם זאת, דילול הרנ"א פי שניים הגדיל את ה-RIN המספיק להמשך (איור 5A, נתיב C1). לפני קביעת ביטוי הגנים, בוצעה אופטימיזציה של רקמות כדי לקבוע את זמן החדירה האופטימלי לשחרור RNA שייתפס על ידי האוליגונוקלאוטידים בשקופית ביטוי הגנים (איור 5B). בהתבסס על הדמיה פלואורסצנטית של טביעת רגל דנ"א משלימה (cDNA), חדירה של 18 דקות הפיקה את הרקע הנמוך ביותר אך האות החזק ביותר, ולכן נבחרה להיות משך הזמן האופטימלי. ההמטוקסילין והכתם של eosin (H&E) הדגימו את המורפולוגיה של הכלי המאפשרת לזהות אזורי עניין (איור 5C). איכות הספרייה הוערכה (איור 5D) ונקבע כי היא מתאימה לריצוף. UMI סופר לכל נקודה, מספר הקריאות לכל נקודה, וסך הגנים הם מדדי איכות המיוצרים על ידי צינור Space Ranger, השונות של כל אחד מהם מוצגת באיור 5E. לבסוף, ביטוי גנים (תוך שימוש ב-Actin alpha-2 (ACTA2) כדוגמה, איור 5F) הודגם באמצעות עיגון מרחבי על הכלי המוכתם H&E.
איור 5: זרימת עבודה תעתיקית מרחבית ותוצאות מייצגות (A) הערכת איכות של רנ"א שחולץ משתי דגימות של עורק מזנטרי, A1 מדגימה אחת, B1 מהדגימה השנייה, C1 מדולל 2x מ-B1. חיצים אדומים מציינים רצועות ריבוזומליות 28S ו-18S. (B) זרימת עבודה של אופטימיזציה מרחבית של רקמות (TO). (C) שקופיות ביטוי גנים (GEX) המציגות את חלקי הרקמה (לוח שמאלי); תמונות H&E של קטעי הרקמה הטעונים על שקופית GEX לפני חלחול במשך 18 דקות, תעתיק הפוך ובניית ספרייה (לוח ימני), סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (D) הערכת איכות של הספריות שהוכנו. (E) מדדי פלט של Space Ranger מראים טווחים בין קריאות ממוצעות, UMIs וגנים לכל נקודה עבור ספריות שונות. פסי שגיאה מציינים מינימום ומקסימום (F) ביטוי ACTA2 בכל מקטע כלי השיט. כל תמונות המיקרוסקופיה צולמו באמצעות מיקרוסקופ הפוך רחב-שדה, מתוך עדשת 5x, מודול אריחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זרימת העבודה המוצגת מפרטת סדרה של טכניקות ליצירת פרופיל של ECs מתוך פיסת עורק אנושי יחידה עם רזולוציה חד-תאית ומרחבית. ישנם מספר שלבים קריטיים וגורמים מגבילים בפרוטוקול. אחד המפתחות ליצירת פרופילי תעתיק הוא רעננות הרקמה ותקינות הרנ"א. חשוב לשמור על רקמות על קרח ככל האפשר לפני העיבוד כדי למזער את פירוק הרנ"א. בדרך כלל, הרקמות שלאחר המוות מעובדות בין 8-14 שעות לאחר זמן המוות. עם זאת, מומלץ להתחיל את הבידוד או את ההקפאה בהקדם האפשרי לאחר החילוץ מהתורמים. במיוחד לצורך מיפוי תעתיק מרחבי, יש לשמור את הרקמה על קרח יבש ולא לאפשר יותר ממחזור הפשרה אחד של הקפאה. יש להטמיע יותר מחתך כלי שיט אחד ב- OCT, כדי לאפשר חזרות במידת הצורך. כמו כן, יש לעשות מאמצים לקדם סביבה נטולת RNase במהלך עיבוד רקמות ובידוד תאים. שנית, גודל הכלים יכול להיות גורם מגביל. עבור תעתיק מרחבי, ניתן לבצע את הפרוטוקול על 1 מ"מ של הכלי בסך הכל, ללא קשר לקוטר. עבור פרוטוקול הדיסוציאציה של תרבית תאים ו-scRNA-seq, הגבול התחתון יהיה אם הכלי צר מדי (כלומר, מתחת לקוטר של 1 מ"מ) כדי לאפשר החדרה של מספריים דיסקציה. בהתבסס על עקרונות אלה, ניתן להתאים את פרוטוקול הדיסוציאציה לכל עורק או וריד בגודל בינוני או גדול יותר, כל עוד גודל כלי השיט מאפשר את הפתיחה, וניתן ליישם את הליך השעתוק המרחבי על כל כלי שיכול להתאים באופן מלא או חלקי למסגרת הפידוקיאלית.
כדי לעבד רקמות לניתוח שעתוק של תא יחיד, מספר קבוצות תיארו את השימוש בליבראז ובאלסטאז כדי להשיג את כל אוכלוסיות התאים בתוך דופן הכלי 9,43,44. עם זאת, מערכי הנתונים המתקבלים מכילים בממוצע רק 3-7% מכלל אוכלוסיית התאים המבוארת כ-ECs 9,45. אחת הדרכים לשפר את ייצוג ה- EC המוגבל בנתוני scRNA-seq היא על ידי העשרת שבר ה- EC על ידי מינוף סמני פני השטח של EC באמצעות FACS44,46. עם זאת, זה בדרך כלל דורש כמויות גדולות של רקמת התחלה וציוד יקר כי לא יכול להיות זמין באופן שגרתי עבור כל המעבדות. פרוטוקול זה מנצל את המיקום האנטומי הייחודי של ECs, viz. בעיקר בשכבה האינטימית, המאפשרת העשרה של ECs ללא צורך בעיכול רקמות קשה ומשפרת את כדאיות התאים עבור scRNA-seq או תרבית שלאחר מכן. ניתן להגדיל את אחוז ה-ECs בתערובת התאים הסופית עבור scRNA-seq על ידי הוספת שלב באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדים בנוגדנים VE-Cadherin/CD144. עם זאת, ייתכן ששלב זה לא יכלול את כל התאים האחרים המקיימים אינטראקציה עם ECs עקב האינטראקציה בין התא לתא המקורי. עם זאת, למרות שבאופן מסורתי סוגי התאים האחרים (למשל, מקרופאגים, תאי שריר חלקים ופיברובלסטים) ייחשבו כ"זיהום" בבידוד EC, הם יכולים לספק מידע שימושי לאינטראקציות בין תאים לתאים בהקשר הרקמה. בניתוח הנתונים של scRNA-seq, ניתן לבאר ביעילות ECs באמצעות סמני EC וניתן להסיק את האינטראקציות בין התא לתאים באופן ביואינפורמטי באמצעות מספר שיטות ביואינפורמטיקה פופולריות (למשל, CellChat47, CellphoneDB48, CytoTalk49 בין היתר). יתר על כן, הכללתם של נתונים אלה יכולה לאפשר אינטגרציה יעילה יותר של נתוני פרופיל השעתוק המרחבי, שאינם נמצאים ברזולוציה של תא יחיד (ראה להלן)34.
עבור תעתיק מרחבי, אין כיום תקן זהב להכנת רקמות כלשהן לטכניקה זו ומחקר מוגבל בהכנת כלי דם, כאשר רוב המחקרים שפורסמו השתמשו ברקמות של בעלי חיים50,51. הטכניקה דורשת שקופיות זמינות מסחרית עם מסגרות fudicial מיוחדות עם אזור לכידה המכיל כ -5,000 כתמים ברקודים בקוטר של 55 מיקרומטר. הכתמים ממוקמים במרחק של 100 מיקרומטרים ממרכז הנקודה לנקודות סמוכות, מה שמשאיר מרווחים של כ-45 מיקרומטר בין כתמים שלא יתווספו לפרופיל, מה שמגביל את הרזולוציה. יתר על כן, נקודה אחת תכיל מספר תאים, מכיוון שרוב התאים נמצאים מתחת ל-55 מיקרומטר בשטח. לכן, כאמור, לא מדובר בטכניקת ריצוף חד-תאית. עם זאת, על ידי שילוב הנתונים עם scRNA-seq, ניתן לשפר את הרזולוציה, וניתן לגלות את ההטרוגניות בתוך נקודה34. למרות שהפרוטוקול הנוכחי מתמקד בבדיקת פרופיל תעתיק מרחבית אחת, ניתן להתאים טכניקה זו לשיטות פרופיל מרחביות מתפתחות אחרות52,53 מכיוון שאיכות החלבון והרנ"א נשמרת בהליך זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ש.ז. הוא מייסד וחבר מועצת המנהלים של Genemo, Inc.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (ל- Z.B.C.); DP1DK126138 ו- DP1HD087990 (ל- S.Z.); מענק של קרן אלה פיצג'רלד ופרויקט משפחת וונק (ל-Z.B.C.); ומענק רשת זרעים של אטלס תאים אנושיים (ל-Z.B.C. ול-S.Z.). המחקר שדווח בפרסום זה כלל עבודה שבוצעה בליבת הגנומיקה האינטגרטיבית בעיר התקווה הנתמכת על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר הפרס P30CA033572. המחברים רוצים להודות לד"ר איסמעיל אל-עבדאללה ולד"ר מריגנג צ'י מצוות השתלת האיים ב-City of Hope לבידוד רקמות אנושיות, לד"ר דונגצ'יאנג יואן ב-City of Hope על עזרתו בניתוח scRNA-seq, ולד"ר מארק הלושקה מהמחלקה לפתולוגיה של הלב וכלי הדם, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס על תובנותיו שלא יסולאו בפז על היסטולוגיה של כלי הדם.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
- Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
- Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
- Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
- Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Stuart, T., Satija, R.
- Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
- Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
- The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
- Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
- Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
- Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
- McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
- Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
- Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
- Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
- Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
- Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
- Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
- Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
- Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
- Stuart, T., et al.
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
- Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
- Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
- Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
- Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
- van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
- Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
- Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
- Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Moffit, J. R., et al.
