Summary
Het protocol beschrijft de isolatie, cultuur en profilering van endotheelcellen uit de menselijke mesenteriale slagader. Daarnaast wordt een methode aangeboden om de menselijke slagader voor te bereiden op ruimtelijke transcriptomics. Proteomics, transcriptomics en functionele assays kunnen worden uitgevoerd op geïsoleerde cellen. Dit protocol kan worden hergebruikt voor elke middelgrote of grote slagader.
Abstract
Endotheelcellen (EC's) zijn cruciaal voor de vasculaire en lichaamsfunctie door hun dynamische reactie op omgevingssignalen. Het ophelderen van het transcriptoom en epigenoom van EC's is van het grootste belang om hun rol in ontwikkeling, gezondheid en ziekte te begrijpen, maar is beperkt in de beschikbaarheid van geïsoleerde primaire cellen. Recente technologieën hebben de high-throughput profilering van EC-transcriptoom en epigenoom mogelijk gemaakt, wat heeft geleid tot de identificatie van voorheen onbekende EC-celsubpopulaties en ontwikkelingstrajecten. Hoewel EC-culturen een nuttig hulpmiddel zijn bij het verkennen van EC-functie en disfunctie, kunnen de kweekomstandigheden en meerdere passages externe variabelen introduceren die de eigenschappen van inheemse EC veranderen, waaronder morfologie, epigenetische toestand en genexpressieprogramma. Om deze beperking te overwinnen, demonstreert het huidige artikel een methode om menselijke primaire EC's te isoleren van donor mesenterische slagaders met als doel hun oorspronkelijke toestand vast te leggen. EC's in de intimale laag worden mechanisch en biochemisch gedissocieerd met behulp van bepaalde enzymen. De resulterende cellen kunnen direct worden gebruikt voor bulk-RNA of eencellige RNA-sequencing of verguld voor kweek. Daarnaast wordt een workflow beschreven voor de voorbereiding van menselijk arterieel weefsel op ruimtelijke transcriptomics, specifiek voor een commercieel beschikbaar platform, hoewel deze methode ook geschikt is voor andere ruimtelijke transcriptoomprofileringstechnieken. Deze methodologie kan worden toegepast op verschillende vaten verzameld van een verscheidenheid aan donoren in gezondheids- of ziektetoestanden om inzicht te krijgen in EC transcriptionele en epigenetische regulatie, een cruciaal aspect van endotheelcelbiologie.
Introduction
Langs het lumen van bloedvaten zijn endotheelcellen (EC's) cruciale regulatoren van vasculaire tonus en weefselperfusie. EC's zijn opmerkelijk in hun vermogen om te reageren op de extracellulaire omgeving en zich aan te passen aan veranderingen in de dynamiek en samenstelling van de bloedstroom. Deze dynamische responsen worden gemedieerd door een netwerk van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen, waaronder transcriptionele en post-transcriptionele modulaties met spatio-temporele resolutie. De ontregeling van deze reacties is betrokken bij vele pathologieën, waaronder maar niet beperkt tot hart- en vaatziekten, diabetes en kanker 1,2.
Een groot deel van de studies maakt gebruik van cellijnen of diermodellen om EC-transcriptoom te ondervragen. De eerste is een handig hulpmiddel, gezien het relatieve gebruiksgemak en de goedkoopheid. Seriële kweek kan echter fenotypische veranderingen in EC's introduceren, zoals fibroblastische kenmerken en een gebrek aan polarisatie, waardoor ze worden losgekoppeld van hun in vivo toestand3. De primaire cellen, bijvoorbeeld human umbilical vein EC (HUVEC) zijn een populaire keuze sinds de jaren 1980, maar zijn afgeleid van een ontwikkelingsvasculair bed dat niet bestaat bij volwassenen, waardoor het onwaarschijnlijk is dat het volwassen EC's volledig vertegenwoordigt. Dieren, met name muismodellen, vertegenwoordigen beter de fysiologische of pathofysiologische omgeving van EC's en maken ondervraging van transcriptomen mogelijk als gevolg van genetische verstoring. Murine EC's kunnen worden geïsoleerd uit verschillende weefsels, waaronder de aorta, longen en vetweefsels met behulp van op enzymen gebaseerde procedures 4,5,6,7. De geïsoleerde cellen kunnen echter niet voor meerdere passages worden gebruikt, tenzij ze6 transformeren en zijn vaak beperkt in aantallen, wat pooling van meerdere dieren vereist 5,8,9.
De komst van nieuwe technologieën die de scheepsarchitectuur op transcriptomisch niveau verkennen, met name met eencellige resolutie, heeft een nieuw tijdperk van endotheelbiologie mogelijk gemaakt door nieuwe functies en eigenschappen van EC's 5,10,11,12,13,14 te onthullen. Een rijke bron gebouwd door Tabula Muris-onderzoekers verzamelde eencellige transcriptomische profielen van 100.000 cellen, waaronder EC's in 20 verschillende muizenorganen15, die zowel gemeenschappelijke EC-markergenen als unieke transcriptomische handtekeningen onthulden met inter- en intraweefselverschillen 5,13. Niettemin zijn er duidelijke verschillen tussen muis en mens in genoom, epigenoom en transcriptoom, vooral in de niet-coderende regio's 16,17,18. Deze bovengenoemde nadelen benadrukken het belang van analyse van EC's met behulp van menselijke monsters om een getrouw profiel te krijgen van EC's in hun oorspronkelijke staat in gezondheid en ziekte.
De meeste EC-isolatiemethoden zijn gebaseerd op fysieke dissociatie door homogenisatie, fijnsnijden en fijnsnijden van het weefsel vóór incubatie met proteolytische enzymen gedurende verschillende tijden. De enzymen en aandoeningen variëren ook aanzienlijk tussen weefseltypen, van trypsine tot collagenase, alleen of in combinatie gebruikt 19,20,21. Verdere op antilichamen gebaseerde verrijking of zuivering worden vaak opgenomen om de zuiverheid van EC's te vergroten. Doorgaans worden antilichamen tegen EC-membraanmarkers, bijvoorbeeld CD144 en CD31, geconjugeerd aan magnetische kralen en toegevoegd aan de celsuspensie22,23. Een dergelijke strategie kan in het algemeen worden aangepast voor EG-isolatie van meerdere menselijke en muizenweefsels, met inbegrip van de in dit protocol geïntroduceerde technieken.
In hun oorspronkelijke toestand interageren EC's met meerdere celtypen en kunnen ze bestaan in vasculaire niches waar celnabijheid cruciaal is voor de functie. Hoewel single-cell en single-nuclear RNA-sequencing (scRNA en snRNA-seq) studies van het grootste belang zijn geweest voor de recente doorbraken in het beschrijven van EC-heterogeniteit, verstoort het dissociatieproces weefselcontext en cel-celcontact, die ook belangrijk zijn om de EC-biologie te begrijpen. Ontwikkeld in 2012 en uitgeroepen tot Methode van het Jaar in 202024, is ruimtelijke transcriptoomprofilering gebruikt om wereldwijde genexpressie te profileren met behoud van de ruimtelijke kenmerken in verschillende weefsels, waaronder hersenen25, tumor26 en vetweefsel27. De technologieën kunnen worden gericht, met behulp van gespecialiseerde sondes die specifiek zijn voor bepaalde RNA-sequenties die zijn bevestigd aan affiniteitsreagentia of fluorescerende tags, waardoor geselecteerde genen met subcellulaire resolutie 28,29,30,31 worden gedetecteerd. Ze kunnen ook ongericht zijn32,33, meestal met behulp van ruimtelijk barcoded oligonucleotiden om RNA te vangen, die samen worden omgezet in cDNA voor latere seq-bibliotheekvoorbereiding en dus het voordeel hebben dat ze de genexpressie van het hele weefsel op een onbevooroordeelde manier afleiden. Ruimtelijke resolutie wordt momenteel echter niet bereikt op een enkel cellulair niveau met commercieel beschikbare technologieën. Dit kan tot op zekere hoogte worden ondervangen met data-integratie met scRNA-seq-gegevens, waardoor uiteindelijk het in kaart brengen van eencellig transcriptoom in een complexe weefselcontext mogelijk is met behoud van de oorspronkelijke ruimtelijke informatie34.
Hierin wordt een workflow beschreven om EC-transcriptoom te profileren met behulp van menselijke superieure mesenteriale slagader, een perifere slagader die is gebruikt om vaatverwijding, vasculaire remodellering, oxidatieve stress en ontsteking te bestuderen 35,36,37. Twee technieken worden beschreven: 1) om EC's te isoleren en te verrijken uit de intima van bloedvaten die mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering combineren, geschikt voor eencellige transcriptoomsequencing of daaropvolgende in vitro cultuur; 2) het voorbereiden van arteriële secties voor ruimtelijke transcriptoomprofilering (figuur 1). Deze twee technieken kunnen onafhankelijk of complementair worden uitgevoerd om EC's en hun omliggende cellen te profileren. Bovendien kan deze workflow worden aangepast voor gebruik op elke middelgrote of grote slagader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke weefselstudies werden uitgevoerd op gedeïdentificeerde exemplaren verkregen van het Southern California Islet Cell Resource Center in City of Hope. De onderzoekstoestemmingen voor het gebruik van postmortale menselijke weefsels werden verkregen van de nabestaanden van de donoren en ethische goedkeuring voor deze studie werd verleend door de Institutional Review Board of City of Hope (IRB nr. 01046).
1. Fysieke dissociatie (geschatte tijd: 1-2 uur)
- Plaats een verse slagader op een schaal van 10 cm en was met steriele Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS).
- Verwijder met een steriele tang en dissectieschaar het vet en de buitenste bindweefsels totdat het vat schoon is. Meet de lengte van het vat met een liniaal buiten de schaal en maak foto's voor de registratie (figuur 1A).
- Geschikte verteringsbuffer voorverwarmen tot 37 °C: voor scRNA-seq celdissociatie-enzym gebruiken; gebruik voor celkweektests 1-6 mg /ml Collagenase D, 3 mg / ml van bacteriën afgeleid protease, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM glucose, met 1 mM CaCl2 6,38 (pH 7,0, vereist geen aanpassing) toegevoegd 5 minuten voorafgaand aan gebruik.
- Neem de mesenteriale slagader (meestal met een diameter van 6-8 mm) en knip in de lengte met een schaar om het vat lumen verticaal te openen.
- Bevestig het vat met behulp van naalden op zwarte was op alle vier de hoeken, waardoor de intima bloot komt te liggen (figuur 1B).
- Voeg 1 ml voorverwarmde verteringsbuffer toe aan intima. Neem een steriel scalpel en schraap het lumen van het vat twee keer voorzichtig.
OPMERKING: Het doel van deze procedure is om de intimale laag te dissociëren, die mogelijk oefening nodig heeft. Er moet voldoende kracht worden uitgeoefend om endotheel te verwijderen, maar niet zozeer dat ook de diepere weefsellagen worden verwijderd, wat de EC-representatie zal verminderen. - Breng de verteringsbuffer over in een buis van 5 ml. Voeg 1 ml verteringsbuffer toe aan de intima en pipetteer voorzichtig op en neer om de resterende cellen te verzamelen en voeg toe aan de buis van 5 ml. Incubeer cellen bij 37 °C en draai gedurende 5 minuten bij 150 tpm.
- Voeg 2 ml M199 medium (of D-PBS als u verder gaat met scRNA-seq) toe aan de celsuspensie om de enzymatische reactie te doven. Meng voorzichtig en centrifugeer bij 4 °C, 600 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en bewaar het supernatant afzonderlijk in cultuur als controle om te observeren of alle cellen in stap 1.8 in de pellet zijn gevangen. Resuspend de celkorrel in 1 ml M199 medium (of D-PBS als u verder gaat met scRNA-seq).
- Beoordeel de levensvatbaarheid van de cel door 10 μL trypan blauw te mengen met 10 μL celvoorraad. Observeer de celmorfologie en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
OPMERKING: Op dit punt kunnen cellen worden gebruikt voor eiwit- of RNA-kwantificering of in vitro worden gekweekt met behulp van EC-kweekmedia volgens standaardprotocollen39. Als alternatief kunnen ze worden voorbereid voor sequencing zoals beschreven in de volgende sectie. - Voor de kweek, coat twee putten van een 6-well plaat door 500 μL bevestigingsreagens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in putten te pipetteren. Na verwijdering van het bevestigingsreagens en wassen met steriele D-PBS, doseer de volledige celvoorraad in één put en het supernatant wordt als controle in de tweede put gehouden.
2. Voorbereiding voor scRNA-seq studies (geschatte tijd: 3-4 h)
- Centrifugeer de celvoorraad vanaf stap 1.11 bij 4 °C, 600 x g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en vul de pellet voorzichtig opnieuw op met een P1000-pipet en een punt met brede boring in 1 ml 0,04% runderserumalbumine (BSA) in D-PBS. Meng goed om een eencellige suspensie te garanderen.
- Laat de oplossing door een zeef van 40 μm gaan om celresten te verwijderen. Als er vuil achterblijft, ga dan door een tweede zeef in 4 ml van 0,04% BSA in D-PBS.
- Centrifugeer bij 4 °C, 600 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 500 μL van 0,04% BSA in D-PBS met behulp van een P1000-pipet met een pipetpunt met brede boring. Meng goed om een eencellige suspensie te garanderen.
- Beoordeel de levensvatbaarheid van de cel door 10 μL celvoorraad te mengen met 10 μL trypan blauw. Met behulp van een hemocytometer, observeer de morfologie, bepaal of er een eencellige suspensie is zonder clusters, controleer op weefselresten en bereken het aantal levende en dode cellen.
- Als cellen geclusterd zijn of er vuil achterblijft, herhaal dan het wassen met 0,04% BSA in D-PBS of ga opnieuw door de zeef van 40 μm.
OPMERKING: Hoewel dit de opbrengst zal verminderen, is het belangrijk dat cellen in een schone eencellige suspensie bestaan voor optimale sequencing. - De eencellige suspensie kan worden gebruikt voor scRNA-seq.
3. Ruimtelijke transcriptoomprofilering (geschatte tijd: 3-4 uur)
- Voeg isopentaan (2-methylbutaan) toe aan een metalen bus en koel af in vloeibare stikstof (LN2) of droogijs (LN2 heeft de voorkeur omdat het de temperatuur lager zal brengen dan droogijs). Giet optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) in putten van gelabelde plastic cryomolden en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan en verwijder de bubbels die verschijnen. Laat cryomold op droogijs afkoelen.
- Snijd ten minste twee coronale secties, 1 cm lang van het vat. Gebruik een lange (12") tang om het weefsel onder te dompelen in isopentaan totdat het bevroren is. Dompel het weefsel snel onder in OCT bij oriëntatie met het lumen zichtbaar in het midden. Zorg ervoor dat u eventuele bubbels verwijdert, vooral die naast het weefsel.
- Gebruik een lange (12") tang, pak de cryomolden vast en houd ze in de metalen bus. Hoewel de basis van de mallen zich in de vloeistof moet bevinden, mag deze niet te diep zijn om isopentaan over het weefsel te laten lopen. Let op het bevriezen, de OCT zal geleidelijk wit worden van buitenaf in 1-2 min.
- Bewaar deze secties in een verzegelde container bij -80 °C gedurende maximaal 6 maanden.
OPMERKING: Bewaar te allen tijde monsters op droogijs en laat niet meer dan één vries-dooicyclus toe. Dit weefsel kan worden gebruikt voor histologische analyse, RNA / DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) of ruimtelijke transcriptomics, die nu zullen worden beschreven. - Stel de cryostaattemperatuur in op -20 °C voor de kamer en -10 °C voor de monsterkop. Equilibrate OCT ingebed vat secties, messen, borstels, en glijden tot -20 °C in de cryostaat gedurende ongeveer 30 minuten. Reinig tijdens het balanceren de machine en alle apparatuur die de secties kan raken, inclusief het mes, met 70% ethanol gevolgd door RNase-decontaminatieoplossing.
- Bevestig het monster door een kleine hoeveelheid OCT op het cirkelvormige cryostaatblok te doseren en het monster erop te plaatsen voordat het bevriest. Plaats het blok in het midden van de monsterkop en schroef het blok op zijn plaats met een hoge zwarte handgreep aan de linkerkant. Snijd overtollige OCT rond het schip weg.
- Stel de snijdikte in op 10 μm op de cryostaat, snijd ongeveer 60 secties en plaats ze in een voorgekoelde buis van 1,5 ml. Deze secties zullen worden gebruikt om de RNA-kwaliteit te beoordelen. Voeg bij verwijdering uit cryostaat onmiddellijk 1 ml RNA-extractiereagens en vortex toe totdat de secties volledig zijn opgelost.
- Voeg 200 μL chloroform toe en meng tot de oplossing lijkt op een aardbeienmilkshake. Centrifugeer bij 11.200 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
- Verzamel de waterige fase (heldere fase bovenop witte en roze lagen) en voeg er 500 μL isopropanol aan toe. Meng door de buizen meer dan 10 keer om te keren en plaats op -80 °C gedurende ten minste 20 minuten.
- Centrifugeer bij 11.200 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Los de gezuiverde RNA-pellet op in 5 μL RNase-vrij water. Onderzoek het RNA-integriteitsnummer (RIN).
OPMERKING: Monsters met RIN ≥ 7 hebben de voorkeur, maar RIN ≥ 6 is acceptabel. Het aantal weefselsecties en het volume van de oplossing voor het oplossen van RNA kan optimalisatie vereisen, afhankelijk van het systeem dat wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de uiteindelijke RNA-concentratie binnen het RIN-functiebereik ligt om een nauwkeurige RIN-evaluatie mogelijk te maken. - Oefen het op de juiste manier snijden en plaatsen van secties binnen de fiduciale frames met behulp van gewone glazen dia's voordat u doorgaat met commercieel beschikbare weefseloptimalisatie of genexpressiedia's. Dit kan worden bereikt door vierkanten van 6,5 mm x 6,5 mm op een gewone glasplaat te tekenen, af te koelen tot -20 °C in de cryostaat en secties in dit opvanggebied te plaatsen.
- Snijd 10 μm secties met anti-roll plaat op zijn plaats, draai en maak voorzichtig plat door het gedeelte zachtjes aan te raken door de omringende OCT.
- Met behulp van RNase-vrije cryostaatborstels plaatst u het weefselgedeelte in het vierkant, met alleen de omringende OCT. Plaats onmiddellijk één vinger (in handschoenen) op de achterkant van het vanggebied om het gedeelte naar de dia te smelten.
- Zodra de sectie is blijven plakken, plaatst u de schuif op de cryobar om de sectie te laten bevriezen. Er moet voor worden gezorgd dat weefsel niet vouwt en weefsel boven de afgebakende randen van het fiduciale frame ligt. Snijd indien nodig het weefsel in helften of kwarten langs het lumen met behulp van een mes om ervoor te zorgen dat het vatgedeelte binnen het frame van 6,5 mm x 6,5 mm past.
- Snijd 10 μm secties van weefsel volgens 3.12-3.14 op weefseloptimalisatie of genexpressiedia's. Breng de dia over naar een slide mailer die op droogijs is geplaatst. Bewaar dia's bij -80 °C gedurende maximaal 4 weken voordat u verder gaat met gepubliceerde ruimtelijke protocollen33,34.
4. Sequencing data-analyse (geschatte tijd: tot 1 week afhankelijk van de bekendheid met software)
OPMERKING: Ga alleen voor ruimtelijke transcriptomische analyse naar stap 4.8. scRNA-seq-gegevens worden verwerkt met behulp van de gestandaardiseerde pijplijn die is uitgelijnd op menselijk hg38-referentietranscriptoom. Het R-pakket Seurat (v3.2.2) wordt gebruikt om scRNA-seq-gegevens te analyseren volgens gepubliceerde richtlijnen40.
- Filter met behulp van gevestigde kwaliteitscontrolestatistieken: zeldzame cellen met zeer hoge aantallen genen (mogelijk multiplets) en cellen met hoge mitochondriale percentages (lage kwaliteit of stervende cellen vertonen vaak mitochondriale besmetting) worden verwijderd.
- Normaliseer gegevens met behulp van "sctransform", een methode om de integratie van monsters te verbeteren in vergelijking met log-normalisatie. Deze genormaliseerde gegevens worden gebruikt voor dimensionaliteitsreductie en clustering, terwijl log-genormaliseerde expressieniveaus worden gebruikt voor analyse op basis van genexpressieniveaus, zoals celtypeclassificatie41.
- Selecteer markergenen per celtype, bijvoorbeeld bloedplaatjes-endotheelceladhesiemolecuul-1 (PECAM1) en von Willebrand-factor (VWF) voor EC's, lumican (LUM) en procollageen C-Endopeptidase Enhancer (PCOLCE) voor fibroblasten, B-celtranslocatiegen 1 (BTG1) en CD52 voor macrofagen, C1QA en C1QB voor monocyten, en myosine zware keten 11 (MYH11) en transgeline (TAGLN) voor vasculaire gladde spiercellen36.
- Bereken het gemiddelde expressieniveau voor afzonderlijke cellen tussen elk paar markeringen om één markering te hebben met een gemiddeld expressieniveau dat is gekoppeld aan elk celtype42.
- Pas een Gaussisch mengselmodel (GMM) met twee componenten toe op de expressiegegevens van elke marker in afzonderlijke cellen om cellen in twee sets te scheiden, namelijk het sterk tot expressie brengen van de marker en het laag uitdrukken van de marker. Op deze manier wordt voor elke marker elke afzonderlijke cel toegewezen aan een van de twee componenten42.
- Gebruik statistische verrijking voor de set markergenen, een exacte test van Fisher, om aan elk cluster een celtype toe te wijzen. Zo wordt per cluster een set p-waarden verkregen, die elk overeenkomen met een celtype. Het celtype met de laagste p-waarde wordt aan dat cluster toegewezen.
- Verwerk de ruimtelijke transcriptomische gegevens met behulp van de Space Ranger-pijplijnen, wat resulteert in ruimtelijke de-barcodering en het genereren van quality control (QC) -statistieken, inclusief totale uitgelijnde reads naar hg38 menselijk transcriptoom, het mediane aantal Unique Molecular Identifier (UMI) of genen per spot35.
OPMERKING: Het R-pakket Seurat (v3.2.2) wordt gebruikt om de door de Space Ranger verwerkte gegevens te analyseren volgens gepubliceerde richtlijnen40. - Normaliseer gegevens met behulp van "sctransform", een methode waarvan is aangetoond dat deze de stroomafwaartse analyse verbetert in vergelijking met log-normalisatie gezien de heterogeniteit van het weefsel en de zeer hoge variantie in tellingen over de vlekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De analyse van EC's uit mesenteriale slagader met behulp van een combinatie van mechanische en enzymatische dissociatie of cryopreservatie voor gebruik in verschillende downstream assays is hier afgebeeld (figuur 1). EC's kunnen worden geprofileerd in mesenteriale slagaders met behulp van de volgende stappen: A) mechanische dissociatie van de intima in combinatie met collagenasevertering naar kweekcellen; B) generatie van eencellige suspensie voor scRNA-seq; of C) doorsneden van de slagader kunnen worden ingebed in OCT om te worden gecryopectioneerd om ruimtelijk transcriptoom te profileren (figuur 1 en figuur 2).
Figuur 1: Arteriële weefselverwerking en ruimtelijke profilering. (A) Een opgeschoonde mesenteriale slagader. (B) Opengesneden vat om intima bloot te leggen. (C) Hematoxyline en Eosine (H & E) kleuring van mesenterische slagader dwarsdoorsnede in het fiduciale frame. Beeld vastgelegd met een 5x lens onder widefield fluorescentie omgekeerde microscoop. (D) Representatief Space Ranger-uitvoerbestand van totale genexpressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van EG-isolatie- en profileringstechnieken. Stroomdiagram met verschillende methoden voor het verwerken van mesenteriale slagaders. Verwerkingstechnieken resulteren in celsuspensies die geschikt zijn voor eencellige (sc) RNA-seq, endotheelcel (EC) cultuur, of het hele weefsel is ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) voor ruimtelijke transcriptoomprofilering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Geïsoleerde EC's gekweekt met behulp van het beschreven protocol vertonen een duidelijke geplaveide morfologie met minimale contaminerende cellen (figuur 3A). Expressie van EC-marker vasculaire endotheel (VE)-cadherine werd bevestigd met behulp van immunofluorescentie die cel-cel juncties visualiseert (figuur 3B). Geïsoleerde EC's werden onderworpen aan flowcytometrie-analyse voor CD31. Als negatieve controles produceerden niet-gekleurde HUVECs (zonder antilichaam) een signaal van 1,1% en HUVECs geïncubeerd met IgG leverden een signaal van 0,8% op. Als positieve controle vertoonden HUVECs gekleurd met CD31-antilichaam 99% zuiverheid en werden ze gebruikt om de kanalen voor menselijke mesenteriale arteriële endotheelcellen (HMAEC's) te gaten. Ongeveer 80% van de cellen was CD31-positief, wat aangeeft dat HMAEC's de meerderheid van de vers geïsoleerde celpopulatie vormden (figuur 3C). Mislukte isolaties, door ofwel te hard/diep te schrapen, de cellen met een te lage dichtheid te zaaien, of de cultuur voorbij passage 3 te handhaven, resulteert in cellen met een verstoorde morfologie, die mogelijk mesenchymale markers (αSMA) tot expressie brengen of langwerpig lijken op een fibroblastische toestand (figuur 3D).
Figuur 3: Validatie van geïsoleerde gekweekte mesenteriale arteriële EC's. (A) Brightfield-beeld van geïsoleerde EC's, 10x lens, schaalbalk = 50 μm. (B) Immunofluorescentie van VE-Cadherine-expressie met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) als nucleaire marker. Beeld gemaakt met een 10x lens onder widefield fluorescentie omgekeerde microscoop. Representatieve afbeelding toont VE-Cadherin lokalisatie. Schaalbalk = 50 μm. (C) FACS-percelen van niet-gekleurd HUVEC (linksboven), HUVEC gekleurd met IgG-controle (rechtsboven), HUVEC gekleurd met CD31 (linksonder) en de geïsoleerde menselijke mesenteriale arteriële endotheelcellen (HMAEC) gekleurd met CD31 (rechtsonder) (D) Immunofluorescentiebeelden van HMAEC's met DAPI (nucleaire marker), alfa-gladde spieractine (αSMA) en CD31. 40x lens, schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
EC's geïsoleerd met behulp van celdissociatie-enzym ondergingen scRNA-seq. Figuur 4A toont een representatieve uniforme variëteit benadering en projectie (UMAP) geïsoleerd uit mesenteriale slagader met behulp van het huidige protocol voor scRNA-seq op geïsoleerde HMAEC's, met 34% cellen geclusterd als EC's met PECAM1 en VWF (figuur 4B, C respectievelijk) als markers.
Figuur 4: scRNA-seq van mesenterische arteriële EC's. (A) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) plot van scRNA-seq gegevens uit mesenteriale slagader. Een 2-dimensionale projectie van de variëteit in een hoogdimensionale ruimte, waarbij elk punt een enkele cel vertegenwoordigt en de nabijheid van andere punten aangeeft hoe vergelijkbaar het transcriptoom met elkaar is. Cellen hebben een kleurcode op basis van hun celtypen. (B) PECAM1-expressie geprojecteerd op UMAP. (C) VWF-expressie geprojecteerd op UMAP. Kleurbalken vertegenwoordigen de expressie van niveaus van genen waarbij de RNA-niveaus worden weergegeven door log-genormaliseerde unieke moleculaire identificatietellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Voor ruimtelijke transcriptomische workflow werd geëxtraheerd RNA uit weefselsecties geëlektroforiseerd op een gel om de RNA-kwaliteit te visualiseren. Een zwak signaal of afwezigheid van 18S en 28S ribosomale RNA-banden en de aanwezigheid van afbraakproducten waargenomen in figuur 5A, baan A1, is een voorbeeld van RNA van slechte kwaliteit en mag niet verder worden verwerkt. Monsters met een concentratie buiten het bereik kunnen leiden tot een lagere RIN (figuur 5A, baan B1). Het verdunnen van het RNA verhoogde echter twee keer de RIN voldoende om door te gaan (figuur 5A, baan C1). Alvorens de genexpressie te bepalen, werd een weefseloptimalisatie uitgevoerd om de optimale permeabilisatietijd te bepalen om RNA vrij te geven dat door de oligonucleotiden op de genexpressiedia moet worden gevangen (figuur 5B). Op basis van de fluorescentiebeeldvorming van complementair DNA (cDNA) voetafdruk, produceerde 18 min permeabilisatie het laagste achtergrond maar sterkste signaal, en werd daarom geselecteerd om de optimale duur te zijn. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring visualiseerde de morfologie van het vat waardoor interessante gebieden konden worden geïdentificeerd (Figuur 5C). De kwaliteit van de bibliotheek werd beoordeeld (figuur 5D) en geschikt bevonden voor sequencing. UMI-tellingen per plek, aantal reads per spot en totale genen zijn kwaliteitsmetingen geproduceerd door de Space Ranger-pijplijn, de variabiliteit van elk weergegeven in figuur 5E. Ten slotte werd genexpressie (met Actin alfa-2 (ACTA2) als voorbeeld, figuur 5F) gevisualiseerd met ruimtelijke verankering op het H & E-gekleurde vat.
Figuur 5: Ruimtelijke transcriptomische workflow en representatieve resultaten (A) Kwaliteitsbeoordeling van RNA geëxtraheerd uit twee monsters van mesenteriale slagader, A1 uit één monster, B1 uit het tweede monster, C1 verdund 2x uit B1. Rode pijlen geven ribosomale 28S- en 18S-banden aan. (B) Ruimtelijke weefseloptimalisatie (TO) workflow. (C) Genexpressie (GEX) dia's met de weefselsecties (linkerpaneel); H&E-afbeeldingen van de weefselsecties die op de GEX-dia zijn geladen vóór permeabilisatie gedurende 18 minuten, omgekeerde transcriptie en bibliotheekconstructie (rechterpaneel), schaalbalk = 1 cm. (D) Kwaliteitsbeoordeling van de voorbereide bibliotheken. (E) Outputstatistieken van Space Ranger tonen bereiken tussen gemiddelde leesbewerkingen, UMI's en genen per plek voor verschillende bibliotheken. Foutbalken geven min en max. (F) ACTA2-expressie over de hele sectie van het vat aan. Alle microscopiefoto's zijn gemaakt met behulp van een widefield omgekeerde microscoop, van een 5x lens, tilescan module. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde workflow beschrijft een reeks technieken om EC's te profileren vanuit een enkel stuk menselijke slagader met eencellige en ruimtelijke resolutie. Er zijn verschillende kritische stappen en beperkende factoren in het protocol. Een sleutel tot transcriptoomprofilering is de versheid van het weefsel en de integriteit van het RNA. Het is belangrijk om weefsels zoveel mogelijk op ijs te houden voorafgaand aan de verwerking om RNA-degradatie te minimaliseren. Meestal worden de postmortale weefsels verwerkt tussen 8-14 uur na het moment van overlijden. Het wordt echter aanbevolen om zo snel mogelijk na extractie van de donoren te beginnen met de isolatie of de cryopreservatie. Specifiek voor het in kaart brengen van ruimtelijke transcriptooms moet het weefsel op droogijs worden bewaard en mag niet meer dan één vries-dooicyclus worden toegestaan. In de LGO moeten meer dan één dwarsdoorsnede van het vaartuig worden ingebouwd, zodat dit zo nodig kan worden herhaald. Er moeten ook inspanningen worden geleverd om een RNase-vrije omgeving te bevorderen tijdens weefselverwerking en celisolatie. Ten tweede kan de grootte van de vaten een beperkende factor zijn. Voor ruimtelijke transcriptomics kan het protocol worden uitgevoerd op 1 mm van het vat in totaal, ongeacht de diameter. Voor het dissociatieprotocol voor celkweek en scRNA-seq zou de ondergrens zijn als het vat te smal is (d.w.z. minder dan 1 mm in diameter) om het inbrengen van een dissectieschaar mogelijk te maken. Op basis van deze principes kan het dissociatieprotocol worden aangepast voor elke middelgrote of grotere slagader of ader, zolang de grootte van de vaten de opening mogelijk maakt, en de ruimtelijke transcriptoomprocedure kan worden toegepast op alle vaten die geheel of gedeeltelijk in het fiduciële frame passen.
Om weefsel te verwerken voor eencellige transcriptoomanalyse hebben verschillende groepen het gebruik van liberase en elastase beschreven om alle celpopulaties binnen de vaatwand te verkrijgen 9,43,44. De resulterende datasets bevatten echter gemiddeld slechts 3-7% van de totale celpopulatie geannoteerd als EC's 9,45. Een manier om de beperkte EC-representatie in de scRNA-seq-gegevens te verbeteren, is door de EC-fractie te verrijken door gebruik te maken van de EC-oppervlaktemarkers via FACS44,46. Dit vereist echter meestal grote hoeveelheden startweefsel en dure apparatuur die mogelijk niet routinematig beschikbaar is voor alle laboratoria. Dit protocol maakt gebruik van de unieke anatomische positie van EC's, namelijk voornamelijk in de intimale laag, die verrijking van EC's mogelijk maakt zonder de noodzaak van harde weefselvertering en de levensvatbaarheid van cellen voor scRNA-seq of daaropvolgende cultuur verbetert. Het percentage EC's in het uiteindelijke celmengsel voor scRNA-seq kan worden verhoogd door een stap toe te voegen met BEHULP VAN VE-Cadherine /CD144 antilichaam-geconjugeerde magnetische kralen. Deze stap sluit echter mogelijk niet alle andere cellen uit die interageren met EC's vanwege de native cel-celinteractie. Hoewel traditioneel de andere celtypen (bijv. Macrofagen, gladde spiercellen en fibroblasten) in EG-isolatie als "contaminatie" zouden worden beschouwd, kunnen ze nuttige informatie opleveren voor cel-celinteracties in de weefselcontext. In de scRNA-seq data-analyse kunnen EC's efficiënt worden geannoteerd met behulp van de EC-markers en kunnen de cel-celinteracties bioinformatisch worden afgeleid met behulp van verschillende populaire bioinformatica-methoden (bijv. CellChat47, CellphoneDB48, CytoTalk49 onder anderen). Bovendien kan de opname van deze gegevens een effectievere integratie en deconvolutie van de ruimtelijke transcriptoomprofileringsgegevens mogelijk maken, die niet de resolutie van één cel hebben (zie hieronder)34.
Voor ruimtelijk transcriptoom is er momenteel geen gouden standaard voor het voorbereiden van weefsel voor deze techniek en beperkt onderzoek bij het bereiden van vasculatuur, waarbij het grootste deel van het gepubliceerde onderzoek dierlijk weefselgebruikt 50,51. De techniek vereist in de handel verkrijgbare dia's met gespecialiseerde fudiciale frames met een opvanggebied met ongeveer 5.000 barcodevlekken met een diameter van 55 μm. De vlekken worden 100 μm uit elkaar geplaatst van het midden van de plek naar aangrenzende plekken, waardoor er ongeveer 45 μm openingen tussen vlekken overblijven die niet worden geprofileerd, waardoor de resolutie wordt beperkt. Bovendien zal een enkele plek meerdere cellen bevatten, omdat de meerderheid van de cellen minder dan 55 μm in oppervlakte is. Zoals eerder vermeld, is dit dus geen single-cell sequencing-techniek. Door de gegevens echter te integreren met scRNA-seq, kan de resolutie worden verbeterd en kan de heterogeniteit binnen een plek worden onthuld34. Hoewel het huidige protocol zich richt op één ruimtelijke transcriptomische profileringstest, kan deze techniek worden aangepast voor andere opkomende ruimtelijke profileringsmethoden52,53 naarmate de eiwit- en RNA-kwaliteit in deze procedure wordt gehandhaafd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.Z. is oprichter en bestuurslid van Genemo, Inc.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (aan Z.B.C.); DP1DK126138 en DP1HD087990 (naar S.Z.); een Ella Fitzgerald Foundation beurs en een Wanek Family Project (aan Z.B.C.); en een Human Cell Atlas seed network grant (aan Z.B.C. en S.Z.). Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie omvatte werk uitgevoerd in de Integrative Genomics Core in City of Hope, ondersteund door het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer P30CA033572. De auteurs willen Dr. Ismail Al-Abdullah en Dr. Meirigeng Qi van het eilandjestransplantatieteam van City of Hope bedanken voor de isolatie van menselijke weefsels, Dr. Dongqiang Yuan van City of Hope voor zijn hulp bij scRNA-seq-analyse en Dr. Marc Halushka van de afdeling Cardiovasculaire Pathologie, Johns Hopkins University School of Medicine voor zijn onschatbare inzichten in vasculaire histologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
- Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
- Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
- Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
- Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7 (2014).
- Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
- Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
- Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Stuart, T., Satija, R.
- Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
- Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
- The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
- Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
- Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19 (2016).
- Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
- McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
- Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489 (2021).
- Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
- Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
- Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
- Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
- Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
- Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
- Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
- Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
- Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
- Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
- Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211 (2020).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337 (2011).
- Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
- Stuart, T., et al.
- Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296 (2019).
- Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
- Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976 (2018).
- Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690 (2020).
- Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
- van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088 (2021).
- Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
- Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
- Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627 (2021).
- Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771 (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Moffit, J. R., et al.
