Method Article

Isolamento e profilazione delle cellule endoteliali arteriose mesenteriche primarie umane a livello di trascrittoma

DOI:

10.3791/63307

⸱

March 14th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, 2Department of Bioengineering, University of California San Diego, 3Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la profilazione delle cellule endoteliali dall'arteria mesenterica umana. Inoltre, viene fornito un metodo per preparare l'arteria umana per la trascrittomica spaziale. Proteomica, trascrittomica e saggi funzionali possono essere eseguiti su cellule isolate. Questo protocollo può essere riproposto per qualsiasi arteria di medie o grandi dimensioni.

Abstract

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Le cellule endoteliali (CE) sono cruciali per la funzione vascolare e di tutto il corpo attraverso la loro risposta dinamica ai segnali ambientali. Chiarire il trascrittoma e l'epigenoma delle CE è fondamentale per comprendere i loro ruoli nello sviluppo, nella salute e nella malattia, ma è limitato nella disponibilità di cellule primarie isolate. Le recenti tecnologie hanno permesso la profilazione ad alto rendimento del trascrittoma EC e dell'epigenoma, portando all'identificazione di sottopopolazioni di cellule EC precedentemente sconosciute e traiettorie di sviluppo. Mentre le colture EC sono uno strumento utile nell'esplorazione della funzione e della disfunzione della CE, le condizioni di coltura e i passaggi multipli possono introdurre variabili esterne che alterano le proprietà della CE nativa, tra cui la morfologia, lo stato epigenetico e il programma di espressione genica. Per superare questa limitazione, il presente documento dimostra un metodo per isolare le EC primarie umane dalle arterie mesenteriche dei donatori con l'obiettivo di catturare il loro stato nativo. Le CE nello strato intimale sono dissociate meccanicamente e biochimicamente con l'uso di particolari enzimi. Le cellule risultanti possono essere utilizzate direttamente per il sequenziamento di RNA di massa o RNA a singola cellula o placcate per la coltura. Inoltre, viene descritto un flusso di lavoro per la preparazione del tessuto arterioso umano per la trascrittomica spaziale, in particolare per una piattaforma disponibile in commercio, sebbene questo metodo sia adatto anche per altre tecniche di profilazione del trascrittoma spaziale. Questa metodologia può essere applicata a diversi vasi raccolti da una varietà di donatori in stato di salute o malattia per ottenere informazioni sulla regolazione trascrizionale ed epigenetica della CE, un aspetto fondamentale della biologia cellulare endoteliale.

Introduction

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Rivestendo il lume dei vasi sanguigni, le cellule endoteliali (CE) sono regolatori cruciali del tono vascolare e della perfusione tissutale. Le CE sono notevoli nella loro capacità di reagire all'ambiente extracellulare e adattarsi ai cambiamenti nella dinamica e nella composizione del flusso sanguigno. Queste risposte dinamiche sono mediate attraverso una rete di eventi di segnalazione intracellulare, comprese le modulazioni trascrizionali e post-trascrizionali con risoluzione spazio-temporale. La disregolazione di queste risposte è implicata in molte patologie, tra cui, ma non solo, malattie cardiovascolari, diabete e cancro 1,2

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Protocol

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Studi sui tessuti umani sono stati condotti su campioni deidentificati ottenuti dal Southern California Islet Cell Resource Center di City of Hope. I consensi di ricerca per l'uso di tessuti umani post mortem sono stati ottenuti dai parenti più prossimi dei donatori e l'approvazione etica per questo studio è stata concessa dall'Institutional Review Board di City of Hope (IRB n. 01046).

1. Dissociazione fisica (tempo stimato: 1-2 h)

  1. Posizionare un'arteria fresca su un piatto di 10 cm e lavare con soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS).
  2. Con pinze sterili e forbici di dissezione,....

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Results

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L'analisi delle CE dell'arteria mesenterica utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica ed enzimatica o crioconservazione per l'uso in vari saggi a valle è descritta qui (Figura 1). Le EC possono essere profilate nelle arterie mesenteriche utilizzando i seguenti passaggi: A) dissociazione meccanica dall'intima accoppiata con la digestione della collagenasi alle cellule di coltura; B) generazione di sospensione monocellulare per scRNA-seq; o C) le sezioni trasversali dell'arteria .......

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Discussion

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Il flusso di lavoro presentato descrive in dettaglio una serie di tecniche per profilare gli EC da un singolo pezzo di arteria umana con risoluzione a singola cellula e spaziale. Ci sono diversi passaggi critici e fattori limitanti nel protocollo. Una chiave per la profilazione del trascrittoma è la freschezza del tessuto e l'integrità dell'RNA. È importante mantenere i tessuti sul ghiaccio il più possibile prima dell'elaborazione per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA. Tipicamente, i tessuti post-mortem vengono .......

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Disclosures

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S.Z. è fondatore e membro del consiglio di amministrazione di Genemo, Inc.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (a Z.B.C.); DP1DK126138 e DP1HD087990 (a S.Z.); una sovvenzione della Fondazione Ella Fitzgerald e un Progetto della Famiglia Wanek (a Z.B.C.); e una sovvenzione per la rete di semi Human Cell Atlas (a Z.B.C. e S.Z.). La ricerca riportata in questa pubblicazione ha incluso il lavoro svolto nel nucleo di genomica integrativa presso City of Hope supportato dal National Cancer Institute del National Institutes of Health con il numero di premio P30CA033572. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Ismail Al-Abdullah e il Dr. Meirigeng Qi del team di trapianto di isole presso City ....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mLUSA Scientific1615-5500
piatto da 10 cmGenesee Scientific25-202
aghi 23GBD305145
2-metilbutanoThermo FisherAC327270010
40 &; filtro Fisher14100150
4200 Sistema TapeStationAgilent TechnologiesG2991BA
provetta da 5 mLThermo Fisher14282300
piastra a 6 pozzettiGreiner Bio-One07-000-208
Fattore di attaccoApplicazioni della cella123-500Reagente di attacco nel protocollo
CeraÈ possibile utilizzare qualsiasi cera nera commerciale
Albumina sierica bovina trattata con shock termicoFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
CentrifugaEppendorf
CloroformioFisherC607
Collagenasi DRoche11088866001
CriostatoSpazzole
Cryostat
D-GlucosioFisherD16-1
DimetilsolfossidoFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Proteasi derivata da batteri nel protocollo
Bisturi di sicurezza monousoMyco Instrumentation6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
EthanolFisherBP2818-4
Siero fetale bovinoFisher10437028
EmocitometroFisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
Tampone campione D1000 ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-5603
Nastro dello schermo D1000 ad alta sensibilitàAgilent Technologies5067-5584
IncubatoreMantenuto a 37 ° C 5% CO2
IsopropanoloFisherBP26324
KClFisherP217-3
Terreno di azoto
199Sigma AldrichM2520-10X
Microscopio a bombola
LeicaPer valutare la morfologia cellulare
Terreno di coltura endoteliale microvascolareApplicazioni cellulari111-500
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Agitatore orbitaleEppendorf
Composto di temperatura di taglio ottimaleFisher4585
Criostampi in plasticaFisher22363553
nastro per schermoa RNAAgilent Technologies5067-5576
Schermo per RNA Tampone per campioni su nastroAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
Acqua priva di RNasiTakaraRR036BAcqua priva di RNasi (2) in kit
Pinza sterile lunga 12"F.S.T91100-16
Pinza fine sterileF.S.T11050-10
Forbici fini steriliF.S.T14061-11
Superfrost PLUS Gold SlidesFisher1518848
TRIzol reagenteFisher15596018
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzyme (1X) rosso fenoloThermo Fisher12605010Enzima di dissociazione cellulare nel protocollo
Kit di accessori Visium10X GenomicsPN-1000215
Pacchetto Visium Gateway, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Vetrino e diapositiva di espressione genica spaziale Visium Kit di reagenti, 4 rxns10X GenomicsPN-1000184
neraLeicaliquidometallica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinic....

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Endothelial CellsMesenteric ArteryCell IsolationTranscriptome ProfilingSingle Cell RNASpatial TranscriptomicsCell ViabilityImmunofluorescence StainingRNA ExtractionHematoxylin Eosin Staining

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