Summary
Il protocollo descrive l'isolamento, la coltura e la profilazione delle cellule endoteliali dall'arteria mesenterica umana. Inoltre, viene fornito un metodo per preparare l'arteria umana per la trascrittomica spaziale. Proteomica, trascrittomica e saggi funzionali possono essere eseguiti su cellule isolate. Questo protocollo può essere riproposto per qualsiasi arteria di medie o grandi dimensioni.
Abstract
Le cellule endoteliali (CE) sono cruciali per la funzione vascolare e di tutto il corpo attraverso la loro risposta dinamica ai segnali ambientali. Chiarire il trascrittoma e l'epigenoma delle CE è fondamentale per comprendere i loro ruoli nello sviluppo, nella salute e nella malattia, ma è limitato nella disponibilità di cellule primarie isolate. Le recenti tecnologie hanno permesso la profilazione ad alto rendimento del trascrittoma EC e dell'epigenoma, portando all'identificazione di sottopopolazioni di cellule EC precedentemente sconosciute e traiettorie di sviluppo. Mentre le colture EC sono uno strumento utile nell'esplorazione della funzione e della disfunzione della CE, le condizioni di coltura e i passaggi multipli possono introdurre variabili esterne che alterano le proprietà della CE nativa, tra cui la morfologia, lo stato epigenetico e il programma di espressione genica. Per superare questa limitazione, il presente documento dimostra un metodo per isolare le EC primarie umane dalle arterie mesenteriche dei donatori con l'obiettivo di catturare il loro stato nativo. Le CE nello strato intimale sono dissociate meccanicamente e biochimicamente con l'uso di particolari enzimi. Le cellule risultanti possono essere utilizzate direttamente per il sequenziamento di RNA di massa o RNA a singola cellula o placcate per la coltura. Inoltre, viene descritto un flusso di lavoro per la preparazione del tessuto arterioso umano per la trascrittomica spaziale, in particolare per una piattaforma disponibile in commercio, sebbene questo metodo sia adatto anche per altre tecniche di profilazione del trascrittoma spaziale. Questa metodologia può essere applicata a diversi vasi raccolti da una varietà di donatori in stato di salute o malattia per ottenere informazioni sulla regolazione trascrizionale ed epigenetica della CE, un aspetto fondamentale della biologia cellulare endoteliale.
Introduction
Rivestendo il lume dei vasi sanguigni, le cellule endoteliali (CE) sono regolatori cruciali del tono vascolare e della perfusione tissutale. Le CE sono notevoli nella loro capacità di reagire all'ambiente extracellulare e adattarsi ai cambiamenti nella dinamica e nella composizione del flusso sanguigno. Queste risposte dinamiche sono mediate attraverso una rete di eventi di segnalazione intracellulare, comprese le modulazioni trascrizionali e post-trascrizionali con risoluzione spazio-temporale. La disregolazione di queste risposte è implicata in molte patologie, tra cui, ma non solo, malattie cardiovascolari, diabete e cancro 1,2.
Gran parte degli studi fa uso di linee cellulari o modelli animali per interrogare il trascrittoma CE. Il primo è uno strumento utile, data la relativa facilità d'uso e l'economicità. Tuttavia, la coltivazione seriale può introdurre alterazioni fenotipiche alle CE, come le caratteristiche fibroblastiche e la mancanza di polarizzazione, disconnettendole dal loro stato in vivo 3. Le cellule primarie, ad esempio la vena ombelicale umana EC (HUVEC) sono state una scelta popolare dal 1980, ma derivano da un letto vascolare di sviluppo che non esiste negli adulti, quindi è improbabile che rappresenti pienamente gli EC maturi. Gli animali, in particolare i modelli murini, rappresentano meglio l'ambiente fisiologico o fisiopatologico delle CE e consentono l'interrogazione dei trascrittomi a seguito di perturbazioni genetiche. Le CE murine possono essere isolate da vari tessuti, tra cui l'aorta, i polmoni e i tessuti adiposi utilizzando procedure basate su enzimi 4,5,6,7. Tuttavia, le cellule isolate non possono essere utilizzate per passaggi multipli a meno che non siano trasformate6 e sono spesso limitate in numero, il che richiede il raggruppamento da più animali 5,8,9.
L'avvento di nuove tecnologie che esplorano l'architettura dei vasi a livello trascrittomico, in particolare con la risoluzione a singola cellula, ha permesso una nuova era della biologia endoteliale rivelando nuove funzioni e proprietà delle CE 5,10,11,12,13,14. Una ricca risorsa costruita dai ricercatori di Tabula Muris ha raccolto profili trascrittomici a singola cellula di 100.000 cellule tra cui EC in 20 diversi organi murini15, che hanno rivelato sia geni marcatori EC comuni che firme trascrittomiche uniche con differenze inter-e intra-tessuto 5,13. Tuttavia, ci sono chiare differenze tra topo e uomo nel genoma, nell'epigenoma e nel trascrittoma, specialmente nelle regioni non codificanti 16,17,18. Questi inconvenienti di cui sopra sottolineano l'importanza dell'analisi delle CE utilizzando campioni umani al fine di ottenere un profilo fedele delle CE nel loro stato nativo in salute e malattia.
La maggior parte dei metodi di isolamento EC si basano sulla dissociazione fisica attraverso l'omogeneizzazione, il taglio fine e la tritatura del tessuto prima dell'incubazione con enzimi proteolitici per tempi diversi. Gli enzimi e le condizioni variano anche considerevolmente tra i tipi di tessuto, dalla tripsina alla collagenasi, usati da soli o in combinazione 19,20,21. Un ulteriore arricchimento o purificazione basato su anticorpi sono spesso inclusi per aumentare la purezza delle CE. Tipicamente, gli anticorpi contro i marcatori di membrana EC, ad esempio CD144 e CD31 sono coniugati a perline magnetiche e aggiunti alla sospensione cellulare22,23. Tale strategia può essere generalmente adattata per l'isolamento CE da più tessuti umani e murini, comprese le tecniche introdotte in questo protocollo.
Nel loro stato nativo, le CE interagiscono con più tipi di cellule e possono esistere in nicchie vascolari in cui la vicinanza cellulare è cruciale per la funzione. Mentre gli studi di sequenziamento dell'RNA monocellulare e mononucleare (scRNA e snRNA-seq) sono stati fondamentali per le recenti scoperte nella descrizione dell'eterogeneità DELLA CE, il processo di dissociazione interrompe il contesto tissutale e il contatto cellula-cellula, che sono anche importanti per comprendere la biologia CE. Sviluppato nel 2012 e nominato Metodo dell'anno nel 202024, il profilo del trascrittoma spaziale è stato utilizzato per profilare l'espressione genica globale mantenendo le caratteristiche spaziali in vari tessuti tra cui il cervello25, il tumore26 e il tessuto adiposo27. Le tecnologie possono essere mirate, utilizzando sonde specializzate specifiche per particolari sequenze di RNA attaccate a reagenti di affinità o tag fluorescenti, rilevando così geni selezionati a risoluzione subcellulare 28,29,30,31. Possono anche essere non mirati32,33, in genere utilizzando oligonucleotidi spazialmente codificati per catturare l'RNA, che insieme vengono convertiti in cDNA per la successiva preparazione della libreria seq e quindi hanno il vantaggio di dedurre l'espressione genica dell'intero tessuto in modo imparziale. Tuttavia, la risoluzione spaziale non è attualmente raggiunta a un singolo livello cellulare con tecnologie disponibili in commercio. Ciò può essere superato in una certa misura con l'integrazione dei dati con i dati scRNA-seq, consentendo in definitiva la mappatura del trascrittoma a singola cellula in un contesto tissutale complesso pur mantenendo le sue informazioni spaziali originali34.
Qui, viene descritto un flusso di lavoro per profilare il trascrittoma EC utilizzando l'arteria mesenterica superiore umana, un'arteria periferica che è stata utilizzata per studiare la vasodilatazione, il rimodellamento vascolare, lo stress ossidativo e l'infiammazione 35,36,37. Vengono descritte due tecniche: 1) isolare e arricchire le CE dall'intima dei vasi sanguigni combinando dissociazione meccanica e digestione enzimatica adatte al sequenziamento del trascrittoma monocellulare o alla successiva coltura in vitro; 2) preparare sezioni arteriose per la profilazione del trascrittoma spaziale (Figura 1). Queste due tecniche possono essere eseguite in modo indipendente o complementare per profilare le CE e le cellule circostanti. Inoltre, questo flusso di lavoro può essere adattato per l'uso su qualsiasi arteria media o grande.
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Protocol
Studi sui tessuti umani sono stati condotti su campioni deidentificati ottenuti dal Southern California Islet Cell Resource Center di City of Hope. I consensi di ricerca per l'uso di tessuti umani post mortem sono stati ottenuti dai parenti più prossimi dei donatori e l'approvazione etica per questo studio è stata concessa dall'Institutional Review Board di City of Hope (IRB n. 01046).
1. Dissociazione fisica (tempo stimato: 1-2 h)
- Posizionare un'arteria fresca su un piatto di 10 cm e lavare con soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS).
- Con pinze sterili e forbici di dissezione, rimuovere il grasso e i tessuti connettivi esterni fino a quando il vaso non è pulito. Misurare la lunghezza della nave con un righello posizionato all'esterno del piatto e scattare foto per i record (Figura 1A).
- Tampone di digestione appropriato preriscaldato a 37 °C: per scRNA-seq utilizzare l'enzima di dissociazione cellulare; per i saggi di coltura cellulare utilizzare 1-6 mg/mL di collagenasi D, 3 mg/mL di proteasi derivata da batteri, 100 mM di HEPES, 120 mM di NaCl, 50 mM di KCl, 5 mM di glucosio, con 1 mM di CaCl2 6,38 (pH 7,0, non richiede aggiustamento) aggiunto 5 minuti prima dell'uso.
- Prendi l'arteria mesenterica (in genere con un diametro di 6-8 mm) e taglia longitudinalmente con le forbici per aprire verticalmente il lume del vaso.
- Usando gli aghi, attaccare il recipiente alla cera nera su tutti e quattro gli angoli, lasciando l'intima esposta (Figura 1B).
- Aggiungere 1 mL di tampone di digestione preriscaldato all'intima. Prendi un bisturi sterile e raschia delicatamente il lume della nave due volte.
NOTA: lo scopo di questa procedura è quello di dissociare lo strato intimale, che potrebbe richiedere pratica. È necessario esercitare una forza sufficiente per rimuovere l'endotelio, ma non così tanto da rimuovere anche gli strati più profondi del tessuto, il che ridurrà la rappresentazione CE. - Trasferire il tampone di digestione in un tubo da 5 ml. Aggiungere 1 mL di tampone digestivo all'intima e alla pipetta su e giù con attenzione per raccogliere le cellule rimanenti e aggiungere al tubo da 5 ml. Incubare le celle a 37 °C, ruotando a 150 giri/min per 5 min.
- Aggiungere 2 mL di mezzo M199 (o D-PBS se si procede con scRNA-seq) alla sospensione cellulare per spegnere la reazione enzimatica. Mescolare delicatamente e centrifugare a 4 °C, 600 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e conservare il surnatante separatamente in coltura come controllo per osservare se tutte le cellule vengono catturate nel pellet nel passaggio 1.8. Risospescere il pellet cellulare in 1 mL di mezzo M199 (o D-PBS se si procede con scRNA-seq).
- Valutare la vitalità cellulare mescolando 10 μL di tripano blu con 10 μL di stock cellulare. Osservare la morfologia cellulare e contare le cellule usando un emocitometro.
NOTA: A questo punto, le cellule possono essere utilizzate per la quantificazione di proteine o RNA o coltivate in vitro utilizzando terreni di coltura CE seguendo i protocolli standard39. In alternativa, possono essere preparati per il sequenziamento come descritto nella sezione successiva. - Per la coltura, rivestire due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti pipettando 500 μL di reagente di attacco in pozzetti per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la rimozione del reagente di attacco e il lavaggio con D-PBS sterile, erogare l'intero stock cellulare in un pozzo e il surnatante mantenuto come controllo nel secondo pozzo.
2. Preparazione per studi scRNA-seq (tempo stimato: 3-4 h)
- Centrifugare il materiale cellulare dal punto 1.11 a 4 °C, 600 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospesciare delicatamente il pellet con una pipetta P1000 e una punta a foro largo in 1 mL di albumina sierica bovina allo 0,04% (BSA) in D-PBS. Mescolare bene per garantire una sospensione monocellulare.
- Passare la soluzione attraverso un filtro da 40 μm per rimuovere i detriti cellulari. Se i detriti rimangono, passare attraverso un secondo filtro in 4 ml di BSA allo 0,04% in D-PBS.
- Centrifugare a 4 °C, 600 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospese il pellet in 500 μL di BSA allo 0,04% in D-PBS utilizzando una pipetta P1000 con una punta di pipetta a foro largo. Mescolare bene per garantire una sospensione monocellulare.
- Valutare la vitalità cellulare mescolando 10 μL di stock cellulare con 10 μL di tripano blu. Usando un emocitometro, osservare la morfologia, determinare se esiste una sospensione a singola cellula senza cluster, verificare la presenza di detriti tissutali e calcolare il numero di cellule vive e morte.
- Se le cellule sono raggruppate o i detriti rimangono, ripetere il lavaggio con lo 0,04% di BSA in D-PBS o passare nuovamente attraverso il filtro da 40 μm.
NOTA: mentre questo ridurrà la resa, è importante che le cellule esistano in una sospensione a cella singola pulita per un sequenziamento ottimale. - La sospensione monocellulare può essere utilizzata per scRNA-seq.
3. Profilazione del trascrittoma spaziale (tempo stimato: 3-4 h)
- Aggiungere isopentano (2-metilbutano) a un contenitore metallico e raffreddare in azoto liquido (LN2) o ghiaccio secco (LN2 è preferito in quanto porterà la temperatura inferiore al ghiaccio secco). Versare il composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) in pozzetti di criostampi di plastica etichettati facendo attenzione a non creare bolle e rimuovere quelli che appaiono. Lasciare raffreddare il criostampo sul ghiaccio secco.
- Tagliare almeno due sezioni coronali, 1 cm di lunghezza della nave. Utilizzando una pinza lunga (12"), immergere il tessuto in isopentano fino a quando non viene congelato. Immergere rapidamente il tessuto in OCT all'orientamento con il lume visibile al centro. Fare attenzione a rimuovere eventuali bolle, specialmente quelle accanto al tessuto.
- Usando una pinza lunga (12"), afferrare i criomoli e tenerli nel contenitore metallico. Mentre la base degli stampi dovrebbe essere nel liquido, non dovrebbe essere troppo profonda per consentire all'isopentano di scorrere sul tessuto. Osserva il congelamento, l'OCT diventerà bianco progressivamente dall'esterno in 1-2 min.
- Conservare queste sezioni in un contenitore sigillato a -80 °C per un massimo di 6 mesi.
NOTA: Mantenere i campioni su ghiaccio secco in ogni momento e non consentire più di un ciclo di congelamento-disgelo. Questo tessuto può essere utilizzato per l'analisi istologica, l'ibridazione in situ a fluorescenza RNA/DNA (FISH) o la trascrittomica spaziale, che verrà descritta ora. - Impostare la temperatura del criostato a -20 °C per la camera e -10 °C per la testa del campione. Equilibrare sezioni di recipienti incorporati OCT, coltelli, spazzole e vetrini a -20 °C nel criostato per circa 30 minuti. Durante l'equilibratura, pulire la macchina e tutte le attrezzature che possono toccare le sezioni, compresa la lama, con etanolo al 70% seguito da soluzione di decontaminazione RNasi.
- Collegare il campione erogando una piccola quantità di OCT sul blocco criostato circolare e posizionando il campione sopra prima che si congeli. Posizionare il blocco al centro della testa del campione e avvitare il blocco in posizione utilizzando un'alta maniglia nera a sinistra. Tagliare via qualsiasi PTOM in eccesso che circonda la nave.
- Impostando lo spessore di taglio a 10 μm sul criostato, tagliare circa 60 sezioni e posizionarle in un tubo pre-raffreddato da 1,5 ml. Queste sezioni saranno utilizzate per valutare la qualità dell'RNA. Al momento della rimozione dal criostato, aggiungere immediatamente 1 mL di reagente di estrazione dell'RNA e vortice fino a quando le sezioni sono completamente dissolte.
- Aggiungere 200 μL di cloroformio e mescolare fino a quando la soluzione assomiglia a un frappè alla fragola. Centrifugare a 11.200 x g per 10 min a 4 °C.
- Raccogliere la fase acquosa (fase chiara sopra gli strati bianchi e rosa) e aggiungere 500 μL di isopropanolo ad essa. Mescolare invertendo i tubi oltre 10 volte e posizionare a -80 °C per almeno 20 minuti.
- Centrifugare a 11.200 x g per 10 min a 4 °C. Sciogliere il pellet di RNA purificato in 5 μL di acqua priva di RNasi. Esaminare il numero di integrità dell'RNA (RIN).
NOTA: i campioni con RIN ≥ 7 sono preferiti, ma RIN ≥ 6 è accettabile. Il numero di sezioni tissutali e il volume di soluzione per la dissoluzione dell'RNA possono richiedere un'ottimizzazione a seconda del sistema utilizzato per garantire che la concentrazione finale di RNA rientri nell'intervallo di funzioni RIN per consentire un'accurata valutazione RIN. - Esercitati a tagliare e posizionare correttamente le sezioni all'interno dei telai fiduciali utilizzando vetrini di vetro normale prima di procedere all'ottimizzazione dei tessuti o ai vetrini di espressione genica disponibili in commercio. Ciò può essere ottenuto disegnando quadrati di 6,5 mm x 6,5 mm su una semplice slitta di vetro, raffreddando a -20 °C nel criostato e posizionando sezioni in questa area di cattura.
- Tagliare sezioni da 10 μm con piastra antirollio in posizione, capovolgere e appiattire con cura toccando delicatamente la sezione attraverso l'OCT circostante.
- Utilizzando spazzole criostatiche prive di RNasi, posizionare la sezione del tessuto all'interno del quadrato, utilizzando solo l'OCT circostante. Posizionare immediatamente un dito (nei guanti) sul retro dell'area di cattura per fondere la sezione sul vetrino.
- Una volta che la sezione ha aderito, posizionare la diapositiva sulla criobare per consentire alla sezione di congelarsi. Bisogna fare attenzione ad evitare il ripiegamento dei tessuti e il tessuto sovrastante i bordi delimitati del telaio fiduciario. Se necessario, tagliare il tessuto a metà o quarti lungo il lume usando una lama per assicurarsi che la sezione del vaso si adatti al telaio di 6,5 mm x 6,5 mm.
- Tagliare sezioni di tessuto da 10 μm come da 3.12-3.14 su vetrini di ottimizzazione tissutale o di espressione genica. Trasferire la diapositiva su un mailer a scorrimento posto su ghiaccio secco. Conservare le diapositive a -80 °C per un massimo di 4 settimane prima di procedere con i protocolli spaziali pubblicati33,34.
4. Sequenziamento dell'analisi dei dati (tempo stimato: fino a 1 settimana a seconda della familiarità con il software)
NOTA: solo per l'analisi trascrittomica spaziale, andare al passaggio 4.8. I dati scRNA-seq vengono elaborati utilizzando la pipeline standardizzata allineata al trascrittoma di riferimento hg38 umano. Il pacchetto R Seurat (v3.2.2) viene utilizzato per analizzare i dati scRNA-seq seguendo le linee guidapubblicate 40.
- Filtra utilizzando metriche di controllo di qualità consolidate: vengono rimosse cellule rare con un numero molto elevato di geni (potenzialmente multipletti) e cellule con alte percentuali mitocondriali (cellule di bassa qualità o morenti spesso presentano contaminazione mitocondriale).
- Normalizzare i dati utilizzando "sctransform", un metodo per migliorare l'integrazione dei campioni rispetto alla normalizzazione dei log. Questi dati normalizzati vengono utilizzati per la riduzione della dimensionalità e il clustering, mentre i livelli di espressione normalizzati dai log vengono utilizzati per l'analisi basata sui livelli di espressione genica, come la classificazione del tipo di cellula41.
- Selezionare i geni marcatori per tipo di cellula, ad esempio la molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche-1 (PECAM1) e il fattore di von Willebrand (VWF) per le CE, il lumicano (LUM) e il procollagene C-Endopeptidasi Enhancer (PCOLCE) per i fibroblasti, il gene di traslocazione delle cellule B 1 (BTG1) e CD52 per i macrofagi, C1QA e C1QB per i monociti e la catena pesante della miosina 11 (MYH11) e transgelina (TAGLN) per le cellule muscolari lisce vascolari36.
- Calcolare il livello di espressione medio tra singole celle tra ogni coppia di marcatori in modo da avere un singolo marcatore con un livello di espressione medio associato a ciascun tipo di cella42.
- Applicare un gaussian mixture model (GMM) con due componenti ai dati di espressione di ciascun marcatore su singole celle al fine di separare le celle in due insiemi, vale a dire, esprimendo altamente il marcatore ed esprimendo in modo modesto il marcatore. In questo modo, per ogni marcatore, ogni singola cella viene assegnata ad una delle due componenti42.
- Utilizzare l'arricchimento statistico per l'insieme dei geni marcatori, un test esatto di Fisher, per assegnare un tipo di cellula a ciascun cluster. In questo modo, si ottiene un insieme di valori p per cluster, ciascuno corrispondente a un tipo di cella. Il tipo di cella con il valore p più basso viene assegnato a tale cluster.
- Elaborare i dati trascrittomici spaziali utilizzando le pipeline Space Ranger con conseguente de-barcoding spaziale e generazione di metriche di controllo di qualità (QC), comprese le letture allineate totali al trascrittoma umano hg38, il numero mediano di identificatori molecolari univoci (UMI) o geni per spot35.
NOTA: Il pacchetto R Seurat (v3.2.2) viene utilizzato per analizzare i dati elaborati da Space Ranger seguendo le linee guida pubblicate40. - Normalizzare i dati utilizzando "sctransform", un metodo che ha dimostrato di migliorare l'analisi a valle rispetto alla normalizzazione dei log data l'eterogeneità del tessuto e l'altissima varianza nei conteggi tra i punti.
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Representative Results
L'analisi delle CE dell'arteria mesenterica utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica ed enzimatica o crioconservazione per l'uso in vari saggi a valle è descritta qui (Figura 1). Le EC possono essere profilate nelle arterie mesenteriche utilizzando i seguenti passaggi: A) dissociazione meccanica dall'intima accoppiata con la digestione della collagenasi alle cellule di coltura; B) generazione di sospensione monocellulare per scRNA-seq; o C) le sezioni trasversali dell'arteria possono essere incorporate in OCT per essere criosezionate per profilare il trascrittoma spaziale (Figura 1 e Figura 2).
Figura 1: Elaborazione del tessuto arterioso e profilazione spaziale. (A) Un'arteria mesenterica ripulita. (B) Vaso tagliato aperto per esporre intima. (C) Colorazione di ematossilina ed eosina (H&E) della sezione trasversale dell'arteria mesenterica nel telaio fiduciale. Immagine catturata utilizzando una lente 5x al microscopio invertito a fluorescenza a campo largo. (D) File di output rappresentativo space ranger dell'espressione genica totale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica delle tecniche di isolamento e profilazione CE. Diagramma di flusso che mostra diversi metodi di elaborazione dell'arteria mesenterica. Le tecniche di lavorazione portano a sospensioni cellulari adatte per RNA-seq a singola cellula (sc), coltura di cellule endoteliali (EC) o intero tessuto incorporato in un composto di temperatura di taglio ottimale (OCT) per la profilazione del trascrittoma spaziale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le EC isolate coltivate utilizzando il protocollo descritto mostrano una morfologia distinta simile a un ciottolo con cellule contaminanti minime (Figura 3A). L'espressione del marcatore EC endoteliale vascolare (VE)-caderina è stata confermata utilizzando l'immunofluorescenza che visualizza le giunzioni cellula-cellula (Figura 3B). Le EC isolate sono state sottoposte ad analisi citometrica a flusso per CD31. Come controlli negativi, gli HUVEC non macchiati (senza anticorpi) hanno prodotto un segnale dell'1,1% e gli HUVEC incubati con IgG hanno prodotto un segnale dello 0,8%. Come controllo positivo, gli HUVEC colorati con anticorpo CD31 hanno mostrato una purezza del 99% e sono stati utilizzati per bloccare i canali per le cellule endoteliali arteriose mesenteriche umane (HMAECs). Circa l'80% delle cellule erano CD31 positive, indicando che le HMAEC costituivano la maggior parte della popolazione cellulare appena isolata (Figura 3C). Isolamenti infruttuosi, attraverso raschiatura troppo dura / profonda, seminando le cellule a densità troppo bassa o mantenendo la coltura oltre il passaggio 3 si traduce in cellule con morfologia disturbata, potenzialmente esprimendo marcatori mesenchimali (αSMA) o allungandosi simile a uno stato fibroblastico (Figura 3D).
Figura 3: Validazione di EC arteriose mesenteriche isolate in coltura. (A) Immagine a campo luminoso di EC isolate, lente 10x, barra di scala = 50 μm. (B) Immunofluorescenza dell'espressione di VE-Caderina con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) come marcatore nucleare. Immagine catturata utilizzando una lente 10x al microscopio invertito a fluorescenza a campo largo. L'immagine rappresentativa mostra la localizzazione ve-cadherin. Barra della scala = 50 μm. (C) grafici FACS di HUVEC non macchiato (in alto a sinistra), HUVEC colorato con controllo IgG (in alto a destra), HUVEC colorato con CD31 (in basso a sinistra) e le cellule endoteliali arteriose mesenteriche umane isolate (HMAEC) colorate con CD31 (in basso a destra) (D) Immagini di immunofluorescenza di HMAECs con DAPI (marcatore nucleare), actina muscolare alfa-liscia (αSMA) e CD31. Obiettivo 40x, barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le CE isolate utilizzando l'enzima di dissociazione cellulare sono state sottoposte a scRNA-seq. La Figura 4A mostra una rappresentativa uniform manifold approximation and projection (UMAP) isolata dall'arteria mesenterica utilizzando il presente protocollo per scRNA-seq su HMAECs isolate, con il 34% di cellule raggruppate come EC usando PECAM1 e VWF (Figura 4B,C rispettivamente) come marcatori.
Figura 4: scRNA-seq delle CE arteriose mesenteriche. (A) Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) plot of scRNA-seq data from mesenteric artery. Una proiezione bidimensionale della varietà in uno spazio ad alta dimensione, dove ogni punto rappresenta una singola cella e la vicinanza ad altri punti indicano quanto sia simile il trascrittoma tra loro. Le celle sono codificate a colori in base ai rispettivi tipi di cella. (B) Espressione PECAM1 proiettata su UMAP. (C) Espressione VWF proiettata su UMAP. Le barre di colore rappresentano l'espressione di livelli di geni in cui i livelli di RNA sono rappresentati da conteggi di identificatori molecolari univoci normalizzati dai log. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per il flusso di lavoro trascrittomico spaziale, l'RNA estratto dalle sezioni di tessuto è stato elettroforizzato su un gel per visualizzare la qualità dell'RNA. Un segnale debole o l'assenza di bande di RNA ribosomiale 18S e 28S e la presenza di prodotti di degradazione osservati nella Figura 5A, corsia A1, è un esempio di RNA di scarsa qualità e non dovrebbe essere elaborato ulteriormente. I campioni con una concentrazione fuori dall'intervallo potrebbero portare a un RIN inferiore (Figura 5A, corsia B1). Tuttavia, diluire l'RNA di due volte ha aumentato il RIN sufficiente per procedere (Figura 5A, corsia C1). Prima di determinare l'espressione genica, è stata eseguita un'ottimizzazione tissutale per determinare il tempo di permeabilizzazione ottimale per rilasciare l'RNA da catturare dagli oligonucleotidi sul vetrino di espressione genica (Figura 5B). Sulla base dell'imaging a fluorescenza dell'impronta di DNA complementare (cDNA), la permeabilizzazione di 18 minuti ha prodotto il segnale di fondo più basso ma più forte, e quindi è stata selezionata per essere la durata ottimale. La colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) ha visualizzato la morfologia del vaso consentendo di identificare le regioni di interesse (Figura 5C). La qualità della libreria è stata valutata (Figura 5D) e determinata come adatta per il sequenziamento. I conteggi UMI per spot, il numero di letture per spot e i geni totali sono metriche di qualità prodotte dalla pipeline Space Ranger, la variabilità di ciascuno visualizzata nella Figura 5E. Infine, l'espressione genica (usando l'actina alfa-2 (ACTA2) come esempio, Figura 5F) è stata visualizzata con ancoraggio spaziale sul vaso colorato H & E.
Figura 5: Flusso di lavoro trascrittomico spaziale e risultati rappresentativi (A) Valutazione della qualità dell'RNA estratto da due campioni di arteria mesenterica, A1 da un campione, B1 dal secondo campione, C1 diluito 2x da B1. Le frecce rosse indicano le bande ribosomiali 28S e 18S. (B) Flusso di lavoro di ottimizzazione dei tessuti spaziali (TO). (C) Diapositive di espressione genica (GEX) che mostrano le sezioni tissutali (pannello di sinistra); Immagini H&E delle sezioni di tessuto caricate sul vetrino GEX prima della permeabilizzazione per 18 min, trascrizione inversa e costruzione della libreria (pannello di destra), barra della scala = 1 cm. (D) Valutazione della qualità delle librerie preparate. (E) Le metriche di output di Space Ranger mostrano intervalli tra letture medie, IDI e geni per spot per diverse librerie. Le barre di errore indicano l'espressione ACTA2 min e max. (F) nella sezione del recipiente. Tutte le immagini al microscopio sono state scattate utilizzando un microscopio invertito a campo largo, da una lente 5x, modulo tilescan. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il flusso di lavoro presentato descrive in dettaglio una serie di tecniche per profilare gli EC da un singolo pezzo di arteria umana con risoluzione a singola cellula e spaziale. Ci sono diversi passaggi critici e fattori limitanti nel protocollo. Una chiave per la profilazione del trascrittoma è la freschezza del tessuto e l'integrità dell'RNA. È importante mantenere i tessuti sul ghiaccio il più possibile prima dell'elaborazione per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA. Tipicamente, i tessuti post-mortem vengono elaborati tra 8-14 ore dopo il momento della morte. Tuttavia, si raccomanda di iniziare l'isolamento o la crioconservazione il prima possibile dopo l'estrazione dai donatori. Specificamente per la mappatura del trascrittoma spaziale, il tessuto deve essere mantenuto su ghiaccio secco e non deve essere consentito più di un ciclo di congelamento-disgelo. Più di una sezione trasversale del recipiente dovrebbe essere incorporata nei PTOM, per consentire ripetizioni, se necessario. Dovrebbero inoltre essere compiuti sforzi per promuovere un ambiente privo di RNasi durante il trattamento dei tessuti e l'isolamento cellulare. In secondo luogo, la dimensione delle navi può essere un fattore limitante. Per la trascrittomica spaziale, il protocollo può essere eseguito su 1 mm della nave in totale, indipendentemente dal diametro. Per il protocollo di dissociazione per la coltura cellulare e scRNA-seq, il limite inferiore sarebbe se il vaso è troppo stretto (cioè inferiore a 1 mm di diametro) per consentire l'inserimento di forbici di dissezione. Sulla base di questi principi, il protocollo di dissociazione può essere adattato per qualsiasi arteria o vena di medie o grandi dimensioni purché la dimensione dei vasi consenta l'apertura e la procedura del trascrittoma spaziale può essere applicata a qualsiasi vaso che possa adattarsi interamente o parzialmente al telaio fiduciale.
Per elaborare il tessuto per l'analisi del trascrittoma a singola cellula, diversi gruppi hanno descritto l'uso della liberasi e dell'elastasi per ottenere tutte le popolazioni cellulari all'interno della parete del vaso 9,43,44. Tuttavia, i set di dati risultanti contengono in media solo il 3-7% della popolazione cellulare totale annotata come CE 9,45. Un modo per migliorare la limitata rappresentazione EC nei dati scRNA-seq è arricchire la frazione EC sfruttando i marcatori di superficie EC tramite FACS44,46. Tuttavia, questo di solito richiede grandi quantità di tessuto di partenza e attrezzature costose che potrebbero non essere regolarmente disponibili per tutti i laboratori. Questo protocollo sfrutta la posizione anatomica unica degli EC, cioè principalmente nello strato intimale, che consente l'arricchimento delle CE senza la necessità di una digestione dei tessuti aggressivi e migliora la vitalità cellulare per scRNA-seq o successiva coltura. La percentuale di EC nella miscela cellulare finale per scRNA-seq può essere aumentata aggiungendo un passaggio utilizzando perline magnetiche coniugate con anticorpi VE-Cadherin/CD144. Tuttavia, questo passaggio potrebbe non escludere tutte le altre cellule che interagiscono con le CE a causa dell'interazione cellula-cellula nativa. Tuttavia, sebbene tradizionalmente gli altri tipi di cellule (ad esempio, macrofagi, cellule muscolari lisce e fibroblasti) siano considerati "contaminazione" nell'isolamento CE, possono fornire informazioni utili per le interazioni cellula-cellula nel contesto tissutale. Nell'analisi dei dati scRNA-seq, gli EC possono essere annotati in modo efficiente utilizzando i marcatori EC e le interazioni cellula-cellula possono essere dedotte bioinformaticamente utilizzando diversi metodi bioinformatici popolari (ad esempio, CellChat47, CellphoneDB48, CytoTalk49 tra gli altri). Inoltre, l'inclusione di questi dati può consentire un'integrazione e una deconvoluzione più efficaci dei dati di profilazione del trascrittoma spaziale, che non sono a risoluzione a cella singola (cfr. infra)34.
Per il trascrittoma spaziale, attualmente non esiste un gold standard per la preparazione di qualsiasi tessuto per questa tecnica e una ricerca limitata nella preparazione della vascolarizzazione, con la maggior parte della ricerca pubblicata che utilizza tessuto animale50,51. La tecnica richiede diapositive disponibili in commercio con cornici fudiciali specializzate con un'area di cattura contenente circa 5.000 punti con codice a barre con un diametro di 55 μm. I punti sono posizionati a 100 μm dal centro dello spot ai punti adiacenti lasciando spazi di circa 45 μm tra i punti che non saranno profilati, limitando la risoluzione. Inoltre, un singolo punto conterrà più cellule, poiché la maggior parte delle cellule sono al di sotto di 55 μm di area. Quindi, come accennato in precedenza, questa non è una tecnica di sequenziamento a singola cellula. Tuttavia, integrando i dati con scRNA-seq, la risoluzione può essere migliorata e l'eterogeneità all'interno di uno spot può essere rivelata34. Sebbene il presente protocollo si concentri su un test di profilazione trascrittomica spaziale, questa tecnica potrebbe essere adattata per altri metodi emergenti di profilazione spaziale52,53 poiché la qualità della proteina e dell'RNA viene mantenuta in questa procedura.
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Disclosures
S.Z. è fondatore e membro del consiglio di amministrazione di Genemo, Inc.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (a Z.B.C.); DP1DK126138 e DP1HD087990 (a S.Z.); una sovvenzione della Fondazione Ella Fitzgerald e un Progetto della Famiglia Wanek (a Z.B.C.); e una sovvenzione per la rete di semi Human Cell Atlas (a Z.B.C. e S.Z.). La ricerca riportata in questa pubblicazione ha incluso il lavoro svolto nel nucleo di genomica integrativa presso City of Hope supportato dal National Cancer Institute del National Institutes of Health con il numero di premio P30CA033572. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Ismail Al-Abdullah e il Dr. Meirigeng Qi del team di trapianto di isole presso City of Hope per l'isolamento dei tessuti umani, il Dr. Dongqiang Yuan presso City of Hope per la sua assistenza con l'analisi scRNA-seq e il Dr. Marc Halushka presso la Divisione di Patologia Cardiovascolare, Johns Hopkins University School of Medicine per le sue preziose intuizioni sull'istologia vascolare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL micro-centrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm dish | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G needles | BD | 305145 | |
| 2-methylbutane | Thermo Fisher | AC327270010 | |
| 40 µm strainer | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation System | Agilent Technologies | G2991BA | |
| 5 mL tube | Thermo Fisher | 14282300 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| Attachment factor | Cell Applications | 123-500 | Attachment reagent in the protocol |
| Black wax | Any commercial black wax can be used | ||
| Bovine serum albumin heat shock treated | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Chloroform | Fisher | C607 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Cryostat | Leica | ||
| Cryostat brushes | |||
| D-Glucose | Fisher | D16-1 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | Bacteria-derived protease in the protocol |
| Disposable Safety Scalpels | Myco Instrumentation | 6008TR-10 | |
| D-PBS | Thermo Fisher | 14080055 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum | Fisher | 10437028 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| High sensitivity D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5603 | |
| High sensitivity D1000 screen tape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| Incubator | Kept at 37 °C 5% CO2 | ||
| Isopropanol | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| Metal cannister | |||
| Microscope | Leica | To assess cell morphology | |
| Microvascular endothelial culture medium | Cell Applications | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker | Eppendorf | ||
| Optimal Cutting Temperature compound | Fisher | 4585 | |
| Plastic cryomolds | Fisher | 22363553 | |
| RNA screen tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| RNA screen Tape sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | Thermo Fisher | AM9780 | |
| RNase-free water | Takara | RR036B | RNase-free water (2) in kit |
| Sterile 12" long forceps | F.S.T | 91100-16 | |
| Sterile fine forceps | F.S.T | 11050-10 | |
| Sterile fine scissors | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold Slides | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol reagent | Fisher | 15596018 | |
| Trypan Blue | Corning | MT25900CI | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) phenol red | Thermo Fisher | 12605010 | Cell-dissociation enzyme in the protocol |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway Package, 2rxns | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium Spatial Gene Expression Slide & Reagent Kit, 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000184 |
References
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