本方案描述了从人肠系膜动脉中分离、培养和分析内皮细胞的方法。此外，还提供了一种用于空间转录组学研究的人体动脉组织制备方法。对分离的细胞可进行蛋白质组学、转录组学及功能检测。该方案可适用于任何中型或大型动脉。
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方法文章
分离和在转录组水平上分析人原代肠系膜动脉内皮细胞
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
内皮细胞（ECs）通过动态响应环境信号，在血管及全身功能中发挥关键作用。阐明ECs的转录组和表观基因组对于理解其在发育、健康和疾病中的功能至关重要，但受限于原代细胞分离的可获得性。近年来的技术进步使得EC转录组和表观基因组的高通量分析成为可能，从而鉴定出此前未知的EC亚群及其发育轨迹。尽管EC培养是研究EC功能与功能障碍的有用工具，但培养条件和多次传代可能引入外部变量，改变原代EC的特性，包括形态、表观遗传状态和基因表达程序。为克服这一局限，本文介绍了一种从供体肠系膜动脉中分离人原代EC的方法，旨在捕获其天然状态。利用特定酶对内膜层中的EC进行机械和生化解离。所获得的细胞可直接用于批量RNA测序或单细胞RNA测序，也可接种进行培养。此外，本文还描述了用于空间转录组学的人类动脉组织制备流程，特别适用于一种商业化的平台，但该方法同样适用于其他空间转录组分析技术。该方法可应用于从不同健康或疾病状态供体获取的多种血管，以深入理解内皮细胞生物学中关键的转录和表观遗传调控机制。
引言
血管腔内壁的内皮细胞（ECs）是血管张力和组织灌注的关键调节者。ECs能够感知细胞外环境，并适应血流动力学和成分的变化，表现出显著的应答能力。这些动态反应通过复杂的细胞内信号网络介导，包括具有时空分辨率的转录和转录后调控。这些反应的失调与多种病理状态相关，包括但不限于心血管疾病、糖尿病和癌症1,2。
大量研究利用细胞系或动物模型来分析内皮细胞转录组。前者因其操作简便且成本较低而成为一种有用的工具。然而，长期连续培养可能导致内皮细胞出现表型改变，例如成纤维细胞样特征以及极性缺失，使其与体内真实状态脱节 体内 状态3原代细胞，例如人脐静脉内皮细胞（HUVEC），自20世纪80年代以来一直是常用选择，但其来源于发育期的血管床，该结构在成人中并不存在，因此难以完全代表成熟的内皮细胞（EC）。动物模型，尤其是小鼠模型，能更好地模拟内皮细胞的生理或病理生理环境，并可用于研究基因扰动所导致的转录组变化。可通过基于酶消化的方法从小鼠多种组织（包括主动脉、肺和脂肪组织）中分离获取小鼠内皮细胞。4,5,6,<....
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方案
人体组织研究使用了来自希望之城南加州胰岛细胞资源中心的去标识化样本。本研究使用尸体人体组织的研究同意书由捐赠者近亲提供，并已获得希望之城机构审查委员会（IRB 编号：01046）的伦理批准。
1. 物理解离（预计时间：1-2 小时）
- 将一条新鲜动脉置于10 cm培养皿中，用无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗。
- 使用无菌镊子和解剖剪去除血管周围的脂肪组织和外层结缔组织，直至血管清洁。将尺子置于培养皿外侧，测量血管长度，并拍照记录。图1A).
- 将适当的消化缓冲液预热至 37 °C：进行单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）时使用细胞解离酶；进行细胞培养实验时使用含 1–6 mg/mL Collagenase D、3 mg/mL 细菌来源蛋白酶、100 mM HEPES、120 mM NaCl、50 mM KCl、5 mM 葡萄糖和 1 mM CaCl₂ 的缓冲液26,38 （pH 7.0，无需调节），使用前5分钟加入。
- 取肠系膜动脉（通常直径为6-8 mm），用剪刀沿纵轴剪开，以垂直打开血管腔。
- 使用针将血管固定在黑色石蜡的四....
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结果
此处展示了使用机械法与酶解法联合分离或冷冻保存肠系膜动脉内皮细胞（ECs），以用于多种下游检测的分析流程（图1）。可通过以下步骤对肠系膜动脉中的内皮细胞进行分析：A）通过从内膜进行机械分离并结合胶原酶消化以培养细胞；B）制备单细胞悬液用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）；或 C）将动脉横切面包埋于OCT包埋剂中，进行冷冻切片以分析空间转录组（图1 和 图2）。
图 .......
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讨论
本方案详细描述了一套利用单细胞和空间分辨率对单个人体动脉组织中的内皮细胞（ECs）进行分析的技术。该实验流程中存在若干关键步骤和限制因素。转录组分析的一个关键是组织的新鲜程度和RNA的完整性。在处理前应尽可能将组织保持在冰上，以最大限度地减少RNA降解。通常情况下，尸源组织在死亡后8至14小时内进行处理。然而，建议在从供体取出组织后尽快开始细胞分离或冷冻保存操作。对于空间转录组分析，组织应保存在干冰上，并且最多只能经历一次冻融循环。为确保实验可重复，应将多个血管横截面包埋于OCT包埋剂中。在组织处理和细胞分离过程中，还应努力维持无RNase的环境。其次，血管的尺寸可能构成限制因素。对于空间转录组学分析，无论血管直径如何，实验可在总长度为1 mm的血管片段上进行。而对于用于细胞培养和单细胞RNA测序（scRNA-seq）的组织解离流程，其下限是血管过于狭窄（即直径小于1 mm），以致无法插入解剖剪刀。根据这些原则，只要血管尺寸允许充分展开，解离流程可适用于任何中等或更大尺寸的动脉或静脉；而空间转录组分析则可应用于能够完全或部分放入定位标记框架内的任何血管。
为进行单细胞转录组分析的组.......
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披露
S.Z. 是 Genemo 公司的创始人兼董事会成员。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01HL108735、R01HL145170、R01HL106089（授予 Z.B.C.）；DP1DK126138 和 DP1HD087990（授予 S.Z.）；Ella Fitzgerald 基金会资助项目及 Wanek 家族项目（授予 Z.B.C.）；以及人类细胞图谱种子网络资助项目（授予 Z.B.C. 和 S.Z.）。本出版物中报道的研究包括在希望之城综合基因组核心实验室完成的工作，该实验室由美国国立卫生研究院国家癌症研究所通过资助号 P30CA033572 提供支持。作者谨此感谢希望之城胰岛移植团队的 Ismail Al-Abdullah 博士和 Meirigeng Qi 博士在人组织分离方面的贡献，感谢希望之城 Dongqiang Yuan 博士在单细胞 RNA 测序分析方面的协助，以及约翰斯·霍普金斯大学医学院心血管病理学部 Marc Halushka 博士在血管组织学方面提供的宝贵见解。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微型离心管 | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 10 cm 培养皿 | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 23G针头 | BD | 305145 | |
| 2-甲基丁烷 | 赛默飞世尔科技 | AC327270010 | |
| 40 µm 细胞筛 | Fisher | 14100150 | |
| 4200 TapeStation 系统 | 安捷伦科技 | G2991BA | |
| 5 mL 离心管 | 赛默飞世尔科技 | 14282300 | |
| 6孔板 | Greiner Bio-One | 07-000-208 | |
| 黏附因子 | 细胞应用 | 123-500 | 方案中的贴壁试剂 |
| 黑色石蜡 | 任何市售的黑色石蜡均可使用 | ||
| 经热激处理的牛血清白蛋白 | Fisher | BP1600-100 | |
| CaCl2 | Fisher | BP510 | |
| 离心 | Eppendorf | ||
| 氯仿 | Fisher | C607 | |
| 胶原酶D | 罗氏 | 11088866001 | |
| 冷冻切片机 | Leica | ||
| 冷冻切片机刷子 | |||
| D-葡萄糖 | Fisher | D16-1 | |
| 二甲基亚砜 | Fisher | MT25950CQC | |
| Dispase II | 罗氏 | 4942078001 | 方案中源自细菌的蛋白酶 |
| 一次性安全手术刀 | Myco 仪器设备 | 6008TR-10 | |
| D-PBS | 赛默飞世尔科技 | 14080055 | |
| 乙醇 | Fisher | BP2818-4 | |
| 胎牛血清 | Fisher | 10437028 | |
| 血细胞计数板 | Fisher | 267110 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-100g | |
| 高灵敏度 D1000 样品缓冲液 | 安捷伦科技 | 5067-5603 | |
| 高灵敏度 D1000 胶带检测 | 安捷伦科技 | 5067-5584 | |
| 培养箱 | 保持在 37 °C 5% CO2 | ||
| 异丙醇 | Fisher | BP26324 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| 液氮 | |||
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2520-10X | |
| 金属罐 | |||
| 显微镜 | Leica | 评估细胞形态 | |
| 微血管内皮细胞培养基 | 细胞应用 | 111-500 | |
| NaCl | Fisher | S271-1 | |
| 新不伦瑞克 Innova 44/44R 轨道摇床 | Eppendorf | ||
| 最佳切割温度化合物 | Fisher | 4585 | |
| 塑料冷冻模具 | Fisher | 22363553 | |
| RNA 筛选胶带 | 安捷伦科技 | 5067-5576 | |
| RNA 筛选 胶带样品缓冲液 | 安捷伦科技 | 5067-5577 | |
| RNase ZAP | 赛默飞世尔科技 | AM9780 | |
| 无RNase水 | Takara | RR036B | 试剂盒中的无RN酶水（2） |
| 无菌 12" 长柄镊子 | F.S.T | 91100-16 | |
| 无菌细镊子 | F.S.T | 11050-10 | |
| 无菌精细剪刀 | F.S.T | 14061-11 | |
| Superfrost PLUS Gold 载玻片 | Fisher | 1518848 | |
| TRIzol试剂 | Fisher | 15596018 | |
| 台盼蓝 | 康宁 | MT25900CI | |
| TrypLE Express 酶（1X）酚红 | 赛默飞世尔科技 | 12605010 | 方案中的细胞解离酶 |
| Visium 附件试剂盒 | 10X Genomics | PN-1000215 | |
| Visium Gateway 试剂盒，2 次反应 | 10X Genomics | PN-1000316 | |
| Visium 空间基因表达载玻片 & 试剂盒，4 次反应 | 10X Genomics | PN-1000184 |
参考文献
- Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinic....
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