Summary
Det aktuella arbetet beskriver stegen för att producera färdig att använda qPCR för T. cruzi DNA-detektion som kan förinstalleras på reaktionskärlet och förvaras i kylskåp i flera månader.
Abstract
Realtids-PCR (qPCR) är en anmärkningsvärt känslig och exakt teknik som möjliggör förstärkning av små mängder nukleinsyramål från en mängd prover. Det har använts i stor utsträckning inom många forskningsområden och uppnått industriell tillämpning inom områden som mänsklig diagnostik och egenskapsval i grödor av genetiskt modifierade organismer (GMO) grödor. qPCR är dock inte en felsäker teknik. Att blanda alla reagenser i en enda huvudblandning som sedan fördelas på 96 brunnar i en vanlig qPCR-platta kan leda till operatörsfel som felaktig blandning av reagenser eller felaktig dosering i brunnarna. Här presenteras en teknik som kallas gelifiering, varigenom det mesta av vattnet som finns i masterblandningen ersätts med reagens som bildar en sol-gelblandning när den skickas till ett vakuum. Som ett resultat bevaras qPCR-reagenser effektivt i några veckor vid rumstemperatur eller några månader vid 2-8 oC. Detaljer om beredning av varje lösning visas här tillsammans med den förväntade aspekten av en gelifierad reaktion utformad för att detektera T. cruzi-satellit-DNA (satDNA). En liknande procedur kan tillämpas för att upptäcka andra organismer. Att starta en gelifierad qPCR-körning är lika enkelt som att ta bort plattan från kylskåpet, lägga till proverna i sina respektive brunnar och starta körningen, vilket minskar installationstiden för en fullplattreaktion till den tid det tar att ladda proverna. Dessutom kan gelifierade PCR-reaktioner produceras och kontrolleras för kvalitet i satser, vilket sparar tid och undviker vanliga operatörsfel när du kör rutinmässiga PCR-reaktioner.
Introduction
Chagas sjukdom upptäcktes i början av 20-talet på landsbygden i Brasilien, där fattigdomen var utbredd 1,2. Än idag fortsätter sjukdomen att vara kopplad till sociala och ekonomiska determinanter för hälsa i Amerika. Chagas sjukdom är bifasisk, bestående av en akut och en kronisk fas. Det orsakas av infektion av parasiten Trypanosoma cruzi, som överförs av insektsvektorer, blodtransfusioner via medfödd väg eller oralt intag av förorenad mat 3,4.
Diagnostiken av Chagas sjukdom kan göras genom observation av kliniska symtom (särskilt Romaña-tecknet), blodutstryksmikroskopi, serologi och molekylära tester som realtids-PCR (qPCR) eller isotermisk förstärkning 4,5,6,7,8,9. Kliniska symtom och blodutstryksmikroskopi används vid misstänkta fall av akuta infektioner, medan sökandet efter antikroppar används som ett screeningverktyg hos asymptomatiska patienter. På grund av dess känslighet och specificitet har qPCR föreslagits användas som ett övervakningsverktyg för kroniska patienter, för akuta patienter som genomgår behandling som mäter parasitbelastningen i blodet och som en surrogatmarkör för terapeutiskt misslyckande 6,8,10,11,12 . Även om qPCR är mer känsligt och specifikt än för närvarande tillgängliga tester, förhindras det effektivt från att kallas diagnostiska verktyg i missgynnade regioner över hela världen på grund av kravet på frysningstemperaturer för transport och lagring13,14,15.
För att kringgå detta hinder har bevarandetekniker som frystorkning och gelifiering undersökts16,17. Medan lyofilisering ger bevarande i flera år, kräver det specialtillverkade reagenser utan närvaro av glycerol, som vanligtvis används för enzymstabilisering / bevarande18. Medan gelifiering har visat sig ge bevarande i månader, tillåter det användning av vanliga reagenser19. Gelifieringslösningen består av fyra komponenter, var och en med specifika roller i processen: sockerarterna trehalos och melezitos skyddar biomolekylerna under uttorkningsprocessen genom att reducera fria vattenmolekyler i lösningen, glykogen producerar en bredare skyddande matris och aminosyran lysin används som en fri radikalavskiljare för att hämma de oxiderande reaktionerna mellan biomolekylens karboxyl, amino- och fosfatgrupper. Dessa komponenter definierar en sol-gelblandning som förhindrar förlust av den tertiära eller kvartära strukturen under uttorkningsprocessen, vilket hjälper till att upprätthålla biomolekylernas aktivitet vid rehydrering19. När reaktionerna har stabiliserats inuti reaktionsrören kan de lagras i några månader vid 2-8 °C eller några veckor vid 21-23 °C istället för vanliga -20 °C. Detta tillvägagångssätt har redan införlivats i tester som är utformade för att diagnostisera sjukdomar som Chagas sjukdom, malaria, leishmaniasis, tuberkulos och cyklosporiasis13,14,15,20.
Det aktuella arbetet beskriver alla steg för att förbereda de nödvändiga lösningarna för gelifieringsförfarandet, fallgroparna i processen och den förväntade slutliga aspekten av en färdig att använda gelifierad qPCR inuti åtta-rörsremsor. Samma protokoll kan anpassas för enkelrör eller 96-brunnsplattor. Slutligen kommer detekteringen av T. cruzi DNA att visas som en kontrollkörning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av stamlösningar och gelifieringsblandning
OBS: Fyra stamlösningar kommer att beredas (400 mg/ml melezitos, 400 mg/ml trehalos, 0,75 mg/ml lysin och 200 mg/ml glykogen) och blandas enligt den andel som visas i tabell 1 för att framställa gelifieringsblandningen. Även om protokollet beskriver 10 ml produktion av lagerlösningar kan det anpassas för lägre eller högre volymer.
- Melezitos lösning
- Väg upp 4 g melezitos i ett 15 ml plaströr, tillsätt 6 ml nukleasfritt vatten och virvla med instrumentets maximala hastighet tills pulvret är solubiliserat.
OBS: Mer vatten kan tillsättas för att underlätta solubilisering, var noga med att inte överskrida den slutliga volymen (se nedan). - Fyll på den slutliga volymen till 10 ml med nukleasfritt vatten. Märk och förvara vid 2-8 °C i upp till 6 månader.
- Väg upp 4 g melezitos i ett 15 ml plaströr, tillsätt 6 ml nukleasfritt vatten och virvla med instrumentets maximala hastighet tills pulvret är solubiliserat.
- Trehalos lösning
- Väg upp 4 g trehalos i ett 15 ml plaströr, tillsätt 6 ml nukleasfritt vatten och virvla med instrumentets maximala hastighet tills pulvret är lösligt.
OBS: Mer vatten kan tillsättas för att underlätta solubilisering, var noga med att inte överskrida den slutliga volymen (se nedan). - Fyll på nukleasfritt vatten till 10 ml och filtrera lösningen genom ett 0,2 μm filter. Märk och förvara vid 2-8 °C i upp till 6 månader.
- Väg upp 4 g trehalos i ett 15 ml plaströr, tillsätt 6 ml nukleasfritt vatten och virvla med instrumentets maximala hastighet tills pulvret är lösligt.
- Glykogenlösning
- Väg upp 2 g glykogen i ett 15 ml plaströr, tillsätt 6 ml nukleasfritt vatten och virvel vid instrumentets maximala hastighet tills pulvret är lösligt.
OBS: Mer vatten kan tillsättas för att underlätta solubilisering, var noga med att inte överskrida den slutliga volymen (se nedan). - Håll lösningen i vila vid 2-8 °C i 8-12 timmar eftersom solubiliseringen av glykogen ger massor av bubblor (figur 1). Fyll på 10 ml med nukleasfritt vatten. Märk och förvara vid 2-8 °C i upp till 6 månader.
- Väg upp 2 g glykogen i ett 15 ml plaströr, tillsätt 6 ml nukleasfritt vatten och virvel vid instrumentets maximala hastighet tills pulvret är lösligt.
- Lysin lösning
- Väg 7,5 mg lysin i ett 15 ml plaströr, tillsätt 6 ml nukleasfritt vatten. Vortex vid instrumentets maximala hastighet tills pulvret är solubiliserat.
OBS: Mer vatten kan tillsättas för att underlätta solubilisering, var noga med att inte överskrida den slutliga volymen (se nedan). - Fyll på nukleasfritt vatten till 10 ml och filtrera lösningen genom ett 0,2 μm filter. Överför lösningen till en bärnstenskolv eller skydda den mot ljus. Märk och förvara vid 2-8 °C grader i upp till 6 månader.
- Väg 7,5 mg lysin i ett 15 ml plaströr, tillsätt 6 ml nukleasfritt vatten. Vortex vid instrumentets maximala hastighet tills pulvret är solubiliserat.
- Gelifieringsblandning (GM)
- Blanda volymerna av stamlösningar i ett 50 ml plaströr enligt tabell 1.
- Blanda reagenserna med tio end-to-end-inversioner av röret.
OBS: Det finns inget behov av ett filtreringssteg om detta steg utförs i en laminär flödessäkerhetshuv. Om detta steg inte utförs i en ren miljö, filtrera lösningen genom ett 0,2 μm-filter innan du överför den till en bärnstenskolv. - Överför lösningen till en bärnstenskolv eller skydda den mot ljus. Märk och förvara vid 2-8 °C i upp till 3 månader.
OBS: Som ett kvalitetskontrollsteg för beredning av gelifieringsblandningen, se till att de uppmätta pH-, konduktivitets- och densitetsvärdena ligger inom följande intervall: pH 5,55-6,66; konduktivitet 0,630-0,757 mS/cm; och densitet 1,08-1,11 g/cm3. Alla mätningar ska göras vid 25 °C.
2. Beredning av qPCR-huvudblandning för gelifiering
OBS: I detta steg framställs qPCR-huvudblandningen för gelifiering. Därför tillsätts inte vatten till blandningen utan istället tillsätts gelifieringsblandningen (tabell 2).
- Tina reagenserna i en kylbehållare. Blanda reagenserna i ett 1,5 ml rör enligt tabell 2. Ett exempel på en reaktion med en slutlig volym på 25 μL innehållande 5 μL DNA-prov visas här.
OBS: DNA-provet tillsätts inte till blandningen i detta steg; den används här enbart för att beräkna de slutliga volymerna för varje reagens i qPCR-mastermixen. DNA-prover bör läggas till precis innan körningen påbörjas (se steg 4 nedan).
3. Gelifiering av reagenserna på reaktionskärlen
- Multiplicera volymerna som visas i tabell 2 på lämpligt sätt för beredning av en åttarörsremsa eller en 96-brunnsplatta.
- Pipet 18,5 μL av gelifieringshuvudblandningen som visas i tabell 2 på varje reaktionsbrunn.
OBS: Denna volym representerar volymerna av oligonukleotidblandning, PCR-buffert och gelifieringsblandning som används för en reaktion (enligt tabell 2) och kommer att variera beroende på koncentrationen av reagenserna och den volym som behövs för en reaktion. Den slutliga volymen i gelifieringshuvudblandningen skiljer sig från volymen i en vanlig masterblandning eftersom vatten inte tillsätts. - Placera rören/plattan i det värmeledande stödet (t.ex. aluminium) inuti vakuumugnen.
OBS: Det värmeledande stödet är valfritt. Operatören måste se till att rörens botten är i kontakt med vakuumugnshyllan för att möjliggöra snabb termisk jämvikt. - Placera en bentonitlerpåse för varannan 96-brunnsplatta.
OBS: Bentonitlerpåsar används för att absorbera det borttagna vattnet från gelifieringshuvudblandningen genom differenstrycket som utövas av vakuumet. Bentonitlerpåsar visade sig vara onödiga för mindre än två 96-brunnsplattor. - Utsätt rören/plattan som innehåller gelifieringshuvudblandningen för tre vakuumcykler (30 ± 5 mBar) på 30 minuter vardera, alternerande med vakuumavgivning tills atmosfärstrycket uppnås (900–930 mBar), under kontrollerad temperatur (30 °C ± 1 °C) (figur 2).
OBS: Instrumentet använder programvara för att styra parametrarna, och ett exempel på cykeln visas i figur 2. Användaren måste skapa profilen för körningen, vilket anger de valda parametrarna. - När cykeln är avslutad, kontrollera rören/plattorna för korrekt gelifiering av reagenserna genom att se till att volymen är synligt reducerad (figur 3) och att vätskorna inte rör sig när rören/plattorna knackas med fingrarna.
OBS: Om gelifiering inte inträffade skulle lösningen stänka på rörväggarna när rören tappas (figur 3). - Försegla och förvara rören/plattorna vid 2-8 °C i 8-12 timmar före användning.
4. Använda en gelifierad qPCR
- Ta bort rörremsan eller plattan från kylskåpet och öppna den i en arbetsstation för provmanipulation. Tillsätt 15 μl nukleasfritt vatten till varje reaktionskärl.
OBS: Volymen av gelifierade reagens anses vara ca 5 μl. Så tillsammans med DNA-provvolymen (se nedan) är den slutliga reaktionsvolymen 25 μL. - Tillsätt 5 μl DNA-prov.
OBS: Alla DNA-mallar av qPCR-kvalitet kan användas. I det aktuella arbetet extraherades DNA från 108T. cruzi epimastigotes (stam Dm28c) och späddes seriellt vid ett förhållande 1:10 med användning av TE-buffert. - Försegla rören/plattorna och fortsätt till valfri utrustning. Kör experimentet och fortsätt till regelbunden dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre av reagenserna som bildar gelifieringsblandningen lösligas lätt vid kraftig virvelbildning. Glykogen kräver dock noggrann virvel för att säkerställa att pulvret har lösts helt. Tyvärr producerar kraftig virvel massor av bubblor, vilket gör det svårt att bestämma lösningens faktiska volym (figur 1A-B). Därför är det viktigt att låta glykogenlösningen vila i kylen tills det mesta av lösningen som fångas i bubblorna har flyttat ner till huvudlösningskroppen. Med tanke på produktionsprotokollen och laboratorierutinen förvaras gelifierade plattor i kylen över natten (eller cirka 8-12 timmar), vilket resulterar i att de flesta bubblorna sätter sig, vilket gör det lättare att bestämma rätt volym och justera till önskad slutlig volym (Figur 1C). Observera skillnaden i volymen av bubblor mellan glykogenrören i figurerna 1B-C, direkt efter solubiliseringen respektive efter sedimentering över natten.
När gelifieringsblandningen har tillsatts till qPCR-masterblandningen i substitution med vatten (tabell 2) är rörremsorna eller plattorna redo att gå till vakuumugnen. Hyllorna i vakuumugnen innehåller ett Peltier-värmeelement, vilket säkerställer att alla rör som är i kontakt med den förblir vid samma temperatur. I detta protokoll hålls temperaturen inuti kammaren konstant vid 30 °C, medan trycket varierar mellan 910-930 mBar (atmosfärstryck) och 30 mBar (nära vakuum). Figur 2 visar dessa två variabler plottade över tiden och visar den konstanta temperaturen (grön linje, övre panel) och tryckvariationen (röd linje, nedre panel). Efter att cyklerna är färdiga minskar huvudblandningen inuti brunnen i volym och blir gelifierad i botten, dvs utan att röra sig eller stänk när rören tappas med fingrarna (figur 3). Rören kan nu kapsejsas och förvaras vid 2-8 °C. Reaktionerna kommer inte att gelifieras om gelifieringsblandningen (tabell 1) är felaktigt framställd; Det föreslagna kvalitetskontrollsteget bör se felet innan gelifieringsblandningen blandas med qPCR-reagenser.
För att kunna användas måste de gelifierade reagenserna inuti rören/plattorna återsuspenderas i nukleasfritt vatten och DNA-provet spädas vanligtvis i vatten eller TE-buffert. Resuspensionen av reagenserna i sol-gelblandningen uppnås under det första steget av denaturering av det termiska protokollet qPCR (vanligtvis 5-10 min vid 95 ° C), så inget extra steg krävs. Figur 4A visar representativa spår av qPCR-detektion av T. cruzi-DNA med hjälp av publicerade oligonukleotidsekvenser15. Suboptimala resultat inkluderar förlust av känslighet, som kan testas med en utspädningskurva för en lösning med en känd koncentration av genomiska mål och förlust av specificitet, som kan testas med en panel av relaterade trypanosomatidorganismer. Figur 4B visar den förlust av känslighet som kan uppstå när gelifieringsprocessen inte utförs korrekt eller när reaktionen förlorar sin stabilitet efter att ha lagrats vid 2-8 °C i mer än 6 månader.
Figur 1: Löslighet av glykogen producerar massor av bubblor. Eftersom glykogen producerar för många bubblor under solubilisering måste glykogenlösningen hållas i vila innan den justeras till den slutliga volymen. (A) Bubblor som bildas under virvel. (B) Allt pulver solubiliserades, men det är inte möjligt att bestämma den slutliga volymen på grund av de överflödiga bubblorna. (C) Efter 12 timmar i kylskåpet (rör i mitten) reduceras volymen av bubblor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Vakuumcykling (nedre panelen) och temperaturkontroll (övre panelen). Representativa spår av temperatur (övre panel) och tryck (nedre panel) variation visas. Svarta linjer representerar de programmerade variationerna, medan de gröna och röda linjerna representerar faktiska avläsningar av instrumentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Aspekter av gelifierad masterblandning inuti en åtta-rörsremsa . (A) qPCR-masterblandningar före vakuumexponeringen. (B) Vätskestänk på rörväggarna på grund av ofullständig gelifiering (endast en vakuumcykel). (C) Gelifierade qPCR-reagenser med en tydlig synlig volymminskning. Vätskan stänker inte på väggarna när rören tappas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa spår av gelifierade masterblandningar som detekterar DNA från T. cruzi epimastigotes. DNA extraherat från T. cruzi-epimastiroter (108 celler) späddes seriellt i förhållandet 1:10, och DNA-koncentrationerna mellan 104 och 100 celler utsattes för detektion med användning av en gelifierad qPCR. (A) Det förväntade resultatet av korrekt gelifierad qPCR (B) Detektion av samma prover med hjälp av en platta där gelifieringen inte utfördes korrekt, vilket resulterade i förlust av känslighet. Observera att de lägre koncentrationerna detekteras mer sällan i panel B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Lösning | Lagerkoncentration | Volym |
| Melezitos | 400 mg/ml | 3 ml |
| Treahlose | 400 mg/ml | 6 ml |
| Lysin | 0,75 mg/ml | 3 ml |
| Glykogen | 200 mg/ml | 3 ml |
| Nukleasfritt vatten | NA | q.s.p. 20 ml |
Tabell 1: Stamkoncentrationer och volymer av lösningar som används för att framställa 20 ml av gelifieringsblandningen. Volymen för varje stamlösning måste justeras proportionellt för att producera lägre eller högre slutliga volymer av gelifieringsblandningen.
| Reagens för reaktionsblandning | Regelbunden mastermix | Gelifiering mastermix |
| Oligomix (25X) | 1 μL | 1 μL |
| PCR-buffert (2X) | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Gelifiering Blandning* | - | 5 μl |
| Nukleasfritt vatten | 6,5 μL | - |
| DNA-prov* | 5 μl | 5 μl |
| *maximalt 20 % av den slutliga reaktionsvolymen | ||
Tabell 2: Volymer av reagenser för framställning av qPCR-masterblandningar för regelbundna eller gelifierade reaktioner. Skillnaden mellan de två masterblandningarna är att vatten tillsätts till den vanliga masterblandningen medan gelifieringsblandningen tillsätts (dvs istället för vatten) till gelifieringsmästarblandningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De senaste åren har belyst behovet av att hitta mer känslig och specifik teknik för att diagnostisera tropiska och försummade sjukdomar. Även om det är viktigt för epidemiologisk kontroll har parasitologiska (optisk mikroskopi) och serologiska tester begränsningar, särskilt när det gäller känslighet och tillämplighet vid vårdplatser. DNA-förstärkningstekniker som PCR, isotermisk förstärkning och respektive variationer har länge använts i laboratoriemiljöer, men tekniska hinder hindrar det från att användas i fältinställningar. Ett av de största hindren är behovet av temperaturer på -20 °C för transport och lagring av reagenserna. För att avhjälpa denna situation har tekniker som frystorkning och gelifiering använts för att lagra PCR-reaktioner ur frysen16,18,19.
Det nuvarande arbetet visar alla steg som är nödvändiga för att gelifiera en qPCR-reaktion för att detektera T. cruzi-DNA inuti reaktionskärlet, vare sig det är rör, rörremsor, mikrofluidiska chips eller plattor. Preliminära studier med en RT-LAMP-reaktion tyder på att gelifieringstekniken också kan användas för att bevara och skydda andra nukleinsyraförstärknings- och modifieringsenzymer, som beskrivs av Rosado et al. 19. Även om det är relativt enkelt är de två stegen som orsakar de flesta operatörsfel i qPCR-rutiner (a) beredningen av glykogen- och melezitoslösningar och (b) beräkning av volymen av reaktionsblandningen som ska tillsättas till varje reaktionsrör före vakuumsteget. Först måste glykogenlösningen kylas över natten före den slutliga volymjusteringen, och melezitoslösningen måste virvlas kraftigt (eventuellt med mild uppvärmning vid 50 °C) för fullständig lösning. För det andra måste den forskare som planerar experimentet vara medveten om att reagensvolymerna beräknade förvakuum kan vara ojämna eftersom vatten inte tillsätts för att runda upp till reaktionsvolymen. Den faktiska reaktionsvolymen kommer att erhållas när den gelifierade reaktionen återsolubiliseras genom tillsats av prov och vatten innan PCR körs.
Den största begränsningen med metoden är reaktionernas stabilitet, som är cirka 6-8 månader vid 2-8 °C14,15; Det är betydligt kortare än frystorkade reaktioner, som kan förbli stabila i år18. Beroende på specificiteten hos oligonukleotidsekvenserna kan ospecifik bindning och förstärkning uppstå, vilket bör undersökas noggrant av forskarna. Till exempel rapporterar Costa och medarbetare att glödgningstemperaturen för den gelifierade qPCR för detektion av C. cayetanensis måste justeras i +1 °C för att undvika ospecifika förstärkningar15,21. På samma sätt bör forskare undvika att använda enzymer som kan regleras av eller använda gelifieringskomponenterna som substrat.
Gelifieringstekniken är särskilt användbar på grund av dess användarvänlighet i laboratorierutinen samt en introduktion i en produktionslinje16,19,22 som möjliggör smidig kvalitetskontroll; Det senare möjliggör i sin tur robusta och jämförbara data för flera operatörer och eliminerar effektivt vanliga operatörsfel i viktiga steg, med en bonus som eliminerar krav på frysningstemperatur under transport och lagring. Preliminära studier tyder på att eliminering av kylkedjan skulle resultera i en total kostnadsminskning med upp till 20% för ett qPCR-test14. Eliminering av kylkedjan gör det också möjligt att implementera qPCR som ett bekräftande test för försummade sjukdomar som Chagas sjukdom i underutvecklade regioner, vilket gynnar deras epidemiologiska kontroll23.
Slutligen effektiviserar gelifieringsprotokollet användningen av qPCR-tester eftersom det bara kräver att användaren tillsätter vatten och det extraherade T. cruzi-DNA : t, undviker fel under reagenshantering och minskar installationstiden samt risken för reagensets kontaminering. Sådana egenskaper ger effektivitet för ett rutinmässigt diagnostiskt laboratorium, påskyndar leveransen av resultat till patienter och ökar diagnosens tillförlitlighet. Slutligen, eftersom den avstår från behovet av en kylkedja på -20 °C, är den lämplig för diagnostisk användning i miljöer med låg resurs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna vill uttrycka sin tacksamhet till Aline Burda Farias för det tekniska biståndet med vakuumugnen, liksom till administrationen vid Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasilien) för att ha gett tillgång till nämnda utrustning. Detta arbete finansierades delvis av bidrag CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
