Summary
В настоящей работе описываются этапы получения готовой к использованию qPCR для обнаружения ДНК T. cruzi , которая может быть предварительно загружена в реакционный сосуд и храниться в холодильнике в течение нескольких месяцев.
Abstract
ПЦР в реальном времени (qPCR) является удивительно чувствительным и точным методом, который позволяет амплифицировать мельчайшие количества мишеней нуклеиновых кислот из множества образцов. Он широко используется во многих областях исследований и достиг промышленного применения в таких областях, как диагностика человека и выбор признаков в культурах генетически модифицированных организмов (ГМО). Однако qPCR не является методом защиты от ошибок. Смешивание всех реагентов в одну мастер-смесь, впоследствии распределенную по 96 скважинам обычной пластины qPCR, может привести к ошибкам оператора, таким как неправильное смешивание реагентов или неточное дозирование в скважины. Здесь представлен метод, называемый гелеобразованием, при котором большая часть воды, присутствующей в основной смеси, замещается реагентами, которые образуют золь-гелевую смесь при подаче в вакуум. В результате реагенты qPCR эффективно сохраняются в течение нескольких недель при комнатной температуре или нескольких месяцев при 2-8oC. Детали приготовления каждого растворапоказаны здесь вместе с ожидаемым аспектом гелеобразной реакции, предназначенной для обнаружения спутниковой ДНК T. cruzi (сатДНК). Аналогичная процедура может быть применена для обнаружения других организмов. Запуск гелеобразного запуска qPCR так же прост, как извлечение пластины из холодильника, добавление образцов в соответствующие колодцы и начало запуска, тем самым уменьшая время настройки реакции с полной пластиной до времени, необходимого для загрузки образцов. Кроме того, гелеобразные реакции ПЦР могут производиться и контролироваться на качество партиями, экономя время и избегая распространенных ошибок оператора при выполнении рутинных реакций ПЦР.
Introduction
Болезнь Шагаса была обнаружена в начале 20века в сельских районах Бразилии, где бедность была широко распространена 1,2. Даже сегодня болезнь по-прежнему связана с социальными и экономическими детерминантами здоровья в Северной и Южной Америке. Болезнь Шагаса двухфазна, включает в себя острую и хроническую фазы. Он вызван инфекцией паразитом Trypanosoma cruzi, передаваемой насекомыми-переносчиками, переливанием крови врожденным путем или пероральным приемом зараженной пищи 3,4.
Диагностика болезни Шагаса может быть проведена путем наблюдения клинических симптомов (особенно знака Романьи), микроскопии мазка крови, серологии и молекулярных тестов, таких как ПЦР в реальном времени (qPCR) или изотермическая амплификация 4,5,6,7,8,9. Клинические симптомы и микроскопия мазка крови используются при подозрении на острые инфекции, в то время как поиск антител используется в качестве инструмента скрининга у бессимптомных пациентов. Из-за своей чувствительности и специфичности qPCR было предложено использовать в качестве инструмента мониторинга для хронических пациентов, для острых пациентов, проходящих лечение, измеряя паразитарную нагрузку в крови, и в качестве суррогатного маркера терапевтической недостаточности 6,8,10,11,12 . Несмотря на то, что qPCR является более чувствительным и специфическим, чем имеющиеся в настоящее время тесты, он фактически не может быть известен как диагностические инструменты в неблагополучных регионах по всему миру из-за требования низких температур для транспортировки и хранения 13,14,15.
Чтобы обойти это препятствие, методы сохранения, такие как лиофилизация и гелеобразование, были изучены16,17. В то время как лиофилизация обеспечивает сохранение в течение многих лет, она требует специально изготовленных реагентов без присутствия глицерина, который обычно используется для стабилизации / сохранения ферментов18. Хотя было показано, что гелеобразование обеспечивает сохранение в течение нескольких месяцев, оно позволяет использовать обычные реагенты19. Раствор для гелеобразования содержит четыре компонента, каждый из которых играет определенную роль в процессе: сахара трегалоза и мелезитоза защищают биомолекулы в процессе высыхания, уменьшая молекулы свободной воды в растворе, гликоген производит более широкую защитную матрицу, а аминокислота лизин используется в качестве поглотителя свободных радикалов для ингибирования реакций окисления между карбоксилом биомолекулы, амино- и фосфатные группы. Эти компоненты определяют золь-гелевую смесь, которая предотвращает потерю третичной или четвертичной структуры в процессе высыхания, тем самым помогая поддерживать активность биомолекул при регидратации19. После стабилизации внутри реакционных трубок реакции могут храниться в течение нескольких месяцев при 2-8 °C или нескольких недель при 21-23 °C вместо обычных -20 °C. Этот подход уже был включен в тесты, предназначенные для диагностики таких заболеваний, как болезнь Шагаса, малярия, лейшманиоз, туберкулез и циклоспориаз 13,14,15,20.
Настоящая работа описывает все этапы подготовки необходимых растворов для процедуры гелеобразования, подводные камни в процессе и ожидаемый конечный аспект готовой к использованию гелеобразной qPCR внутри восьмитрубных полосок. Тот же протокол может быть адаптирован для одиночных труб или плит с 96 скважинами. Наконец, обнаружение ДНК T. cruzi будет показано как контрольный запуск.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление стоковых растворов и гелеобразующих смесей
ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре исходных раствора будут приготовлены (400 мг/мл мелезитозы, 400 мг/мл трегалозы, 0,75 мг/мл лизина и 200 мг/мл гликогена) и смешаны в соответствии с пропорцией, указанной в таблице 1 , для получения гелеобразной смеси. Хотя протокол описывает производство 10 мл стоковых растворов, он может быть адаптирован для более низких или больших объемов.
- Мелезитоза раствор
- Взвесьте 4 г мелезитозы в пластиковой пробирке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше воды для облегчения солюбилизации, заботясь о том, чтобы не превысить конечный объем (см. Ниже). - Восполнить конечный объем до 10 мл водой без нуклеаз. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
- Взвесьте 4 г мелезитозы в пластиковой пробирке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
- Трегалозный раствор
- Взвесьте 4 г трегалозы в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше воды для облегчения солюбилизации, заботясь о том, чтобы не превысить конечный объем (см. Ниже). - Заполните объем до 10 мл водой без нуклеазы и процедите раствор через фильтр 0,2 мкм. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
- Взвесьте 4 г трегалозы в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
- Раствор гликогена
- Взвесьте 2 г гликогена в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше воды для облегчения солюбилизации, заботясь о том, чтобы не превысить конечный объем (см. Ниже). - Держите раствор в состоянии покоя при 2-8 °C в течение 8-12 ч, потому что при солюбилизации гликогена образуется много пузырьков (рисунок 1). Восполнить объем до 10 мл водой без нуклеаз. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
- Взвесьте 2 г гликогена в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы и вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
- Раствор лизина
- Взвесьте 7,5 мг лизина в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы. Вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно добавить больше воды для облегчения солюбилизации, заботясь о том, чтобы не превысить конечный объем (см. Ниже). - Заполните объем до 10 мл водой без нуклеазы и процедите раствор через фильтр 0,2 мкм. Переложите раствор в янтарную колбу или защитите ее от света. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 6 месяцев.
- Взвесьте 7,5 мг лизина в пластиковой трубке объемом 15 мл, добавьте 6 мл воды без нуклеазы. Вихрь на максимальной скорости инструмента до тех пор, пока порошок не будет солюбилизирован.
- Гелеобразующая смесь (ГМ)
- В пластиковой тубе объемом 50 мл смешайте объемы стоковых растворов согласно таблице 1.
- Смешайте реагенты десятью сквозными инверсиями трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости в этапе фильтрации, если этот этап выполняется в ламинарной защитной вытяжке. Если этот этап не выполняется в чистой среде, отфильтруйте раствор через фильтр 0,2 мкм перед переноской его в колбу янтаря. - Переложите раствор в янтарную колбу или защитите ее от света. Этикетка и хранение при температуре 2-8 °C в течение 3 месяцев.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве этапа контроля качества для приготовления гелеобразующей смеси убедитесь, что измеренные значения рН, проводимости и плотности находятся в следующих диапазонах: рН 5,55-6,66; проводимость 0,630-0,757 мСм/см; и плотность 1,08-1,11 г/см3. Все измерения должны проводиться при температуре 25 °C.
2. Приготовление мастер-микса qPCR для гелеобразования
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе готовится мастер-микс qPCR для гелеобразования. Следовательно, воду не добавляют в смесь, а вместо этого добавляют гелеобразующую смесь (таблица 2).
- Разморозьте реагенты в рефрижераторном контейнере. Смешайте реагенты в пробирке объемом 1,5 мл согласно таблице 2. Здесь показан пример реакции с конечным объемом 25 мкл, содержащей 5 мкл образца ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец ДНК не добавляется к смеси на этом этапе; он используется здесь исключительно для расчета конечных объемов каждого реагента мастер-смеси qPCR. Образцы ДНК должны быть добавлены непосредственно перед началом запуска (см. шаг 4 ниже).
3. Гелеобразование реагентов на реакционных сосудах
- Соответствующим образом умножьте объемы, указанные в таблице 2 , для приготовления восьмитрубной полосы или 96-луночной пластины.
- Пипетировать 18,5 мкл мастер-смеси гелеобразования, показанной в таблице 2 , на каждую реакционную лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем представляет собой объемы олигонуклеотидной смеси, буфера ПЦР и гелеобразующей смеси, используемой для одной реакции (согласно таблице 2), и будет варьироваться в зависимости от концентрации реагентов и объема, необходимого для одной реакции. Конечный объем в мастер-смеси для гелеобразования отличается от объема в обычной мастер-смеси, потому что вода не добавляется. - Поместите трубки/пластины в теплопроводящую опору (например, алюминиевую) внутри вакуумной печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теплопроводящая опора является опциональной. Оператор должен убедиться, что нижняя часть трубок находится в контакте с полкой вакуумной печи, чтобы обеспечить быстрое тепловое равновесие. - Поместите один мешок бентонитовой глины на каждые две плиты из 96 скважин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бентонитовые глиняные мешки используются для поглощения удаленной воды из мастер-смеси гелеобразования под влиянием перепада давления, оказываемого вакуумом. Бентонитовые глиняные мешки оказались ненужными для менее чем двух плит из 96 скважин. - Подвергайте трубки/пластины, содержащие мастер-смесь гелеобразования, трем вакуумным циклам (30 ± 5 мБар) по 30 мин каждый, чередуясь с вакуумным высвобождением до достижения атмосферного давления (900-930 мБар), при контролируемой температуре (30 °C ± 1 °C) (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Прибор использует программное обеспечение для управления параметрами, и пример цикла показан на рисунке 2. Пользователь должен создать профиль для запуска, указав выбранные параметры. - Когда цикл будет завершен, проверьте трубки / пластины на правильное гелеобразование реагентов, убедившись, что объем заметно уменьшен (рисунок 3) и что жидкости не перемещаются при постукивании по трубкам / пластинам пальцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если гелеобразование не происходило, раствор разбрызгивался на стенки трубок при постукивании трубок (рисунок 3). - Запечатайте и храните трубки/пластины при температуре 2-8 °C в течение 8-12 ч перед использованием.
4. Использование гелеобразной qPCR
- Извлеките ленту или пластину из холодильника и откройте ее на рабочем месте для обработки образцов. Добавьте 15 мкл воды без нуклеазы в каждый реакционный сосуд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем гелефикованных реагентов считается около 5 мкл. Таким образом, вместе с объемом образца ДНК (см. ниже) конечный объем реакции составляет 25 мкл. - Добавьте 5 мкл образца ДНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть использован любой шаблон ДНК качества qPCR. В настоящей работе ДНК экстрагировали из 108T. cruzi epimastigotes (штамм Dm28c) и последовательно разбавляли в соотношении 1:10 с использованием буфера TE. - Запечатайте трубки/пластины и приступайте к выбранному оборудованию. Запустите эксперимент и приступайте к регулярному анализу данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Три реагента, образующих гелеобразную смесь, легко солюбилизируются при сильном вихре. Тем не менее, гликоген требует тщательного вихря, чтобы гарантировать, что порошок был полностью солюбилизирован. К сожалению, сильное вихрь производит много пузырьков, что затрудняет определение фактического объема раствора (рисунок 1А-В). Поэтому важно оставить раствор гликогена в холодильнике до тех пор, пока большая часть раствора, захваченного внутри пузырьков, не переместится вниз к основному корпусу раствора. Учитывая производственные протоколы и лабораторный режим, гелеобразные пластины хранятся в холодильнике в течение ночи (или около 8-12 ч), что приводит к оседанию большинства пузырьков, что облегчает определение правильного объема и адаптацию к желаемому конечному объему (рисунок 1C). Обратите внимание на разницу в объеме пузырьков между гликогенными трубками на фиг.1В-С, соответственно, сразу после солюбилизации и после ночного оседания.
После того, как гелеобразующая смесь добавляется в мастер-смесь qPCR вместо воды (таблица 2), полоски или пластины трубки готовы к отправке в вакуумную печь. Полки вакуумной печи содержат нагревательный элемент Пельтье, гарантирующий, что любые трубки, которые соприкасаются с ним, остаются при одинаковой температуре. В настоящем протоколе температура внутри камеры поддерживается постоянной на уровне 30 °C, в то время как давление колеблется между 910-930 мБар (атмосферное давление) и 30 мБар (околовакуум). На рисунке 2 показаны эти две переменные, построенные с течением времени, показывающие постоянную температуру (зеленая линия, верхняя панель) и изменение давления (красная линия, нижняя панель). После завершения циклов мастер-микс внутри скважины уменьшается в объеме и становится гелеобразной на дне, т. е. без движения или брызг при постукивании по трубкам пальцами (рисунок 3). Трубки теперь можно закрывать и хранить при температуре 2-8 °C. Реакции не будут желаться, если гелеобразующая смесь (таблица 1) приготовлена неправильно; на предлагаемом этапе контроля качества следует увидеть неисправность перед смешиванием гелеобразующей смеси с реагентами qPCR.
Для использования гелеобразные реагенты внутри пробирок/пластин должны быть повторно суспендированы в воде без нуклеазы, а образец ДНК разбавлен обычно в воде или буфере TE. Повторное суспендирование реагентов золь-гелевой смеси достигается на первом этапе денатурации термического протокола qPCR (обычно, 5-10 мин при 95 °C), поэтому дополнительный этап не требуется. На фиг.4A показаны репрезентативные следы qPCR-обнаружения ДНК T. cruzi с использованием опубликованных олигонуклеотидных последовательностей15. Субоптимальные результаты включают потерю чувствительности, которая может быть проверена с помощью кривой разбавления раствора с известной концентрацией геномных мишеней и потерей специфичности, которая может быть проверена с помощью панели родственных трипаносоматидных организмов. На рисунке 4B показана потеря чувствительности, которая может возникнуть, когда процесс гелеобразования выполнен неправильно или когда реакция теряет свою стабильность после хранения при 2-8 °C в течение более 6 месяцев.
Рисунок 1: Солюбилизация гликогена производит много пузырьков. Поскольку гликоген производит слишком много пузырьков во время солюбилизации, раствор гликогена необходимо держать в состоянии покоя, прежде чем приспособиться к конечному объему. (А) Пузырьки, образующиеся при вихре. (B) Весь порошок был солюбилизирован, но невозможно определить конечный объем из-за избыточных пузырьков. (C) После 12 ч в холодильнике (трубка посередине) объем пузырьков уменьшается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Вакуумный цикл (нижняя панель) и контроль температуры (верхняя панель). Показаны репрезентативные следы изменения температуры (верхняя панель) и давления (нижняя панель). Черные линии представляют запрограммированные вариации, тогда как зеленые и красные линии представляют фактические показания инструмента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Аспекты гелеобразной мастер-смеси внутри восьмитрубной полосы. (A) qPCR мастер-миксы перед вакуумным воздействием. (B) Жидкие брызги на стенках труб из-за неполного гелеобразования (только один вакуумный цикл). (C) Гелефикованные реагенты qPCR с явным видимым уменьшением объема. Жидкость не брызгает на стенки при постукивании трубок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные следы гелеобразных мастер-смесей, обнаруживающих ДНК из эпимастиготов T. cruzi . ДНК, извлеченную из T. cruzi epimastigotes (108 клеток), последовательно разбавляли в соотношении 1:10, а концентрации ДНК в диапазоне от 104 до 100 клеток подвергали обнаружению с использованием гелеобразной qPCR. (A) Ожидаемый результат правильно гелеобразованной qPCR (B) Обнаружение одних и тех же образцов с использованием пластины, где гелевание не было выполнено должным образом, что привело к потере чувствительности. Обратите внимание, что более низкие концентрации обнаруживаются реже в панели B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Решение | Концентрация запасов | Том |
| Мелезитоза | 400 мг/мл | 3 мл |
| Трихлозе | 400 мг/мл | 6 мл |
| Лизин | 0,75 мг/мл | 3 мл |
| Гликоген | 200 мг/мл | 3 мл |
| Вода без нуклеаз | Н.А. | кв.с.. 20 мл |
Таблица 1: Исходные концентрации и объемы растворов, используемых для получения 20 мл гелеобразующей смеси. Объем каждого запасного раствора должен быть пропорционально отрегулирован для получения более низких или более высоких конечных объемов гелеобразующей смеси.
| Реагент реакционной смеси | Обычный мастермикс | Мастермикс гелеобразования |
| Олигомикс (25X) | 1 мкл | 1 мкл |
| Буфер ПЦР (2X) | 12.5 мкл | 12.5 мкл |
| Гелеобразующая смесь* | - | 5 мкл |
| Вода без нуклеаз | 6.5 мкл | - |
| Образец ДНК* | 5 мкл | 5 мкл |
| *максимум 20% от конечного реакционного объема | ||
Таблица 2: Объемы реагентов для получения мастер-смесей qPCR для регулярных или гелеобразных реакций. Разница между двумя мастер-смесями заключается в том, что вода добавляется к обычной мастер-смеси, тогда как смесь гелеобразования добавляется (т.е. вместо воды) в мастер-смесь гелеобразования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Последние годы подчеркнули необходимость поиска более чувствительных и специфических технологий, помогающих диагностировать тропические и забытые болезни. Несмотря на важность эпидемиологического контроля, паразитологические (оптическая микроскопия) и серологические тесты имеют ограничения, особенно в отношении чувствительности и применимости в месте оказания медицинской помощи. Методы амплификации ДНК, такие как ПЦР, изотермическая амплификация и соответствующие вариации, уже давно используются в лабораторных условиях, но технологические препятствия не позволяют использовать его в полевых условиях. Одним из основных препятствий является потребность в температуре -20 °C для транспортировки и хранения реагентов. Чтобы исправить эту ситуацию, такие методы, как лиофилизация и гелеобразование, были использованы для хранения реакций ПЦР из морозильной камеры 16,18,19.
Настоящая работа показывает все этапы, необходимые для гелеобразования реакции qPCR для обнаружения ДНК T. cruzi внутри реакционного сосуда, будь то трубки, полоски трубок, микрофлюидные чипы или пластины. Предварительные исследования с использованием реакции RT-LAMP предполагают, что метод гелеобразования может также использоваться для сохранения и защиты других ферментов амплификации и модификации нуклеиновых кислот, как описано Rosado et al. 19. Несмотря на относительную простоту, двумя этапами, которые вызывают большинство ошибок оператора в процедурах qPCR, являются(а) приготовление растворов гликогена и мелезитозы и (б) расчет объема реакционной смеси, добавляемой в каждую реакционную трубку перед вакуумной стадией. Во-первых, раствор гликогена должен быть охлажден в течение ночи перед окончательной регулировкой объема, а раствор мелезитозы должен быть энергично вихревым (возможно, с мягким нагревом при 50 °C) для полной солюбилизации. Во-вторых, исследователь, планирующий эксперимент, должен знать, что объемы реагентов, рассчитанные до вакуума, могут быть неравномерными, поскольку вода не добавляется для округления к объему реакции. Фактический объем реакции будет получен, когда гелеобразующая реакция повторно солюбилизируется добавлением образца и воды перед запуском ПЦР.
Наибольшим ограничением метода является стабильность реакций, которая составляет около 6-8 месяцев при 2-8 °C14,15; он значительно короче, чем лиофилизированные реакции, которые могут оставаться стабильными в течение18 лет. В зависимости от специфичности олигонуклеотидных последовательностей может происходить неспецифическое связывание и амплификация, которые должны быть тщательно изучены исследователями. Например, Коста и его коллеги сообщают, что температура отжига гелеобразуемого qPCR для обнаружения C. cayetanensis должна быть скорректирована в +1 °C, чтобы избежать неспецифических усилений15,21. Аналогичным образом, исследователи должны избегать использования ферментов, которые могут регулироваться или использовать компоненты гелеобразования в качестве субстратов.
Метод гелеобразования особенно полезен из-за его простоты использования в лабораторных условиях, а также внедрения в производственную линию 16,19,22, что позволяет плавно контролировать качество; последнее, в свою очередь, обеспечивает надежные и сопоставимые данные между несколькими операторами и эффективно устраняет распространенные ошибки оператора на важных этапах, с бонусом в виде устранения требований к температуре замерзания во время транспортировки и хранения. Предварительные исследования показывают, что устранение холодовой цепи приведет к общему снижению затрат до 20% для теста qPCR14. Ликвидация холодовой цепи также позволяет внедрить qPCR в качестве подтверждающего теста на забытые заболевания, такие как болезнь Шагаса, в слаборазвитых регионах, тем самым способствуя их эпидемиологическому контролю23.
Наконец, протокол гелеобразования упрощает использование тестов qPCR, поскольку он требует от пользователя только добавления воды и извлеченной ДНК T. cruzi , избегая ошибок при обращении с реагентами и уменьшая время настройки, а также возможность загрязнения реагента. Такие характеристики обеспечивают эффективность работы рутинной диагностической лаборатории, ускоряя доставку результатов пациентам и повышая достоверность диагноза. Наконец, поскольку он устраняет необходимость в холодовой цепи -20 ° C, он подходит для диагностического использования в средах с низким уровнем ресурсов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить благодарность Алин Бурда Фариас за техническую помощь с вакуумной печью, а также администрации Института молекулярной биологии Параны (IBMP, Куритиба, Бразилия) за предоставление доступа к указанному оборудованию. Эта работа была частично профинансирована грантом CNPq 445954/2020-5.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
