Summary
本研究では、反応容器にプリロードして冷蔵庫に数ヶ月間保存できる 、T. cruzi DNA検出用のすぐに使用できるqPCRを製造するための手順について説明します。
Abstract
リアルタイムPCR(qPCR)は、多数のサンプルから微量の核酸ターゲットを増幅できる、非常に高感度で正確な技術です。多くの研究分野で広く使用されており、遺伝子組み換え生物(GMO)作物の作物におけるヒト診断や形質選択などの分野での産業応用を達成しています。ただし、qPCRはエラー防止技術ではありません。すべての試薬を1つのマスターミックスに混合し、その後通常のqPCRプレートの96ウェルに分配すると、試薬の誤った混合やウェルへの不正確な分注などのオペレーターミスにつながる可能性があります。ここでは、ゲル化と呼ばれる技術が提示されており、マスターミックスに存在する水の大部分は、真空に提出されたときにゾル-ゲル混合物を形成する試薬によって置換されます。その結果、qPCR試薬は室温で数週間、または2〜8 °Cで数ヶ月間効果的に保存されます。 各溶液の調製の詳細は、T. cruzi 衛星DNA(satDNA)を検出するために設計されたゲル化反応の予想される側面とともにここに示されています。同様の手順を他の生物の検出にも適用できます。ゲル化qPCRランの開始は、プレートを冷蔵庫から取り出し、サンプルをそれぞれのウェルに追加し、ランを開始するのと同じくらい簡単で、フルプレート反応のセットアップ時間をサンプルのロードにかかる時間に短縮します。さらに、ゲル化PCR反応はバッチで製造および品質を制御できるため、時間を節約し、ルーチンPCR反応を実行する際の一般的なオペレーターのミスを回避できます。
Introduction
シャーガス病は、貧困が蔓延していたブラジルの農村地域で20世紀初頭に発見されました1,2。今日でも、この病気は南北アメリカの健康の社会的および経済的決定要因に関連し続けています。シャーガス病は二相性で、急性期と慢性期で構成されています。これは、トリパノソーマクルジ寄生虫による感染、昆虫ベクターによる感染、先天性経路を介した輸血、または汚染された食品の経口摂取によって引き起こされます3,4。
シャーガス病の診断は、臨床症状(特にロマーニャ徴候)の観察、血液塗抹顕微鏡検査、血清学、およびリアルタイムPCR(qPCR)または等温増幅4,5,6,7,8,9などの分子検査によって行うことができます。臨床症状と血液塗抹顕微鏡検査は急性感染症の疑いのある症例に使用されますが、抗体の検索は無症候性患者のスクリーニングツールとして使用されます。qPCRは、その感度と特異性から、慢性患者のモニタリングツール、血液中の寄生虫負荷を測定する治療を受けている急性患者、および治療失敗の代理マーカーとして使用することが示唆されています6,8,10,11,12 .qPCRは、現在利用可能な検査よりも感度が高く特異的ですが、輸送および保管のための凍結温度の要件により、世界中の恵まれない地域では診断ツールとして知られることを効果的に妨げられています13,14,15。
この障害を回避するために、凍結乾燥やゲル化などの保存技術が検討されている16,17。凍結乾燥は何年にもわたって保存を提供しますが、酵素の安定化/保存に一般的に使用されるグリセロールの存在なしに特別に作られた試薬を必要とします18。ゲル化は数ヶ月間の保存を提供することが示されているが、それは通常の試薬の使用を可能にする19。ゲル化溶液は4つの成分を含み、それぞれがプロセスにおいて特定の役割を有する:糖トレハロースおよびメレジトースは、溶液中の遊離水分子を減少させることによって乾燥プロセス中に生体分子を保護し、グリコーゲンはより広い保護マトリックスを生成し、アミノ酸リジンは、生体分子のカルボキシル間の酸化反応を阻害するフリーラジカルスカベンジャーとして使用される。 アミノ基およびリン酸基。これらの成分は、乾燥プロセス中の三次または四次構造の喪失を防ぐゾル-ゲル混合物を定義し、したがって、再水和時に生体分子の活性を維持するのに役立ちます19。反応管内で安定化したら、反応物を通常の-20°Cではなく21-23°Cで2-8°Cで数ヶ月間、または数週間保存することができます。 このアプローチは、シャーガス病、マラリア、リーシュマニア症、結核、シクロスポリア症などの疾患の診断に役立つように設計されたテストにすでに組み込まれています13、14、15、20。
本研究では、ゲル化手順に必要な溶液を調製するためのすべてのステップ、プロセスの落とし穴、および8チューブストリップ内のすぐに使用できるゲル化qPCRの予想される最終側面について説明します。同じプロトコルをシングルチューブまたは96ウェルプレートに適合させることができます。最後に、 T. cruzi DNAの検出がコントロールランとして示されます。
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Protocol
1.原液およびゲル化混合物の調製
注:4つのストック溶液(400 mg / mLのメレジトース、400 mg / mLのトレハロース、0.75 mg / mLのリジン、および200 mg / mLのグリコーゲン)を調製し、 表1 に示す割合に従って混合してゲル化混合物を生成します。プロトコルには10 mLのストック溶液の生産が記載されていますが、少量または多量に適合させることができます。
- メレジトース溶液
- 15 mLのプラスチックチューブに4 gのメレジトースを計量し、6 mLのヌクレアーゼフリー水を加え、粉末が可溶になるまで装置の最高速度でボルテックスします。
注意: 最終容量を超えないように注意しながら、可溶化を促進するためにさらに水を加えることができます(以下を参照)。 - ヌクレアーゼフリーの水で最終容量を10 mLにします。ラベルを付けて2〜8°Cで最大6か月間保管します。
- 15 mLのプラスチックチューブに4 gのメレジトースを計量し、6 mLのヌクレアーゼフリー水を加え、粉末が可溶になるまで装置の最高速度でボルテックスします。
- トレハロース溶液
- 15 mLのプラスチックチューブに4 gのトレハロースを量り、6 mLのヌクレアーゼフリー水を加え、粉末が可溶になるまで装置の最高速度でボルテックスします。
注意: 最終容量を超えないように注意しながら、可溶化を促進するためにさらに水を加えることができます(以下を参照)。 - ヌクレアーゼフリーの水で容量を10 mLに構成し、0.2 μmフィルターで溶液をろ過します。ラベルを付けて2〜8°Cで最大6か月間保管します。
- 15 mLのプラスチックチューブに4 gのトレハロースを量り、6 mLのヌクレアーゼフリー水を加え、粉末が可溶になるまで装置の最高速度でボルテックスします。
- グリコーゲン溶液
- 15 mLのプラスチックチューブに2 gのグリコーゲンを量り、6 mLのヌクレアーゼフリー水を加え、粉末が可溶になるまで装置の最高速度でボルテックスします。
注意: 最終容量を超えないように注意しながら、可溶化を促進するためにさらに水を加えることができます(以下を参照)。 - グリコーゲンの可溶化により大量の気泡が発生するため、溶液を2〜8°Cで8〜12時間静止させます(図1)。ヌクレアーゼフリーの水で容量を10 mLに構成します。ラベルを付けて2〜8°Cで最大6か月間保管します。
- 15 mLのプラスチックチューブに2 gのグリコーゲンを量り、6 mLのヌクレアーゼフリー水を加え、粉末が可溶になるまで装置の最高速度でボルテックスします。
- リジン溶液
- 15 mLのプラスチックチューブに7.5 mgのリジンを量り、6 mLのヌクレアーゼフリー水を加えます。粉末が可溶化するまで、機器の最高速度で渦巻きます。
注意: 最終容量を超えないように注意しながら、可溶化を促進するためにさらに水を加えることができます(以下を参照)。 - ヌクレアーゼフリーの水で容量を10 mLに構成し、0.2 μmフィルターで溶液をろ過します。溶液を琥珀色のフラスコに移すか、光から保護します。ラベルを付けて、2〜8°Cで最大6か月間保管します。
- 15 mLのプラスチックチューブに7.5 mgのリジンを量り、6 mLのヌクレアーゼフリー水を加えます。粉末が可溶化するまで、機器の最高速度で渦巻きます。
- ゲル化混合物(GM)
- 50 mLのプラスチックチューブで、 表1に従って容量のストック溶液を混合します。
- チューブの10個のエンドツーエンド反転によって試薬を混合します。
注意: このステップが層流安全フードで実行される場合、ろ過ステップは必要ありません。このステップがクリーンな環境で実行されない場合は、溶液を琥珀色のフラスコに移す前に、0.2 μmフィルターでろ過します。 - 溶液を琥珀色のフラスコに移すか、光から保護します。ラベルを付けて、2〜8°Cで最大3か月間保管します。
注意: ゲル化混合物を調製するための品質管理ステップとして、測定されたpH、導電率、および密度の値が次の範囲内にあることを確認してください:pH 5.55-6.66;導電率0.630-0.757 mS/cm;密度1.08-1.11 g / cm3。すべての測定は25°Cで行う必要があります。
2. ゲル化用qPCRマスターミックスの調製
注:このステップでは、ゲル化用のqPCRマスターミックスが調製されます。したがって、水は混合物に添加されず、代わりにゲル化混合物が添加される(表2)。
- 冷蔵容器で試薬を解凍します。 表2に従って、1.5 mLチューブで試薬を混合します。5 μLのDNAサンプルを含む最終容量25 μLでの反応の例を以下に示します。
注:このステップでは、DNAサンプルは混合物に添加されません。ここでは、qPCRマスターミックスの各試薬の最終容量を計算するためにのみ使用されます。DNAサンプルは、実行を開始する直前に追加する必要があります(以下のステップ4を参照)。
3. 反応容器上の試薬のゲル化
- 8チューブストリップまたは96ウェルプレートの調製のために 表2 に示す容量を適宜乗算する。
- 表2に示すゲル化マスターミックスのピペット18.5 μLを各反応ウェル上に。
注:この容量は、1回の反応に使用されるオリゴヌクレオチドミックス、PCRバッファー、およびゲル化混合物の量を表し( 表2による)、試薬の濃度と1回の反応に必要な量によって異なります。ゲル化マスターミックスの最終容量は、水が添加されていないため、通常のマスターミックスの体積とは異なります。 - チューブ/プレートを真空オーブン内の熱伝導性支持体(アルミニウムなど)に置きます。
注意: 熱伝導性サポートはオプションです。オペレーターは、チューブの底部が真空オーブンの棚と接触していることを確認して、迅速な熱平衡を可能にする必要があります。 - 2つの96ウェルプレートごとに1つのベントナイトクレイバッグを配置します。
注:ベントナイトクレイバッグは、真空によって加えられる差圧によってゲル化マスターミックスから除去された水を吸収するために使用されます。ベントナイト粘土バッグは、2枚未満の96ウェルプレートには不要であることがわかりました。 - ゲル化マスターミックスを含むチューブ/プレートを、制御された温度(30°C±1°C)で、大気圧(900〜930 mBar)に達するまで真空解放交互に、それぞれ30分間の30つの真空サイクル(30 ± 5 mBar)にかけます(図2)。
注意: 機器はソフトウェアを使用してパラメータを制御し、サイクルの例を 図2に示します。ユーザーは、選択したパラメーターを指定して、実行のプロファイルを作成する必要があります。 - サイクルが完了したら、体積が目に見えて減少し(図3)、指でチューブ/プレートを軽くたたいたときに液体が動かないことを確認して、試薬が適切にゲル化しているかどうかを確認します。
注意: ゲル化が起こらなかった場合、チューブをタップしたときに溶液がチューブの壁に飛び散ります(図3)。 - 使用前に、チューブ/プレートを2〜8°Cで8〜12時間密封して保管してください。
4. ゲル化 qPCR を使用する
- チューブストリップまたはプレートを冷蔵庫から取り出し、ワークステーションで開いてサンプル操作を行います。各反応容器に15 μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。
注:ゲル化試薬の容量は約5μLと考えられています。したがって、DNAサンプル量(下記参照)と合わせて、最終反応量は25μLです。 - 5 μLのDNAサンプルを追加します。
注:任意のqPCR品質のDNAテンプレートを使用できます。本研究では、108T. cruzi エピマスティゴテス(株Dm28c)からDNAを抽出し、TEバッファーを使用して1:10の比率で段階希釈しました。 - チューブ/プレートをシールし、選択した機器に進みます。実験を実行し、通常のデータ分析に進みます。
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Representative Results
ゲル化混合物を形成する3つの試薬は、激しいボルテックスで容易に可溶化されます。ただし、グリコーゲンは、粉末が完全に可溶化されていることを確認するために慎重なボルテックスを必要とします。残念ながら、激しい渦流は大量の気泡を生成するため、溶液の実際の体積を決定することは困難です(図1A-B)。したがって、気泡内に閉じ込められた溶液のほとんどがメイン溶液本体に移動するまで、グリコーゲン溶液を冷蔵庫に置かせることが不可欠です。生産プロトコルとラボルーチンを考慮すると、ゲル化したプレートは冷蔵庫に一晩(または約8〜12時間)保管されるため、ほとんどの気泡が沈降するため、正しい容量を決定し、目的の最終容量に調整することが容易になります(図1C)。図1B-Cのグリコーゲンチューブ間の気泡の体積の違いを、それぞれ可溶化直後と一晩沈降させた後に注目してください。
ゲル化混合物が水の代わりにqPCRマスターミックスに添加されると(表2)、チューブストリップまたはプレートは真空オーブンに行く準備が整います。真空オーブンの棚にはペルチェ発熱体が含まれており、それに接触しているチューブが同じ温度に保たれるようにします。現在のプロトコルでは、チャンバー内の温度は30°Cで一定に保たれますが、圧力は910〜930 mBar(大気圧)から30 mBar(真空に近い)の間で変化します。 図 2は、これら2つの変数を経時的にプロットしたもので、一定の温度(緑の線、上のパネル)と圧力の変化(赤い線、下のパネル)を示しています。サイクルが終了すると、ウェル内のマスターミックスの体積が減少し、チューブを指で叩いても動かず、水しぶきがかからずに底部でゲル化します(図3)。チューブはキャップをして2〜8°Cで保管できるようになりました。 ゲル化混合物(表1)が正しく調製されていない場合、反応はゲル化に失敗します。提案された品質管理ステップでは、ゲル化混合物をqPCR試薬と混合する前に、障害を確認する必要があります。
使用するには、チューブ/プレート内のゲル化試薬をヌクレアーゼフリーの水に再懸濁し、DNAサンプルを通常水またはTEバッファーで希釈する必要があります。ゾル-ゲル混合物の試薬の再懸濁は、qPCRサーマルプロトコルの変性の最初のステップ(通常、95°Cで5〜10分)中に達成されるため、追加のステップは必要ありません。図4Aは、公表されたオリゴヌクレオチド配列15を用いたT. cruzi DNAのqPCR検出の代表的な痕跡を示す。次善の結果には、既知の濃度のゲノムターゲットを有する溶液の希釈曲線で試験できる感度の低下、および関連するトリパノソマチド生物のパネルで試験できる特異性の喪失が含まれる。図4Bは、ゲル化プロセスが正しく実行されない場合、または2〜8°Cで6か月以上保存された後に反応が安定性を失った場合に発生する可能性のある感度の低下を示しています。
図1:グリコーゲンの可溶化はたくさんの泡を生成します。 グリコーゲンは可溶化中に気泡を生成しすぎるため、グリコーゲン溶液を最終容量に調整する前に静止させる必要があります。(A)ボルテックス中に形成される気泡。(b)全ての粉末が可溶化したが、過剰な気泡のために最終体積を決定することはできない。(C)冷蔵庫(真ん中のチューブ)で12時間後、気泡の体積が減少します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:真空サイクル(下パネル)と温度制御(上パネル)。 温度(上パネル)と圧力(下パネル)の変動の代表的な痕跡が示されています。黒の線はプログラムされたバリエーションを表し、緑と赤の線は機器の実際の測定値を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:8チューブストリップ内のゲル化マスターミックスの側面 。 (A)qPCRマスターは真空暴露前に混合する。(B)不完全なゲル化(1回の真空サイクルのみ)のためにチューブ壁に液体が飛び散る。(C)ゲル化したqPCR試薬で、明らかに目に見える体積の減少があります。チューブを叩いても液体が壁に飛び散ることはありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:T. cruziエピマスティゴート由来のDNAを検出するゲル化したマスターミックスの代表的な痕跡。T. cruziエピマスティゴテス(108細胞)から抽出したDNAを1:10の比率で段階希釈し、104〜100細胞の範囲のDNA濃度をゲル化qPCRを用いて検出した。(A)正しくゲル化されたqPCRの期待される結果(B)ゲル化が適切に実行されなかったプレートを使用して同じサンプルを検出し、感度が低下します。パネルBでは、より低い濃度が検出される頻度が低いことに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 解決 | 在庫集中 | 容積 |
| メレジトース | 400ミリグラム/ミリリットル | 3ミリリットル |
| トレアロース | 400ミリグラム/ミリリットル | 6ミリリットル |
| リジン | 0.75 ミリグラム/ミリリットル | 3ミリリットル |
| グリコーゲン | 200ミリグラム/ミリリットル | 3ミリリットル |
| ヌクレアーゼフリー水 | 該当なし | q.s.p. 20 ミリリットル |
表1:20mLのゲル化混合物を製造するために使用された溶液のストック濃度および容量。 各ストック溶液の体積は、ゲル化混合物の最終体積を低くまたはより多く生成するように比例的に調整する必要があります。
| 反応混合試薬 | レギュラーマスターミックス | ゲル化マスターミックス |
| オリゴミックス (25X) | 1 μL | 1 μL |
| PCRバッファー(2X) | 12.5 μL | 12.5 μL |
| ゲル化混合物* | - | 5 μL |
| ヌクレアーゼフリー水 | 6.5 μL | - |
| DNAサンプル* | 5 μL | 5 μL |
| *最終反応量の最大20% | ||
表2:通常またはゲル化反応用のqPCRマスターミックスを生成するための試薬の量。 2つのマスターミックスの違いは、水が通常のマスターミックスに添加されるのに対し、ゲル化混合物はゲル化マスターミックスに(すなわち、水の代わりに)添加されることである。
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Discussion
近年、熱帯病や顧みられない病気の診断に役立つ、より感度が高く具体的な技術を見つける必要性が浮き彫りになっています。疫学的管理には重要ですが、寄生虫学的(光学顕微鏡検査)および血清学的検査には、特に感度とポイントオブケアの適用性に関して制限があります。PCR、等温増幅、およびそれぞれのバリエーションなどのDNA増幅技術は、実験室の設定で長い間使用されてきましたが、技術的なハードルにより、フィールドの設定では使用できません。主な障害の1つは、試薬の輸送と保管のために-20°Cの温度が必要であることです。この状況を改善するために、凍結乾燥およびゲル化などの技術が、PCR反応を冷凍庫16、18、19から保存するために使用されてきた。
本研究は、qPCR反応をゲル化して、チューブ、チューブストリップ、マイクロ流体チップ、プレートなどの反応容器内の T. cruzi DNAを検出するために必要なすべてのステップを示しています。RT-LAMP反応を用いた予備研究は、Rosadoらによって記載されているように、ゲル化技術が他の核酸増幅および修飾酵素を保存および遮蔽するためにも使用され得ることを示唆している。19.比較的簡単ですが、qPCRルーチンでオペレーターのミスのほとんどを引き起こす2つのステップは、(a)グリコーゲンおよびメレジトース溶液の調製と(b)真空ステップの前に各反応チューブに追加する反応混合物の体積の計算です。まず、グリコーゲン溶液を最終容量調整の前に一晩冷蔵し、メレジトース溶液を激しくボルテックス(おそらく50°Cで穏やかな加熱)して完全に可溶化する必要があります。第二に、実験を計画している研究者は、反応量に切り上げるために水が追加されていないため、真空前に計算された試薬の体積が不均一になる可能性があることに注意する必要があります。実際の反応量は、PCRを実行する前に、サンプルと水を加えてゲル化反応を再可溶化したときに得られます。
この方法の最大の制限は反応の安定性であり、これは2〜8°Cで約6〜8ヶ月です14,15;凍結乾燥反応よりもかなり短く、18年間安定している可能性があります。オリゴヌクレオチド配列の特異性によっては、非特異的結合および増幅が起こる可能性があり、研究者は慎重に検討する必要があります。例えば、Costaらは、C. cayetanensisを検出するためのゲル化qPCRのアニーリング温度を、非特異的増幅を避けるために+1°Cに調整しなければならなかったと報告しています15,21。同様に、研究者は、ゲル化成分によって調節される可能性のある酵素を使用したり、基質として使用したりすることを避ける必要があります。
ゲル化技術は、実験室ルーチンでの使いやすさ、およびスムーズな品質管理を可能にする生産ライン16,19,22への導入のために特に有用である。後者は、複数のオペレーター間で堅牢で比較可能なデータを可能にし、重要なステップでの一般的なオペレーターのミスを効果的に排除し、輸送および保管中の凍結温度要件を排除するというボーナスを備えています。予備調査では、コールドチェーンを排除することで、qPCRテストのコストが最大20%削減されることが示唆されています14。コールドチェーンを排除することで、開発が遅れた地域でシャーガス病などの顧みられない病気の確認検査としてqPCRを実施することも可能になり、疫学的管理に有利になります23。
最後に、ゲル化プロトコルは、ユーザーが水と抽出した T. cruzi DNAを追加するだけで済むため、qPCR検査の使用を合理化し、試薬の取り扱い中のエラーを回避し、セットアップ時間と試薬の汚染の可能性を短縮します。このような特性は、日常的な診断検査室に効率を提供し、患者への結果の配信をスピードアップし、診断の信頼性を高めます。最後に、-20°Cのコールドチェーンの必要性を省くため、低リソース環境での診断使用に適しています。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、真空オーブンの技術支援を提供してくれたAline Burda Farias氏と、同機器へのアクセスを許可してくれたパラナ分子生物学研究所(IBMP、クリチバ、ブラジル)の管理に感謝の意を表したいと思います。この作業は、助成金CNPq 445954 / 2020-5によって部分的に資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
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