Summary
Die vorliegende Arbeit beschreibt die Schritte zur Herstellung einer gebrauchsfertigen qPCR für den T. cruzi-DNA-Nachweis, die auf das Reaktionsgefäß vorgeladen und mehrere Monate im Kühlschrank gelagert werden kann.
Abstract
Real-time PCR (qPCR) ist eine bemerkenswert empfindliche und präzise Technik, die es ermöglicht, winzige Mengen von Nukleinsäurezielen aus einer Vielzahl von Proben zu amplifizieren. Es wurde in vielen Forschungsbereichen umfassend eingesetzt und erreichte industrielle Anwendung in Bereichen wie der Humandiagnostik und der Merkmalsauswahl in Pflanzen gentechnisch veränderter Organismen (GVO). qPCR ist jedoch keine fehlersichere Technik. Das Mischen aller Reagenzien zu einer einzigen Mastermischung, die anschließend auf 96 Vertiefungen einer regulären qPCR-Platte verteilt wird, kann zu Bedienerfehlern wie falschem Mischen von Reagenzien oder ungenauer Dosierung in die Vertiefungen führen. Hier wird eine Technik namens Gelifikation vorgestellt, bei der der größte Teil des in der Mastermischung vorhandenen Wassers durch Reagenzien ersetzt wird, die beim Aufsetzen in ein Vakuum eine Sol-Gel-Mischung bilden. Infolgedessen werden qPCR-Reagenzien effektiv für einige Wochen bei Raumtemperatur oder einige Monate bei 2-8 °C konserviert. Details zur Herstellung jeder Lösung werden hier zusammen mit dem erwarteten Aspekt einer gelierten Reaktion zum Nachweis von T. cruzi-Satelliten-DNA (satDNA) gezeigt. Ein ähnliches Verfahren kann angewendet werden, um andere Organismen nachzuweisen. Das Starten eines gelierten qPCR-Laufs ist so einfach wie das Entfernen der Platte aus dem Kühlschrank, das Hinzufügen der Proben in ihre jeweiligen Vertiefungen und das Starten des Laufs, wodurch die Rüstzeit einer vollständigen Plattenreaktion auf die Zeit zum Laden der Proben verringert wird. Darüber hinaus können gelierte PCR-Reaktionen in Chargen erzeugt und auf Qualität kontrolliert werden, was Zeit spart und häufige Bedienfehler bei der Durchführung routinemäßiger PCR-Reaktionen vermeidet.
Introduction
Die Chagas-Krankheit wurde Anfang des 20. Jahrhunderts in ländlichen Regionen Brasiliens entdeckt, wo Armut weit verbreitet war 1,2. Auch heute noch ist die Krankheit mit sozialen und wirtschaftlichen Determinanten von Gesundheit in Amerika verbunden. Die Chagas-Krankheit ist biphasisch und umfasst eine akute und eine chronische Phase. Es wird durch eine Infektion durch den Parasiten Trypanosoma cruzi verursacht, der durch Insektenvektoren, Bluttransfusionen auf angeborenem Weg oder die orale Einnahme kontaminierter Lebensmittel übertragenwird 3,4.
Die Diagnose der Chagas-Krankheit kann durch die Beobachtung klinischer Symptome (insbesondere des Romaña-Zeichens), Blutausstrichmikroskopie, Serologie und molekulare Tests wie real-time PCR (qPCR) oder isotherme Amplifikation 4,5,6,7,8,9 erfolgen. Klinische Symptome und Blutausstrichmikroskopie werden bei Verdacht auf akute Infektionen eingesetzt, während die Suche nach Antikörpern als Screening-Tool bei asymptomatischen Patienten eingesetzt wird. Aufgrund seiner Sensitivität und Spezifität wurde vorgeschlagen, qPCR als Überwachungsinstrument für chronische Patienten, für akute Patienten, die sich einer Behandlung zur Messung der Parasitenlast im Blut unterziehen, und als Ersatzmarker für therapeutisches Versagen verwendet zu werden 6,8,10,11,12 . Obwohl die qPCR empfindlicher und spezifischer ist als die derzeit verfügbaren Tests, wird effektiv verhindert, dass sie in benachteiligten Regionen weltweit als Diagnosewerkzeuge bekannt ist, da für Transport und Lagerung Temperaturen unter dem Gefrierpunkt erforderlich sind13,14,15.
Um dieses Hindernis zu umgehen, wurden Konservierungstechniken wie Lyophilisation und Gelierung erforscht16,17. Während die Lyophilisation jahrelang Konservierung bietet, erfordert sie speziell hergestellte Reagenzien ohne die Anwesenheit von Glycerin, das üblicherweise zur Enzymstabilisierung / -konservierung verwendet wird18. Während die Gelierung nachweislich monatelang konserviert wird, ermöglicht sie die Verwendung von regulären Reagenzien19. Die Gelierungslösung besteht aus vier Komponenten, von denen jede eine spezifische Rolle im Prozess spielt: Die Zucker Trehalose und Melezitose schützen die Biomoleküle während des Austrocknungsprozesses, indem sie freie Wassermoleküle in der Lösung reduzieren, Glykogen erzeugt eine breitere Schutzmatrix, und die Aminosäure Lysin wird als Radikalfänger verwendet, um die oxidierenden Reaktionen zwischen dem Carboxyl des Biomoleküls zu hemmen. Amino- und Phosphatgruppen. Diese Komponenten definieren eine Sol-Gel-Mischung, die den Verlust der tertiären oder quartären Struktur während des Austrocknungsprozesses verhindert und so dazu beiträgt, die Aktivität der Biomoleküle bei Rehydratation aufrechtzuerhalten19. Einmal in den Reaktionsröhrchen stabilisiert, können die Reaktionen für einige Monate bei 2-8 °C oder einige Wochen bei 21-23 °C statt der regulären -20 °C gelagert werden. Dieser Ansatz wurde bereits in Tests zur Diagnose von Krankheiten wie Chagas-Krankheit, Malaria, Leishmaniose, Tuberkulose und Cyclosporiasis aufgenommen13,14,15,20.
Die vorliegende Arbeit beschreibt alle Schritte zur Vorbereitung der erforderlichen Lösungen für das Gelierungsverfahren, die Fallstricke im Prozess und den erwarteten Endaspekt einer gebrauchsfertigen gelierten qPCR in Achtröhrchenstreifen. Das gleiche Protokoll kann für einzelne Rohre oder 96-Well-Platten angepasst werden. Schließlich wird der Nachweis von T. cruzi-DNA als Kontrolllauf gezeigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von Stammlösungen und Geliermischung
HINWEIS: Vier Stammlösungen werden hergestellt (400 mg/ml Melezitose, 400 mg/ml Trehalose, 0,75 mg/ml Lysin und 200 mg/ml Glykogen) und entsprechend dem in Tabelle 1 angegebenen Verhältnis gemischt, um die Gelifikationsmischung herzustellen. Obwohl das Protokoll die Produktion von 10 ml Stammlösungen beschreibt, kann es für kleinere oder höhere Volumina angepasst werden.
- Melezitose-Lösung
- Wiegen Sie 4 g Melezitose in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
HINWEIS: Es kann mehr Wasser hinzugefügt werden, um die Solubilisierung zu erleichtern, wobei darauf zu achten ist, dass das Endvolumen nicht überschritten wird (siehe unten). - Das Endvolumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 ml auffüllen. Etiketten und bei 2-8 °C bis zu 6 Monate lagern.
- Wiegen Sie 4 g Melezitose in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
- Trehalose-Lösung
- Wiegen Sie 4 g Trehalose in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
HINWEIS: Es kann mehr Wasser hinzugefügt werden, um die Solubilisierung zu erleichtern, wobei darauf zu achten ist, dass das Endvolumen nicht überschritten wird (siehe unten). - Das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 mL auffüllen und die Lösung durch einen 0,2 μm Filter filtrieren. Etiketten und bei 2-8 °C bis zu 6 Monate lagern.
- Wiegen Sie 4 g Trehalose in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
- Glykogenlösung
- Wiegen Sie 2 g Glykogen in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
HINWEIS: Es kann mehr Wasser hinzugefügt werden, um die Solubilisierung zu erleichtern, wobei darauf zu achten ist, dass das Endvolumen nicht überschritten wird (siehe unten). - Halten Sie die Lösung 8-12 h bei 2-8 °C in Ruhe, da die Solubilisierung von Glykogen viele Blasen erzeugt (Abbildung 1). Füllen Sie das Volumen auf 10 ml mit nukleasefreiem Wasser. Etiketten und bei 2-8 °C bis zu 6 Monate lagern.
- Wiegen Sie 2 g Glykogen in einem 15-ml-Plastikröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu und wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
- Lysin-Lösung
- Wiegen Sie 7,5 mg Lysin in einem 15 ml Kunststoffröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu. Wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
HINWEIS: Es kann mehr Wasser hinzugefügt werden, um die Solubilisierung zu erleichtern, wobei darauf zu achten ist, dass das Endvolumen nicht überschritten wird (siehe unten). - Das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf 10 mL auffüllen und die Lösung durch einen 0,2 μm Filter filtrieren. Die Lösung wird in einen Bernsteinkolben gegeben oder vor Licht geschützt. Etikettieren und bei 2-8 °C Grad bis zu 6 Monate lagern.
- Wiegen Sie 7,5 mg Lysin in einem 15 ml Kunststoffröhrchen, fügen Sie 6 ml nukleasefreies Wasser hinzu. Wirbeln Sie mit der maximalen Geschwindigkeit des Instruments, bis das Pulver gelöst ist.
- Geliermischung (GV)
- In einem 50-ml-Kunststoffröhrchen die Mengen der Stammlösungen gemäß Tabelle 1 mischen.
- Mischen Sie die Reagenzien durch zehn End-to-End-Inversionen des Röhrchens.
HINWEIS: Es ist kein Filtrationsschritt erforderlich, wenn dieser Schritt in einer Laminar-Flow-Sicherheitshaube durchgeführt wird. Wenn dieser Schritt nicht in einer sauberen Umgebung durchgeführt wird, filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,2-μm-Filter, bevor Sie sie in einen Bernsteinkolben geben. - Die Lösung wird in einen Bernsteinkolben gegeben oder vor Licht geschützt. Etikettieren und bei 2-8 °C bis zu 3 Monate lagern.
HINWEIS: Stellen Sie als Qualitätskontrollschritt für die Herstellung der Gelierungsmischung sicher, dass die gemessenen pH-, Leitfähigkeits- und Dichtewerte innerhalb der folgenden Bereiche liegen: pH 5,55-6,66; Leitfähigkeit 0,630-0,757 mS/cm; und Dichte 1,08-1,11 g/cm3. Alle Messungen sollten bei 25 °C durchgeführt werden.
2. Herstellung der qPCR-Mastermischung für die Gelierung
HINWEIS: In diesem Schritt wird die qPCR-Mastermischung für die Gelierung vorbereitet. Daher wird der Mischung kein Wasser, sondern die Geliermischung zugesetzt (Tabelle 2).
- Die Reagenzien in einem Kühlcontainer auftauen. Mischen Sie die Reagenzien in einem 1,5-ml-Röhrchen gemäß Tabelle 2. Ein Beispiel für eine Reaktion mit einem Endvolumen von 25 μL, die 5 μL DNA-Probe enthält, ist hier gezeigt.
HINWEIS: Die DNA-Probe wird in diesem Schritt nicht zu der Mischung hinzugefügt; es wird hier ausschließlich zur Berechnung der Endvolumina jedes Reagenzes des qPCR-Mastermixes verwendet. DNA-Proben sollten direkt vor Beginn des Laufs hinzugefügt werden (siehe Schritt 4 unten).
3. Gelierung der Reagenzien an den Reaktionsgefäßen
- Die in Tabelle 2 angegebenen Volumina für die Herstellung eines Streifens mit acht Rohren oder einer 96-Well-Platte sind entsprechend zu multiplizieren.
- 18,5 μL der in Tabelle 2 gezeigten Geliermastermischung werden auf jede Reaktionsmulde pipet.
HINWEIS: Dieses Volumen stellt die Volumina der Oligonukleotidmischung, des PCR-Puffers und der Gelierungsmischung dar, die für eine Reaktion verwendet werden (gemäß Tabelle 2) und variiert in Abhängigkeit von der Konzentration der Reagenzien und dem für eine Reaktion benötigten Volumen. Das Endvolumen in der Geliermastermischung unterscheidet sich von dem Volumen in einer normalen Mastermischung, da kein Wasser hinzugefügt wird. - Legen Sie die Rohre/Platte in den wärmeleitenden Träger (z. B. Aluminium) im Vakuumofen.
HINWEIS: Die wärmeleitende Unterstützung ist optional. Der Bediener muss sicherstellen, dass der Boden der Rohre in Kontakt mit dem Vakuumofenregal steht, um ein schnelles thermisches Gleichgewicht zu ermöglichen. - Platzieren Sie einen Bentonit-Tonbeutel für jeweils zwei 96-Well-Platten.
HINWEIS: Bentonit-Tonbeutel werden verwendet, um das entfernte Wasser aus der Geliermastermischung durch den Differenzdruck des Vakuums zu absorbieren. Bentonit-Tonsäcke erwiesen sich für weniger als zwei 96-Well-Platten als unnötig. - Die Röhrchen/Platten mit der Geliermastermischung werden drei Vakuumzyklen (30 ± 5 mBar) von jeweils 30 min ausgesetzt, abwechselnd mit Vakuumfreisetzung, bis der atmosphärische Druck (900-930 mBar) erreicht ist, unter kontrollierter Temperatur (30 °C ± 1 °C) (Abbildung 2).
HINWEIS: Das Gerät verwendet Software zur Steuerung der Parameter, und ein Beispiel für den Zyklus ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Benutzer muss das Profil für den Lauf unter Angabe der ausgewählten Parameter erstellen. - Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Röhrchen/Platten auf ordnungsgemäße Gelierung der Reagenzien, indem Sie sicherstellen, dass das Volumen sichtbar reduziert ist (Abbildung 3) und dass sich die Flüssigkeiten beim Klopfen der Röhrchen/Platten mit den Fingern nicht bewegen.
HINWEIS: Wenn keine Gelierung stattgefunden hat, spritzt die Lösung auf die Rohrwände, wenn Röhrchen angeklopft werden (Abbildung 3). - Verschließen und lagern Sie die Röhrchen/Platten vor Gebrauch bei 2-8 °C für 8-12 h.
4. Verwendung einer gelierten qPCR
- Entfernen Sie den Schlauchstreifen oder die Platte aus dem Kühlschrank und öffnen Sie ihn zur Probenmanipulation an einer Arbeitsstation. Fügen Sie jedem Reaktionsgefäß 15 μL nukleasefreies Wasser hinzu.
HINWEIS: Das Volumen der gelierten Reagenzien wird auf etwa 5 μL geschätzt. Zusammen mit dem DNA-Probenvolumen (siehe unten) beträgt das endgültige Reaktionsvolumen 25 μL. - Fügen Sie 5 μL DNA-Probe hinzu.
HINWEIS: Jede DNA-Vorlage in qPCR-Qualität kann verwendet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde DNA aus 108T. cruzi epimastigotes (Stamm Dm28c) extrahiert und unter Verwendung von TE-Puffer im Verhältnis 1:10 seriell verdünnt. - Verschließen Sie die Rohre/Platten und fahren Sie mit dem Gerät Ihrer Wahl fort. Führen Sie das Experiment aus und fahren Sie mit der regulären Datenanalyse fort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drei der Reagenzien, die die Geliermischung bilden, lassen sich bei starkem Wirbeln leicht auflösen. Glykogen erfordert jedoch ein sorgfältiges Wirbeln, um sicherzustellen, dass das Pulver vollständig gelöst wurde. Leider erzeugt starkes Wirbeln viele Blasen, was es schwierig macht, das tatsächliche Volumen der Lösung zu bestimmen (Abbildung 1A-B). Daher ist es wichtig, die Glykogenlösung im Kühlschrank ruhen zu lassen, bis der größte Teil der in den Blasen eingeschlossenen Lösung in den Hauptlösungskörper gelangt ist. Unter Berücksichtigung der Produktionsprotokolle und der Laborroutine werden gelierte Platten über Nacht (oder etwa 8-12 h) im Kühlschrank aufbewahrt, was dazu führt, dass sich die meisten Blasen absetzen, wodurch es einfacher wird, das richtige Volumen zu bestimmen und sich an das gewünschte Endvolumen anzupassen (Abbildung 1C). Beachten Sie den Unterschied im Volumen der Blasen zwischen den Glykogenröhrchen in den Abbildungen 1B-C jeweils direkt nach der Solubilisierung und nach dem nächtlichen Absetzen.
Sobald die Geliermischung als Ersatz für Wasser in die qPCR-Mastermischung gegeben wird (Tabelle 2), sind die Schlauchstreifen oder -platten bereit für den Vakuumofen. Die Regale des Vakuumofens enthalten ein Peltier-Heizelement, das sicherstellt, dass alle Rohre, die mit ihm in Berührung kommen, auf der gleichen Temperatur bleiben. Im vorliegenden Protokoll wird die Temperatur in der Kammer konstant bei 30 °C gehalten, während der Druck zwischen 910-930 mBar (Atmosphärendruck) und 30 mBar (nahezu Vakuum) variiert. Abbildung 2 zeigt diese beiden Variablen im Zeitverlauf und zeigt die konstante Temperatur (grüne Linie, oberes Feld) und die Druckschwankung (rote Linie, unteres Feld). Nachdem die Zyklen beendet sind, nimmt das Volumen der Mastermischung im Inneren der Vertiefung ab und geliert am Boden, d. h. ohne sich zu bewegen oder zu spritzen, wenn die Röhrchen mit den Fingern angeklopft werden (Abbildung 3). Die Röhrchen können nun verschlossen und bei 2-8 °C gelagert werden. Die Reaktionen gelieren nicht, wenn das Geliergemisch (Tabelle 1) falsch hergestellt wird; Der vorgeschlagene Qualitätskontrollschritt sollte den Fehler sehen, bevor die Gelierungsmischung mit qPCR-Reagenzien gemischt wird.
Um verwendet zu werden, müssen die gelierten Reagenzien in den Röhrchen/Platten in nukleasefreiem Wasser resuspendiert und die DNA-Probe üblicherweise in Wasser oder TE-Puffer verdünnt werden. Die Resuspension der Reagenzien der Sol-Gel-Mischung wird während des ersten Schritts der Denaturierung des qPCR-Thermoprotokolls (normalerweise 5-10 min bei 95 °C) erreicht, so dass kein zusätzlicher Schritt erforderlich ist. Abbildung 4A zeigt repräsentative Spuren des qPCR-Nachweises von T. cruzi-DNA unter Verwendung veröffentlichter Oligonukleotidsequenzen15. Suboptimale Ergebnisse sind der Verlust der Sensitivität, der mit einer Verdünnungskurve einer Lösung mit einer bekannten Konzentration genomischer Ziele getestet werden kann, und der Verlust der Spezifität, der mit einem Panel verwandter Trypanosomatidenorganismen getestet werden kann. Abbildung 4B zeigt den Empfindlichkeitsverlust, der entstehen kann, wenn der Gelierprozess nicht korrekt ausgeführt wird oder wenn die Reaktion nach mehr als 6-monatiger Lagerung bei 2-8 °C ihre Stabilität verliert.
Abbildung 1: Die Solubilisierung von Glykogen erzeugt viele Blasen. Da Glykogen während der Solubilisierung zu viele Blasen erzeugt, muss die Glykogenlösung in Ruhe gehalten werden, bevor sie sich an das endgültige Volumen anpasst. (A) Blasen, die sich während des Wirbelns bilden. (B) Das gesamte Pulver wurde gelöst, aber es ist nicht möglich, das endgültige Volumen wegen der überschüssigen Blasen zu bestimmen. (C) Nach 12 h im Kühlschrank (Röhrchen in der Mitte) wird das Volumen der Blasen reduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vakuumwechsel (unteres Bild) und Temperaturregelung (oberes Bild). Repräsentative Spuren von Temperatur- (oberes Bild) und Druckschwankungen (unteres Bild) sind dargestellt. Schwarze Linien stellen die programmierten Variationen dar, während die grünen und roten Linien die tatsächlichen Messwerte des Instruments darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Aspekte der gelierten Mastermischung in einem Achtröhrchenstreifen . (A) qPCR-Mastermischungen vor der Vakuumexposition. (B) Flüssigkeitsspritzer an den Rohrwänden aufgrund unvollständiger Gelierung (nur ein Vakuumzyklus). (C) Gelierte qPCR-Reagenzien mit deutlich sichtbarer Volumenreduktion. Die Flüssigkeit spritzt nicht an die Wände, wenn die Rohre angezapft werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Spuren von gelierten Mastermischungen, die DNA aus T. cruzi epimastigotes nachweisen. DNA, die aus T. cruzi epimastigotes (108 Zellen) extrahiert wurde, wurde seriell im Verhältnis 1:10 verdünnt, und die DNA-Konzentrationen im Bereich zwischen 104 und 100 Zellen wurden mittels einer gelierten qPCR nachgewiesen. (A) Das erwartete Ergebnis einer korrekt gelierten qPCR (B) Nachweis derselben Proben unter Verwendung einer Platte, bei der die Gelierung nicht ordnungsgemäß durchgeführt wurde, was zu einem Verlust der Empfindlichkeit führte. Beachten Sie, dass die niedrigeren Konzentrationen in Panel B seltener nachgewiesen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Lösung | Bestandskonzentration | Volumen |
| Melezitose | 400 mg/ml | 3 ml |
| Treahlose | 400 mg/ml | 6 ml |
| Lysin | 0,75 mg/ml | 3 ml |
| Glykogen | 200 mg/ml | 3 ml |
| Nukleasefreies Wasser | NA | q.s.p. 20 mL |
Tabelle 1: Stammkonzentrationen und -mengen der zur Herstellung von 20 ml der Geliermischung verwendeten Lösungen. Das Volumen jeder Stammlösung muss proportional angepasst werden, um niedrigere oder höhere Endvolumina der Geliermischung zu erzeugen.
| Reagenz der Reaktionsmischung | Regulärer Mastermix | Gelifikation Mastermix |
| Oligomix (25X) | 1 μL | 1 μL |
| PCR-Puffer (2X) | 12,5 μL | 12,5 μL |
| Geliermischung* | - | 5 μL |
| Nukleasefreies Wasser | 6,5 μL | - |
| DNA-Probe* | 5 μL | 5 μL |
| *maximal 20% des endgültigen Reaktionsvolumens | ||
Tabelle 2: Mengen an Reagenzien zur Herstellung von qPCR-Mastermischungen für reguläre oder gelierte Reaktionen. Der Unterschied zwischen den beiden Mastermischungen besteht darin, dass Wasser zur regulären Mastermischung hinzugefügt wird, während die Geliermischung (dh anstelle von Wasser) zur Gelierungsmastermischung hinzugefügt wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die letzten Jahre haben gezeigt, dass empfindlichere und spezifischere Technologien gefunden werden müssen, um tropische und vernachlässigte Krankheiten zu diagnostizieren. Obwohl für die epidemiologische Kontrolle wichtig, haben parasitologische (optische Mikroskopie) und serologische Tests Einschränkungen, insbesondere in Bezug auf Empfindlichkeit und Point-of-Care-Anwendbarkeit. DNA-Amplifikationstechniken wie PCR, isotherme Amplifikation und entsprechende Variationen werden seit langem im Labor eingesetzt, aber technologische Hürden schließen den Einsatz in Feldumgebungen aus. Eines der Haupthindernisse sind Temperaturen von -20 °C für den Transport und die Lagerung der Reagenzien. Um diese Situation zu beheben, wurden Techniken wie Lyophilisation und Gelierung verwendet, um PCR-Reaktionen aus dem Gefrierschrank16,18,19 zu speichern.
Die vorliegende Arbeit zeigt alle Schritte, die notwendig sind, um eine qPCR-Reaktion zu gelieren, um T. cruzi-DNA im Reaktionsgefäß nachzuweisen, seien es Röhrchen, Röhrenstreifen, mikrofluidische Chips oder Platten. Vorläufige Studien mit einer RT-LAMP-Reaktion deuten darauf hin, dass die Gelierungstechnik auch verwendet werden kann, um andere Nukleinsäureamplifikations- und Modifikationsenzyme zu erhalten und abzuschirmen, wie von Rosado et al. beschrieben. 19. Obwohl relativ einfach, sind die beiden Schritte, die die meisten Bedienerfehler in qPCR-Routinen verursachen, (a) die Herstellung von Glykogen- und Melezitoselösungen und (b) die Berechnung des Volumens der Reaktionsmischung, die jedem Reaktionsröhrchen vor dem Vakuumschritt zugesetzt werden soll. Zuerst muss die Glykogenlösung vor der endgültigen Volumeneinstellung über Nacht gekühlt werden, und die Melezitoselösung muss kräftig gewirbelt werden (möglicherweise mit leichter Erwärmung bei 50 ° C), um eine vollständige Solubilisierung zu erreichen. Zweitens muss sich der Forscher, der das Experiment plant, bewusst sein, dass die vor dem Vakuum berechneten Reagenzienvolumina ungleichmäßig sein können, da Wasser nicht hinzugefügt wird, um das Reaktionsvolumen aufzurunden. Das tatsächliche Reaktionsvolumen wird erhalten, wenn die gelierte Reaktion durch Zugabe von Probe und Wasser vor dem Ausführen der PCR wieder gelöst wird.
Die größte Einschränkung der Methode ist die Stabilität der Reaktionen, die bei 2-8 °C14,15 etwa 6-8 Monate beträgt; Es ist wesentlich kürzer als lyophilisierte Reaktionen, die für die Jahre18 stabil bleiben können. Je nach Spezifität der Oligonukleotidsequenzen kann es zu unspezifischen Bindungen und Amplifikationen kommen, die von den Forschern sorgfältig untersucht werden sollten. Zum Beispiel berichten Costa und Mitarbeiter, dass die Glühtemperatur der gelierten qPCR zum Nachweis von C. cayetanensis in +1 °C eingestellt werden musste, um unspezifische Amplifikationen zu vermeiden15,21. Ebenso sollten Forscher die Verwendung von Enzymen vermeiden, die durch die Gelierungskomponenten reguliert werden oder als Substrate verwendet werden könnten.
Die Geliertechnik ist besonders nützlich wegen ihrer einfachen Handhabung in der Laborroutine sowie einer Einführung in eine Produktionslinie16,19,22, die eine reibungslose Qualitätskontrolle ermöglicht; Letzteres wiederum ermöglicht robuste und vergleichbare Daten über mehrere Bediener hinweg und eliminiert effektiv häufige Bedienerfehler bei entscheidenden Schritten, mit dem Vorteil, dass die Anforderungen an die Gefriertemperatur während des Transports und der Lagerung eliminiert werden. Vorläufige Studien deuten darauf hin, dass die Eliminierung der Kühlkette zu einer Gesamtkostensenkung von bis zu 20% für einen qPCR-Test führen würde14. Die Eliminierung der Kühlkette macht es auch möglich, qPCR als Bestätigungstest für vernachlässigte Krankheiten wie die Chagas-Krankheit in unterentwickelten Regionen zu implementieren und so deren epidemiologische Kontrolle zu begünstigen23.
Schließlich rationalisiert das Gelierungsprotokoll die Verwendung von qPCR-Tests, da der Benutzer nur Wasser und die extrahierte T. cruzi-DNA hinzufügen muss, wodurch Fehler bei der Reagenzienhandhabung vermieden und die Einrichtungszeit sowie die Möglichkeit einer Kontamination des Reagenzes verringert werden. Solche Eigenschaften sorgen für Effizienz für ein routinemäßiges Diagnoselabor, beschleunigen die Bereitstellung von Ergebnissen an Patienten und erhöhen die Zuverlässigkeit der Diagnose. Da es auf eine Kühlkette von -20 °C verzichtet, eignet es sich für den diagnostischen Einsatz in ressourcenarmen Umgebungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Aline Burda Farias für die technische Unterstützung beim Vakuumofen sowie der Verwaltung des Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brasilien) für den Zugang zu den genannten Geräten. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Zuschuss CNPq 445954/2020-5 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bentonite clay bags (activated) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spain) | 026157/STD | Not to be confused with silica gel packs |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-free water | preferred vendor | ||
| Oligonucleotides | preferred vendor | ||
| PCR mastermix | preferred vendor or Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazil) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | preferred vendor | ||
| software for vacuum oven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | from in-house cultivated parasites, or purchased from accredited vendors such as ATCC | ||
| Vacuum oven | Memmert Gmbh | VO-400 |
References
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al.
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A.
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G.
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402 (2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154 (2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191 (2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111 (2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158 (2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408 (2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
